RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201264 (21) Numer zgłoszenia: 362069 (22) Data zgłoszenia: 07.09.2000 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: 354039 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 07.09.2000, PCT/EP00/08784 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 15.03.2001, WO01/17551 PCT Gazette nr 11/01 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/12 (2006.01) A61K 39/29 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi i HPV 16L1VLP i HPV 18LI VLP (30) Pierwszeństwo: 07.09.1999,GB,9921146.8 (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A., Rixensart,BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: 15.12.2003 BUP 25/03 (72) Twórca(y) wynalazku: Moncef Mohammed Slaoui,King of Prussia,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2009 WUP 03/09 (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. PL 201264 B1 (57) 1. Kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi, znamienna tym, że zawiera: HPV 16 L1 VLP, HPV 18 L1 VLP, wodorotlenek glinu i 3D MPL. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że VLP są formułowane z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości monowalentnego antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że oczyszczone duże ilości VLP 16 i VLP 18 dodano do wodorotlenku glinu dla otrzymania stosunku 2g VLP / g. 4. Kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi, znamienna tym, że składa się z HPV 16 L1, HPV 18 L1, wodorotlenku glinu i 3D MPL.
2 PL 201 264 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi i HPV 16L1VLP i HPV 18L1 VLP. Wynalazek dotyczy nowych formulacji szczepionek przeciwko ludzkiemu papillowirusowi w szczególności do podawania młodzieży. Papillomawirusy są małymi nowotworowymi wirusami DNA, które są wysoce swoiste gatunkowo. Jak dotąd opisano ponad 70 poszczególnych genotypów ludzkich papillomawirusów (HPV). HPV są zazwyczaj swoiste albo dla skóry (np. HPV-1 i -2) albo powierzchni śluzówkowych (np. HPV-6 i -11) i zwykle wywołują nowotwory łagodne (brodawki), które utrzymują się przez kilka miesięcy lub lat. Takie nowotwory łagodne mogą niepokoić dotknięte nimi osoby, ale z reguły nie stanowią zagrożenia życia, z kilkoma wyjątkami. Niektóre HPV są również związane z rakami. Najsilniejszy związek między HPV i rakiem ludzkim jest ten, który istnieje między HPV-16 i HPV-18 a rakiem szyjki macicy. Rak szyjki macicy jest najbardziej rozpowszechnionym nowotworem złośliwym w krajach rozwijających się, z co roku występującymi na świecie około 500 000 nowymi przypadkami. Aktywne zwalczanie najważniejszych zakażeń HPV-16, a nawet ustalonych raków zawierających HPV-16, jest technicznie wykonalne za pomocą szczepionek. W celu dokonania przeglądu perspektyw profilaktycznych i terapeutycznych szczepień przeciwko HPV-16 patrz Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306 i Hagenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556,559-564. Innymi szczególnie interesującymi serotypami HPV są 31, 33 i 45. Obecnie za pomocą systemów klonowania w bakteriach, a ostatnio za pomocą amplifikacji techniką PGR wyizolowano i scharakteryzowano różne typy HPV. Organizację genomów HPV określono na podstawie porównania z dobrze scharakteryzowanym bydlęcym papillowirusem typu l (BPV1). Choć zdarzają się drobne różnice, wszystkie opisane genomy HPV mają co najmniej siedem genów wczesnych, E1 do E7 i dwa geny późne, L1 i L2. Ponadto region regulatorowy powyżej niesie sekwencje regulatorowe, które wydają się kontrolować najbardziej transkrypcyjne zdarzenia genomu HPV. Geny E1 i E2 są zaangażowane odpowiednio w replikację i kontrolę transkrypcji wirusa i często są rozrywane przez integrację wirusową. E6 i E7 oraz według ostatnich doniesień również E5 są zaangażowane w transformację wirusa. W HPV związanych z rakiem szyjki macicy, takich jak HPV 16 i 18, proces onkogenny rozpoczyna się po integracji DNA wirusa. Integracja powoduje inaktywację genów kodujących kapsydowe białka L1 i L2 i ciągłe instalowanie nadekspresji dwóch wczesnych białek E6 i E7, co prowadzi do stopniowej utraty prawidłowego różnicowania komórkowego i rozwoju raka. Rak szyjki macicy jest powszechny u kobiet i rozwija się przez pośredni stan przedrakowy do raka inwazyjnego, który często prowadzi do śmierci. Stany pośrednie choroby są znane jako śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy i są stopniowane od I do III zgodnie ze zwiększającym się nasileniem. Klinicznie zakażenie HPV kobiecego układu odbytowo-płciowego manifestują się jako kłykcina płaska szyjki, której cechą charakterystyczną jest koilocytoza, odziaływująca głównie na komórki powierzchniowe i pośrednie szyjkowego łuskowatego nabłonka. Koilocyty, które są konsekwencją efektu cytopatycznego wirusa, pojawiają się jako komórki wielojądrzaste z okołojądrową przezroczystą obwódką. Nabłonek jest pogrubiony przez nienormalną keratynizację odpowiedzialną za brodawkowaty wygląd zmian chorobowych. Takie kłykciny płaskie, gdy są dodatnie dla serotypów HPV 16 lub 18, są czynnikami wysokiego ryzyka rozwoju w kierunku śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy (GIN) i raka in situ (CIS), które są uważane za prekursory zmian chorobowych inwazyjnego raka szyjki macicy. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 96/19496 ujawniono odmiany białek E6 i E7 ludzkiego papilliomawirusa, zwłaszcza białka fuzyjne E6/E7 z delecją w obu białkach E6 i E7. Te delecyjne białka fuzyjne uważa się za immunogenne. Szczepionki na bazie L1 HPV ujawniono w WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 i WO 94/05792. Taka szczepionka może zawierać antygen L1 jako monomer, kapsomer lub cząstkę wirusopodobną. Takie cząstki mogą dodatkowo zawierać białka L2. Szczepionki na bazie L2 opisano na przykład w WO 93/00436. Inne szczepionki HPV są oparte na białkach wczesnych, takich jak E7 lub białkach fuzyjnych, takich jak L2-E7. Istnieje potrzeba dostarczania skutecznych szczepionek w celu zapobiegania chorobom, na które szczególnie podatna jest młodzież.
