dr Małgorzata Czerwicka Zakład Analizy Środowiska Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka Wydział Chemii UG

Transkrypt

1 dr Małgorzata Czerwicka Zakład Analizy Środowiska Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka Wydział Chemii UG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2

3 Sir Joseph John Thomson - Uniwersytet w Cambridge odkrycie elektronu odchylenie wiązki elektronów przez pole elektrostatyczne, powstanie pierwszego spektrometru mas 1906 nagroda nobla z fizyki Za badania dotyczące przewodzenia prądu przez gazy

4 skonstruowanie analizatora kwadrupolowego 1956 POŁĄCZENIE CHROMATOGRAFII GAZOWEJ ZE SPEKTROMETRIĄ MAS 1968 powstanie nowej techniki jonizacji przez elektrorozpraszanie (ESI) POŁĄCZENIE MS Z CHROMATOGRAFIĄ CIECZOWĄ (LC-MS) 1985 narodziny techniki desorpcji laserowej w stałej matrycy (MALDI)

5 LAUREACI NAGRODY NOBLA ZA OSIĄGNIĘCIA ZWIĄZANE Z ROZWOJEM SPEKTROMETRII MAS 1. Joseph John Thomson (FIZYKA) Za badania dotyczące przewodzenia prądu przez gazy 2. Francis William Aston (CHEMIA) - Za zbudowanie spektrometru mas i odkrycie wielu niepromieniotwórczych izotopów 3. Wolfgang Paul, Hans Georg Dehmelt (FIZYKA) Za skonstruowanie spektrometru mas z pułapką jonową 4. John Bennet Fenn (ESI), Koichi Tanaka (MALDI) (CHEMIA) - za zastosowanie metod łagodnej jonizacji w badaniach wielkocząsteczkowych biopolimerów /mshistory/mshistory.php

6 UKŁAD WPROWADZENIA PRÓBKI ŹRÓDŁO JONÓW ANALIZATOR DETEKTOR SYSTEM REJESTRACJI DANYCH (KOMPUTER) Int m/z

7 WPROWADZENIE BEZPOŚREDNIE Wloty zimne Wloty gorące Za pomocą sondy WPROWADZENIE POŚREDNIE GC-MS LC-MS

8 WPROWADZENIE BEZPOŚREDNIE

9 WPROWADZENIE POŚREDNIE PRZEZ CHROMATOGRAF

10 STRUMIEŃ ELEKTRONÓW 70 ev OGNISKOWANIE JONÓW UKŁAD WPROWADZENIA PRÓBKI DO ANALIZATORA ŹRÓDŁO JONÓW

11 CI (Chemical Ionisation) chemiczna jonizacja, FD (Field Desorption) jonizacja polem, FAB (Fast Atom Bombardment) jonizacja szybkimi atomami, MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) - desorpcja/jonizacja laserowa w matrycy, ESI (ElectroSpray Ionisation) jonizacja poprzez elektrorozpraszanie, APCI (Atmosferic Pressure Chemical Ionisation) chemiczna jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym

12 wiązka jonów kwadrupole przefiltrowane jony źródło jonów detektor soczewki ogniskujące napięcia DC i RF

13 Pułapka jonów (IT Ion Trap), Analizator czasu przelotu (TOF Time Of Flight), Analizator magnetyczny, Analizator elektryczny (ESA ElectroStatic Analyser), Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (ICR Ion Cyclotrone Resonance, FT-ICR)

14 Detektorem najczęściej jest powielacz elektronów Funkcję rejestratora pełni komputer

15 Zdolność rozdzielczą R spektrometru mas do rozdzielenia dwóch jonów o masach M m i M n wyraża się wzorem: R = M n /(M n - M m ) Spektrometry niskorozdzielcze do m/z = 3000 [R = 3000/( ) = 3000] Spektrometry wysokorozdzielcze do m/z = [R = 250,1933/(250, ,1807) = 19857]

16 Jon molekularny Jony fragmentacyjne

17 Jon/pik podstawowy/ główny

18 Jon izotopowy

19 Cl M+2 32,6% Cl 2 M+2 65,3% M+4 10,6% Cl 3 M+2 97,8% M+4 31,9% M+6 3,5% Br M+2 97,9% Br 2 M+2 195,0% M+4 95,5% Br 3 M+2 293,0% M+4 286,0% M+6 93,4%

