Techniki łączone w analityce chemicznej

Transkrypt

1 Techniki łączone w analityce chemicznej dr inż. Andrzej Wasik Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Gdańsk, 2004

2 Program Ograniczenia klasycznej analizy dwuwymiarowej i sposoby ich pokonania. Definicja technik łączonych. Rodzaje technik łączonych Techniki łączone oparte o wykorzystanie: spektrometrii mas - MS spektroskopii w podczerwieni - IR spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego - NMR inne techniki łączone Podsumowanie

3 Analiza dwuwymiarowa W typowym przypadku analiza chromatograficzna dostarcza nam informacji dwuwymiarowej. Najczęściej jest to zależność między wielkością sygnału z detektora (1 wymiar) od czasu retencji (2 wymiar) GC/FID Intensywność sygnału t ri t ri+1 t ri+2 Czas

4 Analiza dwuwymiarowa Identyfikacja odbywa się na podstawie czasu retencji. Porównujemy czas retencji analitu z czasem retencji wzorca. Problem 1 W przypadku analizy skomplikowanych mieszanin nie mamy pewności, że dany pik odpowiada pojedynczej substancji. Problem 2 Niemożliwa jest identyfikacja nieznanych substancji.

5 Analiza dwuwymiarowa Analiza HPLC-UV ekstraktu z Leuzea carthamoides ?? ????? ???

6 Rozwiązanie Analiza dwuwymiarowa Problem 1 - nakładanie się pików Powtórzyć analizę przy użyciu kolumny z innym typem wypełnienia. Rodzaj oddziaływań pomiędzy analitem a fazą stacjonarną musi być inny niż za pierwszym razem. Zalety: - łatwość wykonania - niski koszt Wady: - wysoka czasochłonność

7 Analiza dwuwymiarowa Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji Rozwiązanie Zastosować detektor dostarczający informacji o strukturze analitu. Innymi słowy zastosować techniki łączone. Zalety: - możliwość identyfikacji nieznanych związków - informacja o ich masie cząsteczkowej i/lub strukturze Wady: - wysokie koszty inwestycyjne - wysokie wymagania co do kwalifikacji personelu - łatwe wykrywanie faktu nakładania się pików - szybsze uzyskanie wyniku końcowego

8 Techniki łączone - definicja Kombinacja (zestaw) metod badawczych, umożliwiających rozdzielenie badanej próbki na poszczególne składniki oraz ich jednoznaczną identyfikację. Rozdzielenie GC - MS LC - ICP/MS Struktura Skład pierwiastkowy

9 Techniki łączone Dzięki wykorzystaniu technik łączonych informacja analityczna zyskuje dodatkowy wymiar (struktura) intensywność sygnału m/z czas

10 Przegląd technik łączonych Tabela 1 Najpopularniejsze techniki łączone GC-MS SFC-MS LC-GC-MS LC-DAD CE-DAD GC-IR SFC-IR LC-GC-IR LC-MS CE-MS GC-IR-MS SFC-GC-MS LC-ICP-MS GC-AES SFC-GC-IR LC-IR GC-ICP-MS LC-NMR GC-GC-MS LC-MS-MS LC-LC-MS

11 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (MS)

12 Podstawy spektrometrii mas Spektrometria mas - metoda określania masy (a ściślej stosunku masy do ładunku m/z) cząstek naładowanych elektrycznie (jonów). Na poruszający się ładunek elektryczny (jon) oddziałuje zarówno pole elektryczne jak i magnetyczne. W spektrometrach mas wykorzystujemy ten fakt aby z mieszaniny jonów wybrać te o konkretnym stosunku m/z i skierować je do detektora, dzięki czemu można określić ich ilość w mieszaninie.

13 Podstawy spektrometrii mas Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem

14 Podstawy spektrometrii mas Dwa najważniejsze elementy spektrometru mas to: komora jonizacyjna, czyli miejsce w którym powstają jony, oraz analizator mas wlot próbki Komora jonizacyjna jony Analizator mas

15 Podstawy spektrometrii mas

16 Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Wyróżnić można dwa rodzaje jonizacji: miękka jonizacja, podczas której tworzy się jedynie jon molekularny (cząsteczkowy) bez fragmentacji cząsteczki, twarda jonizacja, podczas której cząsteczka rozpada się na fragmenty Istnieją takie konstrukcje komór jonizacyjnych, które powodują jedynie miękką jonizację analitów. Natomiast podczas jonizacji twardej powstaje zawsze mieszanina jonów cząsteczkowych i fragmentów cząsteczek analitu.

