(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPO SPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP94/00818 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO94/21292, PCT Gazette nr 22/94 (51) IntCl6: A 61K 3 9 /3 9 A61K 3 1 /7 3 5 (54)Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A i sposób jej wytwarzania oraz kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A i sposób jej wytwarzania (30) Pierwszeństwo: ,GB, ,GB, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/95 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/00 (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS (S.A), Rixensart, BE (72) Twórcy wynalazku: Pierre Hauser, Rixensart, BE Pierre Voet, Rixensart, BE Moncef Slaoui, Rixensart, BE Nathalie M.C. Garcon-Johnson, Rixensart, BE Pierre Desmons, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: Wydrzyńska Danuta, PATPOL Spółka z o.o. PL B1 (57) 1. Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL), znam ienna tym, że jest wizualnie przejrzysta i sterylizowalna przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie cząstki zawiesiny mają rozmiar mniejszy niż 120 nm. 2. Sposób wytwarzania zawiesiny cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A, znamienny tym, że składa się z zawieszania 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A w wodzie i poddawania otrzymanej zawiesiny działaniu ultradźwięków do wytworzenia zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm. 3. Kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nośnikiem, znamienna tym, że zawiera MPL w postaci zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, w ilości μg na dawkę i antygen. 25. Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nośnikiem, znam ienny tym, że polega na mieszaniu zawiesiny cząstek MPL wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, z nośnikiem i antygenem w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce.

2 Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A i sposób jej wytwarzania oraz kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A i sposób jej wytwarzania Zastrzeżenia patentowe 1. Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL), znamienna tym, że jest wizualnie przejrzysta i sterylizowalna przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie cząstki zawiesiny mają rozmiar mniejszy niż 120 nm. 2. Sposób wytwarzania zawiesiny cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A, znamienny tym, że składa się z zawieszania 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A w wodzie i poddawania otrzymanej zawiesiny działaniu ultradźwięków do wytworzenia zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm. 3. Kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylo wanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nośnikiem, znamienna tym, że zawiera MPL w postaci zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, w ilości μg na dawkę i antygen. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera MPL o rozmiarach cząstek nm. 5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że zawiera MPL o rozmiarach cząstek mniejszych niż 100 nm. 6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako nośnik zawiera wodorotlenek glinu. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako nośnik zawiera emulsję typu olej w wodzie lub inny ciekły nośnik lipidowy. 8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen wirusowy. 9. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen Hepatitis A. 10. Kompozycja szczepionki według zastrz. 9, znamienna tym, że jako antygen Hepatitis A zawiera zdezaktywowaną kompozycję pełnych komórek szczepu HM Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen Hepatitis B. 12. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11, znamienna tym, że jako antygen zawiera antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) lub jego wariant. 13. Kompozycja szczepionki według zastrz. 12, znamienna tym, że jako antygen zawiera HBsAg będący antygenem S HBsAg (226 aminokwasów). 14. Kompozycja szczepionki według zastrz. 13, znamienna tym, że jako antygen zawiera HBsAg zawierający dodatkowo sekwencję pre-s. 15. Kompozycja szczepionki według zastrz. 13, znamienna tym, że jako antygen HBsAg zawiera złożoną cząstkę o wzorze (L*, S), przy czym L* oznacza zmodyfikowane białko L wirusa Hepatitis B mające sekwencję aminokwasową złożoną z reszt 12-52, następnie i białka L, a S oznacza białko S HBsAg. 16. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienna tym, że zawiera dodatkowo antygen Hepatitis A. 17. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera jeden lub wiele antygenów Hepatitis i co najmniej jeden składnik wybrany spośród związków różnych od anty-

3 genu Hepatitis, który chroni przez jedną lub wieloma chorobami wybranymi spośród dyfterytu, tężca, kokluszu, Haemofilis influenzae b (Hib) oraz polio. 18. Kompozycja szczepionki według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera kombinację DTP (dyfteryt-tężec-koklusz)-hbsag, kombinację Hib-HBsAg, kombinację DTP-Hib- HBsAg oraz kombinację IPV (nieaktywna szczepionka polio)-dtp-hib- HBsAg. 19. Kompozycja szczepionki według zastrz. 18, znamienna tym, że zawiera dodatkowo antygen Hepatitis A. 20. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że zawiera glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment. 21. Kompozycja szczepionki według zastrz. 20, znamienna tym, że zawiera glikoproteinę D o uciętej sekwencji. 22. Kompozycja szczepionki według zastrz. 21, znamienna tym, że jako białko o uciętej sekwencji zawiera HSVgD2 pozbawione kotwiczącego końca C. 23. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że zawiera HIV gp 160 lub jego immunologiczny fragment. 24. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, znamienna tym, że jako pochodna gp 160 zawiera pochodną gp Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL), i odpowiednim nośnikiem, znamienny tym, że polega na mieszaniu zawiesiny cząstek MPL wizualnie przejrzystej i ste rylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, z nośnikiem i antygenem w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce. * * * Przedmiotem wynalazku jest nowa zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A i sposób jej wytwarzania oraz kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A i sposób jej wytwarzania. 3-0-deacylowany monofosforylolipid A (lub 3-de-0-acylowany monofosforylolipid A) był poprzednio nazywany 3D-MPL lub d3-mpl w celu wskazania że pozycja 3 redukującego końca glukozaminy jest de-o-acylowana. Preparatykę podaje brytyjski opis patentowy nr A. Chemicznie jest to mieszanina 3-deacylowanego monofosforylolipidu A z 4,5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. W opisie termin 3D-MPL (lub d3-mpl) skracany jest do MPL, ponieważ MPL jest zastrzeżoną nazwą Ribi Immunochem,. Montana, stosowanym przez Ribi w celu jednoznacznego nazwania swojego 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A. Brytyjski opis patentowy nr A wspomina, że endotoksyczność wcześniej stosowanych enterobakteryjnych lipopolisacharydów (LPS) zmniejsza się przy zachowaniu immuno gennych właściwości. Jednak opis podaje te informacje po prostu w związku z układami bakteryjnymi (Gram-ujemnymi). Nie wspomniano o rozmiarach cząstek MPL. W istocie rozmiary cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A przekraczają 500 nm. Publikacja WO/92/16231 opisuje szczepionkę zawierającą glikoproteinę gd wirusa opryszczki lub jej immunologiczne fragmenty w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A. Tu także nie wspomniano o rozmiarach cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A. Publikacja WO/92/06113 opisuje szczepionkę zawierającą glikoproteinę 160 wirusa HIV lub jej immunologiczne fragmenty w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A. Nie wspomniano o rozmiarach cząstek MPL. Przedmiotem wynalazku jest zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL), charakteryzująca się tym, że jest wizualnie przejrzysta i sterylizowalna przez ślepą filtrację nahydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie cząstki zawiesiny mają rozmiar generalnie mniejszy niż 120 nm.

4 Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania zawiesiny cząstek 3-0-deacylowa nego monofosforylolipidu A, charakteryzujący się tym, że składa się z zawieszania 3-0-deacylo wanego monofosforylolipidu A w wodzie i poddawania otrzymanej zawiesiny działaniu ultradźwięków do wytworzenia zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm. Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A (MPL) i odpowiednim nośnikiem, charakteryzująca się tym, że zawiera MPL w postaci zawiesiny cząstek wizualnie przejrzystej i sterylizowalnej przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm, korzystnie o rozmiarze cząstek zawiesiny generalnie mniejszym niż 120 nm, w ilości μg na dawkę i antygen. Korzystnie kompozycja zawiera MPL o rozmiarach cząstek nm, a szczególnie korzystnie o rozmiarach cząstek mniejszych niż 100 nm. W innym korzystnym wykonaniu kompozycja szczepionki zawiera jako nośnik wodorotlenek glinu. Innym korzystnym nośnikiem jest emulsja typu olej w wodzie lub inny ciekły nośnik lipidowy. Korzystnie szczepionka według wynalazku antygen zawiera antygen wirusowy. Szczególnie korzystnymi antygenami są: antygen Hepatitis A, a zwłaszcza zdezaktywowana kompozycja pełnych komórek szczepu HM-175; antygen Hepatitis B, a zwłaszcza antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) lub jego wariant, antygen HBsAg będący antygenem S HBsAg (226 aminokwasów), antygen HBsAg zawierający dodatkowo sekwencję pre-s, antygen HBsAg zawierający złożoną cząstkę o wzorze (L*, S), przy czym L* oznacza zmodyfikowane białko L wirusa Hepatitis B mające sekwencję aminokwasową złożoną z reszt 12-52, następnie i białka L, a S oznacza białko S HBsAg; antygen Hepatitis A; jeden lub wiele antygenów Hepatitis i co najmniej jeden składnik wybrany spośród związków różnych od antygenu Hepatitis, który chroni przed jedną lub wieloma chorobami wybranymi spośród dyfterytu, tężca, kokluszu, Haemofilis influenzae b (Hib) oraz polio. Szczególnie korzystne są kompozycje zawierające kombinację DTP (dyfteryt-tężec-ko klusz)-hbsag, kombinację Hib-HBsAg, kombinację DTP-Hib-HBsAg oraz kombinację IPV (nieaktywna szczepionka polio)-dtp-hib-hbsag, i ewentualnie dodatkowo antygen Hepatitis A. W innym wykonaniu kompozycja szczepionki zawiera glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment, a zwłaszcza glikoproteinę D o uciętej sekwencji, korzystnie HSVgD2 pozbawione kotwiczącego końca C. Kompozycja szczepionki korzystnie zawiera HIV gp 160 lub jego immunologiczny fragment, a zwłaszcza jako pochodną gp 160 zawiera pochodną gp 120. Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania kompozycji szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z zawiesiną MPL polegający na mieszaniu zawiesiny MPL z nośnikiem i antygenem w farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce. Korzystnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A (skracanym do nazwy MPL) i odpowiedni nośnik, w której rozmiar cząstek MPL jest niewielki, nie przekracza 120 nm. Takie preparaty nadają się do wielu jedno- lub wielowartościowych szczepionek. Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycje szczepionek według wynalazku mają szczególnie korzystne właściwości opisane poniżej. W szczególności takie kompozycje są wysoce im munogenne. Ponadto można zapewnić sterylność kompozycji z adiuwantem, ponieważ produkt nadaje się do sterylizującej filtracji. Kolejna korzyść z małych cząstek MPL pojawia się w przypadku kompozycji z wodorotlenkiem glinu, ponieważ MPL oddziaływuje z wodorotlenkiem glinu i antygenem tworząc wyodrębnioną jednostkę. W kompozycjach według wynalazku antygen jest antygenem wirusowym, np. antygenem wobec infekcji żółtaczkowej (Hepatitis A, B, C, D lub E) lub opryszczki (HSV-1 lub HSV-2)

