Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006

Transkrypt

1 Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus 25 października 2006 Dr Tobias J. Tuthill Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytet Leeds Leeds LS2 9JT

2 1. Ogólne streszczenie W powtarzanych dwukrotnie testach zawiesinowych, ekspozycja na środek dezynfekujący GAMA Healthcare Clinell badana w stężeniu 50%, stale prowadziła do redukcji miana Feline calicivirus o przynajmniej 4 jednostki logarytmiczne (redukcja 99.99%).

3 2. Wstęp Norowirusy (np. Norwalk virus) są częstą przyczyną zapalenia żołądka i jelit u ludzi. Są one przenoszone za pośrednictwem fekaliów i skażonych produktów spożywczych. Infekcja w populacjach narażonych na bliski kontakt (np. statki rejsowe) może wywołać mini-epidemię o dużej śmiertelności. Skuteczne oczyszczenia i dezynfekcja są wymagane, żeby nppobiegać i kontrolować takie wypadki. Norowirusy są grupą wirusów z rodziny kaliciwirusów. Feline calicivirus (FCV) jest chyba najlepiej zbadanym przedstawicielem ze względu na jego łatwość hodowli w koloniach komórek. Był on powszechnie używany jako środek zastępczy do badań antywirusowych wobec norowirusów. W tym badaniu zostało ocenione działanie antywirusowe testowanego środka dezynfekującego (GAMA Healthcare Clinell)

4 3. Materiały i metody 3.1 Komórki i wirusy Komórki nerki kota Crandell-Rees feline kidney (CRFK) zostały użyte do propagacji i miareczkowania wirusa. Komórki zostały utrzymane jako kultury adherentne przy użyciu standardowych technik. Szczep FCV F9 został wprowadzony do komórek CRFK. Aby przygotować zapasy wirusa, komórki zostały zainfekowane małą wielokrotnością i zamrażana-odmrażane do zaobserwowania całkowitego efektu cytopatycznego. Zainfekowane lizaty komórkowe zostały poddane procesowi klarowania przy użyciu wolnoobrotowej wirówki i przechowywane w temperaturze -80 C. 3.2 Testowany środek dezynfekujący Testowany środek dezynfekujący Clinell został dostarczony przez GAMA Healthcare Ltd. 3.3 Testowanie na działanie antywirusowe Próba na dawkę zakaźną dla komórek hodowli tissue culture infectious dose (TCID50) Próbki testowe zostały rozcieńczone w dziesięciokrotnej kolejno rozcieńczonych seriach i każde 0.1 ml roztworu dodawano, żeby w pomnożyć przez cztery próby konfluentnych komórek CRFK w plytkach na 96 prób (końcowa objętość 0.2 ml/próbę) albo w płytkach na 24 próby (końcowa objętość 2.1 ml/próbę) Po 2-3 dniach próby zostały zbadane na obecność wirusa i ocenione na podstawie działania cytopatycznego. Miano końcowe wirusa (wymagane rozcieńczenie żeby zainfekować 50% komórek) zostało określone przy użyciu formuły Spearmana-Karbera i wyrażone jako TCID50/ml (or as Log TCID50/ml) Test zawiesinowy Zapasy wirusa (0.5ml) zostały zmieszane z równą objętością środka dezynfekującego albo roztworu kontrolnego (phosphate buffered saline, PBS) na 10 minut w temperaturze pokojowej (22-25 C). Miano zakaźnego wirusa w próbce zostało zmierzone za pomocą próby na dawkę zakaźną dla komórek hodowli. 3.4 Test cytotoksyczny kolonii komórek Testowany środek dezynfekujący (albo rozcieńczenie 50:50 środka dezynfekującego w PBS) zostało rozcieńczone w w dziesięciokrotnej kolejno rozcieńczonych seriach i każde 0.1 ml roztworu dodawano, żeby w pomnożyć przez cztery próby konfluentnych komórek CRFK w plytkach na 96 prób albo w płytkach na 24 próby i komórki zostały obserwowane na cytotoksyczność.

