JONY METASTABILNE I FRAGMENTACJA POD WPŁYWEM ENERGII ZDERZEŃ. Copyright 2003 Witold Danikiewicz

Transkrypt

1 JNY METASTABILNE I FRAGMENTACJA PD WPŁYWEM ENERGII ZDERZEŃ

2 Widmo EI kwasu octowego 100 Jony fragmentacyjne Intensywność względna C H 3 C M = 60 H Jon molekularny m/z

3 Terminologia procesów fragmentacji M + P + + N jon macierzysty (parent ion lub precursor ion) jon potomny (daughter ion lub product ion) fragment obojętny (neutral fragment) Energia jonów fragmentacyjnych M + P + + N E M = E P + E N (jeśli pominąć energię uwalnianą E P = E M M M P M w reakcji fragmentacji

4 Rodzaje pomiarów MS/MS Widmo jonów potomnych Widmo jonów macierzystych Q1 Product Ion Scan Q3 Q1 Precursor Ion Scan Q3 m 1 m 2 m 1 Wybór jonu macierzystego Skanowanie jonów potomnych Widmo jonów tracących fragment obojętny o stałej masie Q1 Neutral Loss Scan Q3 m 1 m 2 m 1 Skanowanie jonów macierzystych Wybór jonu potomnego Śledzenie wybranych reakcji fragmentacji Multiple Reaction Monitoring (MRM) m 1 m 2 Skanowanie Q1 i Q3 ze stałą różnicą masy m m 1 - m m 2 - m m 1 m 2 (m 3, m 4...) Wybór jonu macierzystego Wybór jonu potomnego (lub kilku jonów potomnych)

5 Rozkład energii populacji jonów molekularnych w źródle jonów EI P(E) Fragmentacja w źródle jonów M + Czas przebywania jonu w źródle: s Czas przelotu jonu przez spektrometr AMD 604: M = 100 u s M = 400 u s E I (Energia jonizacji) Jony metastabilne E

6 Metody badania fragmentacji w spektrometrze o podwójnym ogniskowaniu i geometrii BE Drugi obszar wolny od pola (II FFR) Widma jonów potomnych MIKES (Mass-analyzed Ion Kinetic Energy Spectrum) Analizator magnetyczny Analizator elektryczny Szczelina wejściowa Komory zderzeń Pierwszy obszar wolny od pola (I FFR) Szczelina wyjściowa Źródło jonów Widma jonów potomnych B/E=const. Widma jonów macierzystych B 2 /E = const. Widma jonów tracących fragment obojętny o stałej masie Powielacz elektronów

7 Widmo EI 1-metylo-4-nitrobenzosultamu N S 2 Intensity (%age) N 2 M = Low Resolution M/z

8 Widma jonów potomnych MIKE i CA-MIKE dla jonu EI 80 Intensity (Volts) Intensity (%age) Low Resolution M/z 164 MIKE dla jonu Low Resolution M/z Intensity (Volts) CA-MIKE dla jonu Low Resolution M/z

9 Intensity (Volts) Widma jonów potomnych B/E i CA-B/E dla jonu EI Intensity (%age) Low Resolution M/z B/E dla jonu Intensity (Volts) Low Resolution M/z CA-B/E dla jonu Low Resolution M/z

10 Widma jonów macierzystych B 2 /E dla jonów 147 i 104 Intensity (Volts) B 2 /E dla jonu 147 Intensity (%age) EI Low Resolution M/z Low Resolution M/z B 2 /E dla jonu 104 Intensity (Volts) Low Resolution M/z

11 Widma utraty obojętnego fragmentu o masie 64 i 28 Intensity (%age) Intensity (%age) EI Low Resolution M/z CNL dla Low Resolution M/z CNL dla 28 Intensity (Volts) Low Resolution M/z

12 SPEKTRMETR MAS TYPU API 365

13 +MS2 (137.00) CE (10): to min from Sample 1 (frag 137 CE ) of beta... Max. 7.7e5 cps e5 7.0e5 6.5e5 6.0e5 5.5e5 CE = 10V M + H + Zależność stopnia fragmentacji od energii zderzeń 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e m/z, amu N N H H [M + H + ] = 137 +MS2 (137.00) CE (10): to min from Sample 1 (frag 137 CE ) of beta... Max. 4.9e5 cps. +MS2 (137.00) CE (10): to min from Sample 1 (frag 137 CE ) of beta... Max. 3.9e5 cps. 4.9e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 CE = 15V m/z, amu M + H e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 CE = 25V m/z, amu M + H