5 zgodnie z poniższym opisem. Opis współczesnych szczepionek przeciwżółtaczkowych wraz z pewną liczbą odnośników można znaleźć w Lancet z 12 maja 1990 na stronie 1142 ff (prof. A.L.W.F. Eddleston). Patrz także Viral Hepatitis and Liver Disease (wyd. Vyas, B.N., Dien stag, J.L. i Hoofnagle, J.H., Grune and Stratton, Inc. (1984)) oraz Viral Hepatitis and Liver Disease (Proceedings of the 1990 International Symposium, wyd. F.B. Hollinger, S.M. Lemon i H. Margolis, publ. Williams i Wilkins). Odnośniki dla HSV-1 i HSV-2 można znaleźć w publikacji WO92/ Infekcja wirusem hepatitis A (HAV) jest szeroko występującym problemem, ale dostępne są szczepionki nadające się do masowych szczepień, np. Havrix (SmithKline Beecham Biologi cals) będący martwą atenuowaną szczepionką ze szczepu HM-175 HAV [patrz Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A, F.E. Andre, A. Hepburn i E.D'Hondt, Prog Med. Virol., tom 37, str (1990) i monografia produktu Havrix opublikowana przez SmithKline Beecham Biologicals (1991)]. Flehming i in. (loc. cit., str ) przejrzał kliniczne aspekty, wirologię, immunologię i epidemiologię Hepatitis A i przedyskutował podejście do opracowywania szczepionek wobec tej pospolitej infekcji wirusowej. W niniejszym opisie wyrażenie antygen HAV odnosi się do antygenu zdolnego do neutralizacji przeciwciała HAV u ludzi. Antygen HAV może zawierać żywe atenuowane cząstki wirusa lub zdezaktywowane atenuowane cząstki wirusa, albo też może być kapsyd lub białko wirusowe HAV, dogodne do wytworzenia metodami inżynierii genetycznej. Infekcja wirusem hepatitis B (HBV) jest szeroko występującym problemem, ale dostępne są szczepionki nadające się do masowych szczepień, np. Engerix-B (SmithKline Beecham plc) otrzymywany metodami inżynierii genetycznej. Wytwarzanie powierzchniowego antygenu Hepatitis B (HBsAg) jest dobrze udokumentowane. Patrz np. Hartford i in., Develop. Biol. Standard 54, str. 125 (1983), Gregg i in., Biotechnology, 5, str. 479 (1987), europejskie opisy patentowe EP-A , EP-A i odnośniki tam zawarte. W niniejszym opisie termin antygen powierzchniowy Hepatitis B lub HBsAg obejmuje każdy antygen HBsAg lub jego fragment wykazujący antygeniczoność antygenu powierzchniowego HBV. Należy rozumieć, że poza 226 aminokwasami sekwencji antygenu HBsAg S (patrz Tiollais i in., Nature, 317, 489 (1985) i odnośniki tam zawarte) HBsAg opisany tutaj może w razie potrzeby zawierać całość lub część sekwencji pre-s opisanej w powyższych odnośnikach i w europejskim opisie patentowym EP-A W szczególności HBsAg może stanowić polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów zawierającą reszty 12-52, a następnie i białka L HBsAg względem otwartej ramki odczytu wirusa B Hepatitis serotypu ad (polipeptyd ten określa się jako L*, patrz europejski opis patentowy EP ). HBsAg z zakresu wynalazku może także zawierać polipeptyd pres1-pres2-s opisany w europejskim opisie patentowym EP (Endotronics) lub jego analogi takie, jak opisano w europejskim opisie patentowym EP (McCormick i Jones). Opisany tutaj HBsAg może się też odnosić do mutantów, np. mutanta ucieczkowego opisanego w publikacji WO 91/14703 lub europejskim zgłoszeniu patentowym nr A1, a szczególnie do HBsAg, w którym na pozycji 145 glicynę podstawiono argininą. Zwykle HBsAg występuje w postaci cząstek. Cząstki mogą zawierać np. białko S samo lub w postaci złożonych cząstek, np. (L*, S), gdzie L* jest takie, jak zdefiniowano powyżej, a S oznacza białko S HBsAg. Wymieniona cząstka ma korzystnie postać, w której jest produktem ekspresji w drożdżach. Glikoproteina D wirusa Herpex Simplex mieści się w osłonie wirusa, a także można ją znaleźć w cytoplazmie zarażonych komórek (Eisenberg R.J. i in., J. of Virol. 1980, 35, ). Składa się z 393 aminokwasów, w tym peptydu sygnałowego, i ma masę cząsteczkową około 60 kd. Ze wszystkich glikoprotein osłony ta jest chyba najlepiej zbadana (Cohen i in. Virology 60, ). Wiadomo, że in vivo gra główną rolę w łączeniu się wirusa z błoną komórkową. Ponadto glikoproteina D wydziela neutralizujące przeciwciała in vivo (Eing i in. J. Med. Virology 127, 59-65).

6 Jednak latentny wirus HSV2 może wciąż ożyć i indukować nawrót choroby pomimo wysokiego poziomu neutralizujących przeciwciał w osoczu pacjenta. Jest więc oczywiste, że zdolność do indukowania tylko neutralizujących przeciwciał nie wystarcza do właściwego zwalczenia choroby. W kompozycjach szczepionek według wynalazku korzystnie stosuje się dojrzałą rekombi nacyjną uciętą glikoproteinę D (rgd2t) lub równoważne białka. Równoważne białka obejmują glikoproteinę gd z HSV-1. W korzystnym aspekcie rgd2t jest glikoproteiną D o 308 aminokwasach, zawierająca aminokwasy od 1 do 306 z naturalnej glikoproteiny z dodatkiem asparaginy lub glutaminy na końcu C uciętego białka. Ta postać białka obejmuje peptyd sygnałowy, który jest ucinany dając dojrzałe białko z 238 aminokwasami. Wytarzanie takiego białka w komórkach jajnika chomików chińskich opisuje europejski opis patentowy Genetech EP-B i Science 222, str. 524, a także Biotechnology, czerwiec 1984, str Taka szczepionka, skomponowana z małym MPL według wynalazku ma znacznie większy potencjał terapeutyczny niż znane kompozycje rgd2t- Chociaż pewne doświadczalne i dostępne w handlu szczepionki dają doskonałe wyniki, wiadomo dobrze, że optymalna szczepionka musi stymulować nie tylko neutralizujące przeciwciało, ale także powinna stymulować tak skutecznie, jak to możliwe, odporność komórkową mediowaną komórkami T. Szczególnie korzystne jest, że kompozycje szczepionek według wynalazku skutecznie indukują zabezpieczającą odporność, nawet przy bardzo niewielkich dawkach antygenu. Stanowią one doskonałą ochronę przeciwko pierwotnej i nawrotowej infekcji, a także korzystnie stymulują zarówno specyficzną pozakomórkową (neutralizującą przeciwciała), a także mediowaną komórkami efektorowymi (DTH) odpowiedź immunologiczną. W celu wytworzenia 3-deacylowanego monofosforylolipidu A z małymi rozmiarami cząstek, zwykle nie przekraczającymi 120 nm, można stosować procedurę opisaną w brytyjskim opisie patentowym GB uzyskując znane 3D-MPL (lub handlowe MPL o większych rozmiarach cząstek można zakupić w Ribi Immunochem) i a następnie produkt można poddać działaniu ultradźwięków aż do otrzymania przejrzystego roztworu. Rozmiary cząstek można oszacować stosując dynamiczne rozpraszanie światła opisane poniżej. W celu utrzymania rozmiarów MPL w zakresie 100 nm po połączeniu z wodorotlenkiem glinu, antygenem i buforem, można dodać Tween 80 lub sorbitol. W tych warunkach ustalono, że MPL nie ulega agregacji w obecności bufora fosforanowego, jak to jest możliwe w jego nieobecności. Postępując w ten sposób określa się dokładniej końcową kompozycję. MPL wciąż oddziaływuje z wodorotlenkiem glinu i antygenem tworząc wyodrębnioną jednostkę. Przejrzysty zawiesina MPL również stanowi aspekt wynalazku. Zawiesinę można sterylizować przepuszczając ją przez filtr. Korzystnie rozmiary cząstek w zawiesinie wynoszą nm. Najkorzystniej rozmiary cząstek w zawiesinie wynoszą poniżej 100 nm. MPL zdefiniowany powyżej występuje w ilości μg, korzystnie μg na dawkę, w której antygen występuje w ilości 2-50 μg lub więcej. Kompozycja szczepionki według wynalazku może zawierać ponadto immunostymulatory, a w korzystnej odmianie QS21 (nazywane niekiedy QA21). Jest to frakcja HPLC ekstraktu saponiny pochodzącego z kory drzewa Quillaja Saponaria Molina, a sposób jej wytwarzania podaje opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr Nośnik może być ewentualnie emulsją typu olej w wodzie, nośnikiem lipidów lub wodorotlenkiem glinu (solą wodorotlenku glinu). Nietoksyczne emulsje typu olej w wodzie korzystnie zawierają nietoksyczny olej, np. skwalen, oraz emulgator taki jak Tween 80, w wodnym nośniku. Wodny nośnik może być np. solanką buforowaną fosforanem. Korzystnie kompozycje szczepionki będą zawierały antygen lub kompozycję antygenową mogącą wywoływać odpowiedź immunologiczną wobec ludzkich lub zwierzęcych patogenów, przy czym antygen lub antygenowa kompozycja pochodzi w HIV-1 (taki jak gp120 lub gp160, patrz publikacja WO 92/06113 i odnośniki tam umieszczone), wirusa opryszczki, taki jak gd lub

