Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas HPLC-MS Magdalena Biesaga Historia spektrometrii mas 1912 J.J. Thomson otrzymuje widma mas 2, 2, C 2, C 2 1918 - pierwszy spektrometr mas sektorowy, ogniskujący jony wg (A.J. Dempster) 1942 - pierwszy komercyjny spektrometr mas 1953 opracowanie kwadrupola i pułapki jonowej (Paul & Steinwedel) 1956 pierwszy GC-MS 1958 pierwszy TF 1968 pierwszy komercyjny kwadrupol 1974 pierwszy spektrometr cyklotronowego rezonansu FTICR, pierwszy LC/MS 1975 pierwsze komercyjne GC/MS 1982 pierwsze widmo insuliny (575 Da) i pierwszy komercyjny QQQ 1987 MALDI (Karas&Hillenkamp) 1988 ESI MS dla białek >2 Da (Fenn) 2 MS makromolekuł >1 6 Da 25 - cyklotronowy ortbitrap(makorov) Wydział Chemii Uniwersytet Warszawski Analytical Chemistry, Vol. 8, o. 15, August 1, 28 Historia spektrometrii mas agrody obla Po co potrzebna jest spektrometria mas Rok Rozdzielczość 1913 13 Thomson 1918 1 Dempster 1919 13 Aston 1937 2 Aston 1991 2 1 8 Marshall Identyfikacja nieznanych związków Potwierdzenie obecności znanych związków (wykluczenie pomyłki z powodu koelucji) Informacje dotyczące związku, których nie dostarcza żaden inny detektor np. masa molekularna, skład atomowy, Selektywny i specyficzny detektor, która pozwala identyfikować i oznaczać ilościowo związki, które są nierozdzielone (skrócenie czasu analizy) Czuły detektor obniżenie LD graniczenia: drogi detektor również przy eksploatacji, wrażliwy na zanieczyszczenia (jednorazowe fiolki, septy, itp.), wymaga doświadczonego operatora Analytical Chemistry, Vol. 8, o. 15, August 1, 28 Zastosowanie LC/MS Profil izotopowy masa monoizotopowa Masa molekularna = średnia masa np. C8H632 M śr = 221,4 g/mol Masa monoizotopowa spektrometr mas pokazuje tylko masy monoizotopowe C8H632 M=219.96942 -Q1: 13 MCA scans from Sample 43 (2-4 D Q1) of 4-12-11.wiff (Turbo Spray), Smoothed 8.3e6 8.e6 12 C 8 H 5 35 2 3-218.8 Max. 8.3e6 cps. 7.5e6 7.e6 6.5e6 6.e6 12 C 8 H 5 35 37 3-221. 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 12 C 8 H 5 37 2 3-1.e6 22 223. 221.9 5.e5 24.2 29. 224. 2 22 24 26 28 21 212 214 216 218 22 222 224 226 228 23 1
Detector A, Channel 1 from Sample 5 (mix-55) of 3-1-7.wiff Max. 357.. 357 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2-2 -4-6 1.43 6.84 4.73 5.22 7.35 11.15 11.713.8 15.17 24.51 28.5 2.45 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 TIC of MRM (13 pairs): Exp 1, from Sample 5 (mix-55) of 3-1-7.wiff (Heated ebulizer) 7 65 6 55 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 7.18 13.24 13.58 15.73 28.96 29.66 32.25 31.82 31.29 3.96 3.45 3.15 32.16 37.72 41.4 Max. 71 cps. 31.14 28.34 7.43 1.59 19.64 33.74 4.19 24.5 42.81 3.4 5.2 2.56 17.35.6 9.99 1.82 35.84 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 24.93 27.3 37.86 38.5 38.27 4.83 38.64 41.11 41.32 41.73 -Q1: 3.94 min from Sample 16 (ferulic5) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5-59. 3 4.e5-6. 2-44.2 2.e5-76.2-131.5 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22-15.1 1 9 8 C 2 H 4 7 6 5 4 3 2 1 279 28 281 282 283 284 Profil izotopowy 1 C 4 H 1 8 C 6 H 8 9 8 7 6 5 4 3 2 1 56 561 562 563 564 565 566 9 8 7 6 5 4 3 2 1 8 81 82 83 84 85 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e5 1.5e5 1.e5 5.e4 Po co potrzebny jest MS? identyfikacja [MH] =295 295. [Ma] =317 [MK] =333 295.9 317.1 293.8 296.4 292.9 315.9 318.4 332.8 285 29 295 3 35 31 315 32 325 33 335 -Q3: Exp 4, 5.177 min from Sample 1 (red bull light) of 4-11-1 kal.wiff (Turbo Spray), Smoothed C 9 H 8 C 1 H 8 C 12 H 8 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 116 1161 1162 1163 1164 1165 128 1281 1282 1283 1284 1285 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 152 1521 1522 1523 1524 1525 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 [M-H] - =293 293.3 Związek o masie 294 292.8 294.2 285 29 295 3 35 31 315 32 325 33 335 Po co potrzebny jest MS? koelucja Po co potrzebny jest MS? koelucja H3C H H Detector A, Channel 1 from Sample 21 (pomidor21) of pestycydy.wiff Max. 2.5e4. 