Ćwiczenie 5 PREPARATYKA DNA Z JĄDER KOMÓRKOWYCH IZOLOWANYCH Z ETIOLOWANYCH SIEWEK PSZENICY. Część doświadczalna obejmuje:

Transkrypt

1 Ćwiczenie 5 PREPARATYKA DNA Z JĄDER KOMÓRKOWYCH IZOLOWANYCH Z ETIOLOWANYCH SIEWEK PSZENICY Część doświadczalna obejmuje: izolowanie jąder komórkowych z etiolowanych siewek pszenicy preparatykę DNA z wyizolowanych jąder ocenę czystości preparatu DNA na podstawie analizy spektrofotometrycznej WPROWADZENIE Izolacja jąder komórkowych Wyodrębnienie poszczególnych struktur subkomórkowych rozpoczyna się od rozdrobnienia badanego materiału i homogenizacji (roztarcia komórek) w odpowiednim środowisku (roztworze homogenizacyjnym). W pozyskiwaniu nieuszkodzonych organelli używa się roztworu izotonicznego tzn. takiego, którego ciśnienie osmotyczne jest równe ciśnieniu osmotycznemu wewnątrz komórki. W roztworach hipotonicznych organelle wchłaniają wodę i pękają, natomiast w roztworach hipertonicznych kurczą się. Homogenizacja tkanki umożliwia zgrubną filtrację homogenatu przez gazę lub nylon, pozwalającą oddzielić nieroztarte, całe komórki czy fragmenty tkanek. Frakcjonowanie składników komórkowych można przeprowadzić w drodze tzw. wirowania różnicowego polegającego na kolejnych wirowaniach przy odpowiednio wzrastających przyspieszeniach podawanych jako wielokrotność przyspieszenia ziemskiego wywołanego przyciąganiem ziemskim (g = 9,81 m x s -2 ). Ze względu na zróżnicowaną wielkość, kształt i gęstość poszczególnych organelli można je w ten sposób wyodrębnić z zawiesiny (Ryc. 1). Jądra komórkowe osadzają się już przy małych przyspieszeniach (600 x g), które można osiągnąć w prostych wirówkach stołowych. Przez ostrożne usunięcie roztworu znajdującego się nad osadem (supernatantu) i zawieszenie osadu jąder w izotonicznym roztworze można uzyskać frakcję wzbogaconą w dużą liczbę jąder komórkowych. Taka surowa frakcja jądrowa zawiera jeszcze inne komponenty komórkowe jako zanieczyszczenia. Oczyszczoną frakcję jądrową można otrzymać na drodze wirowania w skokowym lub ciągłym gradiencie gęstości np. roztworu sacharozy lub glicerolu. W tym wypadku, rozdzielające się w 1

2 czasie wirowania frakcje są stabilizowane przez gradienty gęstości środowiska, które hamują przepływy konwekcyjne utrudniające rozdzielanie cząstek. Ryc. 1. Schemat frakcjonowania struktur subkomórkowych metodą wirowania różnicowego (Koolman, Röhm 2005) Przy frakcjonowaniu struktur subkomórkowych duże znaczenie ma analiza stopnia czystości otrzymanych frakcji. Obecność określonych organelli w wyizolowanej frakcji można potwierdzić oznaczając w niej aktywność odpowiednich enzymów markerowych lub innych cząsteczek znacznikowych. Np. DNA jest znacznikiem jąder komórkowych, rrna rybosomów, a mitochondria można identyfikować oznaczając dehydrogenazę bursztynianową lub oksydazę cytochromową. Stopień jednorodności izolowanej frakcji można określić oznaczając w niej aktywność enzymów lub zawartość cząsteczek znacznikowych charakterystycznych dla innych frakcji subkomórkowych. Poszczególne etapy izolacji organelli komórkowych wykonuje się w niskich temperaturach (przeważnie przy C) spowalniając w ten sposób reakcje trawienia przez uwolnione enzymy proteolityczne oraz ograniczając inne niekorzystne procesy np. utlenianie grup hydrosulfidowych w białkach. 2

