ANALIZA WIDM MASOWYCH OBSŁUGA PROGRAMU DATA ANALYSIS

Transkrypt

1 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBSŁUGA PROGRAMU DATA ANALYSIS (Bruker Daltonics) W ramach przedmiotu: Metody fizykochemiczne (L) I rok Mgr Chemia biologiczna Prowadzący: mgr Karolina Radziszewska 1

2 DATA ANALYSIS 3.4 (Bruker Daltonics) Oprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmy Bruker Daltonics Wymagana licencja użytkownika Dostęp z komputerów Laboratorium Spektrometrii Mas Wydziału Chemii UWr (LW 07) Pozwala na analizę ę widm masowych zapisanych w formacie *.baf 2

3 IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF Każdy folder zawierający widma masowe oznaczony jest rozszerzeniem *.d Wewnątrz możemy znaleźć następujące pliki: Zawiera dane dotyczące metody pomiaru Główny plik zawierający widmo masowe Pliki pomocnicze 3

4 IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF Aby otworzyć widmo masowe należy dwukrotnie kliknąć LP myszy na ikonie: lub zaimportować dane bezpośrednio z poziomu programu uruchamiając go z Paska programów: pojawi się okno startowe 4

5 IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF a następnie główne okno programu 5

6 IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF lub w wersji 4.0 6

7 IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF Aby zaimportować widmo masowe klikamy FILE na pasku głównym: Następnie OPEN: I z odpowiedniego folderu wybieramy Interesujące nas widmo masowe: 7

8 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Zaimportowane widmo masowe zarejestrowane na aparacie microtof Q zapisane jest w formie chromatogramu: Zależność prądu jonowegotic (ang. total ion current) od czasu trwania pomiaru 8

9 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Aby przekształcić chromatogram na uśrednione widmo masowe należy kursor myszy ustawić na początku osi czasu w obszarze chromatogramu, a następnie trzymając wciśnięty PP myszy przeciągnąć kursor do końca linii chromatogramu: droga kursora myszy Miejsce ustawienia kursora i wciśnięcia PPmyszy Miejsce zwolnienia PP myszy y 9

10 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Pojawia się dodatkowe okno, w którym znajduje się uśrednione przez nas widmo masowe: 10

11 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Aby móc przeprowadzić analizę na danym widmie masowym należy najpierw je skopiować. W tym celu klikamy PP myszy w obszarze widma pojawia się okno, w którym LP myszy klikamy COPY TO COMPOUND MASS SPECTRA: 11

12 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Nasze uśrednione widmo masowe zostało skopiowane: 12

13 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE W tej chwili w programie mamy otwarte cztery okna: Lista otwartych plików wraz ze składowymi Uśrednione widmo masowe Chromatogram Skopiowane widmo masowe 13

14 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Do dalszej pracy zamykamy Chromatogram i Uśrednione widmo masowe: KLIK 14

15 PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE Tak powinno prezentować się główne okno programu: 15

16 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Widmo masowe przedstawia zależność m/z czyli masy związku do jego ładunku (oś X) wraz z intensywnością danego sygnału dla odpowiedniej wartości m/z (oś Y): Intensywność Wartości m/z 16

17 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Na widmie obserwujemy wiele sygnałów (pików) pochodzących od jonów związków o określonej wartości m/z: Wartość m/z 17

18 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Jednak obserwujemy również sygnały o niskiej intensywności, dla których nie ma przypisanych wartości m/z. Aby je dokładnie obejrzeć musimy powiększyć obszary widma: Sygnały y o niskich intensywnościach 18

19 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA W tym celu możemy skorzystać z narzędzia powiększania na dwa sposoby. Kliknąć LP myszy w ikonę LUPY na pasku narzędzi zmiana kursora na krzyżyk z lupą: 19

20 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Przy pomocy tak zmienionego kursora z wciśniętym LP myszy otaczamy sygnał bądź obszar, który chcemy powiększyć: 20

21 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Po czym puszczamy LP myszy i otrzymujemy widmo powiększone w wybranym przez nas zakresie: 21