PL 201 264 B1 3 Kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi według wynalazku zawiera: HPV 16 L1 VLP, HPV 18 L1 VLP, wodorotlenek glinu i 3D MPL. Korzystnie VLP w szczepionce według wynalazku są formułowane z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości monowalentnego antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu. Bardziej korzystnie oczyszczone duże ilości VLP 16 i VLP 18 dodano do wodorotlenku glinu dla otrzymania stosunku 2g VLP / g. W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja szczepionki składająca się z HPV 16 L1, HPV 18 L1, wodorotlenku glinu i 3D MPL. Wynalazek dotyczy również HPV 16 L1 VLP sformułowanego z alumem (wodorotlenkiem glinu)/3d-mpl z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości monowalentnego antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu lub AlPO 4. Ponadto w zakres wynalazku wchodzi również HPV 18 L1 VLP sformułowany z alumem (wodorotlenkiem glinu)/3d-mpl z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu lub AlPO 4. Odpowiedzi immunologiczne można generalnie podzielić na dwie zasadnicze kategorie, którymi są odpowiedź humoralna oraz za pośrednictwem komórek (tradycyjnie charakteryzowana odpowiednio przez mechanizmy ochrony z wytworzeniem przeciwciał i mechanizm komórkowy ochrony). Te kategorie odpowiedzi nazwano odpowiedzią typu TH1 (odpowiedź za pośrednictwem komórek) i odpowiedzią immunologiczną typu TH2 (odpowiedź humoralna). Zasadnicze odpowiedzi immunologiczne typu TH1 charakteryzują się wytwarzaniem swoistych antygenowo, ograniczonych do haplotypu cytotoksycznych limfocytów T i odpowiedzi naturalnych komórek zabójców. U myszy odpowiedzi typu TH1 charakteryzują się często wytwarzaniem przeciwciał podtypu IgG2a, gdy tymczasem u ludzi odpowiadają one przeciwciałom typu IgG1. Odpowiedzi immunologiczne typu TH2 charakteryzują się wytwarzaniem szerokiego zakresu izotypów immunoglobulin, w tym IgG1 u myszy. Można uważać, że siłą napędzającą rozwój tych dwóch typów odpowiedzi immunologicznej są cytokiny. Wysokie poziomy cytokin typu TH1 sprzyjają wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej na dany antygen za pośrednictwem komórek, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu TH2 sprzyjają wywoływaniu humoralnej odpowiedzi immunologicznej na antygen. Rozróżnienie typów odpowiedzi immunologicznej TH1 i TH2 nie jest bezwzględne. W rzeczywistości dany osobnik będzie wykazywał odpowiedź immunologiczną opisywaną jako głównie TH1 lub głównie TH2. Jednakże często jest wygodnie rozważać rodziny cytokin w kategoriach opisanych dla klonów limfocytów T mysich CD4 +ve przez Mosmann i Coffman (Mosmann, T. R. i Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie odpowiedzi typu TH1 są związane z produkcją cytokin INF-γ przez limfocyty T. Inne cytokiny, często wiązane bezpośrednio z indukcją odpowiedzi immunologicznej typu TH1, nie są wytwarzane przez komórki T, tak jak IL-12. Kontrastuje z tym fakt, że odpowiedzi typu TH2 są związane z sekrecją IL-4, IL-5, IL-6, IL- oraz czynnika martwicy nowotworu-β-β (TNF-(β). Wiadomo, że pewne adiuwanty szczepionkowe nadają się szczególnie do stymulacji odpowiedzi cytokinowej typu TH1 albo TH2. Tradycyjnie najlepsze wskaźniki równowagi TH1:TH2 odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu lub infekcji obejmują bezpośredni pomiar produkcji cytokin TH1 i TH2 przez limfocyty T in vitro po ponownej stymulacji antygenem i/lub pomiar (przynajmniej u myszy) stosunku odpowiedzi przeciwciał IgG1:IgG2a swoistych dla antygenu. Adiuwantem typu TH1 jest zatem ten, który stymuluje wyizolowane populacje limfocytów T do wytwarzania wysokiego poziomu cytokin typu TH1 w wyniku restymulacji antygenem in vitro oraz wywołuje odpowiedź immunoglobulin swoistych dla antygenu, związaną z izotypem typu TH1. Adiuwanty, które są zdolne do selektywnego stymulowania odpowiedzi komórkowej TH1 opisano w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 94/00153 i WO 95/17209. 