7 jego pochodne, lub białko Immediate Early takie jak ICP27 z HSV-1 lub HSV-2, gb (lub jego pochodne) z ludzkiego cytomegalowirusa, lub gpi, II lub III z wirusa Varicella Zoster, lub z wirusa żółtaczki, takiego jak wirus hepatitis B albo wobec innych wirusowych patogenów, takich jak Respiratory Syncytial Virus, wirus ludzkiego brodawczaka lub grypy, albo też patogenów bakteryjnych, takich jak Salmonella, Neisseria, Borrelia (np. OspA lub OspB lub jego pochodne), lub Chlamydia, lub Bordetella, np. P.69, PT lub FHA, i pasożytów takich jak plazmodium lub Toxoplasma. Kompozycje szczepionki według wynalazku mogą zawierać antygen nowotworowy, i nadawać się na szczepionkę przeciwrakową. Jedną z odmian wynalazku jest kompozycja zawierająca antygen HAV (np. jak w Havrix) w mieszaninie z MPL i wodorotlenkiem glinu zgodnie z poniższym opisem. Kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja zawierająca antygen powierzchniowy wirusa HB (HBsAg) (np. jak w Engerix) w mieszaninie z MPL i wodorotlenkiem glinu zgodnie z poniższym opisem. Kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja zawierająca antygen HBsAg jako cząstki (L8, S) w mieszaninie z MPL i wodorotlenkiem glinu. Kombinowane szczepionki Hepatitis A z Hepatitis B można wytwarzać zgodnie ze sposobem według wynalazku. Kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca dojrzałą uciętą gli koproteinę DrgD2t) lub równoważne białka opisane powyżej. Tak więc kolejną odmianą wyna lazku jest kompozycja według wynalazku zawierająca antygen OspA lub jego pochodną z Borelia burgdorferi. Można na przykład stosować antygeny, szczególnie antygeny OspA ze szczepów ZS7 lub B31. Tak więc kolejną odmianą wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca antygen grypy. Dzięki temu otrzymuje się z ulepszoną szczepionkę przeciw grypie, szczególnie przy zastosowaniu wirusa rozszczepionego. Kompozycję można stosować także z lekkimi cząstkami opryszczkowymi, takimi jak opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/GB92/00824 i międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/GB/ Korzystnie kompozycje szczepionki według wynalazku zawierają inne antygeny do skutecznego leczenia lub profilaktyki jednej lub wielu infekcji bakteryjnych, wirusowych lub grzybiczych. Np. kompozycje szczepionki na żółtaczkę według wynalazku korzystnie zawierają co najmniej jeden składnik taki jak antygen nieżółtaczkowy, znany z tego, że nadaje odporność na jedną lub kilka z powyższych infekcji: defteryt, tężec, koklusz, Haemofilis influenzae b (Hib) oraz polio. Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera HBsAg jak zdefiniowano powyżej. Szczególna kombinacja szczepionki według wynalazku obejmuje kombinację szczepionek DTP (dyfteryt-tężec-koklusz)-hepatitis B, kombinację szczepionek Hib-hepatitis B, kombinację szczepionek DTP-Hib-hepatitis B i kombinację szczepionek IPV (nieaktywna szczepionka poli)-dtp-hib-hepatitis B. Powyższe kombinacje mogą korzystnie zawiera składnik zabezpieczający przed Hepatitis A, szczególnie martwy osłabiony szczep pochodzący ze szczepu HM-175 obecny w Havrix. Odpowiednie składniki takich szczepionek są dostępne w handlu, a szczegóły można otrzymać ze Światowej Organizacji Zdrowia. Na przykład składnik IPV może być zdeaktywo waną szczepionką przeciw polio Salka. Szczepiona przeciwko krztuścowi może zawierać całe komórki lub produkty komórkowe. Korzystnie szczepionka przeciw hepatitis lub kombinowana jest szczepionką pediatryczną. Kompozycje szczepionek według wynalazku mają zastosowanie w terapii medycznej, szczególnie do leczenia lub profilaktyki infekcji, w tym wirusowych i bakteryjnych, lub do immunoterapeutycznego leczenia nowotworów. W korzystnym aspekcie szczepionka według wynalazku stanowi szczepionkę terapeutyczną do leczenia istniejących infekcji, np. żółtaczki B lub opryszczki u ludzi.

8 Preparaty szczepionkowe są opisane ogólnie w New Trends and Develoμments in Vaccines, wyd. Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, Kapsułkowanie liposomami opisuje np. Fullerton, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr i Armor i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki dobiera się tak, indukowała immunozabezpie czającą odpowiedź bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych typowych szczepionek. Ilość ta będzie zmieniała się w zależności od rodzaju wykorzystanych immunogenów. Zwykle można się spodziewać, że każda będzie zawierać μg pełnego immunogenu, korzystnie μg, najkorzystniej 4-40 μg. Optymalną ilość dla konkretnej szczepionki można ustalić w standardowy sposób, w tym obserwując miano przeciwciał lub inne odpowiedzi u badanych. Po wstępnym szczepieniu pacjenci mogą otrzymać wtórną szczepionkę po około 4 tygodniach. W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki skutecznej w zapobieganiu lub leczeniu infekcji, który to sposób polega na mieszaniu antygenu z nośnikiem i zawiesiną MPL, przy czym rozmiary cząstek MPL korzystnie nie przekraczają 120 nm, zwykle nm, bardziej korzystnie około 100 nm lub mniej. Następujące przykłady ilustrują wynalazek i pokazują płynące z niego korzyści. Przykład 1: Wytwarzanie MPL o rozmiarach cząstek nm. Wodę do zastrzyków wprowadza się do fiolek zawierających 3-de-O-acylowany mono fosforylolipid A (MPL) z Ribi Immunochem, Montana, przy pomocy strzykawki do stężenia 1 do 2 mg/ml. Zawiesinę początkową uzyskano stosując mieszanie wirowe. Zawartość fiolek przeniesiono do 25 ml okrągłodennych probówek Corex (10 ml zawiesiny na probówkę) i zawiesinę poddano działaniu ultradźwięków w łaźni ultradźwiękowej. Gdy zawiesina stała się przejrzysta, rozmiary cząstek oceniono metodą dynamicznego rozpraszania światła (Malvern Zetasizer 3). Obróbkę kontynuowano do osiągnięcia przez cząstki MPL rozmiarów nm. Zawiesiny można w pewnych przypadkach przechowywać w temperaturze 4 C bez znaczącej agregacji do 5 miesięcy. Izotoniczny NaCl (0,15 M) lub izotoniczny NaCl z 40 mm fosforanu indukuje gwałtowną agregację (rozmiar >3-5 μm). Przykład 2: Wytwarzanie wielkoskalowe sterylnego rozpuszczalnego MPL o rozmiarach cząstek poniżej 100 nm. Liofilizowany 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (MPL) z Ribi Immunochem umieszczono w zawiesinie w wodzie do zastrzyków (WFI). Zawiesinę przepompowywano w sposób ciągły przez ultradźwiękową komorę przepływową. Komora taka jest sporządzana ze szkła lub stali nierdzewnej z uszczelnieniem z PTFE, aby spełniać wymagania praktyki ogólnole karskiej. Ultradźwięki generuje się odpowiednim generatorem i sonotrodą z Undatim Ultrasonics (Louvain-La-Neuve, Belgia). Wymiennik ciepła dołącza się do pętli w celu uniknięcia degradacji cieplnej produktu. Temperatura MPL między wlotem a wylotem komory wynosi od +4 C do 30 C, a różnica tych temperatur nie przekracza 20 C. Należy rozumieć, że ciepło jest usuwane w miarę przechodzenia materiału przez aparat. Aparat ten pokazano schematycznie na fig Ultradźwięki Proszek MPL(50 do 500 mg) umieszcza się w zawiesinie w WFI w stężeniu od 1 do 2 mg/ml. Zawiesinę MPL (w warunkach mieszania) przepompowuje się w sposób ciągły przez pętlę ultradźwiękową (fig. 1) z natężeniem od 50 do 100 ml na minutę w celu uzyskania temperatury równowagi układu wynoszącej od +4 do +15 C. Widmo własnej częstotliwości sonotrody w układzie (moc, komora przepływowa, natężenie przepływu cieczy, temperatura) ustawia się zgodnie z instrukcją producenta. Wstępnie ustalone granice mieszczą się od do Hz dla przetwornika Hz. Generator pozwala kontrolować optymalną wydajność obróbki ultradźwiękowej (więcej energii i mniej ciepła) w danym czasie. Temperatura w czasie procesu wynosi poniżej 30 C, aby uniknąć degradacji MPL. Proces jest zakończony, gdy cząstki mają rozmiary poniżej 100 nm, a roztwór jest widocznie przejrzysty. W czasie działania ultradźwiękami pobiera się próbki, aby ustalić rozmiary cząstek

