ZAAWANSOWANE METODY USTALANIA BUDOWY ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH

Transkrypt

1 ZAAWANSWANE METDY USTALANIA BUDWY ZWIĄZKÓW RGANICZNYC Witold Danikiewicz Instytut Chemii rganicznej PAN ul. Kasprzaka 44/52, Warszawa Semestr zimowy 217/218 PDSTAWY INTERPRETACJI WIDM MASWYC Spec #1[BP = 817.4, 2132] M Na 8 % Intensity M M Na Ph N M = 397 Ph M K Mass (m/z) C 2 C C 2 5 C C m/z 43 (1%) 3 C 2 C C 2 5 C m/z 57 (7%) 2

2 Pytania, na które może odpowiedzieć chemikowi spektrometria mas 1. Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Metody: widmo EI 7 ev, a w razie niepowodzenia łagodne metody jonizacji (CI, ESI, APCI, APPI, MALDI, FI, FD) w celu zarejestrowania jonu molekularnego. 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego. 3. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej, dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa. Identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm. 4. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów, stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego lub braku zgodności widm () i (-). 5. Jaki jest skład mieszaniny związków? Metody: chromatografia gazowa lub cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS, LC/MS) analiza jakościowa i ilościowa. 6. Jaka jest budowa przestrzenna związków lub ich kompleksów? Metody: spektrometria ruchliwości jonów sprzężona ze spektrometrią mas (IM-MS) wsparta modelowaniem molekularnym i obliczeniami przekrojów czynnych Jaka jest masa cząsteczkowa związku? Aby wyznaczyć masę cząsteczkową trzeba zaobserwować i zidentyfikować jon molekularny (lub pseudomolekularny) Metody: widmo EI 7 ev skuteczne tylko w niektórych przypadkach; często brak jest w widmie jonu molekularnego; łagodne metody jonizacji (CI, ESI, APCI, APPI, MALDI, FI, FD) w celu zaobserwowania jonu molekularnego. 4

3 Terminologia Jon molekularny: jon o masie równej masie cząsteczkowej badanego związku (z dokładnością do masy elektronu), powstający w wyniku oderwania lub (znacznie rzadziej) przyłączenia elektronu przez cząsteczkę. Jest to jon nieparzystoelektronowy (kationo- lub anionorodnik). Jon pseudomolekularny, quasimolekularny lub jon typu jonu molekularnego: jon powstający w wyniku przyłączenia prostego jonu (najczęściej, Na, - ) do cząsteczki badanego związku lub oderwania jonu od tej cząsteczki. becnie zaleca się stosowanie nazw typu: protonowana cząsteczka, deprotonowana cząsteczka itp. Jony tego typu są jonami parzystoelektronowymi. 5, , ,.15 e, , , Li, , , Be, , 1. B, , , 81.2 C, 2 12., , 1.18 Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków N, , ,.365, , , ,.24 F, , 1. Ne, , , , 8.82 Na, , 1. Mg, , , , Al, , 1. Si, , , , 3.12 P, , 1. S, , , , ,.17, , ,

4 Profile izotopowe jonów w funkcji ich masy C 3 7 N 2 C 6 12 N 2 3 C N 5 9 C 3 68 N 1 19 C N 2 39 C N Masa nominalna Masa monoizotopowa Masa średnia 7 Reguła azotowa Parzysta liczba atomów azotu = = parzysta masa cząsteczkowa (nominalna) Nieparzysta liczba atomów azotu = = nieparzysta masa cząsteczkowa (nominalna) W spektrometrii mas dotyczy jonów nieparzystoelektronowych. Dla jonów parzystoelektronowych jest na odwrót. Jony parzystoelektronowe: M, M, M Na, M itp. powstają w wyniku jonizacji ESI, APCI, MALDI. Jony nieparzystoelektronowe: M powstają w wyniku jonizacji EI, FI i FD. 8