3 de-o-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) jest jednym z takich adiuwantów. Jest on znany z patentu GB-V2220211 (Ribi). Chemicznie jest on mieszaniną 3 de-o-acylowanego monofosforylolipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami i jest wytwarzany przez Ribi Immunochem, Montana. Korzystną formę 3 de-o-acylowanego monofosforylolipidu A ujawniono w patencie europejskim EP-0689454B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA). Korzystnie cząstki 3D-MPL są na tyle małe, aby mogły być sterylnie filtrowane przez membranę 0,22 μm (jak opisano w patencie europejskim EP-0689454). 3D-MPL będzie zawarty w kompozycji
4 PL 201 264 B1 w ilości w zakresie μg -0 μg, korzystnie 25-50 μg na dawkę, w której antygen będzie zazwyczaj obecny w zakresie 2-50 μg na dawkę. W kompozycji szczepionki według wynalazku obecny jest również nośnik. Nośnikiem może być sól glinu, taka jak fosforan glinu lub wodorotlenek glinu. Antygeny kompozycji szczepionki według wynalazku łączone są z 3D-MPL i alumem. Typowo w szczepionce do podawania ludziom, 3D-MPL będzie obecny w szczepionce w zakresie 1 μg -200 μg, na przykład -0 μg, korzystnie μg - 50 μg na dawkę. W jednym z korzystnych wykonań antygen HPV w kompozycji szczepionki według wynalazku zawiera L1, główne białko kapsydu HPV, i ewentualnie białko L2, szczególnie z HPV 16 i/lub HPV 18. W tym wykonaniu korzystną formą białka L1 jest skrócone białko L1. Korzystnie L1, ewentualnie fuzja L1-L2, przybiera formę cząstek wirusopodobnych (VLP). L1 można połączyć z innym białkiem HPV, w szczególności E7, co daje fuzję białkową L1-E7. Szczególnie korzystne są chimerowe VLP, zawierające L1-E lub L1-L2-E. Białka według wynalazku korzystnie wyrażane są w E. coli. W korzystnym wykonaniu białka są wyrażane wraz z ogonem histydynowym, zawierającym od 5 do 9, korzystnie sześć reszt histydyny. Są one pożyteczne ułatwiając oczyszczanie. Opis wytwarzania takich białek jest w pełni przedstawiony w złożonym jednocześnie zgłoszeniu patentowym w Wielkiej Brytanii numer GB 9717953.5. Antygen HPV w kompozycji szczepionki może zostać zaadsorbowany na. W jednym z korzystnych aspektów kompozycja szczepionki wynalazku jest szczepionką poliwalentną, na przykład szczepionką cztero- lub pięciowalentną. Kompozycje według niniejszego wynalazku bardzo skutecznie indukują odporność ochronną, nawet przy bardzo niskich dawkach antygenu (np. zaledwie 5 μg rgd2t). Dostarczają doskonałej ochrony przeciw głównej infekcji i stymulują, co korzystne, zarówno specyficzną humoralną odpowiedź immunologiczną (przeciwciała neutralizujące), jak i odpowiedź immunologiczną, w której pośredniczą komórki efektorowe (DTH). Wynalazek w swym kolejnym aspekcie, dostarcza kompozycji szczepionki, jak tu opisana, do stosowania w medycynie, a szczególnie w leczeniu lub profilaktyce infekcji ludzkim papillomawirusem. Szczepionka według wynalazku będzie zawierała ilość antygenów zapewniającą ochronną odpowiedź immunologiczną i może być wytworzona za pomocą konwencjonalnych technik. Wytwarzanie szczepionek jest opisane ogólnie w Pharmaceutical Biotechnology, Tom 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, wydane przez Powell i Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, wydane przez Voller i wsp., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Zamykanie w liposomach zostało opisane, na przykład, przez Fullerton, patent US-4235877. Dołączanie