Copyright 2003 Witold Danikiewicz ELECTROSPRAY IONIZATION (ESI)

Transkrypt

1 ELECTRSPRAY INIZATIN (ESI)

2 NBEL 2002 John B. Fenn ur r.

3 Źródło jonów ESI skonstruowane przez J. Fenna Copyright 2003 M. Mann, S. Shen i J. B. Fenn Electrospray Mass Spectrometry w: Mass Spectrometry in the Biological Sciences: A Tutorial, Ed. M. L. Gross, Kluver Academic Publishers, Dordrecht 1992.

4 Źródło jonów ESI w spektrometrze Mariner

5 Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 1 Tworzenie aerozolu podczas wypływu cieczy z kapilary w polu elektrycznym kapilara gaz rozpylający

6 Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 2 (powtarza się wielokrotnie) dparowanie rozpuszczalnika z kropli i jej rozerwanie ( eksplozja kulombowska ) po przekroczeniu bariery Raleigha odparowanie rozpuszczalnika "eksplozja kulombowska" po przekroczeniu bariery Raleigha

7 Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 3 Wariant desorpcja z kropli Desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej w wyniku działania pola elektrycznego (średnica kropli ok. 10 nm) desorpcja jonu w wyniku działania pola elektrycznego

8 Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej w technice ESI ETAP 3 Wariant odparowanie do sucha W wyniku dalszego odparowywania rozpuszczalnika powstają częściowo solwatowane jony naładowane wielokrotnie mechanizm ten dotyczy dużych, polarnych cząsteczek (średnica kropli ok. 10 nm) dalsze odparowywanie rozpuszczalnika i podziały kropli + + jon naładowany wielokrotnie

9 Gaz rozpylający (N 2 ) Schemat źródła jonów electrospray w spektrometrze API 365 Dysza Płytka osłonowa Ciśnienie atmosferyczne Zbierak Pierścień Copyright 2003 Q Kapilara stalowa ~ 2 Torr 8 x 10-3 Torr Roztwór próbki Przechodzenie jonów do fazy gazowej Gaz osłonowy (N 2 ) Pompa wstępna Pompa turbomolekularna

10 Zasada działania źródła jonów typu TurboIonSpray

11 Źródło jonów typu TurboIonSpray

12 Zasada działania źródła jonów typu MicroIonSpray

13 Źródło jonów ESI firmy Agilent

14 Źródło jonów typu Z-SPRAY

15 Źródła jonów ESI - podsumowanie Electrospray lub IonSpray TurboIonSpray Microspray Nanospray Typ źródła Przepływ próbki 1 50 µl/min µl/min nl/min nl/min Podstawowa zasada: im mniejszy przepływ tym większa czułość. Copyright 2003

16 % Intensity Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu EI 70 ev [M 2 CH 3 ] M = 174 CH M/z M+Na + ESI w MeH M+H % Intensity M+Na Copyright Mass (m/z)

17 Widmo ESI związku o małej cząsteczce (M = 397, MeH, jony dodatnie) Spec #1[BP = 817.4, 2132] 2M + Na Ph 80 N Ph % Intensity M + H + M + Na H M = M + K Copyright Mass (m/z)

18 Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej binaftylu o masie 344 u, zawierającej grupy H i CH % Intensity F? ? F 279.1? F? Spec #1[BP = 201.0, 724] F Mass (m/z) ESI (+) [2M + Na + ] CH (H) (H) m n Spec #1[BP = 343.1, 2675] [M H + ] ESI (-) 2675 % Intensity Copyright Mass (m/z)

19 Widma LSIMS i ESI peptydu o masie 2524,6 u LSIMS w DTE/DTT x M + H M/z Spec /1:8[BP = 632.1, 2248] [M + 4H + ] ESI wmeh [M + 5H + ] 5+ % Intensity [M + 3H + ] M = 0,33 n = Copyright [M + 2H + ] Mass (m/z)

20 Widmo ESI peptydu o masie 3377 u [M+4H + ] Spec /1:14[BP = 846.1, 396] M 0,25 n = % Intensity M [M+5H + ] [M+3H + ] Mass (m/z) Spec /1:14=>DECNV[BP = , 571] % Intensity Copyright Mass (m/z)

