Co to jest spektrometria mas?

Transkrypt

1

2 Co to jest spektrometria mas? Jest to nowoczesna technika analityczna pozwalająca na dokładne wyznaczenie masy analizowanej substancji Dokładność pomiaru może się wahać od jednego miejsca dziesiętnego m/z (niska rozdzielczość) do 6 miejsc po przecinku (wysoka rozdzielczość) Metodę charakteryzuje wyjątkowo wysoka czułość (piko/femto mole)

3 Co to jest spektrometria mas? Spektrometr masowy Instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) analizowanych substancji

4 Rozdzielczość Masa średnia Masa monoizotopowa

5 Zastosowania Biotechnologia: Farmakologia: analiza białek, peptydów, oligonukleotydów, badanie aktywności enzymów monitorowanie przebiegu syntez i metabolizmu leków Badania kliniczne: badania przesiewowe noworodków przeciwko fenyloketonurii i innym chorobom metabolicznym Toksykologia: określanie stężeń substancji toksycznych i ich metabolitów w płynach ustrojowych Ochrona środowiska: określenie czystości wody, powietrza

6 Zastosowania Inne: Badania antydopingowe: wykrywanie sterydów anabolicznych w moczu zawodników Monitorowanie oddechu pacjenta podczas operacji Wykrywanie obecności w organizmie Helicobacter Pylori (analiza wydychanego powietrza) Badanie autentyczności dzieł sztuki Kontrola procesów chemicznych w przemyśle Diagnostyka chorób Biotechnologia: analiza białek, peptydów (ustalanie sekwencji aminokwasów), badanie aktywności enzymów PROTEOMIKA

7 Spektrometr masowy Wprowadzenie próbki Spektrometr masowy MH + M + M + M + M + M + Źródło jonów Analizator Detektor M - m/z Widmo masowe Komputer

8 Wprowadzenie próbki Poszczególne układy różnią się zależnie od stanu skupienia analizowanej próbki jak również metody jonizacji zastosowanej do analizy. 1. Stan stały: sondy z probówką, płytki (jonizacja typu EI, MALDI) 2. Stan ciekły: zawory wstrzykowe, pompy strzykawkowe, systemy HPLC, elektroforeza kapilarna (jonizacja typu ESI) 3. Stan gazowy: układy chromatografii GC, komory próżniowe (jonizacja typu EI, CI, ICP)

9 Jonizacja jonizacja jony dodatnie [M+nX] n+ : przyłączenie naładowanej cząstki masa większa o masę przyłączonego kationu jony ujemne [M-nH] n- : oderwanie naładowanej cząstki masa mniejsza o masę oderwanego kationu kationorodniki M +. : oddanie elektronu masa praktycznie identyczna z masą wyjściowej cząsteczki

10 Jonizacja jonizacja jony dodatnie [M+nX] n+ : Białka, peptydy Obecność grup NH 2 jony ujemne [M-nH] n- : Sacharydy, oligosacharydy, nukleotydy Obecność grup COO, SO 3 H, H 2 PO 4 kationorodniki M +. : Związki niepolarne o małej masie

11 Jonizacja elektronami EI (electron impact) M + e(70ev) -----> M e włòkno żarowe pròbka jony do analizatora kolektor optyka jonòw

12 Jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie ICP W źródle jonów znajduje się palnik plazmowy (rura kwarcowa) otoczony cewką przez którą płynie prąd zmienny o wysokiej częstotliwości Do plazmy wprowadza się roztwór próbki w postaci areozolu W wyniku wzbudzenia jonów w plazmie przez pole magnetyczne generowane przez prąd płynący wokół rury z plazmą, plazma rozgrzewa się (nawet K) Cząsteczki metalu wprowadzone do plazmy pod wpływem temperatury ulegają jonizacji z wydajnościa 100% Plazma: gaz pozytywnie i negatywnie naładowanych cząstek o równym stężeniu (wypadkowy ładunek wynosi zero). Właściwości tego gazu są kontrolowane przez siły elektromagnetyczne

13 Electrospray ESI zasilanie gaz osuszający analizator masowy anoda katoda stożek Taylora rozpad kropli

14 Electrospray ESI Zastosowanie: Średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej. Zakres Da Detekcja w chromatografii cieczowej (!!!), biochemia, biotechnologia, farmakologia, kontrola antydopingowa

15 MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation

16 MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Laser Źródło jonów V 1 V 2 Analizator Detektor ISD Fragmentacja następuje bezpośrednio w źródle jonów. Nie ma możliwości wyselekcjonowania jonu macierzystego.