białek do makrocząsteczek jest ujawnione, na przykład, przez Likhite, patent US-4372945 i przez Armor i wsp., patent US-4474757. Ilość białka w danej dawce szczepionki dobrano jako ilość, która wywołuje ochronną odpowiedź immunologiczną bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych u typowych osób zaszczepionych. Ilość ta będzie się zmieniać w zależności od zastosowania konkretnego immunogenu. Przewiduje się ogólnie, że każda dawka będzie zawierać 1-00 μg białka, korzystnie 2-0 μg, najkorzystniej 4-40 μg. Ilość optymalna danej szczepionki może zostać określona w typowych badaniach obejmujących oznaczenie miana przeciwciał i innych odpowiedzi u pacjentów. Pacjenci mogą otrzymać dawkę przypominającą po około 4 tygodniach po szczepieniu początkowym. Obok szczepienia osób podatnych na zakażenia HPV kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do leczenia, immunoterapeutycznie, pacjentów cierpiących na takie infekcje wirusowe. Jeśli jest to konieczne, można dodać inne antygeny, w dowolnej kolejności, aby utworzyć poliwalentne kompozycje szczepionek, jak tu opisano. Następujące przykłady ilustrują, ale nie ograniczają wynalazku. P r z y k ł a d 1 Porównawcza immunogenność HPV Ags/HBs/gD w szczepionkach monowalentnych albo skojarzonych zawierających AS04 Wstęp Badania immunogenności przeprowadzono u myszy Balb/C przy zastosowaniu czterech różnych antygenów: 1. Cząstki wirusopodobne HPV16 L1 (VLP-16) 2. Cząstki wirusopodobne HPV18 L1 (VLP18)
PL 201 264 B1 5 3. antygen gd z HSV-2 4. HBsAg sformułowane z alumem/3d-mpl (AS04) z zastosowaniem monowalentnego antygenu w dużej ilości antygenu albo 3D-MPL wstępnie zaadsorbowanych na lub AlPO 4. Kompozycje z 3D-MPL/ są określane jako AS04D, podczas gdy kompozycje w oparciu o 3D-MPL/AlPO 4 są określane jako AS04C. Testowano następujące szczepionki: 1. VLP16 + VLP18 AS04D; 2. gd AS04D, 3. HBs AS04C i oceniano możliwość łączenia tych szczepionek. Celem doświadczeń było porównanie immunogenności dwóch różnych kombinacji AS04 wytworzonych z: 1. VLP16 + VLP18 i gd. 2. VLP16 + VLP18 i gd oraz HBsAg Protokół eksperymentalny jest w pełni opisany w części Materiały i Metody. W skrócie, grupy myszy immunizowano domięśniowo dwukrotnie w odstępach 3 tygodni kompozycjami w oparciu o różne Ag. Odpowiedź przeciwciał na VLPs, gd i HBs Ag oraz profil izotypowy indukowany przez szczepienie śledzono w teście ELISA w dniu 14 post II. W tym samym punkcie czasowym analizowano wytwarzanie cytokin (IFNγ/IL5) ) po restymulacji in vitro komórek śledziony antygenami VLPs, gd i HBs. Materiały i metody Formulacja Formulacja kompozycji VLP16, VLP18, gd i HBs sformułowano z 3D-MLP na soli glinu. Użyte składniki Składnik Stężenie Bufor HPV 16 VLP 560 μg/ml Tris 20 mm/nacl 500 mm HPV 18 VLP 550 μg/ml NaCl 500 mm/napo 4 20 mm 380 ng/ml H 2 O HBs 1219 μg/ml PO 4 mm/nacl 150 mm gd 443 μg/ml PBS ph 7,4 3D-MPL 1170 μg/ml Woda do iniekcji AlPO 4 5 mg/ml NaCl 150 mm Adsorpcja a) Adsorpcja VLP Oczyszczoną partię VLP 16 i VLP 18 dodaje się do tak aby otrzymać stosunek 2 μg VLP/ μg. Mieszaninę przechowuje się w temperaturze między 2-8 C do przygotowania końcowej formulacji. b) Adsorpcja gd 2 μg gd miesza się z μg. Mieszaninę przechowuje się w temperaturze między 2-8 C do przygotowania końcowej formulacji. c) Adsorpcja HBs 2 μg Hbs miesza się z μg AlPO 4. Mieszaninę przechowuje się w temperaturze między 2-8 C do przygotowania końcowej formulacji. d) Adsorpcja 3D-MPL 5 μg 3D-MPL miesza się z μg. Mieszaninę przechowuje się w temperaturze między 2-8 C do przygotowania końcowej formulacji. 5 μg 3D-MPL miesza się z μg AlPO 4. Mieszaninę przechowuje się w temperaturze między 2-8 C aż do przygotowania końcowej formulacji.
