IDENTYFIKACJA PRODUKTU SYNTEZY IAA-ASPARAGINIANU METODĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ WSTĘP Synteza koniugatów amidowych auksyn Kwas indolilo-3-octowy (IAA) jest prostą cząsteczką organiczną, pochodną aminokwasu aromatycznego- tryptofanu. IAA stanowi główną auksynę, najlepiej poznany hormon roślinny regulujący prawie wszystkie procesy fizjologiczne. Wszystkie znane naturalne auksyny występują w roślinach w formie fizjologicznie aktywnego wolnego kwasu oraz w połączeniach z innymi związkami jako tzw. koniugaty. Auksyna w tej formie stanowi główną część puli hormonu w komórce. Reakcje syntezy koniugatów polegają na utworzeniu wiązania kowalencyjnego między grupą karboksylową auksyny, a grupą hydroksylową cukrów i inozytolu (koniugaty estrowe) lub grupą aminową wolnych aminokwasów, peptydów i białek (koniugaty amidowe). W tkankach roślin jednoliściennych dominują koniugaty estrowe, natomiast w dwuliściennych połączenia amidowe. Koniugaty pełnią funkcję zapasowego źródła fitohormonu, z którego stopniowo w miarę potrzeby uwalniana jest na drodze hydrolizy aktywna auksyna. W przypadku koniugatów amidowych, ich rola jest nie do końca poznana. Wiele IAA-amidów (IAA-alanina, IAA-leucyna, IAAglicyna) jest substratem amidohydrolaz uwalniających aktywny biologicznie hormon. Dominujące w tkankach roślin dwuliściennych IAA-asparaginian (indolilo-3-acetylo-asparaginian, IAA-Asp) oraz IAA-glutaminian (indolilo-3-acetylo-glutaminian, IAA-Glu) raczej nie stanowią zapasowej puli auksyn, ale pełnią inne nieznane funkcje, np.: w szlakach degradacji IAA. Synteza IAA-amidów przebiega w dwóch etapach. W pierwszym etapie reakcji dochodzi do utworzenia związku pośredniego (intermediatu), IAA-adenylanu (IAA-AMP) stąd wymagana jest obecność ATP i jonów Mg 2+. IAA-adenylan związny jest z enzymem i stanowi donor reszty IAA dla aminokwasów. Uwalniany w pierwszym etapie difosforan (pirofosforan-pp i ) jest substratem difosfatazy (pirofosfatazy), która hydrolizując wysokoenergetyczne wiązanie przesuwa stan równowagi reakcji w prawo, w kierunku tworzenia IAA-Asp. Hydroliza bezwodnikowego wiązania wysokoenergetycznego zasila syntezę IAA-asparaginianu i czyni tę reakcję nieodwracalną. IAA + ATP IAA-AMP + PP i IAA-AMP + Asp IAA- Asp + AMP + 2P i 1
Indolilo-3-acetylo-asparaginian (IAA-Asp) Enzymy syntetyzujące połączenia amidowe są kodowane przez geny naleŝące do rodziny GH3 (Glycine max homology) zaliczane do wczesnych genów auksynowych. Cechą charakterystyczną tych enzymów jest tworzenie wspomnianego związku pośredniego IAA-adenylanu. Reakcja adenylacji jest często spotykana w przemianach metabolicznych, np.:podczas aktywacji aminokwasów w biosyntezie białka czy aktywacji kwasów tłuszczowych. Jedynym zidentyfikowanym dotychczas enzymem, który w tkance roślinnej katalizuje syntezę koniugatów amidowych jest syntetaza IAA-Asp, enzym wyizolowany z niedojrzałych nasion grochu. Wolna auksyna (IAA) oraz jej koniugat (IAA-Asp) zawierają w swojej strukturze pierścień indolowy, stąd identyfikacja produktu reakcji opiera się na wykryciu składnika indolowego na płytce po chromatografii cienkowarstwowej. