Temat pracy Charakterystyka ekspresji receptora programowanej śmierci 1 oraz jego ligandu w przewlekłej białaczce limfocytowej Cel pracy Jedną z cech procesu nowotworzenia jest wykształcenie przez komórki nowotworowe mechanizmów pozwalających na ucieczkę spod nadzoru układu odpornościowego. Prowadzi to do wytworzenia tolerancji na antygeny komórek nowotworowych i umożliwia ich niekontrolowaną proliferację. Celem projektu jest zintensyfikowanie jednego z prawdopodobnych mechanizmów tolerancji względem nowotworu u pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową (PBL-B). Celem pracy będzie scharakteryzowanie ekspresji cząsteczki programowanej śmierci komórkowej PD-1 (programmed death 1) i jej ligandu PD-L1 u chorych na PBL-B. Uzasadnienie wyboru tematu pracy Przewlekła białaczka limfocytowa jest najpowszechniejszą białaczką występującą na zachodniej półkuli 1 oraz dobrym modelem badawczym dla badania procesów nowotworzenia ze względu na łatwość pobrania komórek nowotworowych akumulujących się we krwi chorego w miarę postępu choroby (także w węzłach chłonnych oraz w mniejszym stopniu w śledzionie i szpiku kostnym 1 ). Stan immunosupresji towarzyszy chorobie. Istnieje szereg przesłanek wskazujących na występowanie mechanizmów immunomodulujących odpowiedz układu odpornościowego, takich jak: podwyższony poziom regulatorowych limfocytów T (Tregs) 2 w PBL, podwyższona ekspresja FOXP3 czynnika transkrypcyjnego dla Tregs 3 w PBL oraz fakt supresji odpowiedzi na antygeny wirusowe oraz nowotworowe przez Tregs 3. Pomimo nieznanej patogenezy PBL-B, charakterystyczne jest zaburzenie czynności receptorów swoistych dla limfocytów B (BCR). Pomimo, że PBL-B jest rozrostem limfocytów B, niektóre cząsteczki swoiste dla limfocytów T są obecne na komórkach nowotworowych. Do tych cząsteczek można zaliczyć ZAP70, CD38 i CD5. Ostatnie doniesienia wskazują na istotną rolę cząsteczek PD i jej ligandów modulacji przekaźnictwa przez TCR. Za regulację przekazywania sygnału przez TCR odpowiedzialny jest receptor
programowanej śmierci 1 (PD-1), a jego ligand PD-L1 za hamowanie szlaku sygnałowego BCR. PD-1 jest glikoproteiną odgrywającą istotną rolę w procesie nabywania i utrzymywania tolerancji obwodowej przez limfocyty T oraz mającą negatywny wpływ na aktywację i funkcję limfocytów T w stanie nowotworzenia 4. PD-L2 jest transkrybowany w profesjonalnych komórkach prezentujących antygen (APC). Z kolei ekspresja PD-L1 jest dużo szersza i następuje w aktywowanych limfocytach T i B oraz profesjonalnych, jak i nieprofesjonalnych APC. Nadekspresja PD-L1 została stwierdzona w wielu rodzajach nowotworów, także w nowotworach hematologicznych 5,6, ale takich badań nie wykonano jeszcze dla PBL-B. Inne badania wskazały na rolę PD-L1 w hamowaniu aktywacji limfocytów T oraz supresji śmierci komórek nowotworowych, co wskazuje na rolę nadekspresji PD-L1 w wywoływaniu tolerancji na nowotwór. Powyższe przesłanki wskazują na potencjalną rolę PD-1 i jego ligandów w kontekście terapii przeciwnowotworowej. Przykładem może być zastosowanie cząsteczek anty-pd-l1 powoduje przywrócenie funkcjonalności wyczerpanym CD8 + limfocytom T 4. Reasumując, zbadanie ekspresji PD-1 oraz PD-L1 daje szansę na lepsze poznanie biologii PBL-B oraz zidentyfikowanie potencjalnego mechanizmu komórek białaczkowych spod nadzoru układu immunologicznego. Hamowanie PD-1/PD-L1 może być nowym sposobem na przełamanie tolerancji układu odpornościowego na antygeny komórek nowotworowych oraz przywrócenie funkcji wyczerpanym limfocytom T. Użycie przeciwciał monoklonalnych może w sposób bezpośredni indukować efekt apoptozy w komórkach PBL- B. Natomiast, efektem hamowania PD-1/PD-L1 może więc prowadzić do opracowania nowej, efektywnej opcji w leczeniu pacjentów chorych na PBL-B.