17 Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Miękka i twarda jonizacja cząsteczki analitu stabilny kationorodnik M M M M niestabilny kationorodnik fragmenty m i m j

18 Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Od sposobu jonizacji zależy ile informacji o strukturze związku można uzyskać. Miękka jonizacja pozwala jedynie określić masę cząsteczkową analitu. Jonizacja twarda dostarcza informacji o masie cząsteczkowej i strukturze związku.

19 Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Metody jonizacji Bombardowanie strumieniem cząstek Reakcje chemiczne Pole elektryczne o wysokim natężeniu Wysoka temperatura EI CI ES/IS TS FAB PB FI ICP MALDI FD APCI/PIS brak fragmentacji cząsteczek fragmentacja cząsteczek, możliwość określenia struktury

20 Podstawy spektrometrii mas Wybrane metody jonizacji próbek ciekłych

21 Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) N (~80 C) 2 wysokie napięcie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ciśnienie atmosferyczne separator stożkowy Próżnia N (~80 C) 2 do pompy próżniowej

22 Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) N (~80 C) 2 wysokie napięcie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ciśnienie atmosferyczne separator stożkowy Próżnia N (~80 C) do pompy + próżniowej [M+nH nh] n+ ODPAROWANIE ROZPUSZCZALNIKA POWSTANIE JONÓW WYLOT KAPILARY COULOMBOWSKA EKSPLOZJA KROPLI AEROLOZU

23 Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) Widma masowe początku i końca piku są różne Oznacza to, że ten pozornie pojedynczy pik powstał z nałożenia dwóch innych m/z m/z

24 Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) Możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę). Przepływ fazy ruchomej rzędu 1 ml/min. Nadaje się do analizy związków wysokocząsteczkowych (peptydy, białka), metaloorganicznych i nieorganicznych. Miękka metoda jonizacji, niewielka fragmentacja jonów a co za tym idzie trudności w określeniu struktury analitu. Wysoka czułość. Metoda przydatna do łączenia z kapilarną elektroforezą

25 Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Ciśnienie atmosferyczne Próżnia Próbka ciekła Gaz rozpylający Grzałka 1. Jonizacja cząstek rozpuszczalnika Analizator mas Wyładowanie koronowe 2. Reakcje powstałych jonów z cząsteczkami analitu, tworzenie się klastrów. Przeniesienie ładunku. 3. Rozpad klastrów Igła wyładowcza Gaz osłonowy

26 Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

27 Fotojonizacja chemiczna - Photo Ion Spray (PIS) Ciśnienie atmosferyczne Próżnia Próbka ciekła Gaz rozpylający Grzałka 1. Jonizacja cząstek fotoinicjatora Analizator mas 2. Reakcje powstałych jonów z cząsteczkami analitu, tworzenie się klastrów. Przeniesienie ładunku. 3. Rozpad klastrów Lampa UV Gaz osłonowy

28 Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - (APCI) Int. 12.5e6 APCI-tryb dodatni 215 O 10.0e6 7.5e6 5.0e6 (H 3 C) 3 C NH 2 Metribuzin N C8H14N4OS N M. cz.: N SCH 3 2.5e6 0.0e m/z Int APCI-tryb ujemny O (H 3 C) 3 C NH 2 Metribuzin N C8H14N4 OS N M. cz.: N SCH 3 Wygląd widma masowego zależy nie tylko od rodzaju związku ale także od trybu i parametrów jonizacji, oraz składu fazy ruchomej m/z

29 Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - (APCI) Możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę). Przepływ fazy ruchomej rzędu 2 ml/min. Przydatna do analizy związków nielotnych, nietrwałych termicznie, o małych i średnich masach cząsteczkowych, mało i średnio polarnych. Stosunkowo twarda metoda jonizacji, odpowiedni dobór parametrów jonizacji pozwala na fragmentację cząsteczek i określenie struktury analitu. Wysoka czułość i liniowość odpowiedzi.