5 Wyniki 4.1 Wstępne wyniki testu na antywirusowe działanie środka dezynfekującego Lizaty komórkowe zainfekowane FCV zostały zmieszane z taką samą objętością PBS albo testowanego środka dezynfekującego na dziesięć minut i miano zakaźnych wirusów zostało poddane próbie na działanie cytopatyczne na komórki CRFK na płytkach do 96 prób. Miano próbki zmieszanej z PBS wynosiło 6.75 log TCID50/ml (5.62 x 106 TCID50/ml) Miano próbki zmieszanej ze środkiem dezynfekującym było poniżej progu wykrywalności próby czyli mniej niż 3.5 log TCID50/ml (3.16 x 103 TCID50/ml). Ekspozycja na testowany środek dezynfekujący spowodowała zatem redukcję miana wirusów przynajmniej 3.25 log TCID50/ml. Prób wykrywalności próby został określony na podstawie działąnia cytotoksycznego środka dezynfekującego na komórki. Cytotoksyczność środka dezynfekującego w roztworach była mniejsza niż trzy jednostki logarytmiczne. 4.2 Potwierdzenie działania antywirusowego przez test zawiesinowy W celu potwierdzenia wyników wstępnych testów, został powtórzony test zawiesinowy trzy razy. Dodatkowo, test został zmodyfikowany przez użycie większych objętości kultur (płytki na 24 próby) w próbie TCID, żeby zredukować działanie cytotoksyczne środka dezynfekującego, jednocześnie zwiększając czułość testu. Dzięki tym modyfikacjom cytotoksyczność była widziana tylko przy rozcieńczeniach mniejszych niż 2 jednostki logarytmiczne i granica czułości próby wynosiła 2.5 log TCID50/ml (<3.16x102 TCID50/ml). Lizaty komórkowe zainfekowane FCV zostały zmieszane z zmieszane z taką samą objętością PBS na dziesięć minut i miano zakaźnych wirusów zostało poddane próbie na działanie cytopatyczne na komórki CRFK na płytkach do 24 prób (rysunek 1, tabela 1). Średnia potrójnych prób miała miano 6.5 log TCID50/ml (3.16x10 6 TCID50/ml). Po zmieszaniu lizatów komórkowych zainfekowanych FCV z z taką samą objętością środka dezynfekującego na dziesięć minut miano zakaźnych wirusów było poniżej progu wykrywalności czyli mniej niż 2.5 log TCID50/ml (<3.16x102 TCID50/ml). Ekspozycja na testowany środek dezynfekujący zatem doprowadziła do redukcji miana wirusów przynajmniej 4 log TCID50/ml albo redukcji of 99.99%. Ekspozycja na testowany środek dezynfekujący zredukowała miano wirusów do poziomu poniżej produ wykrywalności próby wskutek cytotoksyczności testowanego środka dezynfekującego. Modyfikacje w próbie TCID (opisane poniżej) poprawiły czułość testu i umożliwiły wykazanie redukcji 4 log miana wirusów przez środek dezynfekujący. Jedna przedstawiony obraz redukcji miana wirusów pozostaje minimum. Całkowita skuteczność środka dezynfekującego wobec feline calicivirus możę być znacznie większa niż uzyskana w tym badaniu.

6 FCV + PBS Rozcieńczenie Log10 Miano wirusów TCID 50 /ml 3.2 x 10 6 FCV + 50% stężenie końcowe <3.2 x 10 2 Rysunek 1. Środek dezynfekujący Clinell redukuje miano zakaźne feline calicivirus. Przedstawienie reprezentatywnej próby pokazuje brak wirusowyh CPE w próbkach poddanych działaniu środka dezynfekującego (dolny panel) przy rozcieńczeniu log 2 lub większym.

7 Tabela 1 Test zawiesinowy TCID50/ml logtcid50/ml 1 +Clinell 3.162E+02* 2.5* E+02* 2.5* E+02* 2.5* Średnia logtcid50/ml 2.5* Redukcja log 4.0# 4 +PBS 3.162E E E * Maksymalne potencjalne miano. Całkowite miano przesłonięte przez toksyczność środka dezynfekującego. # Minimalna redukcja. Całkowity obraz przesłonięty przez toksyczność środka dezynfekującego % redukcji 99.99#

8 5 Wnioski Działanie testowanego środka dezynfekującego (GAMA Healthcare Clinell) wobec feline calicivirus (jako surogat dla norowirusów) zostało zbadane za pomocą testu zawiesinowego. We wstępnym badaniu ekspozycja na środek dezynfekujący Clinell przy testowym stężeniu 50% przez 10 minut doprowadziło do redukcji miana feline calicivirus przynajmniej 3.25 jednostki logarytmiczne. W dalszych podwójnych testach, został użyty zmodyfikowany protoków w celu potwierdzenia działania dezynfekującego Clinell. W tych badaniach ekspozycja na na środek dezynfekujący Clinell przy stężeniu testowym 50% przez 10 minut doprowadziło do redukcji miana feline calicivirus przynajmniej 4 jednostki logarytmiczne (99.99%). GAMA Healthcare Clinell jest skuteczny w redukowaniu zakaźności feline calicivirus w opisanym zakresie. We wszystkich przeprowadzonych testach ekspozycja na środek dezynfekujący doprowadziła do zmniejszenia miana wirusa poniżej progu wykrywalności próby w wyniku cytotoksyczności środka dezynfekującego. Pokazany obraz dla redukcji miana wirusa jest dlatego mimimalny. Całkowita skuteczność środka dezynfekującego wobec feline calicivirus może być znacznie większa niż wyniki uzyskane w tym badaniu.

9 6. Informacje dodatkowe Badanie zostało przeprowadzone przez Dr Tuthill w laboratorium wirusologicznym Profesora Rowlandsa i Profesora Killingtona na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Leeds. Ten raport nie stanowi aprobaty ze strony autora ani Uniwersytetu w Leeds dla testowanego artykułu. Dane zawarte w tym raporcie są oryginalne i wynikają z badań doświadczalnych przeprowadzonych przy zachowaniu dobrych standardów i praktyki laboratoryjnej. Dr Tobias J. Tuthill 25 Październik Wydział Nauk Biologicznych University of Leeds Leeds LS2 9JT