9 metodą fotokorekcyjnej spektroskopii (dynamiczne rozpraszanie światła) stosując Malvern Ze tasizer 3 w taki sposób, jak w przykładzie 1. Całkowity czas przebywania cieczy w komorze oblicza się na od 2,5 do 3,5 minuty (patrz tabela 1) przy komorze o pojemności 20 ml i natężeniu recyrkulacji 50 ml na minutę. Daje to średni czas przebywania 25 s na cykl, a zwykle potrzeba mniej niż 10 cykli dla uzyskania pożądanego efektu - małych cząstek MPL Proces sterylizacji Powstały rozpuszczony MPL sterylizuje się przez ślepą filtrację na hydrofilowej membranie PVDF 0,22 μm. Obserwowane ciśnienie wynosi poniżej 1 bar. Co najmniej 25 mg rozpuszczonego MPL z łatwością przetwarza się na 1 cm2 z odzyskiem ponad 85% Przechowywanie/Trwałość Sterylny rozpuszczony MPL przechowuje się w temperaturze +2 do 8 C. Dane o trwałości (Malvern) nie wykazują znacznych różnic rozmiarów cząstek po 6 miesiącach przechowywani (patrz tabela 2). Przykład 3: Kompozycja szczepionki przeciwko Hepatitis B. MPL o rozmiarach cząstek poniżej 100 nm otrzymano jak w przykładzie 1. Wodorotlenek glinu otrzymano z Superfos (Alhydrogel). MPL umieszczono w zawiesinie w wodzie do zastrzyków w stężeniach od 0,2 do 1 mg/ml metodą działania ultradźwiękami w łaźni wodnej, aż do osiągnięcia rozmiarów cząstek od 80 do 500 nm, według pomiaru fotokorekcyjnego rozpraszania światła. Od 1 do 20 μg HBsAg (S-antygen, jak w Engerix B) w roztworze bufora fosforanowego (1 mg/ml) zaadsorbowano na 30 do 100 μg wodorotlenku glinu (roztwór 10,3 8 mg/ml Al3+) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Do roztworu dodano następnie 30 do 50 μg MPL (roztwór 1 mg/ml). Objętość i osmotyczność ustawiono na 600 μl wodą do zastrzyków i stężonym 5-krotnie buforem fosforanowym. Roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i trzymano w temperaturze 4 C do użycia. Dojrzewanie kompozycji zachodzi w czasie przechowywania. Całość stanowi 10 dawek wstrzykiwanych przy testach na myszach. Przykład 4: kompozycja szczepionki przeciwko Hepatitis A. MPL o rozmiarach cząstek poniżej 100 nm otrzymano jak w przykładzie 1. Wodorotlenek glinu otrzymano z Superfos (Alhydrogel). HAV (360 do 22 EU (jednostki ELISA) na dawkę) poddano wstępnej adsorpcji na 10% końcowego stężenia wodorotlenku glinu (0,5 mg/ml). Do roztworu dodano MPL (12,5 do 100 μg na dawkę). Pozostały wodorotlenek glinu dodano do roztworu i pozostawiono na godzinę w temperaturze pokojowej. Objętości uzupełniono buforem fosforanowym i końcową kompozycję trzymano w temperaturze 4 C do użycia. Przykład 5: Porównanie skuteczności adiuwantów w szczepionce rekombinacyjnej podjednostki glikoproteiny D Herpes Simplex W studium tym określono zdolność kompozycji Al(OH)3 z MPL do polepszania odporności ochronnej obciętej glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 2. Stadia immunogenicz ne przeprowadzono na naczelnych. Celem eksperymentów było zbadanie wpływu rozmiarów cząstek 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (MPL) na immunogenność i skuteczność kompozycji rgd2t, Al(OH)3 i MPL u gryzoni i naczelnych. Zbadano trzy różne kompozycje Al(OH)3 z MPL o małych rozmiarach cząstek: Al(OH)3 z MPL 100 nm (jak opisano poprzednio) Al(OH)3 z MPL i sorbitolem Al(OH)3 z MPL i Tween 5.2. Kompozycje antygenowe Wodorotlenek glinu (Al(OH)3) otrzymano z Superfos (Alhydrogel Superfod, Dania). MPL otrzymano z Ribi Immunochem Research Inc.

10 rgd2t z Al(OH)3/MPL i TEA (trójetyloglin) MPL umieszczono metodą działania ultradźwiękami w łaźni wodnej otrzymując rozmiary cząstek od 200 do 600 nm. Preparaty otrzymano zgodnie ze zgłoszeniem patentowym nr WO 92/16231 i przechowywano w temperaturze 4 C przed użyciem. Dawka zawierała 5 μg fgd2t, 0,5 mg Al(OH)3 i 50 μg MPL rgd2t z Al(OH)3/MPL 100 nm MPL (rozmiary cząstek poniżej 100 nm) otrzymano jak w przykładzie 1. rgd2t adsorbowa no na wodorotlenku glinu i inkubowano jeszcze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Preparat skompletowano dodając bufor PBS z końcowym stężeniem 10 nm PO4 i 150 mm NaCl. Końcową kompozycję inkubowano dalej przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przechowywano w temperaturze 4 C przed użyciem. Dawka zawierała 5 μg fgd2t, 0,5 mg Al(OH)3 i 50 μg MPL rgd2t z Al(OH)3/MPL 100 nm i sorbitol MPL otrzymano jak w przykładzie 1. rgd2t adsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano jeszcze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano następnie 50% roztwór sorbito lu do końcowego stężenia 5%. Dodano następnie roztwór Tris 10 mm do końcowej objętości i inkubowano jeszcze przez godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Kompozycję przechowywano w temperaturze 4 C przed użyciem. Dawka zawierała 5 μg fgd2t, 0,5 mg Al(OH)3 i 50 μg MPL rgd2t z Al(OH)3/MPL 100 nm i Tween MPL otrzymano jak w przykładzie 1. W celu utrzymania rozmiarów cząstek MPL 100 nm dodano do roztworu Tween 80 w stężeniu takim, że daje stężenie 0,01 % w końcowej kompozycji. Dalej przygotowano kompozycję jak powyżej w Dawka zawierała 5 μg fgd2t, 0,5 mg Al (OH)3 i 50 μg MPL Eksperyment profilaktyczny na świnkach morskich W eksperymentach zaszczepiono grupę świnek morskich w dniu 0 i 28 5 μg rgd2t w dwu różnych kompozycjach MPL z wodorotlenkiem glinu. Szczepiono podskórnie dawką 0,5 ml. W miesiąc po pierwszym szczepieniu prowadzono świnkom dopochwowo 105 jednostek HSV2 szczep MS. Obserwowano je codziennie szukając pierwotnej i nawrotnej choroby HSV2 (dni 4 do 39 po zarażeniu) Eksperymenty terapeutyczne na świnkach morskich W eksperymentach zarażono grupę świnek morskich 105 jednostkami HSV2 szczep MS. Po wyzdrowieniu z pierwotnej infekcji obserwowano je codziennie szukając nawrotu choroby opry szczkowej (dni 13 do 21). Świnki zaszczepiono w dniu 21 i 42 szczepionką rgd2t/al(oh)3/mpl. Szczepionki podawano podskórnie w dawce 0,5 ml. Zwierzęta obserwowano codziennie na obecność opryszczkowych uszkodzeń aż około do dnia 60 do Studia immunogenności u naczelnych Immunogenność rgd2t/al(oh)3/mpl w kombinacji z MPL w sorbitolu przeprowadzono na afrykańskich zielonych małpach. Grupy małp zaszczepiono w dniu 0 i μg rgd2t i 0,5 mg Al(OH)3 z 50, 20 lub 5 μg MPL w sorbitolu. Badano specyficzne pozakomórkowe (miano ELISA i zobojętniające) oraz komórek efektorowych (reakcja nadwrażliwa typu opóźnionego DTH) odpowiedzi immunologiczne. Kompozycje podawano domięśniowo w dawce 1 ml. Preparaty kompozycji przygotowywano tak, jak opisano powyżej. Badano krew zwierząt co około dwa tygodnie w celu stwierdzenia obecności przeciwciał. Odpowiedź DTH badano w 14 dni po drugim szczepieniu. Opis testu skórnego podano poniżej Odczyty informacji Przeprowadzono testy w celu określenia specyficznej odpowiedzi na przeciwciała indukowanej przez kompozycje rgd2t/al(oh)3/mpl (określenie miana ELISA anty-rgd2t i miana zobojętniającego anty-hsv2). Skuteczność ochronną kompozycji gd2 oceniano na modelach profilaktycznych i terapeutycznych na świnkach morskich. Przeprowadzono także na małpach studia immunogenności. Określono odpowiedzi specyficzne pozakomórkowe i DTH.