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC, thin layer chromatography) Adsorbenty uŝywane do chromatografii cienkowarstwowej charakteryzują się bardzo małymi cząsteczkami, a bardzo cienka warstwa adsorbentu na powierzchni płytki (0,2 mm) nie moŝe nadmiernie pęcznieć w czasie rozdziału, czy pękać w trakcie suszenia, a takŝe nie moŝe pochłaniać promieniowania UV, które jest często uŝywane do lokalizacji rozdzielanych związków. Powszechnie uŝywanym adsorbentem nieorganicznym jest Ŝel krzemionkowy (Silica Gel) o przeciętnej średnicy ziaren od 5 do 25 µm. Niektóre adsorbenty zawierają domieszkę substancji fluoryzujących, które umoŝliwiają lokalizację związków (np. związków z pierścieniami aromatycznymi) bez uŝywania wywoływaczy, a jedynie przez wystawienie chromatogramu na działanie promieniowania UV o zakresie 254 nm. Na ogół w chromatografii cienkowarstwowej operuje się bardzo niewielkimi ilościami rozdzielanych prób, rzędu kilku µl. Przed rozpoczęciem nanoszenia prób, na płytce zaznacza się linie startu oraz punkty, na które będzie się nanosiło próby. Średnica naniesionych prób (plamek) powinna być moŝliwie mała (2-3 mm). Próbki nanosi się małymi porcjami susząc plamki strumieniem cie- 2
płego powietrza. Układy rozwijające dobiera się eksperymentalnie uwzględniając skład i rodzaj rozdzielanych substancji. Powtarzalność rozdziałów moŝliwa jest tylko przy uŝyciu bardzo czystych rozpuszczalników, a takŝe pod warunkiem, Ŝe skład układu rozwijającego nie ulegnie zmianie np. w wyniku odparowania jednego ze składników. Po skończonym rozdziale i zaznaczeniu ołówkiem czoła układu rozwijającego, płytki suszy się delikatnie w strumieniu ciepłego powietrza. Do lokalizacji bezbarwnych substancji uŝywa się odczynników, które tworzą z rozdzielanymi związkami barwne połączenia. Oprócz tego szereg związków absorbuje UV, co uwidacznia się w postaci ciemnych plam na świecącym tle (o ile adsorbent zawiera dodatek substancji fluoryzującej np. fluoresceiny). Po wybarwieniu rozdzielanych związków mierzy się odległość środka plamki od linii startu i oblicza się wartość R f. Wartości R f powinny być powtarzalne przy zachowaniu stałych warunków rozdziału, tym niemniej wskazane jest rozwinięcie (na tej samej płytce) czystych związków (wzorców), które ułatwią identyfikację rozdzielanych substancji. MATERIAŁY I METODY Materiały: Niedojrzałe nasiona grochu (Pisum sativum) zamroŝone w -20ºC płytki do chromatografii cienkowarstwowej Silica Gel 60 F 254 firmy MERCK mały moździerz z tłuczkiem nylon mikrowirówka Odczynniki: bufor do homogenizacji: 50 mm Tris-HCl ph 7,6; 5 mm 2-merkaptoetanol; 2 mm EDTA Mieszanina wyjściowa: 270 mm Tris-HCl ph 8,6; 27 mm ATP, 27 mm MgCl 2 32 mm IAA w 50% izopropanolu 32 mm kwas L-asparaginowy (jednowodzian soli sodowej kwasu L- asparaginowego) w H 2 O wzorzec IAA-Asp w 50% (v/v) etanolu 50 mm GSH układ rozwijający: octan etylu/chloroform/kwas mrówkowy, zmieszane w stosunku: 55/35/10 odczynnik Van Urk-Salkowskiego: Roztwór A (2 g p-dwumetyloaminobenzaldehyd rozpuścić w 100 ml HCl, a następnie dodać 100 ml 99 % etanolu) 3