3 Preparatyka DNA z izolowanych jąder komórkowych Organizacja genomów roślinnych Genom roślin składa się z trzech części: genomu jądrowego, genomu mitochondrialnego i genomu chloroplastowego. Genom jądrowy zawarty jest w chromosomach, których liczba u różnych organizmów waha się od kilku do kilkudziesięciu. Genomy organelli są w większości koliste, chociaż niektóre doniesienia sugerują, że obok genomów kolistych koegzystują wersje liniowe, a w przypadku chloroplastów mniejsze fragmenty koliste, które zawierają część całego genomu. Genomy organelli mogą występować pojedynczo lub, jak to stwierdzono w mitochondriach ludzkich, nawet w 10, a w przypadku innych organizmów nawet w 100 kopiach w jednym mitochondrium. Genomy jądrowe Na Ryc. 2 pokazano zakres wielkości haploidalnych genomów jądrowych roślin oraz, dla porównania, rozpiętość wielkości genomów bakterii, grzybów i zwierząt. Wielkość genomów jądrowych roślin wyższych jest niezwykle zróżnicowana, gdyż najmniejszy genom rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) zawarty w pięciu chromosomach liczy 7x 10 7 par zasad (70 Mpz), a największy genom szachownicy (Fritillaria assyriaca) ma 1,2x par zasad ( Mpz). Ryc. 2. Porównanie wielkości haploidalnych genomów bakterii, grzybów, roślin i zwierząt (Buchanan, Gruissem, Jones 2000). pz 3

4 Na Ryc. 3 pokazany jest pokrój rzodkiewnika (A. thaliana), rośliny o najmniejszym genomie i szachownicy (F. assyriaca), rośliny z rodziny liliowych, której genom jest około 1700x większy od genomu rzodkiewnika. Porównując wielkość genomów różnych organizmów zwraca uwagę brak bezpośredniego związku między wielkością genomu, a poziomem komplikacji organizmu. Ryc. 3. Porównanie wyglądu: A, rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) (genom jądrowy 70 Mpz) i B, szachownicy (Fritillaria assyriaca) (genom Mpz) (Buchanan, Gruissem, Jones, 2000) Brak dokładnej korelacji pomiędzy złożonością organizmu i wielkością jego genomu określany jest mianem paradoksu wartości C. Obecnie już wiemy, że w genomach mniej złożonych organizmów (drożdże, C. elegans), przestrzeń jest wykorzystywana oszczędniej, gdyż ich geny leżą bliżej siebie. Inaczej jest w przypadku genomu kukurydzy (Zea mays) (6 600 Mpz) zawartego w 10 chromosomach i genomu pszenicy (Triticum aestivum) ( Mpz), które są odpowiednio ponad dwu- i prawie sześciokrotnie większe od genomu ludzkiego. Genomy jądrowe tych roślin zdominowane są przez elementy powtarzające się, które obejmują cztery główne rodzaje rozproszonych sekwencji powtarzających się: długie rozproszone sekwencje jądrowe LINE (ang. long interspersed nuclear elements); krótkie rozproszone sekwencje jądrowe SINE (ang. short interspersed nuclear elements); długie powtórzenia końcowe LTR (ang. long terminal repeats) i transpozony DNA zawierające sekwencje każdego z pozostałych typów. Genom A. thaliana, małego chwastu z rodziny krzyżowych, zawiera około kilo par zasad (70 Mpz) w przeliczeniu na haploidalny garnitur chromosomów. Genom ten jest tylko około sześciokrotnie większy od genomu drożdży i piętnastokrotnie większy od genomu E. coli. Szacuje się, że rzodkiewnik ma około genów. Liczba genów u pozostałych 4

5 roślin, wg aktualnych poglądów, jest podobna, a podstawowa różnica między rzodkiewnikiem a innymi roślinami polega na tym, że u rzodkiewnika około 80% całkowitego jądrowego DNA stanowią sekwencje występujące w jednej lub w kilku kopiach i są to w większości sekwencje kodujące białka. Niemal całkowity brak w genomie rzodkiewnika rozproszonych sekwencji powtarzających się ułatwia znajdowanie genów, co m. in. zdecydowało o tym, że ten mały chwast stał się modelową rośliną w biologii molekularnej roślin. Genomy organellarne roślin Wielkość genomów mitochondrialnych jest zróżnicowana i niepowiązana ze stopniem złożoności organizmu. Genom mitochondrialny człowieka, liczący par zasad (16,5 kpz), znacząco odbiega wielkością od genomu mitochondrialnego roślin, który u rzodkiewnika liczy 367 kpz, 570 kpz u kukurydzy, a u melona aż kpz. Wielkość genomu chloroplastowego różnych gatunków roślin jest zbliżona i mieści się w przedziale od 120 do 160 kpz (około 200 genów). Przyjmując, że komórka roślinna ma przeciętnie od 200 do nawet 3000 mitochondriów i od kilkudziesięciu do kilkuset chloroplastów, to całkowita ilość DNA w tych organellach jest porównywalna z ilością DNA jądrowego. Np. zakładając, że komórka rzodkiewnika zawiera 500 mitochondriów i 50 chloroplastów, a genomy w tych organellach występują tylko w pojedynczych kopiach, to całkowita ilość organellarnego DNA w 1 komórce będzie wynosić około kpz (189,5 Mpz) ( kpz w mitochondriach i 6000 kpz w chloroplastach), co znaczy, że jest niemal 1,5x większa od ilości DNA zawartego w jądrze każdej komórki diploidalnej (2 x 70 Mpz). Preparatyka DNA W preparatyce DNA wykorzystuje się zdolność białek i cukrowców do tworzenia nierozpuszczalnych kompleksów z dodecylosiarczanem potasu, co umożliwia rozdzielenie tych związków od kwasów nukleinowych. Ponadto, użycie w ostatnim etapie oczyszczania 0,3 M octanu sodowego i 40% izopropanolu pozwala na oddzielenie DNA o wysokiej masie cząsteczkowej od pozostałych w roztworze cukrowców oraz pozwala na uzyskanie DNA w postaci długich włókien, które łatwo można przemyć i wysuszyć w alkoholu etylowym. Otrzymany w tej procedurze wielkocząsteczkowy DNA jest dobrym substratem dla większości enzymów restrykcyjnych używanych w biologii molekularnej i może być wykorzystany do analizy struktury genomu roślinnego. Metoda ta pozwala na preparatykę jądrowego DNA bez ultrawirowania preparatu w gradiencie CsCl. Szybkość oczyszczania oraz niewielka ilość materiału potrzebna do izolacji DNA (mniej niż 1 g tkanki) daje możliwość analizy tego 5