11 Miana ELISA i zobojętniające Określono miana anty-przeciwciało rgd2t i aktywność neutralizującą anty-hsv2 zgodnie ze sposobami podanymi w zgłoszeniu patentowym WO 92/ Nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH) Kompozycje rgd2t przetestowano na zdolność indukowania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla komórek T mierzonej przez indukcję odpowiedzi nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH). Afrykańskie zielone małpy zaszczepiono w dniu 0 i μg kompozycji szczepionki gd2 podawanej domięśniowo. Wykonano na nich testy skórne w 14 dni po drugim szczepieniu metodą śródskómej iniekcji na brzuchu 15 lub 5 μg rgd2t w solance. Wykonano na nich testy skórne z solanką jako płynem kontrolnym. Miejsce iniekcji zbadano w 24 i 48 godzin później w poszukiwaniu rumienia i stwardnienia. Zmierzono rozmiary lokalnych reakcji Model dopochwowy zarażenia na śwince morskiej Model ze świnką morską infekcji genitalnej HSV opisał L. Stanberry i in. (J. of Infectious Diseases 1982, 146: ); Intervirology 1985, 24: ). Krótko, w eksperymentach profilaktycznych świnki morskie zarażono dopochwowo 105 jednostek HSV2 szczep MS w miesiąc po ostatnim szczepieniu. Obserwowano codziennie kliniczny przebieg pierwotnej choroby i ostrość uszkodzeń skóry genitalnej w 4-12 dni po zarażeniu. Badano codziennie zwierzęta na obecność powrotnych uszkodzeń opryszczkowych w dniach od 13 do 39. W eksperymentach terapeutycznych świnki morskie zarażono w dniu jednostkami HSV2 szczep MS. Po wyzdrowieniu z pierwotnej infekcji badano je codziennie pod kątem nawrotu opryszczki (dni 13 do 21), po czym podzielono na grupy przypadkowo zgodnie z skutkami choroby pierwotnej i wtórnej (równoważny rozkład zwierząt z łagodną i ostrą infekcją w każdej grupie) w celu wykonania szczepienia lub niewykonania szczepienia. Szczepionkę podawano w dniu 20 i 41 po zarażeniu. Rozkład obecności nawrotu choroby obserwowano zwykle w około 70 dni po zarażeniu. Uszkodzenia opryszczkowe oceniono ilościowo stosując skalę od 0 do 32. Skala ocen Typ uszkodzenia Brak 0 Uszkodzenia pochwowe Ocena - krwawienie 0,5 - zaczerwienienie przez 1 do 2 dni bez krwawienia 0,5 - zaczerwienienie i krwawienie przez dzień 1 - zaczerwienienie bez krwawienia przez co najmniej 3 dni 1 Zewnętrzne pęcherzyki opryszczkowe - <4 małe pęcherzyki 2 - > 4 małe pęcherzyki lub 1 duży 4 - > 4 duże uszkodzenia 8 - zlewające się duże uszkodzenia 16 - zlewające się duże uszkodzenia na całych zewnętrzu genitaliów 32 Odczyty kliniczne Infekcja pierwotna - Ostrość uszkodzenia - = suma dziennych odczytów przez dni od 4 do 12 po infekcji. Ostrość uszkodzenia wyraża się jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe, a także medianę (lepsze dla testu bezparametrowego)

12 Wystąpienia pierwotnej infekcji = % zwierząt mających maksymalne oceny 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 lub 16 (rzadziej 32). Indeks pierwotnej infekcji = Σi (maks. ocena i) x (% wystąpień) z i = 0, 0,5, 2, 4, 8 lub 16. Nawrót choroby - Liczba dni nawrotu = liczba dni z nawrotem dla dni od 13 do 39 po infekcji. Jeden nawrót musi być poprzedzany i musi po nim następować jeden dzień bez uszkodzeń, a w jego okresie muszą być dwa dni z rumieniem lub jeden z pęcherzykami. Liczba dni nawrotu jest wyrażana średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe i medianami. - Ostrość nawrotu = suma dziennych ocen dla dni od 13 do 39 po infekcji. Wyniki są podane jako średnie arytmetyczne ± odchylenia standardowe i mediany Wyniki Skuteczność ochronna różnych kompozycji rgd2t/al(oh)3/mpl porównano w eksperymentach profilaktycznych na świnkach morskich. Przeprowadzono także na naczelnych studia immunogenności. Celem tych eksperymentów było porównanie immunogenności i skuteczności ochronnej rgd2t/al(oh)3 w połączeniu z MPL o różnych rozmiarach cząstek Eksperymenty profilaktyczne Przeprowadzono dwa eksperymenty w celu określenia potencjału różnych szczepionek rgd2t/al(oh)3/mpl w chronieniu przed pierwotną i powrotną chorobą HSV2 przy podawaniu świnkom morskim przed zarażeniem dopochwowym. Eksperyment 1: Porównanie MPL 100 nm z sorbitolem z MPL z TEA Grupę samic świnek morskich Hartleya ( g) zaszczepiono w dniu 0 i 28 5 μg rgd2t/al(oh)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek (100 nm, MPL w sorbitolu) lub większych (MPL w TEA). Kontrolne zwierzęta zaszczepiono zgodnie z tym samym protokołem adiuwantem lub nie szczepiono wcale. Krew pobierano w dniu 14 i 28 po drugim szczepieniu w celu określenia przeciwciał w teście ELISA lub teście zobojętniania. Zwierzęta zarażono 29 dni po drugim szczepieniu 105 jednostkami HSV2 szczep MS dopochwowo. Po zarażeniu obserwowano je codziennie szukając śladów ostrej infekcji (dni 4 do 12 po zarażeniu) i dowodów nawrot nej choroby opryszczkowej (dni 13 do 39 po zarażeniu). a) indukcja odporności pozakomórkowej Jak pokazano w tabeli 3, wyższe miana ELISA i zobojętniające uzyskano w przypadku stosowania MPL o małych rozmiarach cząstek w kompozycji rgd2t/al(oh)3. b) Wpływ szczepienia na pierwotną infekcję HSV2 (tabela 3) W porównaniu z grupą kontrolną zarażoną i przechodzącą ostrą pierwotną infekcję, obie szczepione grupy wykazały znacznie niższy poziom uszkodzeń (p < 0,00005). Rzadsze występowanie uszkodzeń skóry zaobserwowano w przypadku grupy szczepionej rgd2t/al(oh)3/mpl 100 nm (p < 0.06). c) Wpływ szczepienia na nawrotną infekcję HSV2 Wyniki podaje tabela 4. W porównaniu z kontrolną grupą obie szczepionki były w stanie wstrzymać rozwój nawrotu choroby opryszczkowej, na co wskazywała mniej sza liczba przypadków nawrotu (p <0,02 dla rgd2t/al(oh)3mpl 100 nm). d) Wnioski Obie kompozycje są w stanie zapewnić znaczną ochronę przed pierwotną infekcją i zmniejszyć zakres nawrotu choroby. Wyniki pokazują, że kompozycja rgd2t/al(oh)3/mpl z cząstkami MPL o małych rozmiarach ma bardzo dużą skuteczność profilaktyczną. Eksperyment 2: Skuteczność Al(OH)3/MPL 100 nm Grupę świnek morskich Hartleya ( g) zaszczepiono w dniu 0 i 28 5 μg gd2 w Al(OH)3 z MPL 100 nm. Szczepienie wykonano podskórnie w dawce 0,5 ml. Kontrolne zwierzęta zaszczepiono zgodnie z tym samym protokołem adiuwantem lub nie szczepiono wcale. Krew pobierano w dniu 14 i 28 po drugim szczepieniu w celu określenia przeciwciał w teście ELISA lub teście zobojętniania. Zwierzęta zarażono 29 dni po drugim szczepieniu 105 jednostkami HSV2 szczep MS dopochwowo. a) indukcja odporności pozakomórkowej

