Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Izolacja DNA z komórki roślinnej Genom jest to całość informacji genetycznej zawartej w komórce. W organizmie roślinnym niemal cała ilość informacji o budowie i funkcjonowaniu znajduje się jest w jądrze komórkowym, trzeba jednak pamiętać o informacji genetycznej zawartej w organellach takich jak mitochondria i chloroplasty. Informacja ta jest przekazywana do nowo powstających komórek w wyniku replikacji DNA w czasie podziału komórek merystematycznych, a podczas rozmnaŝania roślin komórkom generatywnym i następnym pokoleniom. Genom jądrowy Podstawowa struktura fizyczna wszystkich genomów eukariotycznych jest bardzo podobna, ale róŝnią się one jedną waŝną cechą. Jest nią wielkość genomu, czyli wartość odpowiadająca zawartości DNA w jądrze wyraŝona w jednostkach wagowych (pg) lub w liczbie par zasad (Mpz) (0,1pg = ~100Mpz). Oznaczana jest symbolem C (ang. constans) na określenie zawartości DNA w niezreplikowanym, podstawowym zespole danego gatunku. 1C DNA odpowiada ilości DNA w gamecie, natomiast somatyczne komórki diploidalne mają 2C DNA lub 4C DNA, w zaleŝności od fazy cyklu komórkowego, odpowiednio przed i po replikacji. Wielkość genomu jest określona dla wielu gatunków glonów, paprotników, mszaków i roślin kwiatowych, w tym dla około 3500 gatunków okrytonasiennych, co stanowi zaledwie 1,4% opisanych gatunków. Wartości 1C DNA roślin okrytonasiennych charakteryzują się duŝą rozpiętością (tabela 1).
Tabela 1. Zawartość DNA w jądrach wybranych roślin okrytonasiennych Wg. www.nal.usda.gov/tables/nucna.html Gatunek Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana) Cebula zwyczajna (Allium cepa) Owies zwyczajny (Avena sativa) Kapusta polna (Brassica campestris) Pępawa zielona (Crepis capillaries) Jęczmień (Hordeum vulgare) Pomidor zwyczajny (Lycopersicon esculentum) RyŜ siewny (Oryza sativa) Pszenica zwyczajna (Triticum aestivum) Kukurydza zwyczajna (Zea mays) Mpz/1C 145 4024 11 315 507 1867 4873 883 419 15 966 2292 Gatunki naleŝące do tej samej jednostki taksonomicznej, takiej jak rodzaj czy rodzina, są podobne morfologicznie. Wielkość genomów natomiast moŝe się róŝnić wielokrotnie, nawet między blisko spokrewnionymi gatunkami. O duŝej rozpiętości wielkości genomów decyduje głównie obecność w jądrze nie tylko sekwencji kodujących ściśle związanych z genami, ale równieŝ sekwencji pozagenowych takich jak: a) sekwencje niekodujące wśród których moŝna wyróŝnić DNA pełniący funkcje regulatorowe, promotorowe lub DNA związany ze strukturą macierzy jądrowej oraz sekwencje funkcjonalne chromosomów, tj. sekwencje telomerowe, centromerowe i inicjacji replikacji DNA b) sekwencje powtarzalne stanowiące geny występujące w setkach, a czasem w tysiącach kopii, będące istotną częścią genomu; naleŝą do nich geny rrna, trna i geny kodujące histony. Wśród sekwencji powtarzalnych wyróŝnić moŝna: sekwencje rozproszone po całym genomie, ich liczba i pozycja moŝe się zmieniać się w związku z moŝliwością przemieszczania się (transpozycji) w genomie sekwencje tandemowe występujące jedna za drugą, tworzące szeregi monomerów DNA nie poprzedzielanych innymi sekwencjami c) DNA, którego funkcja jest nieznana, określany jako śmietnikowy DNA (ang. junk DNA)