7 CH3 65 6 55 5 5.14 Pomidor linia niebieska Wzorce linia czerwona 45 4 AU/uV 35 1.96 3 39.23 25 2 38.24 15 32.24 1 5 Identyfikacja 3 związków nierozdzielonych przez HPLC 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 Czas retencji jak dla symazyny, ale widmo MS zupełnie inne!! Po co potrzebny jest MS? czułość Idea spektrometrii mas Kolumna: Luna C-18 (2) Eluent: octan amonuac Przepływ:,3 ml/min Próbka: 5 ng standard AU/uV UV 254 nm 3.1 18.6 22.18 33.32 33.77 37.42 32.83 38.41 34.94 4.1 Jonizacja Fragmentacja Analiza masy Detekcja MS 2
MS versus MS/MS Widmo mas -Q1: 3.94 min from Sample 16 (ferulic 5) o f Da ta SET1.wiff (Turbo Spray) 3.4 e6 3.2 e6 3. e6 [M-H] - 2.8 e6 2.6 e6 2.4 e6 2.2 e6 2. e6 1.8 e6 1.6 e6 1.4 e6 H 3 C Kwas ferulowy -15.1 -CH 3 1.2 e6 1. e6 8. e5 -C 2 6. e5-59.3 4. e5 2. e5-7 6.2-131.5-6.2 -CH 3 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22-44.2 -C 2 Widmo mas białek -cytochrom C Jak rozpoznać masę molekularną [M12H] 12 [M11H] 11 [M9H]9 [M8H] 8 -Q3: Exp 2, 7.53 min from Sample 3 (MIx flawonoli 1) of 22-9-8.wiff (Turbo Spray) 9.7e5 9.e5 8.e5 7.e5 Tryb jonów ujemnych 69 Max. 9.7e5 cps. 69.3 6.e5 5.e5 4.e5 3.e5 2.e5 M n = M M 1 M = n 2 1 M 1 2 M 1 M 2 M1>M2 Masa cząsteczkowa M1 M2 Ładunek białka 153,7 136, 8 12186 136, 1224,5 9 1228 1224,5 1113,3 1 12248 1113,3 12,7 11 1226 12,7 942,2 12 12238 942,2 875,1 13 12274 875,1 816,8 14 12245 816,8 765,9 15 12274 765,9 72,8 16 12224 72,8 68,8 17 1225 68,8 645,1 18 12283 645,1 613,2 19 1238 613,2 584,3 2 12376 69.1 96.8 1.e5 29.2 377. 112.8 579. 175.1 285. 219.2 316.9 345.2 92.9 447.2 243.2 147. 612.5 42.1 547.1 647.3 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 Q3: Exp 3, 7.81 min from Sample 3 (MIx flawonoli 1) of 22-9-8.wiff (Turbo Spray) Max. 7.4e5 cps. 7.4e5 7.e5 6.e5 5.e5 4.e5 3.e5 2.e5 1.e5 Tryb jonów dodatnich 633.3 33.1 84.9 149.1 81.4 94.9 211.3 67.3 91.1 141. 163.3 177.2 251.4 273.5 31.2 331.3 373.4 387.3 413.5 465.3 523.6 63.4 214.9 455.1 649.5 59.3 528.1 569.4 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 Jak rozpoznać masę molekularną Schemat tandemowego układu MS/MSQ TRAP -Q3: Exp 2, 8.474 min from Sample 3 (MIx flawonoli 1) of 22-9-8.wiff (Turbo Spray) 3.3e6 3.e6 2.5e6 2.e6 1.e6 Tryb jonów ujemnych 269.1 285 285.1 299 299. Max. 3.3e6 cps. 3,3x1 6 27.8 5.e5 31.1 284.2 315.3 241.9 287.2 366.9 131. 375.2 157. 171.3 248.9 39. 337.1 343.3 15.7 224.9 357.3 213.1 399.2 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 Q3: Exp 3, 8.52 min from Sample 3 (MIx flawonoli 1) of 22-9-8.wiff (Turbo Spray) Tryb jonów dodatnich 31.4 Max. 1.2e6 cps. 1,2x1 6 1.19e6 1.1e6 271 1.e6 9.e5 271.2 8.e5 323 7.e5 287 6.e5 323.2 5.e5 286.1 287.3 293 39 293.3 339 4.e5 3.e5 2.e5 258.4 149.3 211.4 33.3 315.4 33.9 1.e5 279.4 339.2 153.1 177.3 225.3 135.3 365.1 267.1 194.5 373.3 387.4 282.2 247.2 355. 243.4 294.3 43.3 Q3 może pracować jako kwadrupol lub liniowa pułapka jonowa 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 3
