Poł czenie techniki LC ze spektrometri mas

Transkrypt

1 ń Poł czenie techniki LC ze spektrometri mas dr in. Andrzej Wasik dr in. Agata Kot-Wasik Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechniki Gda skiej

2 ć Analiza dwuwymiarowa W typowym przypadku analiza chromatograficzna dostarcza nam informacji dwuwymiarowej. Najcz ciej jest to zale no mi dzy wielko ci sygnału z detektora (1 wymiar) od czasu retencji (2 wymiar) ć sygnału t ri+1 t ri+2 Intensywno t ri Czas

3 Analiza dwuwymiarowa Identyfikacja odbywa si na podstawie czasu retencji. Porównujemy czas retencji analitu z czasem retencji wzorca. Problem 1 W przypadku analizy skomplikowanych mieszanin nie mamy pewno ci, e dany pik odpowiada pojedynczej substancji. Problem 2 Niemo liwa jest identyfikacja nieznanych substancji.

4 Analiza dwuwymiarowa Analiza PLC-UV ekstraktu z Leuzea carthamoides ?? ????? ???

5 ć ć ń ć Rozwi zanie Analiza dwuwymiarowa Problem 1 - nakładanie si pików Powtórzy analiz przy u yciu kolumny z innym typem wypełnienia. Rodzaj oddziaływa pomi dzy analitem a faz stacjonarn musi by inny ni za pierwszym razem. Zalety: Wady: - łatwo wykonania - niski koszt - wysoka czasochłonno ć

6 ć ć ć ń Analiza dwuwymiarowa Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji Rozwi zanie Zastosowa detektor dostarczaj Innymi słowy zastosowa techniki ł cy informacji o strukturze analitu. czone. Zalety: Wady: - mo zwi liwo zków identyfikacji nieznanych - informacja o ich masie cz i/lub strukturze - łatwe wykrywanie faktu nakładania si pików steczkowej - wysokie koszty inwestycyjne - wysokie wymagania co do kwalifikacji personelu - szybsze uzyskanie wyniku ko cowego

7 ć Techniki ł czone Dzi ki wykorzystaniu technik ł czonych informacja analityczna zyskuje dodatkowy wymiar (struktura) sygnału intensywno m/z czas

8 Przegl d technik ł czonych Tabela 1 Najpopularniejsze techniki ł czone GC-MS SFC-MS LC-GC-MS LC-DAD CE-DAD GC-IR SFC-IR LC-GC-IR LC-MS CE-MS GC-IR-MS SFC-GC-MS LC-ICP-MS GC-AES SFC-GC-IR LC-IR GC-ICP-MS GC-GC-MS LC-NMR LC-MS-MS LC-LC-MS

9 ć ć ć ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas Spektrometria mas - metoda okre lania masy (a ci lej stosunku masy do ładunku m/z) cz stek naładowanych elektrycznie (jonów). Na poruszaj cy si ładunek elektryczny (jon) oddziałuje zarówno pole elektryczne jak i magnetyczne. W spektrometrach mas wykorzystujemy ten fakt aby z mieszaniny jonów wybra te o konkretnym stosunku m/z i skierowa je do detektora, dzi ki czemu mo na okre li ich ilo w mieszaninie.

10 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem

11 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas Dwa najwa niejsze elementy spektrometru mas to: komora jonizacyjna, czyli miejsce w którym powstaj analizator mas jony, oraz wlot próbki Komora jonizacyjna jony Analizator mas

12 PLC-MS TAK, ALE... problem poł czenia LC i MS! PLC, 1 ml/min, bar MS, pró nia Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy zwi zane z uzyskaniem wysokiej pró ni. Podczas analizy GC (faza ruchoma: gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min. Podczas kiedy w PLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływ gazu u wlotu MS rz du 350ml/min w przypadku metanolu i a 1000 ml/min w przypadku wody! ( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")

13 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas

14 ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Wyró ni mo na dwa rodzaje jonizacji: mi kka jonizacja, podczas której tworzy si jedynie jon molekularny (cz steczkowy) bez fragmentacji cz steczki, twarda jonizacja, podczas której cz fragmenty steczka rozpada si Istniej takie konstrukcje komór jonizacyjnych, które powoduj jedynie mi kk jonizacj analitów. Natomiast podczas jonizacji twardej powstaje zawsze mieszanina jonów cz steczkowych i fragmentów cz steczek analitu. na

15 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Mi kka i twarda jonizacja cz M steczki analitu stabilny kationorodnik M M M niestabilny kationorodnik fragmenty m i m j