Opis metody Materiał Badaniem zostanie objęta grupa około 140 chorych z rozpoznaną nie leczoną wcześniej przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową. Materiał do badań będzie stanowić krew obwodowa oraz aspiraty szpiku kostnego pobierane w celu izolacji komórek jednojądrzasty. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej Komórki jednojądrzaste będą izolowane w gradiencie gęstości przy użyciu preparatu Biocoll (Biochrome) przez 20 minut przy przyśpieszeniu 700xg. Uzyskane w ten sposób komórki po dwukrotnym przepłukaniu PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ (Biochrome) zostaną policzone w kamerze Neubauera. Żywotność zostanie oceniona przy użyciu testu barwienia z błękitem trypanu (0.4% Trypan Blue Solution, Sigma). Żywotność poniżej 95% będzie kryterium dyskwalifikującym komórki z dalszych badań. Komórki jednojądrzaste w ilości dziesięciu milionów wyizolowane z krwi obwodowej oraz aspiratów szpiku kostnego do izolacji mrna przechowywane będą w ciekłym azocie lub -80 C do czasu dalszych doświadczeń. Izolacja mrna oraz reakcja odwrotnej transkrypcji W celu izolacji całościowego RNA z próbek krwi obwodowej oraz zostanie użyty zestaw QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen) według protokołu producenta. Z każdej próbki 1 µg całościowego RNA będzie przepisany do 20 µl of cdna przy użyciu zestawu QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Do reakcji qrt-pcr będzie użyty1 µl cdna z każdej próbki. Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym z użyciem odwrotnej transkryptazy (Reat-Time qrt-pcr) Do oceny ekspresji wariantów obróbkowych PD-1 oraz PD-L1 zostanie wykonana reakcja qrt-pcr z użyciem protokołu FastStart Universal SYBR Green Master (Roche Diagnostics). Startery dla wariantów obróbkowych zostaną zaprojektowane według sekwencji NM-005018 dla PD-1 oraz NM-014143 dla PD-L1. Jako gen konstytutywny zostanie użyty gen kodujący
dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH). Do przeprowadzenia reakcji zostanie wykorzystany termocykler ABI Prism 7300 Sequence Detector (Applied Biosystems). Badania czynnościowe W badaniach czynnościowych przeprowadzona zostanie hodowla komórek białaczkowych w obecności IL-4 and CD40L charakteryzujących przedział proliferacyjny PBL-B. Rozmrożone komórki jednojądrzaste zawieszone będą w 1ml PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Separacja limfocytów białaczkowych będzie przeprowadzona przy użyciu zestawu MACS antihuman CD19 MicroBeads (MiltenyBiotec) ze wskazaniami producenta. Komórki będą hodowane przez 24h w pożywce RPMI-1640 (Biochrom, Berlin, Germany) uzupełnioną 10% (v/v) surowicą FCS, 50 U/ml penicyliny, 50 µg/ml streptomycyny oraz 100 µg/ml neomycyny z dodaniem lub bez 0.01 ng/ml IL-4 oraz 200 ng/ml CD40L. Po zakończeniu hodowli ekspresja PD-1 zostanie oceniona na poziomie mrna przy użyciu metody qrt-pcr oraz na poziomie białkowym przy użyciu cytometrii przepływowej.
Literatura 1 Caligaris-Cappio F, Ghia P. Novel Insights in Chronic Lymphocytic Leukemia: Are We Getting Closer to Understanding the Pathogenesis of the Disease? J Clin Oncol. J Clin Oncol. 2008; 26: 4497-503. 2 Beyer M, Kochanek M, Darabi K, Popov A, Jensen M, Endl E, Knolle PA, Thomas RK, von Bergwelt-Baildon M, Debey S, Hallek M, Schultze JL. Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine. Blood. 2005; 106: 2018-25. 3 Giannopoulos K, Schmitt M, Kowal M, Wlasiuk P, Bojarska-Junak A, Chen J, Rolinski J, Dmoszynska A. Characterization of regulatory T cells in patients with B- cell chronic lymphocytic leukemia. Oncol Rep. 2008; 20: 677-82. 4 Barber DL, Wherry EJ, Masopust D, Zhu B, Allison JP, Sharpe AH, Freeman GJ, Ahmed R. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006; 439: 682-7. 5 Azuma T, Yao S, Zhu G, Flies AS, Flies SJ, Chen L. B7-H1 is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells. Blood. 2008; 111: 3635-43. 6 Yamamoto R, Nishikori M, Kitawaki T, Sakai T, Hishizawa M, Tashima M, Kondo T, Ohmori K, Kurata M, Hayashi T, Uchiyama T. PD-1-PD-1 ligand interaction contributes to immunosuppressive microenvironment of Hodgkin lymphoma. Blood. 2008; 111: 3220-4.