13 Jak pokazano w tabeli 3, grupa szczepiona wykazała dobre miana ELISA i zobojętniające. Grupa kontrolna nie wykazała wykrywalnej odpowiedzi przeciwciałowej. b) Wpływ szczepienia na pierwotną infekcję HSV2 (tabela 3) W porównaniu z grupą kontrolną zarażoną i przechodzącą ostrą pierwotną infekcję, szczepiona grupa wykazała znacznie niższy poziom uszkodzeń (p < 0,00005) i występowania (p < 0,002). Nie zaobserwowano zewnętrznych uszkodzeń skóry u szczepionych świnek morskich. c) Wpływ szczepienia na nawrotną infekcję HSV2 (tabela 4) W porównaniu z kontrolną grupą szczepionka rgd2t/al(oh)3/mpl była w stanie zmienić rozwój nawrotu choroby opryszczkowej, na co wskazywała znaczna redukcja ostrości przypadków nawrotu (p < 0,00005) i częstości nawrotów (p < 0,01) d) Wnioski Kompozycja rgd2t/al(oh)3 z cząstkami MPL o małych rozmiarach ma bardzo dużą skuteczność w zapewnianiu ochrony przed pierwotną i wtórną infekcją HSV2 u świnek morskich. Z eksperymentów opisanych powyżej można wyciągnąć wniosek, że kompozycje Al(OH)3 z MPL o małych rozmiarach otrzymane na dwa różne sposoby indukują co najmniej tak silną odpowiedź profilaktyczną, jak kompozycje Al(OH)3 z MPL o dużych rozmiarach. Ponadto MPL o małych rozmiarach korzystnie ulega łatwej sterylizacji przed użyciem Eksperymenty terapeutyczne Celem tych eksperymentów jest porównanie potencjału terapeutycznego różnych kompozycji rgd2t/al(oh)3/mpl w czasie nawrotu opryszczki u świnek morskich z ustaloną infekcją HSV2. Świnki morskie szczepiono dopochwowo w dniu jednostkami HSV2 szczep MS. Obserwowano je codziennie szukając pierwotnej infekcji (dni 4 do 12), a także nawrotu infekcji opryszczkowej (dni 13 do 20). Zwierzęta podzielono na grupy przypadkowo zgodnie z skutkami choroby pierwotnej i wtórnej (równoważny rozkład zwierząt z łagodną i ostrą infekcją w każdej grupie). Świnki morskie bez śladów klinicznych infekcji nie wprowadzono do protokołu. Szczepionkę podawano podskórnie w dniu 21 i 42 po zarażeniu. Terapeutyczną infekcję rgd2t/al(oh)3/mpl oceniono w trzech różnych eksperymentach. Eksperyment 1: Porównanie rgd2t/al(oh)3 z MPL o dużych rozmiarach cząstek (MPL w TEA) Świnki morskie z nawrotem choroby podzielono na grupy, podając im albo 20 μg rgd2t/al(oh)3 z MPL o dużych rozmiarach cząstek (MPL w TEA), lub sam adiuwant. Szczepionki podawano podskórnie w dniu 21 i 42 po zarażeniu. Rozkład nawrotów choroby obserwowano do dnia 84. Jak pokazuje tabela 3, kompozycja rgd2t/al(oh)3/mpl z TEA nie była skuteczna w osłabianiu trwającego nawrotu infekcji; Eksperyment 2: Skuteczność rgd2t/al(oh)3 z MPL 100 nm Dwie grupy świnek morskich zaszczepiono 20 μg rgd2t/al(oh)3 z MPL o małych rozmiarach cząstek (MPL 100 nm), lub zaniechano szczepienia. Szczepionki podawano w dniu 21 i 42 po zarażeniu. Rozkład nawrotów choroby obserwowano do dnia 69. Jak pokazuje tabela 5, w porównaniu z danymi z eksperymentu 1, gdzie użyto MPL o dużych rozmiarach cząstek, szczepienie rgd2t/al(oh)3/mpl 100 nm zmieniła częstość powstawania choroby HSV2 w porównaniu z grupą kontrolną, zmniejszając ostrość nawrotu (-39%, p < 0,05) i liczbę dni z nawrotem (-28%, p < 0,1). Eksperyment 3: Porównanie skuteczności Al(OH)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek W eksperymencie zastosowano trzecią strategię otrzymywania MPL o małych rozmiarach cząstek: dodanie Tween, np. Tween 80. Grupy eksperymentalne były następujące: Grupa 1 (n = 15): 20 μg rgd2t/al(oh)3 z MPL 100 nm z Tween Grupa 2 (n = 15): 20 μg rgd2t/al(oh)3 z MPL 100 nm z sorbitolem

14 Grupa 3 (n = 16): kontrolna Grup kontrolnych nie poddawano szczepieniu lub szczepiono tylko Al(OH)3 z MPL. Szczepionki podawano w dniu 21 i 42 po zarażeniu. Rozkład nawrotów choroby obserwowano do dnia 60. Wyniki pokazano w tabeli 5. Znaczne, wyraźne działanie terapeutyczne zaobserwowano u zwierząt szczepionych dwoma kompozycjami rgd2t/al(oh)3 z MPL. Obie kompozycje znacznie zmniejszały ostrość nawrotów, liczbę dni ich trwania i liczbę nawrotów. Wnioski Zaobserwowano bardzo silne działanie terapeutyczne wobec ustalonego nawrotu genitalnej choroby HSV2 w przypadku dwu kompozycji rgd2t/al(oh)3 z MPL o małych rozmiarach cząstek (około 100 nm). W przeciwieństwie do tego nie zaobserwowano działania terapeutycznego w przypadku MPL o dużych rozmiarach cząstek (MPL w TEA) dodawanego do szczepionki rgd2t/al(oh)3. Wyniki otrzymane dla świnek morskich wyraźnie pokazują skuteczność profilaktyczną kompozycji rgd2t/al(oh)3 z MPL o małych rozmiarach cząstek. Mają one wyższy potencjał terapeutyczny niż rgd2t/al(oh)3 z MPL o dużych rozmiarach cząstek Studia immunogenności rgd2t/al(oh)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek u naczelnych Dawki 50, 20 lub 5 μg MPL 100 nm połączono z 20 μg rgd2t i Al(OH)3 (0,5 mg). Wykonano dwa szczepienia w dniu 0 i po miesiącu. Mierzono specyficzne pozakomórkowe (miano ELISA i zobojętniające) oraz komórek efektorowych (DTH) odpowiedzi immunologiczne. a) procedura doświadczalna Trzy grupy zielonych małp afrykańskich zaszczepiono w dniu 0 i μg gd2t z Al(OH)3 zawierającym 50, 20 lub 5 μg MPL. Badano krew zwierząt co około dwa tygodnie w celu stwierdzenia obecności przeciwciał w testach ELISA (miana anty-gd2) i testach zobojętniających. Trzy kompozycje szczepionki porównano pod względem zdolności indukowania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla komórek T mierzonej przez indukcję odpowiedzi nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH). Na trzech małpach z każdej grupy wykonano na nich testy skórne w 14 dni po drugim szczepieniu metodą iniekcji na brzuchu 15 lub 5 μg gd2t w solance. Wykonano na nich także testy skórne z solanką jako płynem kontrolnym. Miejsce iniekcji zbadano w 24 i 48 godzin później w poszukiwaniu rumienia i stwardnienia. b) Wyniki Odpowiedzi serologiczne i DTH pokazuje tabela 6. Grupy małp szczepione kompozycją rgd2t i Al(OH)3 zawierającą 50 lub 20 μg MPL wytwarzały znacznie więcej zobojętniających przeciwciał niż grupa otrzymująca dawkę 5 μg MPL (odpowiednio p < 0,003 i p < 0,008). Nie było wyraźnej różnicy w mianach ELISA i zobojętniającym mierzonych w grupach 50 lub 20 μg MPL. Zauważono korelację pomiędzy dawką MPL a wpływem na odpowiedź immunologiczną komórek efektorowych. Silną odpowiedź DTH wykryto u większości małp (3/4) szczepionych kompozycjami z 50 lub 20 μg MPL. W przeciwieństwie do tego tylko jedna małpa z grupy 5 μg MPL wykazała odpowiedź w teście skórnym. c) Wnioski Dane podane powyżej pokazują, że działanie jako adiuwanta Al(OH)3 w połączeniu z MPL o małych rozmiarach cząstek jest skuteczne również u naczelnych, a nie tylko u małych gatunków zwierząt. U małp można zaobserwować korelację pomiędzy dawką MPL i immunoge nicznością kompozycji rgd2t/al(oh)3/mpl, przy czym najlepszą odpowiedź serologiczną i DTH daje ilość 50 i 20 μg. Przykład 6: BADANIA KLINICZNE szczepionek na Lyme i Hepatitis B oraz małych cząstek MPL 6.1. Szczepionka na chorobę Lyme zawierająca białko fuzyjne NS1 (1-81) z wirusa grupy i OspA z B. burgdorferi ZS7.