16 ć ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Od sposobu jonizacji zale mo na uzyska. Mi kka jonizacja pozwala jedynie okre cz steczkow analitu. y ile informacji o strukturze zwi li mas Jonizacja twarda dostarcza informacji o masie cz steczkowej i strukturze zwi zku. zku

17 ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Metody jonizacji Bombardowanie strumieniem cz stek Reakcje chemiczne Pole elektryczne o wysokim nat eniu Wysoka temperatura EI CI ES/IS TS FAB PB FI ICP MALDI FD APCI/PIS brak fragmentacji cz steczek fragmentacja cz steczek, mo liwo okre lenia struktury

18 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas Wybrane metody jonizacji próbek ciekłych

19 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja metod elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) N (~80 C) 2 wysokie napi cie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ci nienie atmosferyczne separator sto kowy Pró nia N (~80 C) 2 do pompy pró niowej

20 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja metod elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) N (~80 C) 2 wysokie napi cie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ci nienie atmosferyczne separator sto kowy Pró nia N (~80 C) do pompy pró niowej [M+n n] n+ ODPAROWANIE ROZPUSZCZALNIKA POWSTANIE JONÓW WYLOT KAPILARY COULOMBOWSKA EKSPLOZJA KROPLI AEROLOZU

21 ń Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja metod elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) Widma masowe pocz ko ca piku s ró ne. tku i Oznacza to, e ten pozornie pojedynczy pik powstał z nało enia dwóch innych m/z m/z

22 PLC MS analiza ekstraktu Nodularii PLC-MS SCAN SIM

23 Analiza widma MS [M+] + = M=824.4 OMe O O N N N COO O O C 3 C 3 N N COO O C 3 N N N 2

24 ć ć ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja metod elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) Mo mo liwo pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma e zawiera wod ). Przepływ fazy ruchomej rz du 1 ml/min. Nadaje si do analizy zwi zków wysokocz steczkowych (peptydy, białka), metaloorganicznych i nieorganicznych. Mi kka metoda jonizacji, niewielka fragmentacja jonów a co za tym idzie trudno ci w okre leniu struktury analitu. Wysoka czuło Metoda przydatna do ł. czenia z kapilarn elektroforez

25 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja chemiczna pod ci nieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Ci nienie atmosferyczne Pró nia Próbka ciekła Gaz rozpylaj cy Grzałka 1. Jonizacja cz stek rozpuszczalnika Analizator mas Wyładowanie koronowe 2. Reakcje powstałych jonów z cz steczkami analitu, tworzenie si klastrów. Przeniesienie ładunku. 3. Rozpad klastrów Igła wyładowcza Gaz osłonowy

26 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Fotojonizacja chemiczna - Photo Ion Spray (PIS) Ci nienie atmosferyczne Pró nia Próbka ciekła Gaz rozpylaj cy Grzałka 1. Jonizacja cz stek fotoinicjatora Analizator mas 2. Reakcje powstałych jonów z cz steczkami analitu, tworzenie si klastrów. Przeniesienie ładunku. 3. Rozpad klastrów Lampa UV Gaz osłonowy

27 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja chemiczna pod ci nieniem atmosferycznym - (APCI) Int. 12.5e6 APCI-tryb dodatni 215 O 10.0e6 7.5e6 5.0e6 ( 3 C) 3 C N 2 Metribuzin N C814N4 OS N M. cz.: N SC 3 2.5e6 0.0e m/z Int APCI-tryb ujemny O ( 3 C) 3 C N 2 Metribuzin N C814N4 OS N M. cz.: N SC 3 Wygl d widma masowego zale y nie tylko od rodzaju zwi zku ale tak e od trybu i parametrów jonizacji, oraz składu fazy ruchomej m/z

28 ć ć ć ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja chemiczna pod ci nieniem atmosferycznym - (APCI) Mo mo liwo pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma e zawiera wod ). Przepływ fazy ruchomej rz du 2 ml/min. Przydatna do analizy zwi zków nielotnych, nietrwałych termicznie, o małych i rednich masach cz steczkowych, mało i rednio polarnych. Stosunkowo twarda metoda jonizacji, odpowiedni dobór parametrów jonizacji pozwala na fragmentacj cz steczek i okre lenie struktury analitu. Wysoka czuło i liniowo odpowiedzi.