22 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Powiększanie możemy powtarzać wielokrotnie do odpowiadającej nam skali, jednak za każdym razem należy na nowo uruchomić narzędzie LUPY przez jego zaznaczenie: Wskazówka: Narzędzie lupy uruchomić można również poprzez przytrzymanie lewego klawisza Shift na klawiaturze. W momencie kiedy go trzymamy narzędzie działa i pozwala na wielokrotne powiększanie. 22

23 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Innym sposobem zmiany zakresu na widmie jest przesuwanie osi X. Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym LP myszy przesuwać się będzie cały zakres: 23

24 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym PP myszy będziemy rozszerzać dany zakres: 24

25 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Aby powrócić do wcześniejszego widoku całego widma wystarczy w jego obszarze dwukrotnie kliknąć LP myszy lub po wciśnięciu PP myszy wybrać z listy AUTO SCALING: 25

26 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Wartości m/z podane są z dokładnością do miejsc dziesiętnych. Na takim sygnale ciężko jest określić wartość ładunku, dlatego należy zwiększyć dokładność m/z. W tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS, a następnie zwiększamy wartość w polu MASS PRECISION. Wskazówka: Podając 3 miejsca po przecinku możemy poprawnie określić wartość ładunku w danym sygnale na widmie. 26

27 ANALIZA WIDM MASOWYCH FORMATOWANIE WIDMA Na widmie masowym pojawiają się wartości z dokładnością do 3 miejsc po przecinku: 27

28 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Wybierzmy jeden sygnał na widmie i przypiszmy mu ładunek: 28

29 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Po powiększeniu danego piku obserwujemy: Piki izotopowe Pierwszy pik: Pik monoizotopowy 29

30 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Taki układ pików izotopowych, z których pierwszy pik monoizotopowy nie jest najbardziej intensywny, wskazuje na dużą cząsteczkę (najczęściej polipeptyd lub białko) bądź na układ zawierający dodatek izotopów pierwiastków, np. deuter. Piki izotopowe Pierwszy pik: Pik monoizotopowy 30

31 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Na pierwszy rzut oka wydaje się, że kolejne piki izotopowe dzieli różnica 0,2. Aby to dokładnie sprawdzić wykorzystujemy narzędzie ANNOTATION >>> ANNOTATE. Przy kursorze pojawia się litera A. 31

32 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Po ustawieniu kursora trójkąt poniżej kursora, na odpowiednim piku i trzymając wciśnięty LP myszy przesuwamy go na kolejny pik. Po zwolnieniu LP myszy pojawia się wartość różnica między kolejnymi pikami izotopowymi na widmie. 32

33 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Wykonując tę czynność na wszystkich pikach uzyskujemy średnią wartość różnicy między pikami izotopowymi jako 0,

34 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Aby wyłączyć narzędzie wchodzimy w ANNOTATION i odznaczamy ANNOTATE. Innym sposobem na uruchamianie narzędzia ę ANNOTATE w trakcie analizy widma masowego jest wykorzystanie klawisza Alt na klawiaturze. Wciśnięcie i przytrzymanie powoduje aktywność funkcji ANNOTATE. Gdy puścimy klawisz Alt nadal możemy analizować widmo przy użyciu normalnego kursora. Aby przypisać ładunek musimy widzieć, że różnica między pikami izotopowymi jest od niego ściśle zależna. I tak dla ładunku: +1 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 1, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0, różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,100 34

35 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Zatem w naszym przypadku skoro różnica wynosi 0,200 to sygnał odpowiada cząsteczce o ładunku

36 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Innym sposobem przypisania ładunków sygnałom na widmie masowym jest wykorzystanie odpowiedniego narzędzia, który przypisuje te wartości w sposób automatyczny. W tym calu wchodzimy do zakładki DECONVOLUTE, a następnie PARAMETERS: 36

37 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Wybieramy zakładkę MASS LIST a w niej typ Peak finder: SNAP Narzędzie to pozwala na przypisanie ładunku dla cząsteczek o naturalnym rozkładzie izotopowym (bez dodatków innych izotopów, np. deuteru). Pozostawiamy wartości ustawione standardowo, jedynie w przypadku Maximum charge state jeślispodziewamy się, że widmo masowe przedstawia dużą cząsteczkę wielokrotnie naładowaną, np. białko, warto zwiększyć tę wartość do np. 15. Zatwierdzamy parametry klikając OK. 37