20

21 Jon pseudomolekularny=pozorny jon molekularny Jonizacja substancji chemiczna: M + CH 5 + MH + + CH 4 Jonizacja substancji ESI, APCI

22 Przemiatanie (ang. scanning, TIC - Total Ion Current, full scan, RIC - Reconstructed Ion Chromatogram) w którym rejestruje się pełne widma mas między dwiema zadanymi skrajnymi wartościami mas Int. [%] m/z

23 Fragmentografia mas - SIM, SIR (ang. Selected Ion Monitoring, Single Ion Recording) monitorowane są jedynie wybrane jony charakterystyczne dla szukanych związków a nieobecne w widmach związków potencjalnie z nimi interferujących. Jest to metoda, która odznacza się dużo większą czułością i selektywnością niż technika zbierania wszystkich jonów pochodzących z rozpadu danego związku chemicznego (total scanning) ale stosować ją można do substancji o znanych wcześniej widmach.

24 Fragmentografia mas - SIM, SIR Int. [%] m/z

25 Monitorowanie wybranych reakcji fragmentacji MRM, SRM (ang. Multiple Reaction Monitoring, Selected Reaction Monitoring), w której sprawdza się obecność jonów fragmentacyjnych powstałych z danego jonu prekursora. Przewyższa ona czułością TIC i SIM i jest najbardziej miarodajną metodą potwierdzania obecności danego związku z próbce.

26 MS-MS polega na wybraniu jednego z jonów fragmentacyjnych (może być nim także jon molekularny) tzw. JONU IZOLACJA PREKURSORA (MACIERZYSTY, FRAGMENTACJA PIERWOTNY, ang. ANALIZA parent MAS ion), który dalej ulega fragmentacji, tworząc JONY PRODUKTY (CÓRKI, ang. daughter ions,, JON WTÓRNY)

27 WIDMO MS Int. [%] Wybór jonu prekursora Int. [%] m/z WIDMO MS/MS Int. [%] m/z Fragmentacja jonu prekursora m/z

28 Izolacja jonu macierzystego Izolacja/fragmentacja w przestrzeni (ang. tandem in space)- wymaga kilku analizatorów Izolacja/fragmentacja rozdzielona w czasie (ang. tandem in time) utrzymanie jonów w kontrolowanej przestrzeni

29 Określenie struktury produktów degradacji wybranych cieczy jonowych (właściwie kationów wchodzących w ich skład). 1 mm wodny roztwór chlorku 1-etylo-3-metyloimidazoliowego. Warunki degradacji: 0,2 % H 2 O 2 oraz promieniowania UV (2 h). Otrzymane mieszaniny produktów degradacji poddaliśmy analizie HPLC-MS/MS (jonizacja ESI, detektor pułapka jonowa).

30 N N + R

31 O H 3 C HN C H N CH 2 CH 3 O H C H N + 3 C NH CH 2 CH 3 CH 2 CH O m/z 145 CH 2 CH O H N + CH 2 CH 3 CH CH O - H 2 O O + NH m/z 86 m/z 127 CH 2 m/z 72 CH 3 H C H N + 3 CH CH O m/z 72

32

33 N N + R N N + R N N + R

34

35 ANALIZA SULFONAMIDÓW Białk-Bielińska A. Kumirska J., Palavinskas R., Stepnowski P., Talanta. 12/2009; 80(2):947-53

36 ANALIZA SULFONAMIDÓW

37

38 A + -Rozpad homolityczny pojedynczego wiązania -Rozpad heterolityczny pojedynczego wiązania R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

39 A + Rozpad heterolityczny pojedynczego wiązania R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

40 Względna intensywność piku jonu molekularnego zmniejsza się wraz ze wzrostem stopnia rozgałęzienia. C 6 H 14 M = g/mol R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

41 Względna intensywność piku jonu molekularnego, za wyjątkiem estrów kwasów tłuszczowych, w większości przypadków zmniejsza się wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej w szeregu homologicznym. C 6 H 14 C 12 H 26 C 24 H 50 R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