6 związku w bardzo wczesnym stadium rozwoju rośliny. Nieskomplikowana procedura pozwala na jednoczesną analizę dużej ilości prób. Metodę można stosować do izolacji DNA z komórek większości roślin. MATERIAŁ I METODY Odczynniki: A. Homogenizacja tkanki 1. Bufor do homogenizacji (BH): 50 mm Tris-HCl ph 7,5 zawierający 0,3 M sacharozę, 5mM MgCl 2 i 3 mm CaCl 2 2. Bufor do ekstrakcji (BE): 100 mm Tris-HCl ph 8.0 zawierający 50 mm EDTA i 500 mm NaCl B. Denaturacja białek 1. 20% SDS (siarczan dodecylu sodu) 2. 5 M octan potasu C. Wytrącanie DNA Bufor (B1): 50 mm Tris-HCl, ph 8.0 zawierający 10 mm EDTA 3 M octan sodu Izopropanol D. Oczyszczanie DNA 1. Bufor (B2): 10 mm Tris-HCl, ph 8.0 zawierający 1 mm EDTA Materiał: Siewki pszenicy rosnące 5 dni na podłożu z trocin w temperaturze C w całkowitej ciemności. WYKONANIE A. Homogenizacja tkanki i izolacja jąder komórkowych 5g świeżo ściętych etiolowanych siewek pszenicy homogenizować ręcznie w wychłodzonym moździerzu wyłożonym nylonem i gęstą nylonową siatką z 30 ml roztworu homogenizacyjnego o następującym składzie: 50 mm bufor Tris-HCl ph 7,5, 0,3 M sacharoza, 3 mm CaCl 2 i 5 mm MgCl 2 (6 ml roztworu na 1 g tkanki). Po przesączeniu homogenatu przez cztery warstwy gazy, całą objętość rozlać do dwóch probówek wirówkowych, które następnie 6

7 należy dokładnie zrównoważyć. Zrównoważone probówki umieścić w wirówce MPW-350 i wirować 10 minut przy 700 x g (2200 obr/min). W tych warunkach w osadzie otrzymamy surową frakcję jądrową wzbogaconą w jądra komórkowe. Uzyskaną frakcje jąder komórkowych możemy dalej oczyszczać na drodze wirowania przez skokowy gradient gęstości zgodnie z procedurą opisaną poniżej. UWAGA! Wykonywane ćwiczenie nie obejmuje oczyszczania jąder Oczyszczanie jąder z surowej frakcji jądrowej Osad uzyskany po wirowaniu przy 700xg zawiesza się w niewielkiej objętości (1 ml) buforu homogenizacyjnego, a następnie wolno nawarstwia na umieszczony w probówkach wirówkowych roztwór 0,3 M sacharozy i 40% glicerolu przygotowany w 10 mm buforze Tris-HCl, ph 7,5 zawierający dodatkowo 10 mm KCl, 10 mm MgCl 2 i 10 mm 2-merkaptoetanol. Wirowanie surowej frakcji jądrowej przez skokowy gradient gęstości umożliwia usunięcie większości zanieczyszczeń, które pozostają w nadsączu i osadzenie frakcji jąder komórkowych o stosunkowo wysokiej czystości. Po ostrożnym zebraniu nadsączu, osad jąder zawiesza się w odpowiednim środowisku, którego skład zależy od tego do jakich celów będą wykorzystane wyizolowane jądra. Ryc. 4 przedstawia zdjęcie z mikroskopu świetlnego i mikroskopu fluorescencyjnego frakcji jąder uzyskanych z etiolowanych koleoptyli owsa. Ryc. 4. Jądra komórkowe izolowane z etiolowanych siewek owsa. A obraz z mikroskopu świetlnego, B obraz z mikroskopu fluorescencyjnego (Hetmann Praca doktorska 2005) 7