38 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Aby wykonać dekonwolucję widma w celu przypisania ładunku w zakładce DECONVOLUTE klikamy w MASS SPECTRA lub wybieramy F4 na klawiaturze. Po chwili na widmie pojawią się wartości ładunków, jeśli nie wchodzimy w zakładkę MASS LIST klikamy CLEAR a następnie FIND. 38

39 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU Narzędzie automatycznego przypisania ładunku pozwala na analizę całego widma masowego i oszacowanie ilości i rodzaju związków obecnych na widmie. 39

40 ANALIZA WIDM MASOWYCH PRZYPISANIE ŁADUNKU W tym przypadku mamy do czynienia z widmem masowym jednego związku o wysokiej masie cząsteczkowej ok Da. Świadczy o tym charakterystyczna obwiednia, tj. seria sygnałów odpowiadających kolejnym ładunkom od 3+ do 7+. Wskazówka: Taki układ pików na widmie jest charakterystyczny dla widm ESI dużych peptydów lub białek. 40

41 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Mając przypisane ładunki do odpowiednich sygnałów na widmie oraz wiedząc, które z nich pochodzą od jednego związku możemy obliczyć średnią masę cząsteczkową. I tak dla wcześniej ś wyznaczonego ładunku d k 5+: Wartość piku monoizotopowego m/z wynosi Ładunek czyli z wynosi 5 Dla ogólnego równania: Zatem: m/z = (M cz +z)/z M cz = m/z*z z M cz = *5 5 = Da Aby wyznaczyć średnią masę cząsteczkową należy obliczyć masy dla poszczególnych ładunków, a następnie wyznaczyć średnią. I tak: Da Da Da Da Da M średnia = Da 41

42 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Innym sposobem wyznaczania średnich mas cząsteczkowych, w przypadku widm ESI dla peptydów i białek, jest wykorzystanie wzoru: p 1 = (M + z)/z p 2 = (M + z 1)/(z 1) ) gdzie: p oznacza wartość m/z piku danego związku dla kolejnych ładunków p 1 p 2 42

43 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Wyznaczenie średniej masy cząsteczkowej można wykonać automatycznie w programie wybierając metodę dekonwolucji. Powoduje ona przekształcenie widma masowego z zależności od m/z na zależność od masy. Wchodzimy w zakładkę DECONVOLUTE >>> PARAMETERS Następnie zakładkę CHARGE DECONVOLUTION i wybieramy opcję MAXIMUM ENTROPY Ustalamy zakres mas Wskazówka: Wcześniejsze oszacowanie masy na podstawie ładunku pozwoli na wybranie węższego zakresu mas, a co za tym idzie szybszą dekonwolucję widma. Zatwierdzamy Zt OK. 43

44 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Aby uruchomić dekonwolucję widma klikamy DECONVOLUTE >>> MASS SPECTRA Lub z klawiatury F4. Po przeliczeniu pojawia się nowe widmo masowe przedstawiające zależność od masy cząsteczkowej: 44

45 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Po powiększeniu najwyższego sygnału możemy odczytać wartość masy cząsteczkowej: Jednak wciąż mamy wiele wartości mas, które należy uśrednić. 45

46 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Aby to zrobić wchodzimy w zakładkę PROCESS >>> SMOOTH MASS SPECTRUM Narzędzie to służy do wygładzania widma tak, aby tworzyło ł ono jeden pik o uśrednionej ś wartościś masy cząsteczkowej. Należy zmienić parametr SMOOTHING WIDTH do takiej tkijwartości, ś aby na widmie i mieć ć tylko tlk jeden jd poszerzony sygnał. Zwykle wystarczy już wartość 0.5. Po zatwierdzeniu OK otrzymujemy wygładzone widmo. 46

47 ANALIZA WIDM MASOWYCH OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU Odczytujemy uśrednioną masę cząsteczkową: 47