5 Liczba miejsc nienasycenia Dla cząsteczki o wzorze C x y N z n liczba miejsc nienasycenia N wynosi: N x 1 y 1 z gólniej: typ x: C, Si typ y:, F,, Br, I typ z: N, P typ n:, S Dla cząsteczek obojętnych i kationo- lub anionorodników liczba miejsc nienasycenia musi być całkowita i dodatnia lub równa. Dla jonów parzystoelektronowych ułamkowa i nie mniejsza niż -,5. 9 Warunki, które musi spełnić jon molekularny w widmie EI, FI lub FD (konieczne, ale nie wystarczające) 1. Musi być jonem o najwyższej masie w danym widmie (z uwzględnieniem jonów izotopowych). 2. Musi być jonem nieparzystoelektronowym, czyli odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową. 3. Masy najbliższych mu jonów fragmentacyjnych (czyli fragmentów o najwyższych masach) muszą dać się wyjaśnić utratą fragmentów obojętnych (cząsteczek lub rodników) o logicznych masach. 1

6 Warunki, które musi spełnić jon pseudomolekularny w widmie CI, ESI, APCI lub MALDI 1. Musi być jonem parzystoelektronowym, a odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową po odjęciu lub dodaniu jonu odpowiedzialnego za jonizację (najczęściej, Na, - itp.). 2. Jego masa musi umożliwić wyjaśnienie obecności ewentualnych klastrów typu (nm Kat), (nm Kat) lub (nm A), a także klastrów z matrycą (w LSIMS) lub rozpuszczalnikiem (w ESI). 3. Jego masa musi być zgodna z masami obserwowanych jonów naładowanych wielokrotnie (w ESI, czasem także w LSIMS). 4. W większości przypadków zakwaszenie próbki powinno spowodować wzrost intensywności jonu M, a dodanie soli sodowej jonu M Na. 5. W przypadku próbek o charakterze amfoterycznym (np. peptydy) dodatni jon pseudomolekularny powinien mieć masę o dwie jednostki większą niż ujemny jon pseudomolekularny (dotyczy jonów M i M ). 11 Widmo EI cholesterolu Abundance #22929: Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)- (CAS) $$ Lanol $$ Dyth 3 C M C [M - 15] [M - 17] m/z-->

7 Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu EI 7 ev % Intensity [M 2 ] M = M/z MNa ESI w Me 7 6 M % Intensity MNa Mass (m/z) 13 Identyfikacja jonu molekularnego w ESI Q1: 2.39 to min from Sample 1 (MP 29) of mp3469.wiff (Turbo Spray) Max. 4.5e6 cps. 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 Widmo standardowe w Me MNa 2.5e6 M e6 1.5e MK 1.e e Widmo w Me z dodatkiem kwasu m/z, Da Widmo w Me z dodatkiem soli Na Q1: 5.13 to min from Sample 2 (MP 29 ) of mp3469.wiff (Turbo Spray), Smoothed Max. 3.3e6 cps. 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e M m/z, Da MNa MK Q1: to 3.42 min from Sample 4 (MP 29 Na) of mp3469.wiff (Turbo Spray), Smoothed, Smoothed Max. 3.1e6 cps. 3.1e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e5. M m/z, Da MNa MK 14

8 Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 Da, zawierającej grupy i C 1 9 8? 21.? Spec #1[BP = 21., 724] ESI () 724 C () m % Intensity F 149. F 279.1? F? [2M Na ] F Mass (m/z) () n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M ] ESI (-) % Intensity Mass (m/z) Widm ESI peptydu o masie 2523,5 Da [M 4 ] 4 Spec /1:8[BP = 632.1, 2248] M =,33 n = 3 6 % Intensity 5 4 [M 5 ] 5 3 [M 3 ] [M 2 ] Mass (m/z) M = 3 842,18 3 = 2523,5 Da 16

9 Widmo ESI peptydu o masie Da Widmo po dekonwolucji m 2 m 1 m 1 = (M n)/n m 2 = (M n 1)/(n 1) n = (m 2 1)/(m 1 m 2 ) ( m M m 2 1)( m1 1) 1 m 2 Rozdzielczość spektrometru zbyt niska, aby można było rozróżnić jony izotopowe. 17 Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF 3 CAg ESI C C 2 n MALDI 18

