Prof. dr hab. n. med. Paweł Kamiński Klinika Ginekologii i Ginekologii Onkologicznej Wojskowego Instytutu Medycznego OCENA ROZPRAWY NA STOPIEŃ NAUKOWY DOKTORA NAUK MEDYCZNYCH LEKARZA KRZYSZTOFA WIKTORA pt. Analiza sekwencji mitochondrialnego DNA u pacjentek z endometriozą Warszawa, 26 czerwca 2016 roku 1
Endometrioza jest przewlekłą chorobą ginekologiczną polegającą na ektopowym występowaniu endometrium. Występuje u około 10% kobiet w wieku rozrodczym, a w grupie niepłodnych kobiet nawet u około 50 %. Do chwili obecnej przyczyna endometriozy pozostaje nieznana a patogeneza jest tylko częściowo wyjaśniona. Pośród czynników mogących brać udział w rozwoju endometriozy rozpatruje się czynniki środowiskowe, genetyczne, zaburzenia immunologiczne oraz przewlekły proces zapalny. W ostatnim okresie zwiększyła się liczba doniesień wskazujących na istotną rolę stresu oksydacyjnego w patogenezie endometriozy. Stres oksydacyjny może być odpowiedzialny za lokalne uszkodzenia nabłonka otrzewnej, które mogą sprzyjać przyleganiu i implantacji komórek endometrium. Wytwarzane w zwiększonej ilości wolne rodniki tlenowe (OFR) w warunkach stresu oksydacyjnego mogą powodować uszkodzenia mitochondrialnego DNA i wytworzenie mutacji. Głównym miejscem wytwarzania wolnych rodników tlenowych są mitochondria w których jest zlokalizowany proces fosforylacji oksydacyjnej. Mutacje mitochondrialnego DNA mogą powstać zarówno w linii germinalnej i predysponować do wystąpienia endometriozy, jak również w komórkach somatycznych i brać udział w procesach progresji choroby. Lekarz Krzysztof Wiktor w swojej rozprawie doktorskiej podjął próbę zbadania i analizy charakterystycznych sekwencji mitochondrialnego DNA u kobiet z endometriozą w populacji polskiej. Przedstawiony mi do oceny egzemplarz pracy doktorskiej liczy, łącznie z piśmiennictwem 75 stron wydruku komputerowego. Układ pracy jest typowy i obejmuje następujące rozdziały: wstęp, cel pracy, materiał i metodykę, wyniki badań, omówienie wyników i dyskusję, wnioski, streszczenie w języku polskim i angielskim, piśmiennictwo oraz załączniki. Przed wstępem Doktorant umieścił wykaz skrótów stosowanych w tekście rozprawy. W obszernym wstępie obejmującym 20 stron Doktorant przedstawił epidemiologię i bieżące poglądy na patogenezę endometriozy, zwłaszcza w aspekcie potencjalnego wpływu stresu oksydacyjnego. Stres oksydacyjny w przypadkach endometriozy rozpoczyna się lokalnie w jamie otrzewnowej a zasadnicze znaczenie w jego zapoczątkowaniu odgrywają erytrocyty i fragmenty endometrium przeniesione podczas wstecznego miesiączkowania. Autor omówił ponadto piśmiennictwo od momentu pierwszego opisu genomu mitochondrialnego dokonanego przez 2
Andersona w 1981 roku oraz dotychczasowe badania mitochondrialnego DNA w endometriozie. Lekarz Krzysztof Wiktor wykorzystując przedstawione we wstępie różne aspekty omawianego zagadnienia, sformułował cel badawczy swojej rozprawy, którym było stwierdzenie występowania charakterystycznych mutacji w obrębie mitochondrialnego DNA u kobiet z endometriozą w populacji polskiej. W rozdziale Materiał i Metodyka Autor charakteryzuje grupę badaną. Badaniami objęto 18 pacjentek leczonych operacyjnie z powodu potwierdzonej badaniem histologicznym endometriozy (torbieli endometrialnych jajników) w II Katedrze i Klinice Ginekologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie i Oddziale Ginekologii i Położnictwa Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. Stefana Kardynała Wyszyńskiego w Lublinie. Materiał do badań stanowiło mitochondrialne DNA z próbek krwi (ok. 300 µl) zabezpieczanych na kartach FTA oraz z wycinków tkanek zmienionych chorobowo. Materiał tkankowy zamrażano i przechowywano w stanie zamrożenia (-70 stopni C), zaś próbki krwi zabezpieczano na kartach FTA (Whatman, Brentford, UK) i przechowywano w temperaturze pokojowej do czasu przeprowadzenia badań. Badania sekwencji pełnych genomów mitochondrialnych przeprowadzono w Zakładzie Genetyki Molekularnej i Sądowej Collegium Medicum im. Ludwika Rydigera w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Doktorant