LC/MS Spektrometria mas rozwinęła się w narzędzie analityczne o bardzo szerokich możliwościach Sposóbwprowadzania próbki stanowi poważne wyzwanie w technice LC-MS Mechanizmy jonizacji zależą od rodzaju źródła jonów oraz warunków jonizacji a warunki jonizacji wpływają: Parametry pracy komory jonizacyjnej (potencjały elektryczne, temperatura, przepływ gazu) Parametry chromatograficzne (skład i pheluentu, przepływ, rodzaj dodatków) LC/MS w 7 krokach Krok 1: Rozpuszczalniki rozpuścić próbkę w odpowiednim rozpuszczalniku Krok2:Jak dostarczyć próbkę do źródła jonów? różne sposoby: tryb bezpośredni, FIA, HPLC Krok 3: Jonizacja Krok 4: Transport jonów do próżni jony przechodzą przezinterfejspomiędzy ciśnieniem atmosferycznym a próżnią Krok5:Analiza mas Jony są analizowane zgodnie do wartości ( Q1; Q3 ), lub: jako fragmenty w komorze kolizyjnej ( Q2 ) Krok 6: Detekcja Jony wykrywane są przy zastosowaniu powielacza jonów Krok 7: Analiza danych Krok 1: Rozpuszczalniki zalecane (ESI/APCI): Wpływ składu eluentu na jonizację zawartość AC Mieszanina woda/ metanol lub woda/ac Dodatek lotnego buforu: ctan amonu lub mrówczan amonu (2-2 mm) W trybie jonów dodatnich: Dodatek kwasu mrówkowego lub octowego (.1-1%) ułatwia powstawanie jonów protonowanych dodatnich [MH] W trybie jonów ujemnych: Dodatek amoniaku (.1-1%) ułatwia oderwanie protonu -powstawanie jonów ujemnych [M-H] - R. Kostiainen, T.J. Kauppila / J. Chromatogr. A 1216 (29) 685 699 Wpływ składu eluentu na jonizację dodatek octanu amonu In te ns ity, c ps -Q1: 2 MCA scans from Sample 2 (Myricetin Dp-2 -q1) of 11-2-9.wiff (Turbo Spray) 316.9 1.9e5 [M-H] - =317 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 bez octanu amonu Max. 1.9e5 cps. -Q1: 2 MCA scans from Sample 11 (Myricetin z octanem amonu Q1 DP-2) of 11-2-9.wiff (Turbo Spray) 4.e7 3.5e7 3.e7 2.e4 346.7 379.2 31.1 1.e4 318.6 353.1 366. 21.7 253. 315.2 293.3 379.9 255. 281.2 219.1 334.1 348.1 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 2.5e7 In te n sity, cp s 9.9e7 9.5e7 9.e7 8.5e7 8.e7 7.5e7 7.e7 6.5e7 6.e7 5.5e7 5.e7 4.5e7 2.e7 1,9x1 5 364.8 9,9x1 7 H H z octanem amonu 316.8 [M-H] - =317 Max. 9.9e7 cps. Krok 1: Rozpuszczalniki niezalecane Sole i nielotne bufory: ah 2 P 4, a, bufor fosforanowyetc. Kwasy nieorganiczne: Kwas solny, kwas siarkowyetc. Inne związki powszechnie stosowane w HPLC Kwas trifluorooctowy (TFA) -wysokie tło w trybie jonów ujemnych pochodzące od jonu 113 Trietyloamina(nielotna! i łatwo zanieczyszcza aparaturę, przylepia się do powierzchni)-wysokie tło w trybie jonów dodatnich pochodzące od 12 1.5e7 364.9 3.9 1.e7 347. 379. 5.e6 314.8 333. 366.1 112.7 118.8 136.9 14.9 183.1 255.1 151. 168.8 178.8 199. 211. 216.8 227. 241.1 269.1 281. 293.1 31.9 348. 384.9 398.9 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 4
Krok 2: Jak doprowadzić próbkę do źródła jonów Krok 3: trzymywanie jonów sposoby jonizacji Tryb ciągły: Ciągły przepływ z wykorzystaniem dodatkowej pompy Przepływ 5-1 µl/min ptymalizacja parametrów dla analitu Analiza przepływowa ( FIA ): Próbka jest wstrzykiwana do eluentu tłoczonego przez pompy HPLC ptymalizacja parametrów źródła LCMS: Składniki próbki rozdzielane są na kolumnie i wyciek wchodzi bezpośrednio do źródła jonów Rozdzielenie składników na kolumnie ułatwia identyfikację analitów przez selektywny detektor MS Elektrorozpylanie(ESI) Jonizacja poprzez zastosowanie wysokiego napięcia Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) Jonizacja pod wpływem wyładowań koronowych Fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (APPI) Jonizacja