10 Widma ESI kompleksów eterów makrocyklicznych z kationami litowców M Na M K M Rb m/z, amu N M = 29 N Ligand Na K Rb Cs (1:1:1:1:1) w Me 2 (7:3) M Cs 2M Na M Na M K M Cs M Rb M = 62 N N Ligand Na K Rb Cs (1:1:1:1:1) w Me 2 (7:3) 2M K 2M Rb M Na M Cs m/z, amu 19 Widma ESI aldehydu o M = 269 Da w Me i Et Mariner Spec /27:32 (T /1.39:1.82) ASC[BP = 324.1, 611] 1 9 Widmo w Me M Me Na R Aldehydy często tworzą hydraty i hemiacetale: R' % Intensity M M Me M Na 32.2 M 2 Na Mass (m/z) R R' Widmo w Et Mariner Spec /7:26 (T /.38:2.) ASC[BP = 338.2, 355] M Et Na % Intensity M 2 Na M Na Mass (m/z) 2

11 2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego lub pseudomolekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych; badanie profilu izotopowego; łączne zastosowanie obu powyższych metod. 21, , ,.15 e, , , Li, , , Be, , 1. Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków B, , , 81.2 C, 2 12., , 1.18 N, , ,.365, , , ,.24 F, , 1. Ne, , , , 8.82 Na, , 1. Mg, , , , Al, , 1. Si, , , , 3.12 P, , 1. S, , , , ,.17, , ,

12 Ważne: Dokładny pomiar masy - wymagania Dokładny pomiar masy nie zastępuje analizy elementarnej, ponieważ nie dostarcza informacji o czystości próbki. Pozwala jedynie na stwierdzenie, że w widmie masowym badanej próbki znajduje się pik pochodzący od jonu o masie odpowiadającej założonemu wzorowi sumarycznemu. Czystość związku należy udowodnić w inny sposób. Wymagania większości czasopism odnośnie dokładnych pomiarów masy są następujące: 1. Pomiar musi dotyczyć jonu molekularnego lub pseudomolekularnego (a nie jonów fragmentacyjnych). 2. Dokładność pomiaru powinna wynosić 5 ppm (w niektórych czasopismach dopuszcza się 1 ppm, zwłaszcza dla wyższych mas). 3. Można mierzyć masy nie przekraczające 1 u. 23 Zależność liczby możliwych wzorów sumarycznych od dokładności pomiaru masy i masy cząsteczkowej 24

13 Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx MM286/1 z4_mm (.863) AM2 (Ar,3.,.,.); Cm (43:49) : TF MS ES 5.e6 581,371 Czy jon o m/z 581 jest jonem M czy MNa? % m/z Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx M = C Czy jon o m/z 581 jest S MNa = C jonem M czy MNa? Si Na 26

14 Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx MM286/1 z4_mm (.863) AM2 (Ar,3.,.,.); Cm (43:49) : TF MS ES 5.e6 Jeśli jon m/z 581 jest jonem M, to jego klaster powinien mieć masę 2 x 58 1 = Jeśli jon m/z 581 jest jonem MNa, to jego klaster powinien mieć masę 2 x = % m/z Ustalanie wzoru sumarycznego w programie MassLynx Najlepszy wzór: C Si 2 Na zgadza się ze wzorem: 2 x C Si Na 28

15 Profile izotopowe kombinacji pospolitych pierwiastków dwuizotopowych typu M2 29 Porównanie profilu izotopowego zmierzonego i obliczonego Widmo zmierzone Intensity (%age) Low Resolution M/z Intensity (%age) Widmo obliczone dla składu: C F 6 N 2 5 Ru Mass 3

16 3. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów (w EI); stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego; stwierdzenie wzajemnej niezgodności widm jonów dodatnich i ujemnych. 31 Typowe zanieczyszczenia próbek obserwowane w widmach masowych 32

17 Węglowodory nasycone (na przykładzie triakontanu C 3 62 ) M = Silikony Abundance 73 #275767: SILIKNFETT SE3 (GREVELS) R Si Si n Si R M = m/z-->

18 Ftalan di-n-butylu M = Ftalan diizooktylu M = 39 36

19 Widmo ESI ftalanów Spec /2:19 ASC[BP = 413.3, 542] ftalan diizooktylu Na % Intensity ftalan di-n-butylu Na (ftalan diizooktylu) 2 Na Mass (m/z) Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm; analiza fragmentacji w standardowym widmie EI; badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej (CID); dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych; wymiana izotopowa. 38

20 Identyfikacja produktu reakcji na podstawie widma masowego C 2 5 C 2 5 Na Et czy? x Intensity (%age) = C M Low Resolution M/z 39 Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru 4 N 2 M = 137 Intensity (%age) Intensity (%age) Widmo standardowe Low Resolution M/z Widma EI Widmo po kilkakrotnym odparowaniu próbki z D Low Resolution M/z d d 2 d