21 WIDM ESI PEPTYDU MASIE Da Widmo po dekonwolucji m 2 m 1 m 1 = (M + n)/n m 2 = (M + n + 1)/(n + 1) n = (m 2 1)/(m 1 m 2 ) M = ( m 2 1)( m1 1) m 1 m 2

22 Widmo ESI(+) dimeru albuminy wołowej

23 Widmo ESI(-) syntetycznego oligonukleotydu Copyright 2003

24 Widmo ESI kompleksu w MeH roztwór świeżo przygotowany [L + H ] [2L+Co 2+ ] 2+ Spec #1[BP = 309.2, 8991] L + CoCl wmeh [L+Co 2+ +Cl - ] % Intensity [L+Co 2+ +MeH] [3L+Co 2+ ] [2L+Co 2+ +Cl - ] Mass (m/z) [2L+2Co 2+ +3Cl - ] +

25 Widmo ESI kompleksu w MeH roztwór po 1 godzinie [L + 2H + ] 2+ Spec #1[BP = 155.1, 4153] L + CoCl 2 wmeh [L + H + ] % Intensity Copyright 2003 Mass (m/z)

26 Widmo ESI kompleksów 18-C-6 z kationami litowców M + Rb + M + Cs M = C-6 + NaCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) (bez K +!) M + Na + M + K M + Cs m/z, amu

27 Widma ESI kompleksów eterów makrocyklicznych z kationami litowców M + Na M + K M + Rb m/z, amu NH M = 290 HN Ligand + NaCl + KCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) M + Cs + 2M + Na + M + Na M + K + M + Cs M + Rb + M = 602 N N CH 3 CH 3 Ligand + NaCl + KCl + RbCl + CsCl (1:1:1:1:1) w MeH H 2 (7:3) 2M + Na + 2M + K + 2M + Rb+ Copyright M + Cs m/z, amu

28 Widmo ESI w MeH związku o masie 451 Da M + Na Spec /1:13[BP = 474.1, 3323] Ph N Tos C 26 H 29 N 4 S M = 451 % Intensity M + Na [3M + Fe 2+ ] Copyright Mass (m/z)

29 Fragment widma ESI w MeH związku o masie 451 Da odpowiadający jonowi [3M + Fe 2+ ] 2+ oraz widmo obliczone dla podanego wzoru % Intensity Widmo zmierzone Spec /1:13[BP = 474.1, 3323] Ph N Tos C 26 H 29 N 4 S M = 451 % Intensity Widmo obliczone Copyright IS:C78H87N312S3Fe[BP = 704.7, 100] Mass (m/z)

30 Widmo ESI w MeH estru metylowego N-FMC-proliny 100 M + Na M + Ca N CH M + Fe M = M + Mg M + H M + Na Copyright 2003

31 Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) Atmospheric Pressure Chemical Ionization

32 Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) Copyright 2003

33 Widmo APCI(-) digoksyny w układzie MeH/CHCl 3 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H CH 3 CH 3 H H CH 3 H CH 3 H = = = = CH 3 H -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff Max. 2.6e6 cps. 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e e Copyright e m/z, amu

34 Cechy charakterystyczne metod ESI i APCI zakres mas (do 2000 dla APCI) związki polarne (ESI) i niepolarne (APCI) wprowadzane w roztworach lotnych rozpuszczalników współpraca z analizatorami magnetycznymi, kwadrupolowymi, pułapkami jonowymi i TF: możliwość badania fragmentacji wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych oraz wykonywania dokładnych pomiarów masy możliwość bezpośredniej współpracy z HPLC mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki Copyright 2003

35 Fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (APPI) Atmospheric Pressure Photoionization

36 Źródło jonów do APPI

37 Procesy jonizacji w metodzie APPI

38 Porównanie czułości metod APCI i APPI Copyright 2003

39 Analiza HPLC-MS mieszaniny wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z detekcją APPI Compound Naphthalene Acenaphthylene Acenaphthene Fluorene Phenanthrene Anthracene Fluoranthene Pyrene Benz(a)anthracene Chrysene Benzo(b)fluoranthene Benzo(k)fluoranthene Benzo(a)pyrene Benzo(g,h,I)perylene Indeno(1,2,3,c,d)pyrene Dibenz(a,h)anthracene Mass Reversed Phase (pg on column) Copyright 2003