pod wpływem promieniowania UV Jonizacja przez desorpcję laserową z udziałem matrycy (MALDI) Źródło jonów, stożek (skimmer) i Q Mechanizmy jonizacji Kapilara Turbogas Ścieki ESI elektrorozpylanie APCI jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym APPI fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym Sposoby jonizacji Elektrorozpylanie (ESI) APPI ESI APCI Możliwe do uzyskania jony pseudomolekularne Tryb jonów dodatnich: Protonowane jony pseudomolekularne [MH] Addukty z Jonami metali alkalicznych[ma], [MK] Jonem amonowym[mh 4 ] Tryb jonów ujemnych: Deprotonowane jony pseudomolekularne [M-H] - Addukty [MHC] -, [MCH 3 C] - 5
Elektrorozpylanie (ESI) ajbardziej łagodny sposób jonizacji dla związków polarnych i jonowych LC ebulizer Gas Atmospheric pressure Vacuum High Voltage TurboV heaters Curtain Gas Jonizacja chemiczna pod cisnieniematmosferycznym (APCI) Jonizacja z wykorzystaniem wyładowań koronowych Trójstopniowy proces jonizacji: 1. Jonizacja cząsteczek gazu: 2, 2 Evaporation (TurboV heaters) Mass Analyzer 2. Zjonizowany gaz jonizuje cząsteczki rozpuszczalnika: H 3, CH 3 2 Exhaust Formation of charged droplets Coulomb- Explosion rifice Curtain Gas 3. CH 3 2 i/lubr H 3 przekazują proton docząsteczek analitu: [MH] Jonizacja chemiczna pod cisnieniematmosferycznym (APCI) Jonizacja przez desorpcję laserową z udziałem matrycy (MALDI) LC ebulizer Gas Atmospheric pressure Vacuum łagodny sposób jonizacji, Solvent Analyte powstają tylko jony jednokrotnie naładowane, 5 C Curtain Gas brak fragmentacji w źródle Corona Discharge eedle X X Ionization of solvent molecules Mass Analyzer M Exhaust Reaction with analyte molecules; Formation of clusters Curtain Gas Declustering Metoda dla związków średnio i mało polarnych Metoda dla związków nielotnych, głównie o dużych masach (białka, peptydy, oligosacharydy, oligonukleotydy) o masach do 1 kda Jak dobrać sposób jonizacji: ESI? Jak dobrać sposób jonizacji: APCI? AU/uV Detector A, Channel 1 from Sample 2 (RDPP2-6h) of 13-2-9.wiff Max. 1.e6. 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e5 3.2 5.19 6.41 14.15 15.99 21.73 23.31 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 TIC of -Q1: Exp 1, from Sample 2 (RDPP2-6h) of 13-2-9.wiff (Turbo Spray) Max. 1.1e8 cps. 1.e8 8.e7 6.e7 4.e7 2.e7 2.49 3.5 11.34 11.86 18.34 19.4 23.6 27.9 22. 28.19 24.14 9 31.71 1 34.23 11 36.28 12 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 TIC of Q1: Exp 2, from Sample 2 (RDPP2-6h) of 13-2-9.wiff (Turbo Spray) Max. 4.6e8 cps. 4.6e8 4.e8 3.e8 2.e8 1.e8 UV 1 -ESI-MS ESI-MS??? 9.82 11.85 2 3 16.27 3 22.4 22.85 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 28.26 16.27 14.44 32.3 16.76 4??? 4 2 3?? 5 6 6 45 6 7 8 31.35 7 7 9 13 24.1 26.12 18.35 29.1 33.57 37.138.44 39.36 41.98 43.4 46.85 AU/uV Detector A, Channel 1 from Sample 2 (RDPP2-6h) of 12-2-9.wiff Max. 1.e6. 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e5 3.18 5.17 6.37 14.8 15.92 21.64 23.21 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 TIC of -Q1: Exp 1, from Sample 2 (RDPP2-6h) of 12-2-9.wiff (Heated ebulizer) Max. 7.6e7 cps. 7.6e7 6.e7 4.e7 2.e7 1.15 16.2 2.58 22.76 27.78 9 31.58 1 34.1 11 36.1 12 35.89 35.44 38.81 39.27 43.78 34.1 41.4 47.32 49.36 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 TIC of Q1: Exp 2, from Sample 2 (RDPP2-6h) of 12-2-9.wiff (Heated ebulizer) Max. 1.3e8 cps. 1.3e8 1.e8 5.e7 UV 1 -APCI-MS APCI-MS 2 3 16.24 31.39 27.36 4.98 22.89 4.58 8.42 8.93.21 14.34 18.97 7.15 11.62 28 3 3 4 4 5 6 6 7 523.5 26.65 7 8 31.29 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 28.9 7 31.81 31.48 9 13 36.11 28.12 21.89 34.4 31.88 41.63 42.59 39.98 44.32 46.86 49.28 6