21 M Na M 16 Widma ESI Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru 41 N 2 M = 137 % Intensity % Intensity Mass (m/z) d 2 -M Na 162 d 2 -M D d 3 -M d 3 -M D d-m D d 2 -M M D d-m 163 d 3 -M Na d 1 -M Na Widmo w Me/ 2 Widmo w MeD/D Mass (m/z) MECANIZMY FRAGMENTACJI JNÓW ZWIĄZKÓW RGANICZNYC 42

22 Cechy charakterystyczne zjawiska fragmentacji jonów Proces jednocząsteczkowy; szybkość fragmentacji jest mała w porównaniu z szybkością rozpraszania energii na wszystkie stopnie swobody jonu: proces quasirównowagowy; możliwość równoległego (konkurencyjnego) przebiegu wielu procesów fragmentacji danego jonu; możliwość przebiegu reakcji następczych (fragmentacja wieloetapowa); intensywność względna piku jonu fragmentacyjnego zależy od szybkości jego tworzenia i szybkości dalszego rozpadu. 43 Możliwe warianty fragmentacji jonów dodatnich Jony E E EE R E E N rozerwanie nieparzystej liczby wiązań, najczęściej 1 rozerwanie parzystej liczby wiązań, najczęściej 2 Jony EE EE EE N EE E R sposób preferowany: rozerwanie parzystej liczby wiązań, najczęściej 2 sposób na ogół niekorzystny, ale są bardzo liczne wyjątki: rozerwanie nieparzystej liczby wiązań, najczęściej 1 Even electron rule reguła parzystości elektronów E - jony nieparzystoelektronowe; EE - jony parzystoelektronowe 44

23 Stany przejściowe w reakcjach prostego rozerwania wiązania i przegrupowania A B C D Reakcja prostego rozerwania wiązania kontrolowana przez entalpię A B C D A B C D "luźny stan przejściowy" (luźno związany) Równanie Eyringa-Polanyi ego kbt k h e G RT # kbt h e S R # e RT # A B C D " ciasny stan przejściowy" (ciasno związany) Reakcja przegrupowania kontrolowana przez entropię A D B C 45 Zależność wyglądu widma EI octanu etylu od energii elektronów proste rozerwanie wiązania przegrupowanie M C 3 C C 2 M = 88 46

24 Podstawowe rodzaje fragmentacji jonów Fragmentacja inicjowana przez centrum rodnikowe dotyczy tylko jonów nieparzystoelektronowych (jonorodników). Fragmentacja inicjowana przez ładunek dotyczy jonów nieparzysto- i parzystoelektronowych. Fragmentacja w miejscu odległym od położenia ładunku w jonie (chargé-remote fragmentation) dotyczy jonów parzystoelektronowych. 47 Jakościowe teorie fragmentacji A. Tworzenie najtrwalszych produktów fragmentacji Zgodnie z tą teorią fragmentacja przebiega w taki sposób, aby jej produktami były możliwie najtrwalsze, czyli najlepiej stabilizowane (o najniższej energii) jony i rodniki. Teoria ta jest zgodna z postulatem ammonda: fragmentacja jest procesem endoenergetycznym, dlatego też charakteryzuje się późnym, czyli zbliżonym do budowy produktu ( product-like ) stanem przejściowym: E A M współrzędna reakcji 48

25 Jakościowe teorie fragmentacji A. Tworzenie najtrwalszych produktów fragmentacji cd. W tej teorii stosuje się zapisy równań reakcji fragmentacji w postaci np.: Ph C 15 Ph C m/z 15 Nie dyskutuje się lokalizacji ładunku i miejsca rodnikowego, ani mechanizmu fragmentacji. 49 Jakościowe teorie fragmentacji B. Teoria inicjowania fragmentacji poprzez zlokalizowany ładunek i/lub niesparowany elektron Lokalizację ładunku w cząsteczce określa względna łatwość oderwania elektronu. Kolejność orbitali pod względem łatwości oderwania elektronu: n > > Dla elektronów n (niewiążących): N > S > > I, Br,, F Zgodnie z tą teorią stosuje się zapis przemieszczeń elektronów podczas fragmentacji: 1 elektron 2 elektrony (para) C 2 C 2 2 C C 2 We wzorach pomija się na ogół niewiążące pary elektronowe nie uczestniczące w reakcji. 5

