INDUKWANIE ZJAWISKA AUTLIZY U BAKTERII Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska Wstęp teoretyczny Struktura mureiny tworzącej ścianę komórkową Zarówno u bakterii gramdodatnich jak i gramujemnych, na zewnątrz błony cytoplazmatycznej znajduje się sztywna struktura zwana mureiną (syn. peptydoglikan), dodatkowo wzmocniona kwasami tejchojowymi lub techuronowymi (bakterie gramdodatnie) oraz różnymi białkami, w tym lipoproteinami. Mureina pełni przede wszystkim funkcje mechaniczne, chroniąc komórkę przed skutkami zmian ciśnienia osmotycznego, wieloma czynnikami chemicznymi (rozpuszczalniki czy detergenty), nadaje także i utrzymuje charakterystyczny dla danego gatunku bakterii kształt i uczestniczy w procesach związanych z podziałem komórkowym. Szkielet cukrowy mureiny składa się z jednostek dwucukrowych zbudowanych z reszt N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) oraz kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc), połączonych wiązaniem -1 4 glikozydowym (Rys. 1.). Do reszty D- mleczanowej kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest krótki peptyd, w skład którego wchodzą zarówno typowe dla białek bakterii i organizmów wyższych izomery L, jak i rzadko występujące izomery D, aminokwasów. Tetrapeptydy i tripeptydy sąsiadujących ze sobą łańcuchów połączone są poprzecznymi wiązaniami peptydowymi. W ostatnim etapie biosyntezy mureiny, to jest w wydłużaniu łańcuchów cukrowych (transglikozylacja) i tworzeniu wspomnianych wiązań poprzecznych (transpeptydacja) uczestniczą białka, które potrafią również wiązać penicylinę i wskutek tego zostały nazwane białkami wiążącymi penicylinę (PBP). W czasie tzw. procesów dojrzewania mureiny, towarzyszących wzrostowi komórki bakteryjnej, makrocząsteczka ta u niektórych gatunków bakterii, przede wszystkim chorobotwórczych, ulega pewnym modyfikacjom. Do tego rodzaju zmian w części glikanowej należy brak acetylacji grupy aminowej przy węglu C-2 w resztach glukozoaminy lub kwasu muraminowego lub dodatkowa -acetylacja kwasu N-acetylomuraminowego przy węglu C-6. bie te modyfikacje czynią mureinę mniej podatną na aktywność niektórych muramidaz, np. lizozymu (występującego w komórkach i płynach ustrojowych ssaków), który hydrolizuje wiązanie glikozydowe w łańcuchu cukrowym mureiny. Deacetylazy N-acetyloaminocukrów W trakcie biosyntezy bakteryjnej mureiny, tworzącej zrąb ściany komórkowej, dołączane są prekursory w postaci disacharydopeptydu zawierającego N-acetyloglukozoaminę (GlcNAc) i kwas N-acetylomuraminowy (MurNAc). W dojrzałej mureinie niektórych bakterii, w tym bakterii patogennych, część reszt aminocukrowych może występować w postaci nie N-acetylowanej (dotyczy to zarówno glukozoaminy, jak i kwasu muraminowego). W mureinie oportunistycznej bakterii L. monocytogenes około 70% reszt glukozoaminy jest niepodstawionych grupą acetylową (badania naszej grupy badawczej), co czyni ją gorszym substratem dla lizozymu Dopiero w roku 2002 wykryto u dwoinki zapalenia płuc enzym o charakterze deacetylazy GlcNAc, który przypuszczalnie in vivo usuwa grupy acetylowe z aminocukru. Podobne badania przeprowadzono również u bakterii glebowowych z rodzaju Bacillus (2008 r.), a w roku 2007 opisano deacetylazę GlcNAc u L. monocytogenes. Wyniki te podkreślają centralną rolę N-deacetylacji peptydoglikanu w wirulencji L. monocytogene i Streptococcus pneumoniae. Dzięki tej modyfikacji komórki bakterii są zdolne do przeżycia w przewodzie pokarmowym, w profesjonalnych fagocytach, ponieważ nie są wrażliwe na działanie lizozymu. Istotną konsekwencją N-deacetylacji peptydoglikanu jest zwiększenie przeżywalności bakterii w pierwszych, a także późnychj etapach procesu infekcji. 9