6 PL 201 264 B1 Formulacja H 2 O i NaCl miesza się ( x zatężony) i po minutach mieszania w temperaturze pokojowej dodaje się różne składniki: zaadsorbowany antygen, zaadsorbowany 3D-MPL i (patrz tabela poniżej). Wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez minut i przechowuje w 4 C aż do użycia do iniekcji. Antygen (y) Immunostymulatory Nośnik Grupa Typ μg Typ μg Typ μg A gd VLP16 VLP18 2 2 2 3D-MPL 5 B gd VLP16 HPV18 HBs 2 2 2 2 3D-MPL 5 AlPO 4 C gd 2 3D-MPL 5 30 D VLP16 VLP18 2 2 3D-MPL 5 Al.(OH) 3 20 E HBs 2 3D-MPL 5 AlPO 4 30 Serologia myszy Serologia anty-vlp16 i anty-vlp18 Ocenę ilościową przeciwciał anty-vlp16 i anty-vlp18 przeprowadzono przy zastosowaniu testu ELISA używając jako antygeny opłaszczające VLP16 503/1 (20/12/99) i VLP18 504/2 (25//99F). Zastosowano 50 μl roztworu antygenu i przeciwciała na studzienkę. Antygen rozcieńczono do stężenia końcowego 0,5 μg/ml w PBS i adsorbowano przez noc w 4 C do ścianek studzienek 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dania). Płytki inkubowano następnie przez 1 godzinę w 37 C z PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej. Dwukrotne rozcieńczenia surowicy (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/400) w buforze wysycającym dodano do opłaszczonych VLP płytek i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Płytki przemyto czterokrotnie PBS 0,1% Tween 20 i do każdej studzienki dodano skoniugowane z biotyną anty-mysie Ig (Amersham, UK) rozcieńczone 1/1500 w buforze wysycającym i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Po etapie przemywania, dodano kompleks streptawidyna-biotynylowana peroksydaza (Amersham, UK) rozcieńczony 1/00 w buforze wysycającym na dodatkowe 30 minut w 37 C. Płytki przemyto jak wyżej i inkubowano 20 minut z 0,04% roztworem o-fenylenodiaminy (Sigma), 0,03% H 2 O 2 w 0,05 M buforze cytrynianowym ph 4,5 z 0,1% Tween 20. Reakcję zatrzymano 2N H 2 SO 4 i odczytano przy 490/630 nm. Miana ELISA obliczono względem odnośnika przy użyciu SoftmaxPro (stosując równanie z czterema parametrami) i wyrażono jako EU/ml. Odpowiedź anty-gd Ocenę ilościową przeciwciał anty-gd przeprowadzono przy zastosowaniu testu ELISA używając gd (gd 43B318) jako antygenu opłaszczającego. Zastosowano 50 μl roztworu antygenu i przeciwciała na studzienkę. Antygen rozcieńczono do stężenia końcowego 1 μg/ml w PBS i zaadsorbowano przez noc w 4 C do ścianek studzienek 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dania). Płytki inkubowano następnie przez 1 godzinę w 37 C z PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej i 0,1% Tween 20 (bufor wysycający 0 μl/studzienkę). Dwukrotne rozcieńczenia surowicy (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/0) w buforze wysycającym dodano do opłaszczonych gd płytek i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Płytki przemyto czterokrotnie PBS
PL 201 264 B1 7 z 0,1% Tween 20 i do każdej studzienki dodawano skoniugowane z biotyną anty-mysie Ig, IgGl, IgG2a, IgG2b lub Ig (Amersham, UK) rozcieńczone 1/00 w buforze wysycającym i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Po etapie przemywania, dodano kompleks streptawidyna-biotynylowana peroksydaza (Amersham, UK) rozcieńczony 1/00 w buforze wysycającym na dodatkowe 30 minut w 37 C. Płytki przemyto jak wyżej i inkubowano 20 minut z 0,04% roztworem o-fenylenodiaminy (Sigma), 0,03% H 2 O 2 w 0,05 M buforze cytrynianowym ph 4,5 z 0,1% Tween 20. Reakcję zatrzymano 2N H 2 SO 4 i odczytano przy 490/630 nm. Miana ELISA obliczono względem odnośnika przy użyciu SoftmaxPro (stosując równanie z czterema parametrami) i wyrażono jako EU/ml. Serologia anty-hbs Ocenę ilościową przeciwciał anty-hbs przeprowadzono przy zastosowaniu testu ELISA używając HBs (Hep 286) jako antygenu opłaszczającego. Zastosowano 50 μl roztworów antygenu i przeciwciała na studzienkę. Antygen rozcieńczono do stężenia końcowego 1 μg/ml w PBS i zaadsorbowano przez noc w 4 C na ściankach studzienek 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dania). Płytki inkubowano następnie przez 1 godzinę w 37 C z PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej i 0,1% Tween 20 (bufor wysycający). Dwukrotne rozcieńczenia surowicy (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/0) w buforze wysycającym dodano do opłaszczonych HBs płytek i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Płytki przemyto czterokrotnie PBS z 0,1% Tween 20 i do każdej studzienki dodano skoniugowane z biotyną anty-mysie Ig (Amersham, UK) rozcieńczone 1/1500 lub IgG1, IgG2a, IgG2b (IMTECH, USA) rozcieńczone odpowiednio 1/4000, 1/8000, 1/4000, w buforze wysycającym i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Po