29 ć ć ź ź ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Zakres przepływów tolerowanych w tej metodzie jest rz du ułamków mililitra na minut. Współpraca LC z FAB mo liwa jest dzi ki zastosowaniu dzielników strumienia eluenta. W przypadku CE dzielniki nie s potrzebne. Próbka musi by tioglicerolu b d rozdzielcz (mo wykonawcze). wymieszana/rozpuszczona w tzw. matrycy np. glicerolu, alkoholu nitrobenzylowym. Mo na to zrobi przed kolumn liwe problemy z rozdzieleniem) b d na jej wylocie (trudno Przydatna do analizy zwi zków nielotnych, nietrwałych termicznie, o du ych masach cz steczkowych i wysokiej polarno ci (kwasy nukleinowe, leki, zwi zki powierzchniowo czynne). Mi kka metoda jonizacji. Stosunkowo wysoka czuło. ci

30 ń Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Metody jonizacji próbek ciekłych (PLC, CE) Jonizacja metod oraz elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) Jonizacja chemiczna pod ci nieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) to w chwili obecnej dwie najcz chromatografii cieczowej. ciej stosowane metody jonizacji w Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowa, łatwo ci u ycia, wysokiej czuło ci oraz mo liwo ci pracy z przepływami fazy ruchomej rutynowo stosowanymi w PLC. ESI i APCI to komplementarne metody jonizacji.

31 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas

32 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Podstawy spektrometrii mas - rodzaje analizatorów mas Kwadrupolowe (pojedyncze i wielokrotne) (Quadrupole) Pułapki jonowe (Ion Trap) Analizatory czasu przelotu (Time-Of-Flight TOF) Sektory magnetyczne (Magnetic Sector) Sektory magnetyczne z podwójnym ogniskowaniem (Double Focusing Magnetic Sector) Mieszane np. sektor magnetyczny/pułapka jonowa, kwadrupol/analizator czasu przelotu (ybrid)

33 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Wpływ rozdzielczo ci na kształt pików 1.0 FWM 0.7 FWM 0.5 FWM 0.3 FWM 0.2 FWM 0.1 FWM

34 Ź ć Ź Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Analizator kwadrupolowy - Quadrupole Pr ty kwadrupola Detektor ródło zasilaj ce pr ty kombinacj napi, stałego i o cz stotliow ci radiowej ródło jonów

35 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Analizator kwadrupolowy - Quadrupole Wygl d analizatora kwadrupolowego z pr tami o przekroju hiperbolicznym, firmy ThermoFinnigan

36 ć ć ć ć ć ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Analizator kwadrupolowy - cechy Najpowszechniej spotykany typ analizatora Typowy zakres m/z: Stosunkowo mała pr trybie Full Scan) Wysoka czuło dko w trybie SIM Relatywnie niska rozdzielczo Wysoka odtwarzalno zbierania pełnych widm (niska czuło (siła rozdzielcza) (dobrze nadaje si Du y zakres dynamiczny (zdolno małych sygnałów) do pomiarów ilo do pomiaru zarówno du w ciowych) ych jak i

37 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Pułapka jonowa - Ion Trap

38 ć ć ć ć ć ć ć ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Pułapka jonowa - cechy Małe rozmiary, łatwo Wysoka pr dko Stosunkowo niska czuło Wysoka rozdzielczo Mo liwo Mały zakres dynamiczny konserwacji zbierania pełnych widm (du w trybie SIM a czuło, doskonała do pomiarów jako w trybie Full Scan) ciowych (identyfikacja) przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS Stosunkowo słaba odtwarzalno Jako widm zale y od wielu parametrów

39 ź Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF) Laser Obszar przelotu jonów Repeler Próbka Detektor Płytki ogniskuj ce Schemat analizatora czasu przelotu ze ródłem jonów typu MALDI

40 ć ć ź ć Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Analizator czasu przelotu - cechy Najszybszy ze znanych analizatorów mas Najszerszy praktyczny zakres m/z Wysoka czuło Wysoka rozdzielczo (siła rozdzielcza) Z natury przystosowany do pracy z impulsowymi ródłami jonów jak np. MALDI, cho istniej konstrukcje przystosowane do pracy z np. EI Wysokie wymagania co do pr dko ci detektora

41 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Technika MS n Monitorowanie jonów fragmentacyjnych pochodz (Product (Fragment) Ion Scan) cych od wybranego prekursora CID Gaz reakcyjny np. argon

42 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Technika MS n Technika monitorowania jonów fragmentacyjnych pochodz cych od wybranego prekursora (Product Ion Monitoring) pozwala na wygodne okre lenie struktury wybranego analitu (parent ion). Niektóre opublikowane zastosowania to: wczesna diagnoza niektórych chorób genetycznych np. choroby Fabry ego wykrywanie oraz identyfikacja narkotyków i rodków farmakologicznych w płynach ustrojowych (bardzo skomplikowana matryca) wykrywanie oraz identyfikacja bojowych rodków truj potencjalnych BST w warunkach polowych cych (BST) i

43 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Technika MS n Monitorowanie wybranego jonu fragmentacyjnego pochodz (Selected Reaction Monitoring - SRM) cego od wybranego prekursora Gaz reakcyjny np. argon