Lizozym Enzym o właściwościach muramidazy, zdolny do hydrolizy wiązań -1 4 glikozydowych pomiędzy N-acetyloglukozoaminą (GlcNAc) oraz kwasem N-acetylomuraminowymo (MurNAc). Lizozym występuje w niektórych komórkach i płynach ustrojowych człowieka oraz zwierząt i stanowi bardzo istotną pierwszą barierę dla bakterii. Największe jego ilości można znaleźć we łzach oraz w białku jaja kurzego. G N C 2 C 2 N N -Acetylglucosamine C C3 C A 3 N C 3 L-alanine C C 3 N C C LD-C DD-C C 2 D-glutamic acid C 2 N meso-dap C (C 2 ) 3 N D-alanine 3 C C N D-alanine 3 C C C N-acetylmuramic acid (MurNAc) A C C N C 2 N T C E C 3 C 3 C N C (C 2 ) 3 N C 2 C 2 C C N 3 C C N 3 C C N-Acetylglucosamine (GlcNAc) D-alanine C C N C D-glutamic acid L-alanine G meso-dap T Rysunek 1. Struktura mureiny (peptydoglikanu) Escherichia coli Enzymy hydrolizujące wiązania w mureinie 1. Wiązanie -1,4-glikozydowe hydrolizowane jest przez glikozydazy: (G) -N-acetyloglukozoaminidaza (T) -N-acetylomuramidaza, Lityczna transglikozylaza* 2. Wiązania w części peptydowej są hydrolizowane przez: (E) endopeptydazy, DD-peptydazy (A) amidaza N-acetylomuramoilo-L-alaninowa (LD-C) L,D-karboksypeptydaza (DD-C) DD-karboksypeptydaza MurNAc GlcNAc MurNAc GLUKZAMINIDAZY: przecinają łańcuch oliosacharydowy, uwalniając disacharydy lub dłuższe cząsteczki. ydrolizują również produkty obrotu 10
metabolicznego mureiny, uwalniając tym samym substraty wykorzystywane przez komórki jako źródło węgla i energii. Uwolnione komponenty mureiny mogą również pełnić rolę efektora w procesie agregacji i sporulacji np. u Myxococcus xanthus. U Staphylococcs aureus, hydrolaza ta jest odpowiedzialna za wywoływanie odpowiedzi immunologicznej u ssaków, będąc jednym z determinatów patogenezy. MURAMIDAZY: biorą udział w metabolizmie bakteryjnej ściany komórkowej. Dzięki kontrolowanemu rozrywaniu wiązań w mureinie enzymy te są niezbędne w procesach wydłużania ściany komórkowej i podziału komórki, ale także mogą powodować autolizę komórki. Znane są także przypadki uczestnictwa tych enzymów w procesie sporulacji np. u rodzaju Bacillus oraz w obrocie metabolicznym mureiny u Lactobacillus acidophilus. LITYCZNE TRANSGLIKZYLAZY: Enzym ten nie jest hydrolazą mureiny, ponieważ reakcji nie towarzyszy cząsteczka wody*. W komórkach E. coli występują specyficzne muramidazy, które nie tylko rozrywają wiązanie glikozydowe ale jednocześnie katalizują wewnątrzcząsteczkową transglikozylację z wytworzeniem wiązania 1,6-anhydro w cząsteczce kwasu muraminowego (Rys. 2). Rysunek 2. Wewnątrzcząsteczkowa transglikozylacja z wytworzeniem wiązania 1,6-anhydro w cząsteczce kwasu muraminowego AMIDAZY: dcinają peptyd od łańcuch cukrowego w mureinie. Enzymy te biorą udział w hydrolizie produktów obrotu metabolicznego na mniejsze cząsteczki. Bierą udział w procesie autolizy w fazie stacjinarnej u bakterii z rodzaju Bacillus oraz w lizie indukowanej antybiotykami -laktamowymi, np. u Streptococcus pneumoniae. ENDPEPTYDAZY: Katalizują reakcje rozszczepienia wiązania poprzecznego między sąsiednimi peptydami w mureinie i są tym samym odpowiedzialne za stopień usieciowania tego polimeru. KARBKSYPEPTYDAZY: Enzymy te są zazwyczaj białkami PBP (ang. penicillin binding protein). Enzymy te odcinają D-alaninę od peptydu Główne funkcje autolizyn wzrost i podział komórki oddzielanie się komórek potomnych po podziale dojrzewanie mureiny obrót metaboliczny i recykling mureiny indukcja -laktamaz sporulacja i kiełkowanie chemotaksja formowanie funkcjonalnej struktury rzęski 11