40 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

41 Nobel 2002 Koichi Tanaka ur r.

42 Spektrometr MALDI TF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time f Flight) wiązka światła lasera V Laser wiązka jonów droga wiązki jonów = l Detektor Zależność czasu przelotu jonu od jego masy t = l v ev = mv = 2 l 2eV m 2 m = = v = 2eV 2 l l 2eV t 2eV m 2 m Próbka na blaszce stalowej Copyright 2003 Znaczenie symboli: m masa jonu (kg) e ładunek elementarny (C) V napięcie przyspieszające (V) v prędkość liniowa jonu (m/s) t czas przelotu jonu (s) l droga wiązki jonów (m)

43 Mechanizm jonizacji w technice MALDI Impuls laserowy trafia w powierzchnię próbki (a) przekazując jej energię, która powoduje stopienie i odparowanie cząsteczek obojętnych i jonów z małego obszaru próbki (b). Po kilku nanosekundach cząsteczki obojętne zostają odpompowane, a cząstki naładowane (jony) są wciągane polem elektrycznym do analizatora spektrometru masowego (c).

44 Matryce stosowane w technice MALDI Copyright 2003

45 Widmo MALDI-TF β-galaktozydazy M+H Da

46 Widmo MALDI-TF białka (M = Da)

47 Widma MALDI-TF zarejestrowane przy użyciu lasera podczerwonego i nadfioletowego Copyright 2003

48 Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF 3 CAg Copyright 2003 ESI MALDI

49 Cechy charakterystyczne metody MALDI zakres mas związki polarne, stałe lub nielotne ciecze mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki MALDI współpracuje praktycznie tylko z analizatorami TF umiarkowana rozdzielczość (w najnowszych spektrometrach wysoka) metody badania fragmentacji ciągle wymagają dopracowania możliwość pełnej automatyzacji wprowadzania próbek i rejestrowania widm Copyright 2003

50 Desorption-Ionization Mass Spectrometry on Porous Silicon (DIS)

51 Matryce krzemowe stosowana w technice DIS Copyright 2003

52 Widma zarejestrowane metodą DIS Copyright 2003 a, The DIS mass spectrum of a mixture of five peptides (2 pmol each). b, The DIS mass spectrum of a mixture of three small molecules, including caffeine (m/z 196), an antiviral drug WIN (m/z 357) and reserpine (m/z 609) (1 pmol each). c, The DIS mass spectrum of 10 pmol N-octyl β-dglucopyranoside (m/z 293) and its sodium adduct ion (m/z 315). The sodium ion (m/z 23) itself was also detected. Desorption ionization mass spectrometry on porous silicon; Jing Wei, Jillian M. Buriak & Gary Siuzdak, Nature, 399 (1999)

53 Widma zarejestrowane metodą DIS Figure 4. DIS mass spectra of des-argbradykinin using small quantities of sample and in the presence of salt. a d, DIS mass spectra with: a, 7 fmol; b, 700 attmol; c, 2 pmol in the presence of a 2M NaCl; d, 2 pmol in a saturated solution of K 3 P 4 buffer solution. All spectra shown were generated from an n- type mesoporous silicon surface modified with an ethyl phenyl termination; they are the average of 128 shots with a nitrogen laser (337 nm) at an intensity, typical of MALDI experiments, of 2 to 50 mj per pulse. Desorption ionization mass spectrometry on porous silicon; Jing Wei, Jillian M. Buriak & Gary Siuzdak, Nature, 399 (1999)

54 Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)

55 Matryca ProteinChip

56 Widmo SELDI-TF mieszaniny peptydów Copyright 2003 Fig. 2. SELDI-TF MS spectra of glucocerebrosidase after tryptic digestion. Positive-ion mass spectra of peptide products resulting from on-chip tryptic digestion of glucocerebrosidase, as analyzed by SELDI- TF MS. The mass/charge (m/z) values of all detected species are shown. Emilia Caputo, Ramy Moharram, and Brian M. Martin, Analytical Biochemistry 321 (2003)