30 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Jonizacja strumieniem szybkich atomów zaliczana jest do miękkich metod jonizacji. Jonizacja analitów następuje na skutek bombardowania roztworu analitu w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku (matrycy) za pomocą strumienia szybkich atomów argonu lub ksenonu o energiach rzędu 3-8 kev. Do jonizacji analitów można też wykorzystać strumień rozpędzonych jonów cezu o energii do 35 kev. Ta modyfikacja FAB znana jest pod nazwą spektrometrii jonów wtórnych (Secondary Ion Mass Spectrometry - SIMS). W praktyce różnice pomiędzy obiema metodami są niewielkie. Rolą matrycy (rozpuszczalnika) w metodzie FAB jest: 1) absorbcja energii rozpędzonych atomów uderzających w powierzchnię roztworu 2) rozpuszczenie analitu 3) ciągłe odnawianie powierzchni roztworu 4) wspomaganie jonizacji jako donor/akceptor protonów bądź elektronów

31 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Działo "atomowe" Sonda z próbką Analizator mas

32 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) źródło jonów piewotnych (4-6 ev) soczewki jonowe anoda katoda emitująca elektrony - "powolne" atomy gazu - gaz zjonizowany - "szybkie" atomy gazu elektrody odchylające komora kolizyjna gaz obojętny (Ar, Xe) sonda z kroplą próbki + + strumień jonów wtórnych do analizatora mas

33 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Sonda do wprowadzania próbki do komory jonizacyjnej FAB. Na zbliżeniu widoczna jest kropla gliceryny zawierająca rozpuszczony analit.

34 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Dwustronna sonda do wprowadzania próbki do komory jonizacyjnej FAB. Po jednej stronie umieszcza się próbkę, po drugiej wzorzec. Widoczna na ilustracji dźwignia służy do obracania sondy o 180.

35 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Porowaty spiek Xe 0/Cs Obudowa sondy Strumień jonów wtórnych Eluent z LC z dodatkiem matrycy FAB Do analizatora mas Kwarcowa kapilara Opcjonalny absorbent eluenta Ciągły film cieczy Modyfikacja sondy FAB umożliwiająca podłączenie chromatografu cieczowego lub kapilarnej elektroforezy.

36 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) tetramezytyloporfiryna C H N NH N N HN Przykład widma masowego uzyskanego metodą FAB

37 Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB) Zakres przepływów tolerowanych w tej metodzie jest rzędu ułamków mililitra na minutę. Współpraca LC z FAB możliwa jest dzięki zastosowaniu dzielników strumienia eluenta. W przypadku CE dzielniki nie są potrzebne. Próbka musi być wymieszana/rozpuszczona w tzw. matrycy np. glicerolu, tioglicerolu bądź alkoholu nitrobenzylowym. Można to zrobić przed kolumną rozdzielczą (możliwe problemy z rozdzieleniem) bądź na jej wylocie (trudności wykonawcze). Przydatna do analizy związków nielotnych, nietrwałych termicznie, o dużych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności (kwasy nukleinowe, leki, związki powierzchniowo czynne). Miękka metoda jonizacji. Stosunkowo wysoka czułość.

38 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Technika MALDI polega na jonizacji składników próbki na skutek naświetlenia silnym i krótkim impulsem lasera UV (3-5 ns, 337 nm). Mechanizm jonizacji nie jest jeszcze dokładnie zbadany, wiadomo że jest on kilkuetapowy. Pierwszym etapem jest jonizacja specjalnie dobranych składników tzw. matrycy (np. kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy, kwas pikolinowy, 9- nitroantracen). W kolejnych etapach następuje jonizacja analitów na skutek przekazania ładunku (np. protonu lub kationu sodowego) od jonów matrycy. MALDI jest unikatową metodą jonizacji analitów. Jej specyficzne cechy można wykorzystać właściwie jedynie w połączeniu z jednym tylko typem analizatora mas jakim jest analizator czasu przelotu (Time Of Flight - TOF). Dlatego też, mówiąc MALDI najczęściej mamy na myśli połączenie MALDI-TOF.