17 Anchor Chip Zwiększanie zatężenia próbki Wyższa czułość

18 Desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie DIOS Stosowanie specjalnie spreparowanych płytek z porowatego krzemu (DIOS) lub porowatego ditlenku krzemu (DIOSD) pozwala na bezpośrednią jonizację próbki, bez używania matrycy Funkcje matrycy pełni porowaty krzem

19 Płytka krzemowa używana w eksperymentach DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie. Zdjęcie wykonano w Laboratorium Mikroskopii Skaningowej z Emisją Polową i Mikroanalizy w ING UJ

20 Ostrza krzemowe (ang. nano towers, NT) Dzięki uprzejmości dr A. Góreckiej- Drzazgi

21 Analizatory Analizator kwadrupolowy (Q) Pułapka jonów (IT) Analizator czasu przelotu (TOF) Analizatory magneto-elektrostatyczne (B/E) Spektrometria cyklotronowego rezonansu jonowego (ICR) Orbitrap

22 Analizator kwadrupolowy (Q)

23 Analizator kwadrupolowy (Q)

24 Pułapka jonów (IT)

25 Pułapka jonów (IT)

26 Analizator czasu przelotu TOF Analizator Reflektor J3 J2 J1 F1 F2 F3 J1 Źródło jonów Detektor

27 Analizator czasu przelotu TOF TRYB Z ODBICIEM TRYB LINIOWY

28 Spektrometria cyklotronowego rezonansu jonowego (ICR)

29 Orbitrap

30 Analizatory - podsumowanie Q IT TOF TOF reflectron FTICR Orbitra p Limit m/z Rozdzielczość FWHM (1 000 m/z) Dokładność 100 ppm 100 ppm 200 ppm 10 ppm < 5 ppm < 5 ppm Praca Ciągła Impulsowa Impulsowa Impulsowa Impulsowa Impulsowa Ciśnienie 10-5 Torr 10-3 Torr 10-6 Torr 10-6 Torr Torr Torr

31 Widmo masowe polimeru

32 Widmo masowe Hemoglobiny

33 Widmo masowe Hemoglobiny

34 Oznaczanie ładunku jonu Da Da Da

35 Związki zawierające brom Br x Br xy (Br 2 ) Br y 79 Br x + 79 Br y = 158 Br xy 81 Br x + 81 Br y = 162 Br xy 79 Br x + 81 Br y = 160 Br xy 81 Br x + 79 Br y = 160 Br xy

36 Związki zawierające brom

37 Fragmentacja (QqQ) Soczewki Żródło jonów Analizator 1 Komora kolizyjna Analizator 2 Detektor 1 Detektor 2

38 MALDI-PSD (TOF/TOF) TOF 1 TOF 2 Analizator Reflektor Źródło jonów LIFT Detektor

39 Widma fragmentacyjne

40 Proces fragmentacji x 1 y 1 z 1 x 2 y 2 z 2 x 3 y 3 z 3 H 2 N R 1 O N H R 2 O H N R 3 O N H R 4 O OH a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3

41 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Wyniki MALDI-PSD x R K * _probki_krakow_CCA_pm16_digested_ \0_D19\1\ LIFT\1SRef A V Q A S G P S V D I/L H S F Y T T Y F S H I/L D V S P G S A Q V K 3 A R x _probki_krakow_CCA_pm16_digested_K-TAG+CAF_Lift_ \0_I19\1\ LIFT\1SRef K-TAG V Q A S G P S V D I/L H S F Y T Sulf m/z

42 Literatura J. Silberring, R. Ekman, Mass spectrometry and hyphenated techniques in neuropeptide research, Willey-Interscience, NY 2002 P.Suder, J. Silberring, Spektrometria mas, Wyd. UJ, Kraków 2006 E. de Hoffman, V. Stroobant, Mass spectrometry, Principles and Applications, Willey, England 2007

43