Krok 4: Transport jonów do próżni - bez próżni nie ma spektrometrii mas! Krok 5: Analizatory mas Trzy stopnie próżni: Area R-Skimmer (ca. 1 to2 torr) Area Q (some Millitorr) Area Q1/Q2/Q3/CEM (ca..9 x 1-5 torr) Spektrometry sektorowe: magnetyczne, elektryczne Spektrometry kwadrupolowe, oktapolowe itd Pułapki jonowe (QIT oraz LIT) Spektrometry czasu przelotu (TF) Spektrometry rezonansu cyklotronowego (ICR) Krok 5: Analizatory mas Jony wyprodukowane w źródle jonów są analizowane przez analizator mas Kwadrupol może: Transportować jony (RF) Skanować jony (sortować pod względem wartości ) Wybierać jony (np. tylko jedną określoną wartość ) Pułapka jonowa może: Zatrzymać jony(zebrać) i skanować jony (MS) Zatrzymać, wyizolować, wzbudzić, fragmentować, skanować jony(ms/ms) Zasada działania analizatora kwadrupolowego Cztery idealnie równoległe pręty: do których przyłożone jest napięcie prądu stałego (DC) oraz nakłada się potencjał zmieniający się z częstością radiową (RF) Zmiana polaryzacji powoduje, że jony poruszają się pomiędzy prętami kwadrupola. Różnica potencjałów przyspiesza cyrkulujące jony wzdłuż kwadrupola detektor trajektoria stabilna trajektoria niestabilna źródło Prąd stały i przemienny Tandemowy analizator mas Q TRAP System Zasada działania liniowej pułapki jonowej Zatrzymanie jonów Jonywchodzą do pułapki i są utrzymane przez zmieniające się pole (RF); jony nie mogą opuścić pułapkibo są przyłożone odpowiednie potencjały na wlocie/wylocie Skanowanie owe jony nie mogą wejść do pułapki ze względu na barierę potencjału Jony opuszczają pułapkę zgodnie ze zmieniającą się częstotliwością Fragmentacja Można wybrać tylko jeden jon, który wejdzie do pułapki, zostanie poddany fragmentacji i określone zostaną produkty (MS n ) 7
Schemat liniowej pułapki jonowej Analizator czasu przelotu - TF Radial Trapping simultaneously Ramp EXB E k = qv= mv 2 /2 Axial Trapping Axial Trapping (EXB) v = (2qV/m) 1/2 t = L/v = L (m/2qv) 1/2 AF3 Ramped Radial Trapping Przykładowe czasy przelotu: 2 μsec 118 46 μsec- 622 9 μsec- 2421 Krok 5: Analiza jonów i fragmentacja Krok 6: Detekcja aładowany jon może rozpaść się na naładowany fragment i fragment obojętny: AB A andb AB - A - andb Może zachodzić dalsza fragmentacja Fragmentacja może zachodzić: W wyniku zderzeń jonów z gazem kurtynowym (osłonowym) w źródle jonów W komorze kolizyjnej (= Q2) zderzenia z gazem kolizyjnym W pułapce jonowej(= Q3 ) Ion Path CEM CEM Horn Voltage (-) CEM Bias Voltage () DF (Deflector) CEM (Continuous Electron Multiplier) Ion generates electron cascade in the horn DF 1 Mž 1 pf 1 kv Signal utput Signal Handling Board System Controller (in System Electronics Box) Droga jonów: kwadrupole i potencjały Typy skanowań za pomocą pojedynczego analizatora Single MS DP SK EP IQ1 Quad 1 (IE1) CEP CXP Quad 3 (IE3) EXB CEM ST LIAC (CE) DF Interface Lens DP = Declustering Potential (orifice plate) SK = Skimmer EP = Entrance Potential (Q lens) IQ1= Interquad Lens 1 Detector CEM = Continuous Electron Multiplier DF = Deflector Lens of the Quadrupole rail ST = Stubbies Quad 1 = First mass filter (IE1) CEP = Cell Entrance Potential LIAC = Collision cell (CE), Quad 2 CXP = Cell Exit Potential Quad 3 = Second mass filter (IE3) EXB = Exit Barrier 8