39 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Laser Obszar przelotu jonów Repeler Próbka Detektor Płytki ogniskujące Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI

40 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Zasada jonizacji techniką MALDI

41 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI

42 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

43 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) tetramezytyloporfiryna C H N NH N N HN Przykład widma masowego uzyskanego metodą MALDI

44 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Przykład widma masowego uzyskanego metodą MALDI

45 Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Specyficzna metoda jonizacji. Nie stosuje się do połączeń on-line z technikami rozdzielania substancji. Wymaga połączenia z bardzo szybkim analizatorem mas. Dotychczas jedynie analizator TOF spełniał ten warunek. Ostatnio pojawiają się doniesienia o udanych próbach z użyciem analizatora FT-ICR (Fourier Transform - Ion Cyklotron Resonance). Próbka musi być wymieszana/rozpuszczona z tzw. matrycą np. kwasem 2,5- dihydroksybenzoesowym, kwasem pikolinowy lub 9-nitroantracenem. Zadaniem matrycy jest pochłonięcie promieniowania laserowego dzięki czemu następuje pośrednia jonizacja analitów. Przydatna do analizy związków nielotnych, o dużych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności (kwasy nukleinowe, białka, polimery). Miękka metoda jonizacji.

46 Metody jonizacji próbek ciekłych (HPLC, CE) Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) oraz Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) to w chwili obecnej dwie najczęściej stosowane metody jonizacji w chromatografii cieczowej. Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowań, łatwości użycia, wysokiej czułości oraz możliwości pracy z przepływami fazy ruchomej rutynowo stosowanymi w HPLC. ESI i APCI to komplementarne metody jonizacji.

47 Podstawy spektrometrii mas Wybrane metody jonizacji próbek gazowych

48 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization

49 Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) M M stabilny kationorodnik M M fragmenty m i Podczas jonizacji strumieniem elektronów (70 ev) zachodzą oba procesy, z przewagą twardej jonizacji. Uzyskane widmo masowe jest bogate w jony fragmentacyjne niestabilny kationorodnik m j

50 Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) Przykład widma EI 100 Benzen, m.cz.=78 Jon molekularny (M) Pasmo główne (największe natężenie) 60 Jony fragmentacyjne Pasmo izotopowe (M+1) m/z

51 Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) Przykład widma EI. Widoczne charakterystyczne piki izotopowe chloru NH N N Cl N NH CH 3 CH 3 Cyprazine m. cz.:227, ( Cl) ( Cl) m/z

52 Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) Najbardziej popularna metoda jonizacji w chromatografii gazowej. Twarda metoda jonizacji. Często jon molekularny ma małą intensywność. Bogate biblioteki widm masowych - prosta identyfikacja analitów. Bardzo szeroki zakres zastosowań. Wysoka czułość, liniowość i powtarzalność odpowiedzi.

53 Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) Zasadniczo konstrukcja komory jonizacyjnej do jonizacji chemicznej jest taka sama jak dla jonizacji strumieniem elektronów. Różnicę stanowi fakt, iż w przypadku jonizacji chemicznej wraz z próbką do komory jonizacyjnej doprowadza się gaz reakcyjny (metan, amoniak, izobutan). Cząsteczki gazu reakcyjnego ulegają jonizacji a powstałe jony reagują z cząsteczkami próbki. Wynikiem tych reakcji jest powstanie zjonizowanych cząsteczek analitów. Jest to stosunkowo miękka metoda jonizacji. Z reguły jon molekularny ma dużą intensywność przy ograniczonej fragmentacji.

54 Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)

55 Względna intensywność Względna intensywność EI ester metylowy kwasu oktanowego m.cz.=158 0 CI ester metylowy kwasu oktanowego m.cz.= Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) m/z [MH] m/z 127 M [M C2H 5] + [M C3H 6] Porównanie widm EI oraz CI tego samego związku. Charakterystyczny brak fragmentacji oraz obecność adduktów w obrazie widma CI.

56 Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) Druga pod względem popularności metoda jonizacji w chromatografii gazowej. Komora do CI tak niewiele różni się konstrukcją od komory do EI, że wielu producentów wytwarza komory z możliwością przełączenia trybu jonizacji EI-CI Miękka metoda jonizacji. Ułatwione wyznaczenie masy cząsteczkowej analitu. Mała odtwarzalność procesu jonizacji = brak bibliotek widm masowych. Metoda komplementarna do EI

57 Metody jonizacji próbek gazowych (GC) Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) oraz Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI) wraz z ich modyfikacjami to dwie najczęściej stosowane metody jonizacji w chromatografii gazowej. Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowań, łatwości użycia i wysokiej czułości. EI oraz CI to komplementarne metody jonizacji. Największą zaletą jonizacji strumieniem elektronów jest powtarzalność tego procesu czego wynikiem są komercyjnie dostępne biblioteki widm masowych obejmujące tysiące związków chemicznych. Umożliwia to automatyzację procesu identyfikacji nieznanych substancji.