etapie przemywania, dodano kompleks streptawidyna-biotynylowana peroksydaza (Amersham, UK) rozcieńczony 1/00 w buforze wysycającym na dodatkowe 30 minut w 37 C. Płytki przemyto jak wyżej i inkubowano 20 minut z 0,04% roztworem o-fenylenodiaminy (Sigma), 0,03% H 2 O 2 w 0,05 M buforze cytrynianowym ph 4,5 z 0,1% Tween 20. Reakcję zatrzymano 2N H 2 SO 4 i odczytano przy 490/630 nm. Miana ELISA obliczono względem odnośnika przy użyciu SoftmaxPro (stosując równanie z czterema parametrami) i wyrażono jako EU/ml. Wytwarzanie cytokin Dwa tygodnie po drugiej immunizacji myszy zabito, pobrano aseptycznie śledziony i zgromadzono je w pule. Otrzymano zawiesiny komórkowe w pożywce RPMI 1640 (GIBCO) zawierającej 2 mm L-glutaminę, antybiotyki, 5x -5 M 2-merkaptoetanol i 5% płodową surowicę cielęcą. Komórki hodowano przy końcowym stężeniu 5x 6 komórek/ml w 1 ml w 24-sudzienkowych płaskodennych płytkach z różnymi stężeniami (-1 μg/ml) każdego Ag (antygenu VLPs, gd lub HBs). Supernatanty zebrano 96 godzin później i zamrażono do czasu testowania pod kątem obecności IFNγ i IL5 przy zastosowaniu testu ELISA. IFNγ (Genzyme) Ocenę ilościową IFNγ przeprowadzono w teście ELISA stosując odczynniki z firmy Genzyme. Roztwór próbek i przeciwciała zastosowano w objętości 50 μl na studzienkę. 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania (Maxisorb Immunoplate, Nunc, Dania) opłaszczono przez noc w 4 C 50 μl chomiczego anty-mysiego IFNγ rozcieńczonego 1,5 μg/ml w buforze węglanowym ph 9,5. Płytki inkubowano następnie przez 1,5 godziny w 37 C z 0 μl PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej i 0,1% Tween 20 (bufor wysycający). Dwukrotne rozcieńczenia supernatantu ze stymulacji in vitro (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/2) w buforze wysycającym dodano do opłaszczonych anty-ifnγ płytek i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Płytki przemyto 4 razy PBS z 0,1% Tween 20 (bufor do przemywania) i do każdej studzienki dodano skoniugowane z biotyną kozie anty-mysie IFNγ rozcieńczone w buforze wysycającym do końcowego stężenia 0,5 ng/ml i inkubowano przez 1 godzinę w 37 C. Po etapie przemywania, dodano koniugat AMDEX (Amersham) rozcieńczony 1/000 w buforze wysycającym na 30 minut w 37 C. Płytki przemyto jak wyżej i inkubowano z 50 μl TMB (Biorad) przez minut. Reakcję zatrzymano 0,4 N H 2 SO 4 i odczytano przy 450/630 nm. Stężenia obliczono przy użyciu krzywej standardowej stosując SoftmaxPro (równanie z czterema parametrami) i wyrażono jako pg/ml. IL5 (Pharmingen) Ocenę ilościową IL5 przeprowadzono przy zastosowaniu testu ELISA używając odczynników z firmy Pharmingen. Roztwór próbek i przeciwciała zastosowano w objętości 50 μl na studzienkę. 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dania) opłaszczono przez noc w 4 C 50 μl szczurzego przeciwciała anty-mysia IL-5 rozcieńczonego do 1 μg/ml w buforze węglanowym ph 9,5. Płytki inkubowano następnie przez 1 godzinę w 37 C z 0 μl PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej i 0,1% Tween 20 (bufor wysycający). Dwukrotne rozcieńczenia su-
8 PL 201 264 B1 pernatantu ze stymulacji in vitro (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/2) w buforze wysycającym dodano do opłaszczonych anty-il-5 płytek i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Płytki przemyto 4 razy PBS z 0,1% Tween 20 (bufor do przemywania) i do każdej studzienki dodano skoniugowane z biotyną szczurze anty-mysie IL5 rozcieńczone w buforze wysycającym do końcowego stężenia 1 μg/ml i inkubowano przez 1,5 godziny w 37 C. Po etapie przemywania, dodano koniugat AMDEX (Amersham) rozcieńczony 1/000 w buforze wysycającym na 30 minut w 37 C. Płytki przemyto jak wyżej i inkubowano z 50 μl TMB (Biorad) przez minut. Reakcję zatrzymano 0,4 N H 2 SO 4 i odczytano przy 450/630 nm. Stężenia obliczono przy użyciu krzywej standardowej (zrekombinowana mysia IL-5) stosując SoftmaxPro (równanie z czterema parametrami) i wyrażono jako pg/ml. Grupy Grupy po myszy Balb/C immunizowano domięśniowo następującymi formulacjami: T a b e l a 1 Grupy i formulacje Grupa A B C Formulacja VLP16 2 μg / VLP18 2 μg / gd 2 μg / 3D-MPL 5 μg / 50 μg VLP16 2 μg / VLP18 2 μg / HBs 2 μg / gd 2 μg / 3D-MPL 5 μg / 40 μg / AlPO 4 μg gd 2 μg / 3D-MPL 5 μg / 50 μg D VLP16 2 μg / VLP18 2 μg / 3D-MPL 5 μg / E HBs 2 μg / 3D-MPL 5 μg / AlPO 4 μg / 40 μg Szczegóły formulacji są opisane powyżej w części Materiały i Metody Wyniki 1. Serologia a) Odpowiedź anty-vlp16: Odpowiedzi humoralne (Ig) mierzono w teście ELISA stosując VLP16 503-1 (20/12/99) jako antygen opłaszczający. Surowicę zanalizowano dnia 14 post II. Na fig. 1 pokazano odpowiedzi