XIC of -Q1 MI (1 ion): 218.9 amu from Sample 1 (TuneSampleame) of 2,4-D_DP_eg.wiff (Turbo Spray) 1.25e6 1.2e6 1.15e6 1.1e6 1.e6 9.5e5 9.e5 8.5e5 8.e5 7.5e5 7.e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e5 1.5e5 1.e5 5.e4 Max. 1.3e6 cps. -38-36 -34-32 -3-28 -26-24 -22-2 -18-16 -14-12 -1-8 -6-4 -2 DP, Volts -14.48 -Q1: 5 MCA scans from Sample 1 (2,4 D DP optimum) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 7.e6 7.2e6 6.5e6 6.e6 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 1.e6 5.e5 13.1 Max. 7.2e6 cps. 16.8 114.9 151.9 163. 171. 219.9 14.8 222. 119.1 135.1 18.1 126.7 143.3 157. 164.8 119.9 195.2 2.1 213.1 217.1 13.8 128. 146.2 173. 177.2 178.8 185. 29. 224. 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 -Q1: 5 MCA scans from Sample 2 (2,4 D DP 8) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 9.9e6 9.5e6 9.e6 8.5e6 8.e6 7.5e6 7.e6 6.5e6 6.e6 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 126.8 16.9 163.1 164.7 22.9 219.1 222.8 Max. 9.9e6 cps. 125.4 1.e6 161.9 5.e5 218.5 142.8 157. 22.8 13.1 17.9 11.7 122.1 128.2 145.2 166. 25. 129.4 14.1 176.9 18.8 185.2 192.9 194.9 23.3 29.3 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 -EMS: 4 MCA scans from Sample 5 (2,4 D DP optimum EMS) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 5.2e6 5.3e6 5.e6 4.8e6 4.6e6 4.4e6 4.2e6 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 161.4 163.4 Max. 5.3e6 cps. 8.e5 165.4 6.e5 162.4 4.e5 143.5 22.5 223.4 115.4 157.6 164.4 2.e5 129.5 138.4 171.5 17.4 127.3 152.5 177.5 179.3 215.5 11.3 122.5 136.8 145.6 17.5 186.6 191.6 199.4 21.4 214.3 224.1 227.8 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 219.4 221.4 -Q3: 5 MCA scans from Sample 4 (2,4 D DP optimum Q3) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 5.2e6 5.3e6 5.e6 4.8e6 4.6e6 4.4e6 4.2e6 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 16.8 -Q3: 5 MCA scans from Sample 4 (2,4 D DP optimum Q3) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 2.3e6 2.2e6 2.1e6 2.e6 1.9e6 1.8e6 1.7e6 1.6e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 5.e5 4.e5 3.e5 16.8 162.7 162. Max. 2.3e6 cps. 2.e5 223.3 164.9 216.9 221.8 1.e5 11.2 114.6 128.9 143.2 157. 159.3 113.2 121.1 171.3 177. 185. 13.1 14.7 152.1 166.2 187.4 199. 2.5 28.9 224.6 227.4 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 Max. 2.3e6 cps. 8.e5 162.7 6.e5 219.6 4.e5 218.1 2.e5 222.8 11.2 114.6 164.9 113.2 121.1 128.9 159.3 136. 14.7 143.2 152.1 157. 171.3 177. 185. 187.4 199. 2.5 28.9 213.9 227.4 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 22.8 218.9 22.8 218.9 219.6 218.1 Wpływ DP na widmo MS Rozdzielczość w MS Intensity, cps [M-H] - =219 Fragmentacja w źródle jonów In ten sity, cps Inten sity, cps DP=5 V DP=8 =125 [M-H] - =219 =161 [M-H] - =219 R s = masa szerokosc piku 5% m m Lowresolution Rs=5 co oznacza, że analizator rozrózniajony o 5 i 5,1 lub 5 i 51 (kwadrupol, pułapka jonowa) High resolution Rs=15, co oznacza, że można rozróżnić jony o 5 i 53 lub 5 i 533 (TF, orbitrap, ICRs) = Rozdzielczość - porównanie Pułapka jonowa versus kwadrupol I nt en sity, cp s IT =161 [M-H]-=219 I nt en sity, cp s Q [M-H]-=219 =161 I nt en sity, cp s =161 [M-H]-=219 Pojedyncze analizatory - porównanie Monitorowanie wybranego jonu (SIM) Kwadrupol: skanuje jony, wybiera jony, Rs 5-1 (masa nominalna) Pułapka: skanuje jony, wybiera jony, zatrzymuje jony, fragmentuje jony (MS/MS) Rs 1-2 (masa nominalna) TF: skanuje jony, określa dokładną masę Rs 5-3 (masa dokładna) rbitrap(ms-ftir) skanuje, wybiera jony, zatrzymuje jony, fragmentuje jony (MS/MS) Rs 5-3 (masa dokładna) XIC of -Q3: Exp 2, 196.4 