autoliza transformacja komponentów komórkowych wydzielanie białek Autoliza komórki bakteryjnej zachodzi w wyniku niekontrolowanej aktywności endogennych enzymów hydrolitycznych (autolizyn) wobec ściany komórkowej, co prowadzi do śmierci komórki. Mechanizm tego procesu nie jest dotąd w pełni poznany. Rozluźnienie struktury mureiny lub częściowe jej usunięcie powoduje, na skutek wysokiego cisnienia wewnątrzkomórkowego (3 6Atm, a więc porównywalne z ciśnieniem występującym w dętce rowerowej), pęknięcie błony cytoplazmatycznej i wyciek zawartości komórki na zewnątrz. "Samobójcza" aktywność autolizyn jest, w nieznany dotąd sposób, umożliwiana lub wyzwalana przez warunki wpływające hamująco na syntezę mureiny lub naruszające strukturę osłon komórkowych. Autoliza komórki bakteryjnej związana jest z degradacją mureiny przez endogenne enzymy. Nie wszystkie hydrolazy mureinowe są potencjalnymi enzymami autolitycznymi mogącymi spowodować lizę komórki bakteryjnej. W skład systemu autolitycznego E. coli wchodzą trzy lityczne transglikozylazy Slt70, MltA, MltB oraz trzy endopeptydazy PBP4, PBP7 i MepA. U B. subtilis, poprzez analizę sekwencji genomu, wykazano obecność ok. 35 potencjalnych enzymów o aktywności hydrolaz mureiny. W warunkach laboratoryjnych autolizę niektórych gatunków bakterii można wywołać w różny sposób. Najczęściej stosowane metody to: - stworzenie warunków beztlenowych (np. dla Bacillus subtilis) - zastosowanie czynników chaotropowych (np. kwas trichlorooctowy, etanol) - usunięcie ze środowiska wzrostowego składnika ściany (kwas diaminopimelinowy) nie syntetyzowanego przez bakterię - inkubacja niektórych bakterii gramdodatnich w hipertonicznym podłożu - zastosowanie czynników naruszających integralność błony zewnętrznej bakterii gramujemnych (poliaminy, wersenian sodowy) - potraktowanie rosnących bakterii antybiotykami hamującymi wczesne (fosfonomycyna, D-cykloseryna) lub późne ( antybiotyki -laktamowe, moenomycyna) etapy syntezy mureiny - hodowle niektórych gatunków bakterii (Streptococcus pneumoniae, niektóre szczepy Neisseria gonorrhoeae) ulegają spontanicznej lizie w krótkim czasie po osiągnięciu fazy stacjonarnego wzrostu. Agregacja komórek Myxococcus xanthus w warunkach głodu, z wytworzeniem ciał owocowych, połączona jest a autolizą ogromnej części populacji. Niektóre gatunki bakterii ulegają spontanicznej autolizie w wyniku zmiany p lub potencjału oksydoredukcyjnego środowiska. Stosunkowo najlepiej zbadano proces indukcji autolizy komórek bakteryjnych w obecności antybiotyków -laktamowych. Klasyczne -laktamy indukują autolizę wyłącznie w komórkach aktywnie rosnących. Mimo, że już minęło ponad 60 lat od odkrycia penicyliny przez Fleminga, to efekt bakteriolizy jest nadal niezrozumiały. Powodem takiej sytuacji jest brak dostatecznej wiedzy na temat wewnątrzkomórkowej kontroli enzymów autolitycznych. Proponowane są dwie hipotezy dla wyjaśnienia autolizy pod wpływem działania penicyliny i podobnych inhibitorów: 1. Model enzymatycznej równowagi (Weidel i Pelzer, 1964 ), który zakłada, ze wzrost mureiny wymaga dwóch systemów enzymatycznych - hydrolaz i syntetaz, będących w równowadze. Autoliza miałaby być wynikiem zachwiania tej równowagi na skutek selektywnego zahamowania syntetaz, białek PBP przez penicylinę. 12