przeciwciał Ig anty-vlp16 mierzone w poszczególnych surowicach dnia 14 post II. Miana anty-vlp16 otrzymane po immunizacji kombinacją VLPs, gd i Ag HBs (Grupa B) były nieco niższe niż otrzymane bądź z kombinacją VLPs i gd (Grupa A) bądź monowalentną formulacją VLPs (grupa D) (GMT wynoszące odpowiednio 27578 versus 485 EU/ml versus 44448 EU/ml). Przed analizą statystyczną wobec każdej populacji zastosowano test T-Grubbs dla wykluczenia danych. Dwie nieodpowiadające myszy w grupach A i D wyeliminowano z analizy. Wykazano, że stosując test Student Newman Keuls zaobserwowane między grupami różnice nie są statystycznie istotne. b) Odpowiedź anty-vlp18: Odpowiedzi humoralne (Ig) mierzono w teście ELISA stosując VLP18 504-2 (25//99) jako antygen opłaszczający. Surowicę zanalizowano dnia 14 post II. Na fig. 2 pokazano odpowiedzi przeciwciał Ig anty-vlp18 mierzone w poszczególnych surowicach z dnia 14 post II. Miana anty-vlp18 otrzymane po immunizacji kombinacją VLPs, gd i Ag HBs (Grupa B) były tego samego rzędu wielkości co miana otrzymane bądź dla kombinacji VLPs i gd (Grupa A) bądź dla monowalentnej formulacji VLPs (grupa D) (GMT wynoszące odpowiednio 56078 versus 88786 EU/ml versus 76991 EU/ml). Przed analizą statystyczną wobec każdej populacji zastosowano test T-Grubbs w celu wykluczenia danych. Dwie nieodpowiadające myszy w grupach A i D wyeliminowano z analizy. Wykazano, że różnice te nie są statystycznie istotne przy zastosowaniu jednokierunkowej analizy wariancji. c) Odpowiedź anty-gd: Odpowiedzi humoralne (I g i izotypy) mierzono przy zastosowaniu testu ELISA stosując gd jako antygen opłaszczający. Surowicę analizowano 14 dnia post II.
PL 201 264 B1 9 Na fig. 3 pokazano odpowiedzi przeciwciał anty-gd mierzone w poszczególnych surowicach z 14 dnia post II. Odnośnie do odpowiedzi anty-gd zaobserwowano niewielkie zmniejszenie dla GMT otrzymanego z kombinacją VLPs/ gd/hbs (Grupa B) w porównaniu z samym gd (Grupa C) bądź kombinacją VLPs/gD (grupa A) (GMT wynoszące 18631 versus 32675 EU/ml versus 27058 EU/ml). Przed analizą statystyczną wobec każdej populacji zastosowano test T-Grubbs dla wyeliminowania danych. Dwie nieodpowiadające myszy w grupach A i D wyeliminowano z analizy. Przeprowadzono jednokierunkową analizę wariancji dla mian anty-gd po przekształceniu logarytmicznym danych post II. Nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic pomiędzy trzema kompozycjami. Analizowany rozkład izotypowy w połączonych w pule surowicach był następujący: Rozkład izotypowy (%) IgG1 IgG2a IgG2b Grupa A 96 3 2 Grupa B 96 3 2 Grupa C 97 1 1 Nie zaobserwowano znaczących różnic w profilu izotypowym indukowanym przez te trzy kompozycje: w tych trzech grupach indukowana była głównie odpowiedź IgG1 (96-97% IgG1) jak przedstawiono w tabeli poniżej. d) Odpowiedź anty-hbs: Odpowiedzi humoralne (Ig i izotypy) zmierzono przy zastosowaniu testu ELISA wykorzystując HBsAg (Hep286) jako antygen opłaszczający. Zanalizowano surowicę z dnia 14 post II. Na fig. 4 pokazano odpowiedzi przeciwciał anty-hbs zmierzone w poszczególnych surowicach dnia 14 post II. Nieco niższą odpowiedź anty-hbs obserwuje się dla kombinacji z grupy B zawierającej antygeny VLPs, gd i HBs w porównaniu z samym HBs (grupa E) (GMT wynoszące 28996 EU/ml versus 20536 EU/ml). Przeprowadzono jednokierunkową analizę wariancji dla mian anty-hbs po przekształceniu logarytmicznym danych post II. Nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych między grupą B (VLP/HBs/gD) versus grupa E (HBs AS04C) przy zastosowaniu testu Student Newman Keuls. Analizowany rozkład izotypowy w połączonych w pule surowicach był następujący i nie wykazywał różnic pomiędzy 2 grupami z proporcją IgG2a zachowaną w szczepionce skojarzonej. Rozkład izotypowy (%) IgG1 IgG2a IgG2b Grupa B 54 24 21 Grupa E 56 23 21 2. Odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem limfocytów Odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem komórek (limfoproliferacja, wytwarzanie IFNγ/IL5) oceniono dnia 14 post II po restymulacji komórek in vitro antygenami VLPs, gd lub HBs. Dla każdej grupy myszy utworzono pule z 5 narządów. Procedura eksperymentalna jest w pełni opisana w części Materiały i Metody. 3. Wytwarzanie cytokin a) Restymulacja in vitro przez VLP16 i VLP18 Na fig. 5 pokazano wytwarzanie cytokin monitorowane w komórkach śledziony po 96 godz. restymulacji in vitro przez VLP16. Na fig. 6 pokazano wytwarzanie cytokin monitorowane w komórkach śledziony po 96 godzinach restymulacji in vitro przez VLP18. Stosując do restymulacji μg i 1 μg Ag dla żadnego z antygenów VLP nie zaobserwowano wyraźnego wpływu wielkości dawki na wytwarzanie obydwu cytokin.