dokonał szczegółowego opisu metodyki ekstrakcji DNA, amplifikacji i sekwencjonowania mitochondrialnego DNA, oraz rozdziału i analizy produktów sekwencjonowania. Klasyfikacji haplogrupowej otrzymanych sekwencji nukleotydowych dokonano na podstawie danych uzyskanych w wyniku sekwencjonowania 20 666 pełnych genomów mitochondrialnych przez inne zespoły badawcze, zebranych przez van Oven i Kayser (2009 z późniejszą aktualizacją). Drzewo filogenetyczne odzwierciedlające pokrewieństwo pomiędzy pełnymi genomami mitochondrialnymi zrekonstruowano z wykorzystaniem oprogramowania mtphyl v. 4.015 (http://eltsov.org/mtphyl.aspx). Doktorant przeprowadził analizę mutacji peryferyjnych po dokonaniu lokalizacji mutacji peryferyjnych w określonych regionach genomu mitochondrialnego oraz weryfikacji ich statusu (zmiany synonimiczne i niesynonimiczne) co określił z wykorzystaniem oprogramowania MutaAnalyzer załączonego w pakiecie mtphyl v. 3.520 (http://eltsov.org/mtphyl.aspx) oraz oprogramowania MitoAnalyzer (National 3
Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD, USA; http://www.cstl.nist.gov/biotech./strbase/mitoanalyzer.html). Współczynnik ewolucyjnej konserwatywności (ang. Conservation index; CI) pozycji aminokwasowej w białku (szacowany na podstawie opracowania Ruiz- Pesiniego i wsp., 2004) wyznaczono za pomocą oprogramowania MutaAnalyzer zawartego w pakiecie mtphyl v. 3.520 (http://eltsov.org/mtphyl.aspx). Wartość współczynnika patogeniczności (ang. Pathogenicity Index; PI) mutacji niesynonimicznych zaczerpnięto z opracowania opublikowanego przez Pereirę i wsp. (2011). Częstość występowania mutacji peryferyjnych zidentyfikowanych w niniejszej pracy w drzewie filogenetycznym ludzkiego mitochondrialnego DNA określano na podstawie 2196 sekwencji pełnych genomów mitochondrialnych opracowanych przez Soaresa i wsp. (2009). Obecność zaobserwowanych mutacji peryferyjnych w drzewie filogenetycznym ludzkiego mtdna określano na podstawie analizy 20 666 sekwencji pełnych genomów mitochondrialnych, opublikowanych przez różne zespoły badawcze i zreasumowanych w opracowaniu van Ovena i Kaysera (2009) z późniejszą aktualizacją. Częstości haplogrup skalkulowano wykorzystując pakiet Excel. Istotność statystyczną różnic częstości (pod)haplogrup obserwowanych w ogólnej populacji polskiej oraz w populacji pacjentek z endometriozą, określano za pomocą testu chi kwadrat z poprawką Yates a, z wykorzystaniem oprogramowania zawartego w pakiecie STATISTICA v. 9.1 (StatSoft Inc). Dobór materiału badań i metodyka są prawidłowe i nie wzbudzają zastrzeżeń. Pragnę podkreślić, że prawidłowe wykorzystanie przez Doktoranta wyników dotychczasowych badań populacyjnych mitochondrialnego DNA w analizie wyników badań własnych stanowi bardzo dobry przykład dobrej praktyki w badaniach naukowych. Uzyskane wyniki badań Doktorant przedstawił w formie opisowej oraz w 3 tabelach i na 5 rycinach, które nadają prezentacji wyników badań dużą przejrzystość i czytelność. Doktorant przedstawił szczegółową analizę mutacji stwierdzonych u wszystkich badanych pacjentek z uwzględnieniem haplogrup, pozycji mutacji, zmian nukleotydowych i aminokwasowych, oraz współczynników patogenności i konserwatywności. W przeprowadzonych badaniach własnych pełnych sekwencji mitochondrialnego DNA u pacjentek z endometriozą Doktorant nie stwierdził mutacji 4
somatycznych odróżniających mitochondrialne DNA krwi pacjentek z endometriozą i mitochondrialne DNA w tkankach guzów endometrialnych. Ponadto Doktorant w przeprowadzonych badaniach wykazał, że haplotypy należące do haplogrupy T występują istotnie statystycznie częściej wśród pacjentek z endometriozą aniżeli w ogólnej populacji polskiej (p = 0,0389). W omówieniu wyników i dyskusji Doktorant odrębnie przedyskutował stabilność sekwencji pełnych genomów mitochondrialnych w komórkach zmienionych chorobowo u pacjentek z endometriozą oraz różnice w częstości występowania haplogrup mitochondrialnego DNA w populacji pacjentek z endometriozą i ogólnej populacji polskiej. Badania Doktoranta wykazały, że haplotypy należące do haplogrupy T występują istotnie