26 Najważniejsze mechanizmy fragmentacji inicjowane niesparowanym elektronem i/lub ładunkiem 1. Rozerwanie wiązania w wyniku oderwania jednego z jego elektronów - e R C - R C R C Proces ten ma znaczenie tylko dla alkanów i fluorowcoalkanów. - C 3 7 m/z 57 (5%) Preferencje: tworzy się kation o najwyższej rzędowości; odrywa się największa grupa alkilowa. m/z 1 - C m/z 71 (48%) m/z 85 (4%) Rozpad inicjowany miejscem rodnikowym (rozpad homolityczny) Rozpad dotyczy tylko jonów E. Zdolność do inicjowania rozpadu : N > S,, >, Br > Miejsce rodnikowe dostarcza elektron do utworzenia wiązania z sąsiednim atomem z równoczesnym rozerwaniem następnego wiązania. Proces przebiega z zachowaniem położenia ładunku. C 2 2 C m/z 31 (1%) Preferencje: odrywa się największa grupa alkilowa lub grupa o najwyższej rzędowości; tworzy się kation najlepiej stabilizowany. C C C 2 C m/z 45 (55%) C 2 C 5 C m/z 43 (1%) C 2 C 3 C 2 5 C m/z 57 (7%) 52

27 3. Rozpad inicjowany ładunkiem (indukcyjnie; rozpad heterolityczny) W rozpadzie tym ulega przemieszczeniu cała para elektronowa w kierunku atomu z ładunkiem dodatnim. Rozpad ten może przebiegać zarówno dla jonów E, jak i EE. Następuje przeniesienie ładunku. Preferencje: Tworzy się trwalszy kation (większy lub o wyższej rzędowości). Przykłady rozpadu jonów nieparzystoelektronowych E i C 2 5 C 2 C 5 C m/z 29 (4%) (ponadto C 2 =C 2 5, m/z 59, 4%, z rozpadu C C i C C (ponadto C m/z 43, 36%, z rozpadu m/z 57 (1%) Rozpad inicjowany ładunkiem cd. Przykłady rozpadu jonów parzystoelektronowych EE C 2 5 CI i C C C 2 C 2 C 5 C i i C2 5 C 2 54

28 4. Reakcje fragmentacji przebiegające z przegrupowaniem (rozerwanie dwóch wiązań) jony E Przykłady efekt orto przebiegający poprzez 6-członowy stan przejściowy: Kwasy benzoesowe i ich estry podstawione z pozycji orto Y R Y = CR,, NR r R =, alkil Y R i - R odrywa się cząsteczka obojętna i pozostaje kationorodnik (E E ) Y C orto-nitrotoluen (i inne orto-nitroalkilobenzeny) R N r R = alkil R N CR N CR - N (możliwe też inne struktury) odrywa się rodnik i powstaje kation (E EE ) Reakcje fragmentacji przebiegające z przegrupowaniem (rozerwanie dwóch wiązań) jony EE orto- -C - 2 [M] [M] -C 2 meta- C C -C - 2 -C 2 [M] para- N - 2 N m/z 12 N -C C N m/z 92 -C 2 Widma fragmentacyjne jonu [M ] (m/z 138) trzech izomerycznych kwasów aminobenzoesowych zarejestrowane przy tej samej energii zderzeń. N N m/z 138 m/z 94 56

29 5. Fragmentacja z przegrupowaniem w miejscu odległym od położenia ładunku w jonie jony EE Przykład estry alkilowe: R 1 R r R 1 R lub R 1 R Jest to proces często obserwowany w widmach fragmentacyjnych jonów parzystoelektronowych (np. w ESI). Ładunek może znajdować się w miejscu oddalonym od miejsca fragmentacji ( charge-remote fragmentation ). 57 Identyfikacja zanieczyszczeń opidogrelu jako przykład wykorzystania reguł fragmentacji S 3 C N 58