2. Mechanizm wyzwalania hydrolizy peptydoglikanu (Giesbrecht, 1992) zakłada, że autoliza indukowana penicyliną jest rezultatem działania specyficznych hydrolaz, normalnie biorących udział w procesie przecinania septy, podczas oddzielania się komórek potomnych po podziale. ydrolazy te kontynuują swoje działanie nawet mimo braku właściwego formowania septy (zablokowane syntetazy PBP). Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotować hodowlę logarytmiczną (inoculum 1:20, 100 ml), A 600 0,8, następujących bakterii: - Escherichia coli - Bacillus subtilis - Pseudomonas putida - Micrococcus luteus 2. odowle odwirować (5 tys. rpm, 10 min, 4 o C) w probówkach wirowniczych z wykorzystaniem wirówki typu Sorvall RC-5B firmy DuPont Instruments. 3. W czasie wirowania należy rozlać na szalki rozpuszczone podłoże stałe (Agar dżywczy-a) 4. Po zakończeniu wirowania, zlać supernatant (dokładnie osuszyć brzegi probówki ręcznikiem papierowym w pozycji do góry nogami ) 5. sad zawiesić w 40 ml odpowiedniego buforu lizującego o składzie: A) - 40 ml buforu o p=8,0 (50 mm Tris/Cl) - 0,4 ml 100 mm EDTA B) - 40 ml buforu o p=8,0 (50 mm Tris/Cl) - 0,4 ml 100% Tritonu X-100 6. Wykonać spektrofotometryczny pomiar D, przy długości fali 600 nm (t 0 ) UWAGA! Gęstość optyczna (optical density - D) mierzona przy długości fali 600 nm powinna mieścić się w zakresie 0,6-0,8. Jeżeli jest wyższa wartość D, należy dolać odpowiednią ilość buforu lizującego i ponownie wykonać pomiar. 7. Próby (zawiesinę bakterii) należy inkubować z wytrząsaniem w temp. 37 o C. Kolejne pomiary D wykonywać po 10, 20, 30, 40 i 60 minutach. 8. Jednocześnie po dokonaniu pomiaru D, należy pobierać po 1 ml zawiesiny bakterii w celu wykonania odpowiedniego rozcieńczenia (10-2 ; 10-4 ) w probówkach z wykorzystanie soli fizjologicznej - RF i wysiania na podłoże stałe. Wyniki w postaci liczby kolonii (przeżywalność) należy odczytać na następnych ćwiczeniach. 9. dczytane wartości D należy zestawić w tabeli i policzyć procentowy spadek wartości D, traktując wartość pomiaru w czasie t 0 jako 100%. Wyniki doświadczenia należy przestawiać w postaci wykresu patrz przykład poniżej. 10. Po omówieniu wyników, należy sformułować i zapisać wnioski! 13
D [%] Tabela Czas [min] D Escherichia coli Pseudomonas putida Bacillus subtilis Micrococcus luteus 0 0,8/100% 0,7/100% 0,8/100% 0,6/100% 10 X/X% X/X% X/X% X/X% 20 30 40 60 Wykres - przykład Triton X-100-stimulated autolysis of L. monocytogenes EGD and mutant MK 100 80 60 l. monocytogenes EGD L. monocytogenes MK 40 20 0 0 30 60 90 120 150 180 210 time [min] Literatura uzupełniająca: 1.Wykłady z Fizjologii Bakterii. Popowska M., Korsak D. 2.Biologia molekularna bakterii pod redakcją Baj J., Markiewicz Z., PWN 2006 3. Struktura i funkcje osłon bakteryjnych. Markiewicz Z., PWN 1993 4. Markiewicz Z., Popowska M. 2011. An Update on Some Structural Aspects of the Mighty Miniwall Pol. J. Microbiol. 60(3):181-186 5. Popowska M. 2004. Analysis of the Peptidoglycan ydrolases of Listeria monocytogenes: Multiple Enzymes with Multiple Functions. Pol. J. Microbiol. 53: 29-34 6. Popowska M.1998. Bakteryjne enzymy hydrolizujące wiązania w mureinie. Post Microbiol. 2, XXXVII. 14