statystycznie częściej wśród pacjentek z endometriozą aniżeli w ogólnej populacji polskiej (p = 0,0389). Na tej podstawie Doktorant wskazał, że obecność mutacji definiujących haplogrupę T, tzn. 10 tranzycji: G709A, G1888A, A4917G, G8697A, T10463C, G13368A, G14 905A, A15 607G, G15928A i C16294T może modulować skłonność do zachorowania na endometriozę. Doktorant w dyskusji przedstawił szczegółową i obszerną analizę filogenetyczną potencjalnie możliwych patogennych wpływów tych tranzycji na funkcjonowanie komórki. Ponadto omówił stwierdzone w badaniach innych autorów asocjacje niektórych spośród tych tranzycji z występowaniem chorób. Umożliwiło to Doktorantowi na wskazanie, że spośród 10 tranzycji definiujących haplogrupę T trzy tranzycje: A4917G; T10463C; G15928A mogą odgrywać istotną rolę w patogenezie endometriozy i mogą mieć największą wartość prognostyczną w określaniu ryzyka wystąpienia endometriozy. Jednakże Autor rozprawy stwierdza, że to wskazanie powinno być potwierdzone w dalszych badaniach na najwyższym poziomie rozdzielczości polegających na analizie sekwencji pełnych genomów mitochondrialnych. Na podstawie analizy uzyskanych wyników badań Doktorant wysunął cztery wnioski wynikające z przeprowadzonych badań, z których pierwszy ma wartość poznawczą oraz trzy pozostałe wnioski, które mają wartość poznawczą i mogą mieć znaczenie w praktyce klinicznej. We wniosku pierwszym Doktorant stwierdził, że sekwencje pełnych genomów mitochondrialnego DNA w tkankach zmienionych chorobowo pacjentek z endometriozą posiadają wysoką stabilność i nie stwierdzono specyficznych dla endometriozy mutacji somatycznych. We wniosku drugim i trzecim stwierdził, że kobiety należące do haplogrupy T posiadają zwiększone ryzyko zachorowania na endometriozę oraz określanie mutacji definiujących tę haplogrupę 5
może być wykorzystane w ocenie ryzyka zachorowania na endometriozę. Ostatni wniosek wskazuje, że tranzycje: A4917G; T10463C; G15928A mogą odgrywać istotną rolę w patogenezie endometriozy i mogą mieć największą wartość prognostyczną w określaniu ryzyka wystąpienia endometriozy. Sądzę, że dla przejrzystości wniosek drugi i trzeci powinien być połączony w jeden łączny wniosek. Piśmiennictwo jest bardzo obszerne i obejmuje 209 pozycji, wśród których dominują artykuły anglojęzyczne, tylko 4 pozycje są w języku polskim - wszystkie prawidłowo dobrane do tematyki pracy. Sądzę, że dysproporcja w zakresie literatury polskojęzycznej i anglojęzycznej jest zbyt wyraźna, ponadto liczba pozycji powinna być ograniczona, albowiem nie wszystkie znajdują swoje odzwierciedlenie w rozprawie doktorskiej. Praca jest bardzo oryginalna, jednak grupa badana obejmująca 18 przypadków jest zbyt mała, nawet w kontekście analizy haplogrup. Mam nadzieję, że w przyszłości Doktorant będzie kontynuował swoje dociekania naukowe i ten materiał będzie bogatszy o analizę kolejnych przypadków. Pragnę podkreślić, iż praca napisana jest poprawnym językiem, staranna edytorsko i stylistycznie. Wydaje mi się jednak, że Autor powinien ponumerować poszczególne pozycje piśmiennictwa co nie jest obligatoryjne, ale jednak ułatwia zapoznanie się z każdą rozprawą doktorską. Wszelkie moje uwagi odnoszące się do powyższej rozprawy doktorskiej nie zmieniają mojej bardzo pozytywnej jej oceny. Badania przeprowadzono po uzyskaniu zgody Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Reasumując, z pełnym przekonaniem stwierdzam, iż przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska lekarza Krzysztofa Wiktora pt. Analiza sekwencji mitochondrialnego DNA u pacjentek z endometriozą jest cennym, aktualnym i rzetelnym opracowaniem podjętego tematu, w którym Doktorant wykazuje umiejętność samodzielnego poruszania się w zawiłej problematyce. Dysertację tę oceniam bardzo pozytywnie, stąd też zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Medycznego w Lublinie o dopuszczenie lekarza Krzysztofa Wiktora do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Z uwagi na pełną oryginalność dokonań Doktoranta wnoszę o wyróżnienie rozprawy doktorskiej. Prof. dr hab. n. med. Paweł Kamiński 6