15 Wytwarzanie kompozycji NS 1 -OspA/wodorotlenek glinu NSl-OspA wytworzoną zgodnie z procedurą ze zgłoszenia patentowego WO 93/04175 zaadsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Końcową objętość osiągnięto dodając bufor fosforanowy (PO4 10 mm, NaCl 150 mm). Kompozycję przechowywano w temperaturze 4 C do wykorzystania. Dawka zawiera 10 μg NS1-OspA/500 μg wodorotlenku glinu NS1-OspA/wodorotlenek glinu/mpl NS1-OspA zaadsorbowano na wodorotlenku glinu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. MPL, wytworzony jak uprzednio opisano, dodano do kompozycji i ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Końcową objętość osiągnięto dodając bufor fosforanowy (PO4 10mM,NaCl 150 mm). Kompozycję przechowywano w temperaturze 4 C do wykorzystania. Dawka zawiera 10 μg NSl-OspA/500 μg wodorotlenku glinu/50 μg MPL Przebieg szczepień Ochotnicy otrzymali trzykrotnie zastrzyki domięśniowe 1 ml danej kompozycji w dniach 0, 31 i 62. Osocza pobrano w 30 dnia po I, II i III szczepieniu. Poddano je analizie ELISA na łączną zawartość IgG anty-ospa i podobną do LA-2 odpowiedź przeciwciałową w teście inhibicji (LA-2 wykazało jako przeciwciało działanie zabezpieczające przed infekcją u myszy) Kompozycje HBsAg/MPL dla ludzi Wytwarzanie kompozycji HBsAg 20 μg/wodorotlenek glinu 500 μg HBsAg zaadsorbowano na końcowej ilości wodorotlenku glinu i końcową objętość osiągnięto dodając bufor fosforanowy z solanką (PO4 10 mm, NaCl 150 mm) dla dawki 1 ml. Kompozycję przechowywano w temperaturze 4 C do wykorzystania HBsAg 20 μg/wodorotlenek glinu 100 μg HBsAg skomponowano jak powyżej adsorbując na 100 μg wodorotlenku glinu. Końcowa objętość wynosiła 1 ml na dawkę HBsAg 20 μg/wodorotlenek glinu 100 μg/mpl 50 μg HBsAg zaadsorbowano na 100 μg wodorotlenku glinu. Dodano MPL we właściwym stężeniu i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Końcową objętość osiągnięto dodając odpowiedni bufor (jak powyżej) i przechowywano w temperaturze 4 C do wykorzystania Przebieg szczepień Ochotnicy (20 w grupie) otrzymali zastrzyki domięśniowe 1 ml jednej z danych kompozycji. Osocza pobrano w miesiącu 0, 1, 3 i 6. Poddano je analizie na przeciwciała zabezpieczające handlowo dostępnym testem Abbota WYNIKI Tabela 8 pokazuje, że MPL stosowany w połączeniu z wodorotlenkiem glinu i NS1 -OspA w postaci cząstek 100 nm skutecznie pozwala na powstanie wyższych zmian przeciwciał o naturze inhibitującej, niż antygen na wodorotlenku glinu, a kinetyka serokonwersji jest szybsza. Wynika stąd że dla rozpuszczalnego antygenu, takiego jak NS1-OspA, u ludzi MPL skomponowany w postaci małych cząstek ma własności adiuwanta wykazywane już u zwierząt w dla innych rozpuszczalnych antygenów. Tabela 7 pokazuje, że działanie wspomagające utracone w wyniku zmniejszenia ilości wodorotlenku glinu w kompozycjach dla Hepatitis B może być odzyskane po dodaniu MPL w postaci opisanej w niniejszym opisie. MPL polepsza także szybkość serokonwersji. Przykład 7: Połączona kompozycja szczepionki - Hepatitis B + Hepatitis A HBsAg adsorbuje się na 90% końcowej ilości wodorotlenku glinu (0,5 mg/ml) i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Odczyn ph ustawia się na 6,2 i preparat pozostawia na 14 dni w temperaturze pokojowej do dojrzenia. antygen Hepatitis A w ilości 360 do 22 UE na dawkę, w postaci zdezaktywowanej pochodnej szczepu HM-175 (jak w Havrix) poddaje się wstępnej adsorpcji na wodorotlenku glinu

16 w 10 % końcowego stężenia (0,5 mg/ml). Resztę wodorotlenku glinu dodaje się następnie do roztworu i pozostawia na godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. HAV zaadsorbowany na wodorotlenku glinu dodaj e się następnie do kompozycji HBsAg. Do roztworu HAV/HBsAg dodaje się MPL (cząstki mniejsze niż 100 nm) do końcowego stężenia 12,5 do 100 μg na 1 ml dawki, uzupełnia się do końcowej objętości i przechowuje kompozycję w temperaturze 4 C przed użyciem. Przykład 8: Kombinowane szczepionki zawierające dodatkowe antygeny Kombinowane szczepionki można wytwarzać dodając jeden lub kilka żądanych antygenów do kompozycji opisanych w przykładzie 2, 3 lub 4 powyżej. Przykład 9: Wzrost odporności pozakomórkowej i indukcja odporności komórkowej metodą immunizacji myszy HBsAg skomponowanym z wodorotlenkiem glinu i MPL Wpływ Al(OH)3 z MPL na indukcję przeciwciał anty-hbs Myszy Balb/c immunizowano podskórnie lub przezskórnie rekomibnacyjnym HBsAg ad sorbowanym na Al(OH)3 z MPL jako adiuwantem. Myszy szczepiono dwukrotnie kompozycjami HBsAg(Al(MPL i mierzono odpowiedź przeciwciał po pierwszej i drugiej dawce. Łączną ilość Ig zmierzono testem ELISA lub AUSAB (Abbott Lab, 111.), zawierając szczególną uwagę na indukcję przeciwciał izotypu IgG2a, ponieważ jest on indukowany głównie przez wydzielanie g-interferonu. Indukcja tego izotypu pośrednio odzwierciedla aktywację odporności komórkowej, konkretnie aktywację Th1. Zbadano stosunek HBsAg/MPL i rozmiary cząstek MPL Eksperyment 1: Wpływ dawki MPL (> 500 nm) na immunogenność rec HBsAg adsorbowanego na Al(OH)3 Grupę 10 samic myszy Balb/c immunizowano podskórnie 2,5 μg rechbsag adsorbowanego na 50 μg Al ++(jako Al(OH)3 zawierającego rosnące ilości MPL (3,1 do 50 μg) o rozmiarach cząstek> 500 nm. Myszy szczepiono dwukrotnie 100 μl w odstępie dwutygodniowym. Pobrano próbki krwi po 2 tygodniach od pierwszego zastrzyku (częściowe) i po tygodniu od drugiego. Zmierzono łączne IgG anty-hbs i specyficzne IgG2a testem ELISA stosując rechbsag jako antygen przechwytujący. Miana wyrażono jako odwrotności rozcieńczenia odpowiadającego 50% wartości maksymalnej (środkowe rozcieńczenie). Wyniki wskazują na wzrost ilości specyficznych IgG i IgG2a ze wzrostem dawek MPL, szczególnie przy dawce od 12,5 do 50 μg. Wpływ jest widoczny dla pierwotnej i wtórnej odpowiedzi, i jest szczególnie wyraźny dla IgG2a (prawie 20-krotny wzrost), wskazując pośrednio na wydzielanie g-interferonu indukowane immunizacją MPL Eksperyment II - Porównanie klinicznych zestawów adsorbowanego rechbsag zawierającego lub nie zawierającego MPL (> 500 nm) Przygotowano 3 kliniczne zestawy rechbsag adsorbowanego na Al(OH)3: zestaw DSAH16 nie zawierał MPL i był zestawem kontrolnym. Zestawy DSAR501 i 502 przygotowano w podobny sposób (20 μg rechbsag adsorbowano na 0,5 mg Al+++ jako Al(OH)3), ale zawierały 50 μg MPL (> 500 nm). Trzy zestawy wstrzyknięto grupom po 10 myszy (200 μl zawiera 2,5 μg HBsAg, 100 μg Al+++ i 6,25 μg MPL), dwukrotnie w odstępie dwutygodniowym. Pobrano próbki krwi po 14 dniach od pierwszego zastrzyku i po tygodniu od drugiego. Zmierzono poziom przeciwciał anty-hbs zestawem AUSAB lub domowym ELISA dla IgG lub IgG2a. Wyniki podaje tabela 2. Wyniki wskazują, że dwa tygodnie po pierwszym zastrzyku oba zestawy zawierające MPL indukując bardzo wyraźną odpowiedź anty-hbs (12,4 i 41,9 mlu/ml), a zestaw bez MPL tylko odpowiedź minimalną (0,75 mlu/ml). Liczba odpowiedzi jest także wyższa w przypadku obecności MPL (9/10 i 9/10 wobec 1/10 bez MPL). Wpływ MPL podkreśla także stan po drugim zastrzyku, ponieważ uzyskane miana dla zestawów DSAR501 i DSAR502 są około 6-krotnie wyższe niż w nieobecności MPL. Wskazuje to, że przynajmniej w przypadku myszy MPL (> 500 nm) może polepszyć zarówno kinetykę odpowiedzi anty-hbs, jak i poziom tej odpowiedzi.