to 196.9 amu from Sample 15 (mix odnosnik new ph2 4 Me) of 9-4-11.wiff (Turbo Spray), Smoothed Max. 3.2e5 cps. 8.12 3.e5 2.5e5 2.e5 1.5e5 1.e5 5.e4 2.82 5.87 12.48 13.67 25.34 26.54 28.77 32.69 35.27 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 XIC of -Q3: Exp 2, 178.9 to 179.4 amu from Sample 15 (mix odnosnik new ph2 4 Me) of 9-4-11.wiff (Turbo Spray), Smoothed Max. 1.9e6 cps. 7.68 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 Kwas syringinowy Kwas kawowy 4.e5 2.e5 17.43 4.98 5.97 13.24 21.67 2.62 11.68 19.77 25.24 35.83 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 9
-MS2 (219.) CE (-3): 21 MCA scans from Sample 1 (2,4 D MS2 CE 3) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 6.5e6 6.e6 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 1.e6 5.e5 125. Max. 6.6e6 cps. 88.9 98.5 11.7 123.7 159.8 175.1 219. 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 -MS2 (219.) CE (-5): 21 MCA scans from Sample 11 (2,4 D MS2 CE 5) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 4. 9e6 4. 8e6 4. 6e6 4. 4e6 4. 2e6 4. e6 3. 8e6 3. 6e6 3. 4e6 3. 2e6 3. e6 2. 8e6 2. 6e6 2. 4e6 2. 2e6 2. e6 1. 8e6 1. 6e6 1. 4e6 1. 2e6 1. e6 8. e5 6. e5 4. e5 2. e5 16.8 Max. 4.9e6 cps. 161.7 174.9 217.4 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 16.7 219. XIC of -MRM (57 pairs): Exp 1, 179./135. amu from Sample 14 (USe 3 min jablko mix) of 1-3-11.wiff (Turbo Spray) 46 44 42 4 38 36 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 6.97 Max. 476.7 cps. 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 Fragmentacja MS2 Fragmentacja jonów MS2 Intens ity, cps I nten sit y, c ps CE=3 ev CE=5 ev 125 161 161 [M-H] - =219 [M-H] - =219 1.6x1 5 1.4x1 5 1.2x1 5 1.x1 5 8.x1 4 6.x1 4 4.x1 4 2.x1 4 219/161 219/125 219/89 219/61 158.8-1 -9-8 -7-6 -5-4 -3-2 -1 energia kolizyjna, ev Intensywność sygnału, cps 6.x1 5 H - 161 - H C 2H 2 2 C 6H 58.55 Da 89.27 Da H C 6H 3 2 4.x1 5 C C 6H 2-16.9561 Da C 124.9794 Da C H H C 5H H 61.78 Da 125 219 2.x1 5 89 61 6 8 1 12 14 16 18 2 22 Monitorowanie wybranych reakcji (MRM) (Multiple Reaction Monitoring) MRM herbicydów w ekstrakcie jabłka z dodatkiem wzorca H3C H Q1: SIM Q2: Fragmentacja Q3: SIM Intens ity, c ps Kwas kawowy H 179/135 utrata C 2 XIC of MRM (13 pairs): Exp 1, 22./132. amu from Sample 47 (jablko faszerowane pestycy 247) of 3-1-7.wiff (Heated ebulizer) 125 12 115 11 15 1 95 XIC of MRM (12 pairs) Max. 19 cps. H CH3 9 Redukcja szumu, dwukrotne filtrowanie mas wzrost S/ Analiza ilościowa poprzez definicję par MRM-( Q1/Q3 ) 85 8 75 7 65 6 55 5 45 4 35 3 25 2 6.75 15 6.39 7.8 1 5 1.32 2.92 4.27 4.58 8.38 1.2 12.4113.81 17.54 2.47 21.29 22.99 27.18 29.24 29.83 32.64 34.12 36.86 37.96 4.62 43.43 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 kreślanie jonu pseudomolekularnego jonu o 89 Tryb utrata obojętnej cząsteczki (L) Q1: Skan Q2: Fragmentacja Q3: SIM (filtrowanie jonów o określonym ) -Prec (89.): 1 MCA scans from Sample 29 (2 4 D Prec of 89 CE 3) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 2.e4 1.9e4 wskazuje jony z Q1, które 1.8e4dają określony fragment Jon o 89 powstaje z jonów o 125; 161; 218 In te n sity, cp s 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.e4 9 161 161.4 219 218.9 Max. 2.e4 cps. 221.2 Q1: Skan Q2: Fragmentacja -L (36.): 13 MCA scans from Sample 38 (2 4_D L 36 CE 1) of 4-12-11.wiff (Turbo Spray) 1.e5 Q3: Skan równoległydo Q1 9.5e4 9.e4 Wskazuje jony, które utraciły cząsteczkę 8.5e4 obojętną w Q2 8.e4 7.5e4 7.e4 6.5e4 6.e4 5.5e4 5.e4 4.5e4 2,4-D utrata H(36): Jony 161 i 125 tracą H 161 161. Max. 1.e5 cps. 8 7 163.2 4.e4 3.5e4 3.e4 6 5 4 3 2 125 135.8 165. 211.5 219.8 223.3 2.5e4 2.e4 1.5e4 1.e4 5 125 124.9 162.9 162.1 164.2 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 1