8 B. Preparatyka DNA z izolowanych jąder komórkowych Wytrącanie białek z ekstraktu jądrowego 1. Osad surowej frakcji jąder uzyskany po wirowaniu przy 700 x g zawiesić w 5 ml buforu ekstrakcyjnego (BE) o następującym składzie: 100 mm Tris-HCl, ph 8,0, 50 mm EDTA i 500 mm NaCl. Po dokładnym rozprowadzeniu osadu, uzyskaną zawiesinę jąder podzielić na 5 porcji o objętości 1 ml (każda para ćwiczeniowa pobiera po 1ml zawiesiny do probówki Eppendorfa). 2. Do 1 ml zawiesiny dodać 70 µl 20% roztworu SDS, dobrze wytrząsnąć i umieścić na 10 min w łaźni wodnej o temp C. 3. Do próby dodać 300 µl 5 M roztworu octanu potasu, dokładnie wytrząsnąć, a następnie probówkę umieścić na 10 min w lodzie. 4. Zdenaturowane białka oddzielić wirując próbę 10 min przy x g ( obr/min) Wytrącanie DNA 1. Supernatant uzyskany po odwirowaniu zdenaturowanych białek przenieść do suchej probówki Eppendorfa, a następnie dodać 600 µl wychłodzonego do 20 0 C izopropanolu. 2. Probówkę dokładnie wytrząsnąć, a następnie umieścić na 10 min w zamrażarce w temperaturze 20 0 C. Strącający się w tych warunkach DNA osadzić wirując próbę 10 min przy x g ( obr/min). 3. Pipetą ściągnąć ostrożnie supernatant znajdujący się nad osadem DNA (UWAGA! Należy to robić bardzo uważnie, tak żeby nie poruszyć osadu DNA). W tym celu najpierw dokładnie obejrzeć dno probówki, znaleźć osad DNA, a następnie koniec pipety włożyć na dno probówki obok osadu DNA. 4. Resztki supernatantu usunąć pozostawiając na jakiś czas probówkę z osadem DNA na bibule filtracyjnej odwróconą do góry dnem. (UWAGA! Nie wytrząsać resztek roztworu, gdyż można odkleić osad DNA od ścianki probówki). 8

9 Oczyszczanie DNA 1. Osad DNA rozpuścić w 0,7 ml roztworu B1 zawierającego: 50 mm bufor Tris-HCl, ph 8,0 i 10 mm EDTA. 2. Nierozpuszczony materiał odwirować w mikrowirówce (wirować 3 min). 3. Ściągnąć ostrożnie pipetą supernatant i przenieść go do suchej probówki Eppendorfa, a następnie dodać 75 µl octanu sodu i 500 µl izopropanolu schłodzonego do 20 0 C. Probówkę starannie wytrząsnąć, a następnie strącający się DNA odwirować w mikrowirówce (wirować 5 min). 4. Uzyskany osad DNA rozpuścić w 100 µl roztworu B2 (10 mm bufor Tris-HCl, ph 8,0 zawierający 1 mm EDTA). Analiza spektrofotometryczna uzyskanego preparatu DNA ocena czystości preparatu 1. Do suchej probówki Eppendorfa pobrać 50 µl otrzymanego roztworu DNA i dodać 950 µl roztworu B2 (10 mm bufor Tris-HCl, ph 8,0 zawierający 1 mm EDTA) (roztwór DNA zostanie rozcieńczony 20-krotnie). 2. W spektrofotometrze Schimadzu UV-160A wyznaczyć widmo absorpcyjne w zakresie nm, a następnie mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm wyznaczyć współczynnik K A (A260 nm /A280 nm ). Jako próby odniesienia używać roztworu B2 (10 mm bufor Tris-HCl, ph 8.0 zawierający 1 mm EDTA). Wartość współczynnika K A określa czystość preparatu DNA. DNA o wysokiej czystości charakteryzuje się wartością K A zbliżoną do 2. Zagadnienia do przygotowania: budowa chemiczna i struktura DNA i RNA genomy jądrowe i organellarne budowa chromatyny organizmów eukariotycznych Literatura: Biochemia JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa,

10 Genomy TA Brown PWN, Warszawa 2001 Biochemistry & Molecular Biology of Plants BB Buchanan, W Gruissem, RL Jones, American Society of Plant Physiologist, Rockville, Maryland,