48 ANALIZA WIDM MASOWYCH DODATKOWE INFORMACJE Na widmie masowym oprócz sygnałów pochodzących od głównego związku obserwuje się także piki pochodzące od innych składników mieszaniny. Często są to zanieczyszczenia wynikające z użytych rozpuszczalników, bądź produkty uboczne wcześniejszych reakcji. Zwykle charakteryzują się one niższą intensywnością ś sygnałów na widmie ich zawartość w analizowanej próbce jest mniejsza, bądź mają mniejszą zdolność do jonizacji. 48

49 ANALIZA WIDM MASOWYCH DODATKOWE INFORMACJE Często obok pików, odpowiadających głównemu produktowi, znajdują się dodatkowe sygnały pochodzące od adduktów jonów sodu lub potasu do cząsteczki. Na + 23 Da K + 39 Da Należy pamiętać, że dodanie jonu metalu powoduje jonizację związku bez udziału H +. 49

50 ANALIZA WIDM MASOWYCH INFORMACJE STRUKTURALNE Typowe widmo ESI MS dostarcza informacji o rodzaju, wzorze sumarycznym i masie cząsteczkowej związku. Aby uzyskać informacje na temat jego struktury należy wykonać widma fragmentacyjne MS/MS. Podstawowym typem są widma CID (ang. collision induced dd dissociation) ) fragmentacji wywołanej zderzeniowo. W wyniku zderzeń obojętnego gazu z cząsteczkami analizowanej substancji, do których dochodzi w komorze kolizyjnej spektrometru mas, otrzymujemy charakterystyczne t widmo masowe. 50

51 ANALIZA WIDM MASOWYCH INFORMACJE STRUKTURALNE Fragmentacja związków metodą CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych z wcześniej wybranego przez nas jonu obserwowanego na widmie masowym. W wyniku fragmentacji dochodzi do rozerwania wiązań ą w cząsteczce ą z utworzeniem odpowiednich jonów potomnych fragmentów cząsteczki. W przypadku peptydów i białek otrzymuje się następujące rodzaje fragmentów: 51

52 ANALIZA WIDM MASOWYCH INFORMACJE STRUKTURALNE W przypadku peptydów i białek fragmentacja CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych określonego typu. W ich skład wchodzą reszty aminokwasowe o następujących masach monoizotopowych: 52

53 ANALIZA WIDM MASOWYCH WIDMA FRAGMENTACYJNE Na widmie masowym ESI MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS: Jon prekursorowy 53

54 ANALIZA WIDM MASOWYCH WIDMA FRAGMENTACYJNE Na widmie masowym ESI MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS: Jony fragmentacyjne 54

55 ANALIZA WIDM MASOWYCH WIDMA FRAGMENTACYJNE Możemy wyznaczyć ładunki dla odpowiednich fragmentów stosując wcześniej opisaną procedurę SNAP: 55

56 ANALIZA WIDM MASOWYCH WIDMA FRAGMENTACYJNE Wykorzystując narzędzie ANNOTATION możemy wyznaczyć rodzaje reszt aminokwasowych znajdujących się w łańcuchu. Wystarczy zmienić typ na: Korzystając z wartości różnic odległości między sygnałami możemy wyciągać wnioski odnośnie ś budowy cząsteczki poddanej fragmentacji: Obecne straty t neutralne 17 Da oraz 18 Da. Obecność reszt aminokwasowych Ala oraz Lys. 56

57 ANALIZA WIDM MASOWYCH WIDMA FRAGMENTACYJNE Przeprowadzenie analizy fragmentacyjnej pozwala na wyciągnięcie wielu wniosków odnośnie budowy cząsteczki. Umożliwia m.in.: określenie sekwencji aminokwasowej w peptydzie, wskazanie miejsc modyfikacji, potwierdzenie struktury związku, wykrycie produktów ubocznych reakcji i ich zidentyfikowanie. W zależności od rodzaju związku poddanego analizie otrzymuje się różnego rodzaju jony fragmentacyjne, często charakterystycznedla danej grupy. Analiza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzaju analizowanego związku. 57

58 WARUNKI ZALICZENIA Wykonanie analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocy programu Data Analysis przedstawione w formie sprawozdania pisemnego. Termin oddania sprawozdań ń 7 dni od daty dt zajęć ć laboratoryjnych lb POWODZENIA 58