-MS3 (219.),(161.): 16 MCA scans from Sample 21 (2 4-D MS3 DP optimum Ce 18 AF2 4) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.e4 8 6 4 2 Max. 3.6e4 cps. 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 115 12 125 13 135 14 145 15 155 16 165 17 -MS3 (219.),(161.): 1 MCA scans from Sample 22 (2 4-D MS3 DP optimum Ce 18 AF2 6) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 2.5e4 2.4e4 2.3e4 2.2e4 2.1e4 2.e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.e4 9 8 7 6 5 4 3 2 125.3 161.3 161.9 Max. 2.5e4 cps. 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 115 12 125 13 135 14 145 15 155 16 165 17 125.3 -MS3 (161.),(125.): 31 MCA scans from Sample 14 (MS4 2-4-D 161-125 AF2 2) of 3-9-11.wiff (Turbo Spray) 4 39 38 37 36 35 34 33 32 31 3 29 28 27 26 25 24 23 22 21 2 19 18 17 16 15 14 -MS3 (161.),(125.): 8 MCA scans from Sample 25 (2 4 D MS4 CE 3 2-19-161-125 AF2 4) of 2-12-11.wiff (Turbo Spray) 66 64 62 6 58 56 54 52 5 48 46 44 42 4 38 36 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 89.1 89.2 Max. 4 cps. 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 115 12 125 13 Max. 6666.7 cps. 14 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 115 12 125 13 125.3 MS3 QTrap MS4 QTrap Jon 1= 219 (Q1) Jon 2 161 (Q2) Fragmentacja 161 w IT 219 161 125 In ten si ty, c ps Intens ity, c ps AF2=4 ev AF2=6 ev 161 125 125 Jon 1= 219 Jon 2=161 (źródło jonów DP-8) Fragmentacja 161 w komorze kolizyjnej Fragmentacja 125 w pułapce (IT) 219 161 125 89 219-161 (Q1)-161(Q2)-IT (fragmentacja 125) Intens ity, c ps Intens ity, c ps AF2= 2eV AF2=3 ev 89 89 125 LC- MS/MS Zastosowanie LC/MS analiza propolisu TIC: from Sample 2 (mix) of 2-11-11.wiff (Turbo Spray) Max. 1.2e7 cps. Detector A, Channel 2 from Sample 2 (mix) of 2-11-11.wiff Max. 3.2e4. 1.e7.13 2.37 TIC of -Q3: Exp 1, from Sample 2 (mix) of 2-11-11.wiff (... Max. 1.e7 cps. 1.e7.13 2.37 TIC of -MS2 (233.) CE (-2): Exp 2, from Sample 2 (mi... Max. 1.7e6 cps. 1.7e6 1.e6 XIC of -MRM (4 pairs): Exp 3, 232.9/125.1 amu from Sa... Max. 1.7e4 cps. 1.7e4 1.e4 XIC of -MRM (4 pairs): Exp 3, 219./161. amu from Sa... Max. 1.3e5 cps. 1.e5 MRM 233/125 MRM 219/161 5.82 5.82 5.83 8.52 8.51 8.56 8.48 AU/uV 3.2e4 2.62 3.59 1.71 -Q3: Exp 1, 8.472 min from Sample 2 (mix) of 2-11-11... Max. 6.4e5 cps. 5.e5 62. 96.9 9.8 112.7 14.9 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 -MS2 (233.) CE (-2): Exp 2, 8.556 min from Sample... Max. 5.3e5 cps. 4.e5 2.e5 125.2 5.48 16.7 8.12 162.8 234.9 161. 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 XIC of -MRM (4 pairs): Exp 3, 219./125. amu from Sa... Max. 1.6e4 cps. 1.6e4 1.e4 XIC of -MRM (4 pairs): Exp 3, 232.9/161.1 amu from Sa... Max. 1.8e5 cps. 1.8e5 1.e5 -Q3 MS2 of 233 MRM 219/125 MRM 233/161 5.37 5.84 8.48 ieznane związki o tych samych parach MRM!!! Zastosowanie LC/MS -ieznane związki o tych samych parach MRM Podziękowania MRM (285/151) Prec (151) ER (3) EPI (3) H H3C W wykładzie zostały wykorzystane materiały: z seminariów firm Agilent, Waters, Brucker, AppliedBiosystem z książek R.A.W.Johnstone, M.E. Rose Spektrometriamas E, de Hoffmann, J. Charette, V. Stroobant Spektrometria mas, Ch. Dass Fundamentals of contemporaty mass spectrometry Wyniki własne otrzymane w Laboratorium badań Strukturalnych Wydziału Chemii UW 11