Genom geny i sekwencje związane z genami sekwencje pozagenowe geny pojedyncze geny powtarzalne geny i sekwencje związane z genami geny i sekwencje związane z genami Rys 1. Typy sekwencji w genomie jądrowym Genom mitochondrialny Genomy mitochondrialne roślin są znacznie większe niŝ genomy mitochondrialne zwierząt i grzybów. Wielkość genomu mitochondrialnego roślin uległa szybkim zmianom w trakcie ewolucji. Za róŝnice w wielkości są odpowiedzialne wewnętrzne duplikacje oraz integracja z genomem mitochondrialnym sekwencji pochodzących z genomu jądrowego i plastydowego. Znacznej dynamice podlega równieŝ organizacja roślinnych genomów mitochondrialnych: układ genów w tych genomach jest bardzo róŝny, choć zasadniczo utrzymane są te same sekwencje kodujące. Mitochondrialny DNA (mtdna) roślin posiada geny związane z procesem wytwarzania energii, niektóre geny kodujące białka rybosomowe, geny rybosomowych RNA (rrna) oraz geny trna. Genom chloroplastowy Chloroplasty zawierają wiele kopii kolistej cząsteczki DNA. Liczba tych kopii jest zmienna i zaleŝna od czynników zewnętrznych. Średnio jest od 20 do 60 identycznych cząsteczek, jednak liczba ta moŝe osiągnąć zawrotną wartość 900 kopii na organellę w przypadku intensywnej ekspozycji rośliny na światło. Tę ogromną liczbę cząsteczek DNA przypadającą na jeden chloroplast tłumaczy się wzmoŝonym zapotrzebowaniem na rybosomy organellowe, a zwiększenie ich liczby musi być poprzedzone powieleniem liczby genów rrna. Poznano całkowitą sekwencję nukleotydów kolistego DNA chloroplastowego niektórych gatunków roślin (np. tytoń, ryŝ) i wyjaśniono funkcję większości występujących tam genów. Oprócz genów
kodujących niektóre białka chloroplastowe, DNA plastydowy zawiera takŝe geny kodujące wszystkie rodzaje RNA chloroplastowego (mrna, trna, rrna) uczestniczące w procesie translacji. Szacuje się, Ŝe genom plastydowy zawiera geny dla około 120 białek, co stanowi niewielką część wszystkich białek występujących w chloroplastach, zaś pozostałe białka kodowane są przez genom jądrowy. Wiele białek chloroplastowych np. karboksylaza 1,5-bisfosforybulozy, kluczowy enzym w procesie asymilacji CO 2, powstaje w wyniku współdziałania genomu plastydowego i jądrowego. śyjemy w erze intensywnego poznawania sekwencji nukleotydowych genomów wielu organizmów. Przykładem mogą być genomy dwóch roślin modelowych: Arabidopsis thaliana (dwuliściennej) i Oryza sativa (jednoliściennej). Znamy obecnie sekwencję zarówno ich genomu jądrowego, mitochondrialnego, jak i plastydowego. Organizm modelowy to taki, który badany jest przez wielu naukowców ze względu na jego cechy, które czynią go łatwym obiektem badań oraz jest on na tyle podobny do innych organizmów, Ŝe wnioski wyciągnięte z jego badań mogą być szeroko zastosowane. Jednym z przykładów organizmów modelowych jest Arabidopsis thaliana (rzodkienik pospolity). Kukurydza i ryŝ waŝne rośliny uprawne, równieŝ są szeroko badane, a Antirrhinum majus (wyŝlin wielki, potocznie lwia paszcza ) stał się modelem do badania kwitnienia. Arabidopsis thaliana naleŝy do rodziny kapustowatych i jest małym, niezbyt waŝnym chwastem rolniczym. Ma wiele istotnych cech, które czynią go odpowiednim organizmem modelowym do badania roślin: małe rozmiary genomu (120 000 kpz) umoŝliwiły całkowite zsenkwencjonowanie genomu (Arabidopsis Genome Project AGP) niewielkie rozmiary pozwalają na hodowanie duŝej liczby roślin w komorach hodowlanych i szklarniach krótki cykl Ŝyciowy od wykiełkowania do wytworzenia nowych nasion mija 6-8 tygodni małe nasiona waŝące 20µg kaŝde, około 20 000 z kaŝdej rośliny; nasiona moŝna łatwo przechowywać i łatwo teŝ uzyskiwać duŝą liczbę roślin łatwe indukowanie mutacji za pomocą czynników chemicznych lub promieniowania jonizującego łatwy obiekt do badań molekularnych