58 Podstawy spektrometrii mas Uniwersalne metody jonizacji próbek

59 Jonizacja przebiegająca z całkowitym rozpadem cząsteczki Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy - Inductively Coupled Plasma (ICP) to metoda jonizacji znacząco różniąca się od metod wcześniej omówionych. Wprowadzenie analitu do indukcyjnie ogniskowanej plazmy powoduje całkowity rozpad cząsteczki i powstanie jednoatomowych jonów. Metoda ta uniemożliwia określenie struktury cząsteczki ale pozwala na dokładne określenie jej składu pierwiastkowego. Dzięki wysokiej energii plazmy, efektywności jonizacji i wysokiej czułości, aparaturę ICP/MS można łączyć z praktycznie każdą techniką rozdzielania substancji.

60 Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy Inductively Coupled Plasma (ICP) Argon Palnik plazmowy Analizator mas Kolumna GC lub wylot rozpylacza Do pomp próżniowych

61 Przykład wykorzystania techniki ICP-MS MeEtHg Et Hg Hg Impulsy [1] Hg Hg 199 Hg Technika GC-ICP-MS Oznaczanie organicznych pochodnych rtęci w tkance dorsza Czas retencji [s]

62 Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy Inductively Coupled Plasma (ICP) Cząsteczka analitu rozpada się na atomy - brak informacji strukturalnej. Metoda ta nadaje się do połączeń ze wszystkimi technikami rozdzielania substancji. Niezwykle wysoka czułość związana z wysoką efektywnością procesu jonizacji. Niektóre pierwiastki można oznaczać na poziomie fg (!). Kosztowna zarówno inwestycyjnie, jak i eksploatacyjnie.

63 Podstawy spektrometrii mas

64 Podstawy spektrometrii mas - rodzaje analizatorów mas Kwadrupolowe (pojedyncze i wielokrotne) (Quadrupole) Pułapki jonowe (Ion Trap) Analizatory czasu przelotu (Time-Of-Flight TOF) Sektory magnetyczne (Magnetic Sector) Sektory magnetyczne z podwójnym ogniskowaniem (Double Focusing Magnetic Sector) Mieszane np. sektor magnetyczny/pułapka jonowa, kwadrupol/analizator czasu przelotu (Hybrid)

65 Podstawy spektrometrii mas Magnetic Spektrometry Sector Instruments z sektorem magnetycznym Constant rozdzielczość Resolution with mass nie zależy od masy 10% Valley Definition Rozdzielczość = m / m

66 Podstawy spektrometrii mas Kwadrupole Pułapki jonowe TOF Magnetic Sector Instruments rozdzielczość Constant zależy Resolution od masywith mass 10% Valley Definition Rozdzielczość = m / m m/z 500/1, R = 500 m/z 500/0.1, R = 5000 FWHM - Full Width at Half Maximum Całkowita szerokość w połowie wysokości

67 Wpływ rozdzielczości na kształt pików 1.0 FWHM 0.7 FWHM 0.5 FWHM 0.3 FWHM 0.2 FWHM 0.1 FWHM

68 Analizator kwadrupolowy - Quadrupole Pręty kwadrupola Detektor Źródło zasilające pręty kombinacją napięć, stałego i o częstotliowści radiowej Źródło jonów

69 Analizator kwadrupolowy - Quadrupole Wygląd analizatora kwadrupolowego z prętami o przekroju hiperbolicznym, firmy ThermoFinnigan

70 Analizator kwadrupolowy - cechy Najpowszechniej spotykany typ analizatora Typowy zakres m/z: Stosunkowo mała prędkość zbierania pełnych widm (niska czułość w trybie Full Scan) Wysoka czułość w trybie SIM Relatywnie niska rozdzielczość (siła rozdzielcza) Wysoka odtwarzalność (dobrze nadaje się do pomiarów ilościowych) Duży zakres dynamiczny (zdolność do pomiaru zarówno dużych jak i małych sygnałów)

71 Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS) Pułapka jonowa - Ion Trap