42 Preferowany jest rozpad przy atomie węgla z podstawnikiem alkilowym. Im bardziej podstawiony atom, tym bardziej prawdopodobny rozpad ze względu na wzrastającą trwałości trzeciorzędowego karbokationu w porównaniu z drugo- i pierwszorzędowym. Najbardziej prawdopodobna jest eliminacja w postaci rodnika największego podstawnika przy rozgałęzieniu. R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

43 C 6 H 14 M = g/mol

44 Obecność podwójnych wiązań, układów cyklicznych a w szczególności pierścienia aromatycznego wpływa na stabilizację jonu molekularnego i zwiększa prawdopodobieństwo jego pojawienia się. R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

45 Pierścienie nasycone tracą chętnie podstawnik alkilowy (szczególny przypadek rozgałęzienia) a ładunek dodatni chętniej pozostaje na fragmencie zawierającym pierścień. R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

46 W pierścieniach aromatycznych z podstawnikami alkilowymi bardzo chętnie rozpada się wiązanie w położeniu β względem pierścienia w konsekwencji czego powstaje stabilizowany przez rezonans jon benzylowy (1) lub bardziej prawdopodobny jon tropyliowy (2). (1) (2) R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

47 Wiązanie C-C sąsiadujące z heteroatomem rozpada się, a ładunek pozostaje na fragmencie zawierającym heteroatom, którego niewiążące elektrony uczestniczą w stabilizacji rezonansowej Podczas rozpadu często mają miejsce przegrupowania z eliminacją obojętnej cząsteczki np. monotlenek węgla, alken, woda, amoniak, siarkowodór, kwas cyjanowy, tiol, keten lub alkohol. R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

48 R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

49 R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007 NAJCZĘŚCIEJ SPOTYKANE JONY FRAGMENTACYJNE NAJCZĘŚCIEJ TRACONE FRAGMENTY R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Waraszawa 2007

50 Książkowe Komputerowe: - internetowe - przy spektrometrach mas

51 Int. m/ z Int. Int. m/ z m/ z

52 Techniki łączone ze spektrometrią mas: Chromatografia gazowa - GC Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC Chromatografia cienkowarstwowa TLC Elektroforeza kapilarna - CE

53 Chromatografia gazowa z detektorem MS (GC-MS) - analiza związków lotnych o masach cząsteczkowych do 1000 Da. Krótki zazwyczaj czas analizy może ulec wydłużeniu gdy zaistnieje konieczność przeprowadzenia analizowanych związków w odpowiednie lotne pochodne W metodzie LC-MS, przy zastosowaniu źródła ESI, możliwe jest analizowanie związków o masie nawet kilkuset tysięcy Da

54 Technika MS z jonizacją za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy (ang. Inductively Coupled Plasma ICP) -w tym przypadku jonizacja powoduje całkowity rozpad cząsteczki i powstanie jednoatamowych jonów -nie uzyskujemy informacji strukturalnych ale skład pierwiastkowy -można ją łączyć z każdą techniką rozdzielania substancji

55 Spektrometrię mas wykorzystuje się w celu: określenia masy molekularnej, określenia struktury nieznanych związków, potwierdzenia struktury syntezowanych związków, ustalenia składu jakościowego i ilościowego mieszanin.

56 Analiza środków dopingujących. Analiza struktury polisacharydów Analiza peptydów i białek Analiza żywności Analiza próbek środowiskowych

57 ANALIZA STRUKTURY POLISACHARYDÓW określenia rodzaju jednostek cukrowych wchodzących w skład polisacharydu; ustalenia kolejności i sposobu powiązania ze sobą reszt cukrowych w łańcuchu; określenia wielkości pierścienia poszczególnych monosacharydów; przyporządkowania cukrów do szeregu konfiguracyjnego D i L; określenia konfiguracji anomerycznych atomów węgla; identyfikacji podstawników niemających charakteru cukrowego (rodzaj, ilość, miejsce występowania).

58 SEKWENCJONOWANIE POLISACHARYDÓW Produkty częściowej hydrolizy tetrasacharydu A-B-C-D: A + B + C + D A-B + C-D A-B-C + D A + B-C-D A + B-C + D Identyfikacja mas otrzymanych fragmentów Ustalenie sekwencji

59 SEKWENCJONOWANIE PEPTYDÓW pod. red. P. Sudera, I. Silberring, Spektrometria mas, Wydawnictwo UJ, 2006

60