PL 201 264 B1 Dla wszystkich kompozycji zaobserwowano wyraźny profil TH1. T a b e l a 2 Stosunek IFN-y/IL-5 po restymulacji in vitro przez VLP16 i VLP18. Stosunek IFN / IL-5 Grupa A Grupa B Grupa D VLP16 μg/ml 5,2 8,9 11,8 VLP16 1 μg/ml 15,1 14,3 16,5 Stosunek IFN / IL-5 Grupa A Grupa B Grupa D VLP18 μg/ml 19,6 11,1 16,1 VLP18 1 μg/ml 23,2 14,3 18,2 b) Restymulacja in vitro przez gd Na fig. 7 pokazano wytwarzanie cytokin monitorowane w komórkach śledziony po 96 godzinach restymulacji in vitro przez antygen gd. Nie zaobserwowano wyraźnego wpływu wielkości dawki przy zastosowaniu dawki μg i 1 μg Ag do restymulacji. IFN-γ jest wytwarzany w znacznie wyższych stężeniach w porównaniu z IL-5 (tabela 3) wskazując na wyraźny profil TH-1 odpowiedzi immunologicznej we wszystkich ocenianych grupach (szczepionka monowalentna versus skojarzona). T a b e l a 3 Stosunek IFN-γ/IL-5 po restymulacji in vitro przez gd. Stosunek IFN / IL-5 Grupa A Grupa B Grupa C gd μg/ml 6,2 7,2 3,1 gd 1 μg/ml 6,2 11,2 2,3 c) Restymulacja in vitro przez HBs Na fig. 8 pokazano wytwarzanie cytokin monitorowane w komórkach śledziony po 96 godzinach restymulacji in vitro przez antygen HBs. Dla grupy B obserwowano znaczący poziom wytwarzania IFN-γ, ale nie IL5. Jak pokazano w tabeli 2 zaobserwowano wyższy poziom wytwarzania IFN-γ dla grupy E w porównaniu z grupą B. Jednakże wyższe wartości tła dla IFNγ zaobserwowano w grupie E (monowalentna HBs) dla kontroli bez antygenu przy restymulacji. Bardzo wysoki stosunek IFN-γ/IL-5 zaobserwowano dla szczepionki monowalentnej wskazując, że indukowana jest mocna odpowiedź TH1. Podobnie, wysoki stosunek IFN-γ/IL-5 zmierzono dla szczepionki skojarzonej potwierdzając zdolność tej kompozycji do indukowania również odpowiedzi TH-1. T a b e l a 4 Stosunek IFN-γ/IL-5 po restymulacji in vitro przez HBs Stosunek IFN / IL5 Grupa B Grupa E HBs μg/ml 15,8 65,3 HBs 1 μg/ml 7,6 67,6 Wnioski Wpływ kombinacji Ag VLPs/gD lub Ag VLPs/gD/HBs sformułowanych w AS04 na immunogenność oceniano na myszach Balb/C: Odnośnie do analizy serologicznej, nie zaobserwowano ujemnego wpływu kombinacji Ag na serologię anty-vlps, anty-gd i anty-hbs. Kombinacja antygenów VLPs i gd lub VLPs, gd i HBs nie ma ujemnego wpływu na profil izotypowy i odpowiedzi przeciwciał wykazywane przez szczepionki monowalentne gd i HBs. Przy ocenie cytokin, profil TH1 (stosunek IFN-γ/IL-5) obserwowany dla każdej szczepionki monowalentnej potwierdzono w grupach, gdzie stosowano szczepionki skojarzone.
PL 201 264 B1 11 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi, znamienna tym, że zawiera: HPV 16 L1 VLP, HPV 18 L1 VLP, wodorotlenek glinu i 3D MPL. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że VLP są formułowane z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości monowalentnego antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że oczyszczone duże ilości VLP 16 i VLP 18 dodano do wodorotlenku glinu dla otrzymania stosunku 2g VLP / g. 4. Kompozycja szczepionki przeciwko ludzkiemu papillowirusowi, znamienna tym, że składa się z HPV 16 L1, HPV 18 L1, wodorotlenku glinu i 3D MPL. 5. HPV 16 L1 VLP, znamienny tym, że jest sformułowany z alumem / 3D-MPL z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości monowalentnego antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu lub AlPO 4. 6. HPV 18 L1 VLP, znamienny tym, że jest sformułowany z alumem / 3D-MPL z wykorzystaniem wstępnie zaadsorbowanych dużych ilości monowalentnego antygenu lub 3D MPL na wodorotlenku glinu lub AlPO 4. Rysunki
12 PL 201 264 B1
PL 201 264 B1 13
14 PL 201 264 B1
PL 201 264 B1 15
16 PL 201 264 B1
PL 201 264 B1 17
18 PL 201 264 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.