72 Pułapka jonowa - Ion Trap

73 Pułapka jonowa - cechy Małe rozmiary, łatwość konserwacji Wysoka prędkość zbierania pełnych widm (duża czułość w trybie Full Scan) Stosunkowo niska czułość w trybie SIM Wysoka rozdzielczość, doskonała do pomiarów jakościowych (identyfikacja) Możliwość przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS Mały zakres dynamiczny Stosunkowo słaba odtwarzalność Jakość widm zależy od wielu parametrów

74 Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF) Laser Obszar przelotu jonów Repeler Próbka Detektor Płytki ogniskujące Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI

75 Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF) Źródło jonów Lustro elektrostatyczne (reflektron) Repeler Detektor Pierwszy obszar przelotu jonów Płytki ogniskujące Drugi obszar przelotu jonów Niska energia Wysoka energia Średnia energia

76 Analizator czasu przelotu - cechy Najszybszy ze znanych analizatorów mas Najszerszy praktyczny zakres m/z Wysoka czułość Wysoka rozdzielczość (siła rozdzielcza) Z natury przystosowany do pracy z impulsowymi źródłami jonów jak np. MALDI, choć istnieją konstrukcje przystosowane do pracy z np. EI Wysokie wymagania co do prędkości detektora

77 Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera wzmacniacz FFT m/z + B 0 RF wzbudzenie 8 MHz 100 khz

78 Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera

79 Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera - cechy Szybkość porównywalna z TOF Dokładność wyznaczania masy < 1 ppm Bardzo wysoka czułość: 1 attomol = mola Wyjątkowo wysoka rozdzielczość > Możliwość przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS

80 Analizatory z sektorem magnetycznym - Magnetic Sector Analizator mas z sektorem magnetycznym

81 Analizatory z sektorem magnetycznym - Magnetic Sector Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem

82 Analizatory z sektorem magnetycznym i podwójnym ogniskowaniem - cechy Stanowią wzorzec z którym porównuje się inne typy analizatorów mas Bardzo wysoka odtwarzalność Najlepszy ze znanych analizatorów pod względem analizy ilościowej Wysoka czułość Wysoka rozdzielczość (siła rozdzielcza) Bardzo szeroki zakres dynamiczny Duże rozmiary, wysokie koszty

83 Technika MS n Monitorowanie jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora (Product (Fragment) Ion Scan) CID Gaz reakcyjny np. argon

84 Technika MS n Technika monitorowania jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora (Product Ion Monitoring) pozwala na wygodne określenie struktury wybranego analitu (parent ion). Niektóre opublikowane zastosowania to: wczesna diagnoza niektórych chorób genetycznych np. choroby Fabry ego wykrywanie oraz identyfikacja narkotyków i środków farmakologicznych w płynach ustrojowych (bardzo skomplikowana matryca) wykrywanie oraz identyfikacja bojowych środków trujących (BST) i potencjalnych BST w warunkach polowych

85 Technika MS n Monitorowanie wybranego jonu fragmentacyjnego pochodzącego od wybranego prekursora (Selected Reaction Monitoring - SRM) Gaz reakcyjny np. argon

86 Technika MS n Technika monitorowania wybranego jonu (jonów) fragmentacyjnego pochodzącego od wybranego prekursora (Selected Reaction Monitoring) pozwala na znaczącą poprawę selektywności i czułości oznaczeń w przypadku analizy próbek o bardzo złożonej matrycy LC/MS SIM Ekstrakt z moczu konia wyścigowego. Monitorowanie obecności dexamethazonu. LC/MS/MS ,147,

87 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (IR)

88 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni Spektroskopia w podczerwieni - metoda badawcza polegająca na pomiarze absorpcji promieniowania z zakresu podczerwieni (IR - Infra Red) przez badane substancje. Promieniowanie podczerwone (0, µm) pochłaniane jest przez większość substancji chemicznych. Długość fali pochłanianego promieniowania zależy od rodzaju atomów tworzących wiązanie, jego długości i najbliższego otoczenia atomów. Wiedząc jakie długości fali promieniowania podczerwonego absorbuje dana substancja możemy określić jej budowę chemiczną. Można tego dokonać albo przez analizę poszczególnych pasm absorpcji albo przez porównanie widma nieznanej substancji z widmami zawartymi w bibliotekach.