17 Wyniki potwierdził poziom specyficznej IgG i IgG2a po immunizacji zestawem DSAH 16 (bez MPL) i DSAR502 (z MPL): miano anty-hbs IgG wynosi 5 (pierwotna odpowiedź) i 3 (wtórna odpowiedź) razy więcej w obecności MPL Eksperyment III: Wpływ dawki MPL (< 100 nm) na immunogenność rekombinacyj nego HBsAg adsorbowanego na Al(OH)3 Grupę 10 myszy (Balb/c, samice, 7-tygodniowe) immunizowano podskórnie 1 μg rekom binacyjnego HBsAg adsorbowanego na 50 μg Al+++ (jako Al(OH)3) zawierającego rosnące ilości MPL (3,1 do 25 μg) o rozmiarach cząstek < 100 nm. Myszy szczepiono dwukrotnie 200 μl w odstępie dwutygodniowym. Pobrano próbki krwi po 2 tygodniach od pierwszego zastrzyku i po tygodniu od drugiego. Zmierzono testem ELISA odpowiedź anty-hbs (łączne Ig, IgG, IgG2a) na pobranym osoczu. Miana wyrażono jako środkowe rozcieńczenie (odwrotności rozcieńczenia odpowiadającego 50% wartości maksymalnej). Wyniki wskazują, że nawet mała dawka 3,1 μg MPL indukuje silny wzrost odpowiedzi antygenu, zarówno pierwotnej, jak i wtórnej. Odpowiedź jest maksymalna dla 6,25 μg i spada do wartości w nieobecności MPL przy dużych dawkach MPL; (25 μg). Wzór odpowiedzi jest podobny dla IgG, IgG2a i łącznej Ig. Wyniki są przeciwne do wyników dla MPL o dużych rozmiarach (> 500 nm) i wskazują, że cząstki MPL o małych rozmiarach (> 100 nm) są skuteczniejsze (co najmniej w przypadku odporności pozakomórkowej), ponieważ potrzeba mniej MPL dla uzyskania maksymalnego efektu. Wyższą aktywność MPL o małych rozmiarach cząstek potwierdziło kilka doświadczeń. Jak widać dla MPL o dużych rozmiarach cząstek (> 500 nm), działanie wspomagające MPL jest wyższe dla IgG2a niż łącznej IgG lub Ig. Przy maksymalnym efekcie wtórnej odpowiedzi (6,25 μg MPL) występuje 25-krotny wzrost zawartości IgG2a, oraz odpowiednio 7,6 i 4,3 dla IgG i łącznej Ig Indukcja odporności komórkowej przez rechbsag adsorbowany na Al(OH)3 - wpływ MPL Jeśli odporność pozakomórkowa wystarcza do ochrony przed wirusem Hepatitits B, indukcja komórkowej odporności (CTH, Th1) powinna mieć duże znaczenie w leczeniu choroby. Do leczniczych szczepionek konieczne są nowe kompozycje, ponieważ Al(OH)3 jest w stanie polepszyć odporność pozakomórkową, ale nie komórkową. Zbadano wpływ MPL na indukcję komórek Th1 zdolnych do wydzielania IL-2 i g-(to jest gamma)- interferonu u myszy Balb/c immunizowanych rechbsag adsorbowanym na Al(OH) Eksperyment I - Wpływ MPL (> 500 nm) na indukcję komórek Th1 po immunizacji myszy Balb/c HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3 Grupę 10 myszy Balb/c (samice, 5-tygodniowe) immunizowano zastrzykiem w poduszkę stóp 30 μl roztworu zawierającego 10 μg HBsAg 15 μg Al+++ (jako Al(OH)3) i 15 μg MPL. Kontrolnym myszom wstrzyknięto tę samą ilość rechbsag zmieszanego z FCA (pozytywna kontrola) lub adsorbowanego na Al(OH)3 (negatywna kontrola). Sześć dni po immunizacji myszy zabito i usunięto podkolanowe węzły chłonne. Komórki węzłów (LNC 2,105/ml) hodowano przez różny okres (24 do 74 godzin) na pożywce RPMI uzupełnionej 1 % negatywnego osocza myszy i 5 μg/ml rechbsag. Po zakończeniu hodowli zmierzono ilość IL-2, INF-g i IL-4 wydzielonego do pożywki. IL-2 oszacowano po zdolności do stymulacji proliferacji (miarą jej było przyłączanie 3H-tymidyny) zależnej od IL-2 linii CTL (komórki VDA2), a miano wyrażono jako wskaźnik stymulacji (SI = ilość 3H-tymidyny włączanej do stymulowanych komórek/ilość 3H tymidyny do niestymulowanych komórek). Ilość IL-4 i INF-g mierzono przy pomocy handlowych zestawów ELISA (Holland Biotechnology dla IFN-g i Endo gen dla IL-4). Miana wyrażono w pg IFN-g/ml. Wyniki wskazują, LNC z myszy immunizowanych HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3 nie wydziela znaczniej szych ilości IL-2, IL-4 lub INF-g. W przeciwieństwie do tego duże ilości IL-2 (SI = 38 po 48 godzinach) i znaczne ilości INF-g wydzielają LNC z myszy immunizowanych HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3 z MPL. Wydzielanie to jest podobne (INF-g) lub wyższe (IL-2) w porównaniu z obserwowanym dla myszy immunizowanych HBsAg z FCA, a in vitro zachodzi wcześniej.

18 Nie wykryto IL-4 po immunizacj i HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3 nawet w obecności MPL. Taki profil wydzielania wskazuje, że specyficzne komórki Th1 (IL-2, INF-g) uległy indukcji przez immunizację adsorbowanym HBsAg w obecności MPL, ale nie w jego nieobecności. Jednak nie wykryto Th2 (IL-4) w tych warunkach immunizacji Eksperyment I - Wpływ dawki MPL (<100 nm) na indukcję komórek Th1 po immunizacji myszy Balb/c HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3. Grupę 5 myszy Balb/c immunizowano zastrzykiem w dwie poduszki stóp 30 μl roztworu zawierającego 10 μg HBsAg adsorbowanego na 15 μg Al+++ (jako Al(OH)3) ze wzrastającą ilością MPL (100 nm, 0 do 15 μg). Sześć dni po zastrzyku myszy zabito i komórki węzłów podkolanowych (LNC, 2, 106 komórek/ml)) hodowano na pożywce RPMI uzupełnionej 1% negatywnego osocza myszy przez różny okres (24 godziny do 96/25) w obecności 5 μg/ml rechbsag. Wydzielanie IL-2 zmierzono stymulując proliferację komórek VDA2, a stężenie IL-2 wyrażono jako wskaźnik stymulacji (SI). Wydzielanie INF-g zmierzono przy pomocy handlowych zestawów i wyrażono w pg/ml. Stwierdzono, że wydzielanie IL-2 wzrasta bardzo znacznie przy niskiej dawce MPL (7,5 μg), a maksymalny efekt powstaje przy 15 μg MPL. Wydzielanie IL-2 jest znacznie istotniejsze po 24 godzinach niż po 48 lub 72 godzinach. Wydzielanie INF-g nie następuje w przypadku HBsAg adsorbowanego na Al(OH)3 w nieobecności MPL. Mała dawka (7,5 μg) MPL indukuje wydzielanie INF-g, a ponownie maksymalny efekt powstaje przy 15 μg MPL. W przeciwieństwie do IL-2 wydzielanie INF-g jest w hodowli opóźnione i wzrasta z czasem do 96 godzin. Łącznie dane te wskazują, że MPL (poniżej 100 nm) jest silnym induktorem Th1 w połączeniu z HBsAg adsorbowanym na Al(OH)3. Zbadano wpływ kompozycji zawierającej HBsAg adsorbowany na Al(OH)3 i MPL na indukcję pozakomórkowej i komórkowej odporności u myszy Balb/c. Wyniki wskazuj, że MPL wyraźnie polepsza kinetykę odpowiedzi anty-hbs, ponieważ znacznie więcej przeciwciał anty-hbs znaleziono po pierwotnym i powtórnym szczepieniu. Zmodyfikowana jest także jakość anty-hbs i obserwuje się preferowaną indukcję IgG2a, która wskazuje pośrednio na wydzielanie INF-g, a więc indukcję komórkowej odporności. Bezpośrednie określenie indukcji komórek Th1 przez kompozycje zawierające HBsAg, Al(OH)3 i MPL wskazuje wyraźnie, że MPL bardzo silnie indukuje wydzielanie IL-2 i INF-g przez komórki Th1. Takie kompozycje stanowią ważny wkład w rozwój leczniczych szczepionek. Najlepsze wyniki osiągnięto w przypadku MPL o rozmiarach cząstek mniejszych niż 100 nm. Wyniki eksperymentów opisanych tutaj podają tabele Wnioski Łączne dane sugerują, że MPL o małych rozmiarach cząstek jest ulepszonym immunosty mulatorem u naczelnych, w tym i człowieka, w porównaniu z MPL o dużych rozmiarach cząstek. Cech ta połączona z możliwością wytwarzania na wielką skalę preparatów sterylizowanych powoduje, że ML o małych rozmiarach cząstek jest odpowiednim immunostymulatorem do wielu ludzkich i zwierzęcych szczepionek. Tabela 1 Próba nr Cząstki MPL i odzyskiwanie filtracyjne przy różnych parametrach działania ultradźwiękami Stężenie mg/ml Łączny czas przebywania w komorze (min.) Rozmiar cząstek przed filtracją (nm) Odzysk po filtracji (%) , , , , ,8 77 Brak ,8 98 Brak