44

45 ZASTOSOWANIE TECNIKI PLC-MS Oznaczanie rodków dopinguj cych (zwłaszcza podczas wszelkich zawodów sportowych!) Ustalanie sekwencji aminokwasów (pomy l o wszelkich chorobach genetycznych) Oznaczanie pozostało obecno ci antybiotyków, zawarto ci hormonów w paszach zwierz oraz produktach z nich otrzymywanych (przecie zabezpieczaj na fermach stosuje si cych tysi je do szybkiego wzrostu) ce zwierz ogromne ilo cych, ich mi ci zwi ci witamin, zków sie t przed chorobami i zmuszaj ce Identyfikacja narkotyków (policja, medycyna s dowa)

46 ZASTOSOWANIE TECNIKI PLC-MS Oznaczanie flawonoidów (tutaj przykład identyfikacji flawonoidów obecnych w sokach owocowych) PLC-ESI-MS min 2,4 - D (-)Epicatechin-3-O-gallate (ECG) C 2 COO O Cl Cl [M-] - Pseudomolecular ion of contaminant coeluted with 2,4-D 325.0? O O O O 169 O [M-] - O O O O O Mm/z

47 ZASTOSOWANIE TECNIKI PLC-MS Identyfikacja cjanotoksyn obecnych w wodzie morskiej pojawiaj cych si w czasie zakwitów alg (zwykle w sierpniu w okolicach pla pełno, a pla e s zamkni te dla k pi trójmiejskich jest ich cych si na kilka dni)

48 MS-SCAN analiza ekstraktu: jezioro Karczemne [M+] + N 2 + O [M+2] 2+ C 3 3 C O C 3 O N N N O C 3 C 2 O 3 C C 3 N O R1 N N A O O O Anatoksyna A N N N 2 MC RR

49 MS-SIM analiza ekstraktu: jezioro Karczemne Jon monitorowany: 166 (Anatoksyna-a) Jon monitorowany: 520 (MC-RR) Jon monitorowany: 825 (Nod) 1046 (MC-YR) Jon monitorowany: 995 (MC-LR)

50 ń ć ZASTOSOWANIE TECNIKI PLC-MS Identyfikacja produktów degradacji wielu trwałych organicznych zanieczyszcze rodowiska (POP s, wprowadzone do w warunkach naturalnych podlegaj rodowiska pozostaj mikrobiologicznej degradacji z utworzeniem cz bardziej szkodliwych produktów) w nim na długo, po czym fotodegradacji, termicznej i stokro wielokrotnie Arbitrary Intensity [%] m/z 267 O O O -22-1/2 O2 O O - CO - CO + + m/z m/z m/z m/z 239 O m/z 255

51 ć ZASTOSOWANIE TECNIKI PLC-MS Analiza zawarto ubrow i w ci kumaryny w nalewach na traw ubrówce (Kumaryna - benzopiron, substancja organiczna (lakton kwasu o-hydroksycynamonowego) o przyjemnym zapachu siana. Jest stosowana w przemysłach: perfumeryjnym, mydlarskim, tytoniowym. Poniewa powoduje marsko w troby u zwierz stwierdzono, ona niemal całkowicie wycofana z produktów spo Europie i USA). Analiza pozostało ci niesteroidowych wie ego e kumaryna t laboratotyjnych została rodków ywczych w przeciwzapalnych i przeciwbólowych (NSAID) w wodach (NSAID s ju poziomie ppt, powoduj w niektórych krajach obecne w wodzie pitnej na c efekt lekoodporno ci). tolmetin diflunisal fenoprofen naproxen diclofenac ibuprofen

52 ć ć ć ć Techniki ł czone Konieczno analizy próbek o skomplikowanym składzie wmusza zastosowanie technik ł czonych. Wymagania co do wiarygodno ci wyniku analizy cz sto wykluczaj mo liwo identyfikacji analitów jedynie na podstawie czasu retencji. Jedynie poł czenie mo liwo ci rozdzielania skomplikowanych mieszanin przy wykorzystaniu metod chromatograficznych z informacj strukturaln daje mo liwo wiarygodnej identyfikacji analitów. Dzi ki wykorzystaniu technik ł czonych mo na w znacznym stopniu przyspieszy i obni y koszty analiz dzi ki mniejszym wymaganiom co do etapu przygotowania próbki do analizy.

53 Ń WNIOSKI KO COWE: Technika PLC MS zaczyna by coraz powszechniej stosowana w laboratoriach analitycznych ze wzgl du na jej zalety.

54 Ń WNIOSKI KO COWE: Wkrótce technika LC-MS mo e sta si technik rutynowych analiz.