30 Widmo ESI() opidogrelu Q1: to 2.46 min from Sample 3 (9/1 ACN 2 Ac.6 ml/min 27 nm) of Max. 2.9e6 cps. 2.9e6 2.5e6 C 3 N S M 2.e6 1.5e e6 5.e m/z, amu 59 Fragmentacja opidogrelu MS2 (322.1) CE (1): to 5.39 min from Sample 1 (frag 322) of opidogrel2.wiff (Unknown Ion Source) 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.e5 2.8e5 2.6e5 C 3 N S Max. 4.e5 cps. N S RDA C 2 N S 2.4e5 2.2e5 2.e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e m/z, amu MS2 (324.) CE (2): to min from Sample 2 (frag 324) of opidogrel2.wiff (Unknown Ion Source) 1.5e M Max. 1.1e5 cps. m/z 322/324 m/z 212/214 -C predominates at low collision energy C 2 N -C 2 =N predominates at high collision energy C 1.e5 9.5e4 9.e4 8.5e4 m/z 184/186 m/z183/185 8.e4 7.5e4 7.e4 6.5e4 6.e4 5.5e4 5.e4 4.5e4 4.e4 3.5e4 3.e4 2.5e M - N -CN C 2 -C 2.e4 1.5e4 1.e m/z, amu m/z 152/154 m/z125/127 m/z155/157 6

31 Chromatogramy PLC/UV i GC/MS opidogrelu Detector A, Channel 1 from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_Q1.wiff Max. 4.e6. 1.4e e5 1.2e5 1.1e e5 9.e4 8.e4 AU/uV 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e e4 1.e Time, min 7mg_mlMe_slit_1_1_start1stop operator: Marian lejnik clopid1527_ci 1 GCT Premier 1-ct-27 18:9: TF MS CI TIC % Time Synteza opidogrelu (ostatni etap) S S N C 2 / N Reakcja typu Picteta-Spenglera (wariant reakcji Mannicha) 62

32 Zanieczyszczenie opidogrelu o masie 351/353 Da EPI (352.4) CE (2): Exp 2, 5.98 to min fromsample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_frag e6 4.e6 3.5e6 Zanieczyszczenie Max. 4.6e6 cps EPI (322.5) CE (2): Exp 2, to min from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_fra... Max. 4.5e6 cps e6 M M 4.e6 opidogrel 3.5e6 3.e6 3.e6 2.5e e e6 2.e6 1.5e6 1.e e6 1.e e e m/z, amu m/z, amu Różnica masy: 3 Da (np. C 2 ). Drogi fragmentacji: identyczne jak w opidogrelu powstają te same jony fragmentacyjne. Wnioski: badany związek ma grupę o masie 31 Da w pierścieniu tiofenowym N S Prawdopodobna struktura: 63 Zanieczyszczenie opidogrelu o masie 323/325 Da EPI (324.) CE (3): Exp 1, to min from Sample 2 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_fra e6 9.5e6 9.e6 8.5e6 8.e6 7.5e6 7.e6 6.5e6 6.e6 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.5e6 2.e6 1.5e6 1.e6 5.e Fragmentacja jonu m/z 324 ( 35 ) Max. 9.9e6 cps m/z, amu EPI (326.) CE (3): Exp 1, 1.97 to min from Sample 1 (2,5mg75%ACN25%2) of 2227_ymc_fra e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e e5 M M 6.e e e Max. 2.8e6 cps. Fragmentacja jonu m/z 326 ( 37 ) m/z, amu Różnica masy: 2 Da (2). Drogi fragmentacji: istotne różnice w porównaniu z opidogrelem, ale niektóre jony wspólne (183/185, 155/157). Wnioski: brak fragmentacji typu RDA świadczy o nieobecności pierścienia 6-członowego z atomem azotu. N S Prawdopodobna struktura: 64

33 N Proponowane drogi fragmentacji zanieczyszczenia o masie 323/325 C 2 N -C C 2 N S N S m/z 226/228 m/z 198/2 - C 2 =N- m/z 324/326 - C S C -C S m/z 183/185 m/z155/157 m/z 111 m/z 264/ Klasyfikacja podstawowych typów fragmentacji protonowanego łańcucha peptydowego 2 N C C R x n y n 2 N z n C R C (...) N C R x 1 C y 1 2 N C 1 2 n n1 z 1 R C 2 2 a 1 b 1 c 1 a n b n c n 66

34 Ustalanie sekwencji peptydu na podstawie widma ESI-CID-MS = 129,3 Glu Spektrometr: Finnigan MAT LCQ J.R. Yates III, J. Mass Spectrom., 33, 1 (1998) 67 Spektrometria ruchliwości (mobilności) jonów sprzężona ze spektrometrią mas (IM-MS) Ion Mobility Mass Spectrometry 68