89 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni promieniowanie kosmiczne (10 do 10 cm) promieniowanie gamma (10 do 10 cm) λ -8-6 promieniowanie X (10 do 10 cm) długość fali daleki ultrafiolet (10 do 2 10 cm) -5-5 ultrafiolet (2 10 do cm) światło widzialne ( do podczerwień ( do cm) cm) energia ν = -- 1 λ 10-2 E = h ν mikrofale (3 10 do 10 cm) częstotliwości radiowe ( do 5 10 cm) 10 3

90 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni widzialne BLISKA (NEAR) λ, cm λ, µm do ( ) 0.78 do 3 λ, cm -1 (liczba falowa) do 4000 energia (E) kj/mol podczerwień ŚREDNIA (MID) do ( ) 3 do do kj/mol DALEKA (FAR) do ( ) 30 do do kj/mol mikrofale cm = 10-2 m mm = 10-3 m µm = 10-6 m

91 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni region "fingerprint" Relative Transmittance Acetamidophenol (paracetamol) HN OH O CH Wavenumber (cm ) 1000.

92 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Podstawy spektroskopii w podczerwieni Spektroskopia w podczerwieni (IR) jest nieniszczącą metodą badawczą. Dzięki temu aparaturę do IR można łączyć szeregowo z innymi technikami pomiarowymi. Znane są np. takie połączenia jak GC-IR-MS, LC-IR-MS czy CE-IR-UV. Dzięki spektroskopii IR możliwe jest rozróżnienie izomerów strukturalnych o bardzo podobnych widmach masowych (!). Spektroskopię w podczerwieni w połączeniu z chromatografią gazową lub cieczową wykorzystuje się głównie jako metodę identyfikacji analitów, często jako metodę uzupełniającą (komplementarną) do MS.

93 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) MS kontra IR Rel. Abundance Rel. Abundance Naftalen C H 10 8 Azulen C H 10 8 Relative Transmittance Relative Transmittance Naftalen W niektórych przypadkach trudno C10H8 zidentyfikować 0.2 pewne substancje jedynie na podstawie prostego widma MS. 1. Wtedy 0.8 z pomocą może przyjść IR Azulen C H m/z Wavenumber (cm ) 1000.

94 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Połączenie GC-IR Obecnie stosowane spektrometry IR to praktycznie wyłącznie aparaty FT-IR (Fourier Transform Infra Red), cechują się one dużą prędkością zbierania widm (kilka sekund na widmo), mniejszym kosztem, wyższą stabilnością oraz lepszą czułością w porównaniu do klasycznych spektrometrów dyspersyjnych. Do innych detektorów np. MS Wylot kolumny GC Celka pomiarowa wykonana w technologii Lightpipe Wiązka IR ze spektrometru Detektor Ogrzewany termostat

95 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Połączenie GC-IR

96 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Połączenie HPLC-IR (SFC-IR) Eluent z kolumny HPLC Grzałka dyszy Kapilara śr. wew. 100 µm Do detektora Lustro IR Wiązka IR ze spektrometru Gaz ogrzewający kapilarę Faza ruchoma Osad analitu Germanowy dysk Silnik

97 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR) Spektroskopia w podczerwieni - cechy Nieniszcząca metoda badawcza. Możliwość szeregowego łączenia z innymi detektorami. Umożliwia rozróżnienie izomerów strukturalnych. Metoda komplementarna do MS. Stosunkowo mała czułość. Szeroko stosowana do identyfikacji leków, używek, polimerów, barwników. Bogate biblioteki widm IR ułatwiają identyfikację nieznanych substancji.

98 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)

99 Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance) Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - metoda badawcza polegająca na pomiarze absorbcji promieniowania elektromagnetycznego przez jądra atomowe umieszczone w silnym zewnętrznym polu magnetycznym. Jądra atomowe wykazują właściwość zwaną spinem. O ile liczba protonów i liczba neutronów tworzących jądro nie są jednocześnie parzyste to spin takiego jądra jest różny od zera. Takie jądra atomowe są przedmiotem badań NMR. W zależności od swojego ułożenia w cząsteczce związku chemicznego, atomy (jądra atomów) danego pierwiastka pochłaniają różne częstotliwości promieniowania co umożliwia określenie ich ilości oraz wzajemnego położenia.