Wykonanie ćwiczenia Celem ćwiczenia jest izolacja DNA z liści dowolnej rośliny pochodzącej z hodowli in vitro. Materiały i sprzęt Zestaw do izolacji DNA z roślin Genomic Mini AX Plant (A&A Biotechnology). Materiały i sprzęt: liście tytoniu 50mg ciekły azot 10ml 70% EtOH 0,5ml bufor TE 100µl probówki Eppendorfa probówki 15ml z kolumną pipety automatyczne moździerz łopatka metalowa wirówka eppendorfa 12 000 14 000 obr./min termoblok worteks Izolacja DNA 1. Próbkę materiału roślinnego (50 mg) umieścić w probówce eppendorfa i wstawić probówkę do lodu. 2. Następnie tkankę roślinną przenieść do moździerza i ucierać energicznie z 10 ml ciekłego azotu. 3. Przenieść utartą masę roślinną do probówki eppendorfa i dodać 0,9 ml zawiesiny lizującej LS (uwaga: zawiesinę naleŝy wymieszać przez kilkukrotne odwracanie butelki) oraz 20 µl roztworu Proteazy. LS składa się z: Tritonu X-100 Chlorowodorku guanidyny Bufor MOPS 4. Całość wymieszać i inkubować w 50 C przez 30 min. Probówkę naleŝy mieszać od czasu do czasu przez worteksowanie. 5. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek., a następnie wirować 5 min. przy 10 000 14 000 obr./min. 6. Pobrać supernatant (na dnie powinien znajdować się zwarty osad stanowiący mieszaninę niezlizowanego materiału oraz drobinek pochodzących z mieszaniny lizującej) i nanieść go na kolumnę umieszczoną w probówce 15 ml. Poczekać aŝ lizat przejdzie przez kolumnę.
7. Następnie dwukrotnie przepłukać kolumnę przez dodanie 1,5 ml roztworu płuczącego K2. Za kaŝdym razem poczekać aŝ roztwór wypłynie z kolumny. Skład roztworu K2: 0,8M NaCl 15% izopropanol Bufor MOPS 8. Dodać do kolumny 0,25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczekać aŝ wypłynie z kolumny (krok ten ma na celu zmniejszenie całkowitej objętości eluatu, gdyŝ martwa objętość kolumny wynosi 0,3ml). Skład roztworu K3: 1,2M NaCl 15% izopropanol bufor Tris-HCl, ph=8,0 9. Przenieść kolumnę do nowej probówki 2 ml, która posiada odpowiednie Ŝeberka pozwalające na łatwe umieszczenie w probówce i eluować DNA przez dodanie do kolumny 1 ml roztworu elucyjnego K3. 10. Do eluatu zwierającego DNA dodać 0,8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM. Całość wymieszać i wirować 10 min. przy 12 000 obr./min (uwaga: roztwór PM zawiera dodatkowo wzmacniacz precypitacji, dlatego przed uŝyciem naleŝy go wymieszać przez kilkukrotne odwracanie butelki). Skład PM: izopropanol akrylami liniowy (wzmacniacz precypitacji) 11. Po odwirowaniu zlać supernatant (na dnie powinien być widoczny jasnoniebieski osad DNA) i dodać do probówki 0,5 ml 70% EtOH, w celu wytrącenia DNA. Próbkę wymieszać i wirować 3 min. przy 12 000 obr./min. 12. Po odwirowaniu zlać supernatant i trzymając probówkę w pozycji odwróconej, przytknąć samą końcówkę pipety (bez pipety) do dna i ścianek probówki celem kapilarnego usunięcia resztek alkoholu. Następnie suszyć odwróconą do góry dnem probówkę przez 5 min. w temp. pokojowej. 13. Osad zawiesić w 20 µl buforu TE (niebieska barwa osadu pozwala kontrolować proces rozpuszczania DNA).
Przygotowanie sprawozdania 1. Opisać procedurę izolacji DNA z komórki roślinnej i wyjaśnić cel kaŝdego etapu i rolę kaŝdego odczynnika. 2. Scharakteryzować inny niŝ Arabidopsis thaliana roślinny organizm modelowy. 3. Wymienić główne róŝnice między genomem komórki roślinnej i zwierzęcej. Literatura uzupełniająca: 1. Wojtaszek P, Woźny A, Ratajczak L. Biologia komórki roślinnej. Funkcja. PWN 2007 2. Lack AJ, Evans DE. Biologia roślin. Krótkie wykłady. PWN 2003 3. Brown TA. Genomy. PWN 2001 4. Kopcewicz J, Lewak S. Fizjologia roślin. PWN 2002