35 Spektrometria ruchliwości jonów Jonizacja Rozdział jonów na podstawie szybkości dryfu Detekcja jonów W klasycznej spektrometrii ruchliwości jonów rozdział następuje na podstawie różnic w szybkości dryfu jonów przez rurę z gazem pod wpływem słabego pola elektrycznego. 69 Spektrometria ruchliwości jonów Szybkość dryfu jonów v zależy od współczynnika ruchliwości K i natężenia pola elektrycznego E: v = KE Współczynnik ruchliwości jonu K można obliczyć z równania Masona - Schampa: K 3 16 ze N 2 1 kt z liczba ładunków jonu; e ładunek elementarny; N koncentracja gazu buforowego (liczba cząsteczek w jednostce objętości); k stała Boltzmanna; T temperatura; masa zredukowana; przekrój czynny jonu na zderzenia z gazem buforowym. mm m M m masa cząsteczkowa gazu buforowego; M masa cząsteczkowa jonu. K z Szybkość dryfu jonów jest więc odwrotnie proporcjonalna do iloczynu ich przekroju czynnego i pierwiastka z masy zredukowanej, a wprost proporcjonalna do ładunku jonu. 7

36 Sprzężenie spektrometrii ruchliwości jonów ze spektrometrią mas (IM-MS) Dwie podstawowe konstrukcje spektrometrów IM-MS: Jonizacja Analizator ruchliwości jonów (rozdział jonów na podstawie szybkości dryfu) Analizator masy (rozdział jonów na podstawie m/z) Detekcja jonów Jonizacja Analizator masy (rozdział jonów na podstawie m/z) Analizator ruchliwości jonów (rozdział jonów na podstawie szybkości dryfu) Detekcja jonów 71 Wariant pierwszy: spektrometr Agilent IM-QTF Spektrometr umożliwia bezpośrednie wyznaczenie przekrojów czynnych jonów 72

37 Wariant drugi: SYNAPT G2-S DMS (Waters) 73 Rozróżnianie p-butyloaniliny i N-butyloaniliny za pomocą techniki ruchliwości jonów N N 2 aniliny_mix z1_mzat_aniliny_3_8_212 Synapt G2-S : TF MS ES _15.2.5Da 2.35e5 N Intensywność [%] % Time Czas dryfu [ms] Protonowana N-butyloanilina posiada większą mobilność niż p-butyloanilina. Przekroje czynne Ω, obliczone za pomocą programu MBCAL metodą Trajectory Method wynoszą, odpowiednio, 76,9 oraz 77,7 Å 2. 74

38 W jaki sposób wykorzystać technikę IM-MS do zaproponowania lub potwierdzenia struktury jonu w fazie gazowej? Analyst, 215, 14, Przykład zastosowania techniki IM-MS do badania niekowalencyjnych agregatów kaliksalenów Dimer gospodarz - gość Kapsuła M. Petryk, A Troć, B. Gierczyk, W. Danikiewicz, M. Kwit, Chem. Eur. J. 215, 21,

39 Przykład zastosowania techniki IM-MS do badania niekowalencyjnych agregatów kaliksalenów [2] [2] Na 2 * [2] Na 2 * [2] Widmo masowe ESI() roztworu kaliksalenu 2 (R = Me) 77 Przykład zastosowania techniki IM-MS do badania niekowalencyjnych agregatów kaliksalenów [M] [2M] Monomery PM7 [M] m/z Ω exp Ω t 1 685,4 19,6 193,8 (1,7%) 2 775,5 212,5 211,6 (-,4%) 3 921,8 219,5 229,7 (4,4%) 4 853,6 241,9 234, (-3,4%) 78

40 Przykład zastosowania techniki IM-MS do badania niekowalencyjnych agregatów kaliksalenów [M] [2M] Dimery Kapsuła Dimer gospodarz - gość [2M] m/z Ω exp Ω t ,6 31,7 317,7 (2,2%) 2 155, 332,6 324,7 (-2,4%) ,7 334,7 336,1 (,4%) 4(a) 176,3 348,5 338,4 (-3,%) 4(b) 176,3 366,4 365,8 (-,2%) PM7 79