Roztwór B (2.03 g FeCl 3 x 6 H 2 O rozpuścić w 500 ml H 2 O, a następnie dodać 300 ml stę- Ŝonego kwasu siarkowego) Odczynnik Van Urk-Salkowskiego zawiera 1 część roztworu A i 3 części roztworu B. WYKONANIE Homogenizacja tkanki: (1 homogenat na całą grupę) W wychłodzonym moździerzu odwaŝyć 2 g zamroŝonych duŝych nasion grochu, dodać 2 ml zimnego buforu do homogenizacji (1 cz tkanki: 1 cz środowiska homogenizacyjnego daje 50 % homogenat), dokładnie rozetrzeć ręcznie w moździerzu. Zawartość moździerza przecisnąć bardzo starannie przez nylon do zlewki. Zmierzyć objętość przesączu, przelać do probówek Eppendorfa i odwirować w mikrowirówce (6000 obr/min., 5 minut). Klarowny supernatant przenieść do nowej probówki Eppendorfa. Do oznaczeń preparat przechowywać w lodówce. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych Środowisko reakcyjne (kaŝda para przygotowuje swoje środowisko): w małej probówce Eppendorfa zmieszać: 13,5µl mieszaniny wyjściowej, 4,5µl 32 mm IAA, 23µl 32 mm Asp, 2,8 µl 50 mm GSH, 1,2 µl H 2 O. Mieszaninę wymieszać przez krótkie zwirowanie w mikrowirówce. Obliczyć stęŝenia wszystkich składników mieszaniny. Przygotowanie płytek do rozdziału chromatograficznego Na płytce aluminiowej pokrytej krzemionką, 1 cm od dolnego brzegu narysować ołówkiem poziomo linię startu i zaznaczyć na niej kropkami w odstępach 1 cm, miejsca naniesienia próbek: 0,1,2,3,4,5. Płytkę przechowywać w suchym i ciemnym miejscu dbając aby nie uległa zanieczyszczeniu. Wykonanie oznaczeń Do suchej probówki napipetować 15µl środowiska reakcyjnego i umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 30 C na 1-2 minuty. Następnie dodać 9 µl homogenatu z nasion grochu. Próbę wymieszać przez kilkukrotne przepipetowanie. Natychmiast pobrać 4µl próby i przenieść na płytkę TLC w miejscu 0 (kontrola dla homogenatu). Miejsce naniesienia wysuszyć suszarką. Mieszaninę inkubować 20, 40 i 60 minut. Po kaŝdym czasie inkubacji pobrać 4 µl próby, nanieść na płytkę TLC i wysuszyć. Na koniec nanieść 2 µl wzorca IAA-Asp. 4
Próba zerowa: w probówce zmieszać 15 µl środowiska reakcyjnego i 9 µl buforu do homogenizacji. Próbę inkubować 60 minut. Po dokładnym wysuszeniu, wstawić płytki do komory chromatograficznej i rozwijać do czasu, aŝ czoło roztworu rozwijającego znajdzie się w odległości 4-5 mm od górnego brzegu płytki. Po wyjęciu płytek z komory, zaznaczyć czoło roztworu rozwijającego. Płytki dokładnie wysuszyć, a następnie zanurzyć w odczynniku Salkowskiego (ostroŝnie ze względu na wysokie stęŝenie kwasu siarkowego w odczynniku Salkowskiego!). Nadmiar roztworu odsączyć miedzy dwiema warstwami papierowego ręcznika, a następnie ostroŝnie suszyć w gorącym strumieniu powietrza (uŝywając suszarki do włosów), aŝ do całkowitego wybarwienia plamek zawierających pierścień indolowy. OPRACOWANIE ĆWICZENIA Dokumentacją ćwiczenia jest kserokopia lub skan płytki po TLC. Na rysunku zaznaczyć linię startu, połoŝenie substratu i produktu reakcji. Zmierzyć odległości plamek zawierających IAA-Asp od linii startu. Obliczyć R f dla produktu reakcji. Przeanalizować przebieg reakcji w czasie, wyjaśnić wynik próby zerowej i kontrolnej. W opracowaniu proszę obliczyć końcowe (po dodaniu homogenatu) stęŝenia składników mieszaniny reakcyjnej. LITERATURA 1. Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z biochemii PWN 2. Ostrowski M, Jakubowska A. Identification of enzyme activity that conjugates of indole-3- acetic acid to aspartate in immature seeds of pea (Pisum sativum). J Plant Physiol 2008; 165: 564-569. 5