14 Zależność stopnia fragmentacji od energii zderzeń -MS2 (227.20): to min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff,... Max. 8.2e5 cps. -MS2 (227.20): to min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff,... Max. 2.4e5 cps. 8.0e5 7.5e5 7.0e5 6.5e5 6.0e5 5.5e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 CE = 10V N S 2 [M H] e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 CE = 20V [M H] e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 -MS2 (227.20): to min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff, e5 4.2e5 4.0e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 N 2 M = m/z, amu CE = 15V Max. 4.3e5 cps m/z, amu [M H] e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e m/z, amu MS2 (227.20): to min from Sample 2 (frag 227 CE ) of 1K1686.wiff, e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 CE = 25V Max. 2.6e5 cps m/z, amu [M H] 226.9

15 Praca w trybie MS Spektrometr typu Q-TF Praca w trybie MS/MS

16 Spektrometr Q-TF z analizatorem TF typu W

17 Widma fragmentacji peptydu (Q-TF)

18 Widma fragmentacji peptydu (Q-TF)

19 Spektrometr ESI - Ion Trap firmy Agilent

20 Widma kolejnych fragmentacji glikozydu (pułapka jonowa LCQ; jony ujemne)

21 Fragmentacja w źródle jonów electrospray (cone voltage fragmentation) Gaz rozpylający (N 2 ) Dysza Płytka osłonowa Ciśnienie atmosferyczne bszar fragmentacji U Zbierak Declustering potential lub nozzle potential lub skimmer potential Q ~ 2 Torr 8 x 10-3 Torr Roztwór próbki Przechodzenie jonów do fazy gazowej Gaz osłonowy (N 2 ) Pompa wstępna Pompa turbomolekularna

22 Cone voltage fragmentation [M+2H + ] 2+ MARINER Nozzle potential 100V [M+H + ] B 2 A [M+2H + ] 2+ Y MARINER Nozzle potential 280V Y 3 Y 4 B 3 B 4 Y 6 Y B Y [M+H + ] [M+Na + ] +

23 B 2 A Widma MS/MS peptydu (M = ) [M+2H + ] 2+ Y MARINER (ESI-TF) Nozzle potential 280V Y 3 Y 4 B 3 B 4 Y 6 Y B Y [M+H + ] [M+Na + ] B 2 [M+2H + ] API 365 (ESI-QQQ) Product Ion Scan dla jonu m/z 621 [M+2H + ] 2+ Y Y Y B A 2 Y 7 Y Y 4 B B B B 6 8 A

24 Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas GC/MS

25 Problemy związane z techniką GC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf gazowy Spektrometr mas Próbka w formie pary rozcieńczonej dużą ilością gazu EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI: wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI Problemy do rozwiązania: pozbycie się dużej ilości gazu nośnego szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Lotność (ew. po derywatyzacji) dporność na wysoką temperaturę

26 Budowa zestawu chromatograf gazowy spektrometr mas (GC/MS) strzyka wka z próbką komora termostatowana kolumna kapilarna źródło jonów linie transmisji danych hel Chromatograf gazowy Spektrometr mas Komputer

27 Spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym Źródło jonów EI Analizator kwadrupolowy Detektor do pompy do pompy sygnał do wzmacniacza

28 Analiza GC/MS mieszaniny wzorcowej Abundance TIC: EVALDEM.D Time--> Abundance Average of to min.: EVALDEM.D (-) m/z-->

29 Identyfikacja związku z wykorzystaniem biblioteki widm masowych Abundance 9000 Average of to min.: EVALDEM.D (-) 188 Widmo zmierzone m/z--> Abundance Widmo biblioteczne m/z--> #72704: 3-Chlorobiphenyl $$ 1,1'-Biphenyl, 3-chloro- (CAS) Cl

30 Chromatogram gazowy mieszaniny nitrotoluenów N2 HN H 2 S 4 N 2 N

31 Chromatogram GC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a α-pinen (96 %) 2.33 β-pinen (97 %) 3.17 sabinen (97 %) mircen 3.33 (96 %) limonen (99 %) γ-terpinen (97 %) 5.82 linalool (97 %) octan linalylu (91 %) α-bergamoten (98 %) β-kariofilen (99 %) p-cymen (97 %) α-terpinolen (98 %) β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) α-terpineol (91 %) geranial (96 %) octan geranylu (91 %) min. Liczby w nawiasach określają w procentach współczynnik zgodności widma zmierzonego i bibliotecznego

32 Chromatogram całkowitego prądu jonowego i chromatogram dla wybranej masy jonu

33 Chromatogramy dla wybranych mas w warunkach pomiaru wysokiej rozdzielczości

34 Analiza GC/MS 1-metylo-4-nitrobenzosultamu N S 2 N - S 2 N A N 2 M = 228 S 2 N 2 M = 228 N 2 M = 164 N CH 2 A N 2 M = 164 M + N CH 2 N 2 M = 164

35 H N S 2 Analiza GC/MS 4-nitrobenzosultamu N 2 N 2 M = 150 8a M = 214 t - S 2 H N Abundance S 2? N M = a Time--> N H t 9a N 2 NH 2 N 9a M = 300 Generation and Reactions of Aza-orthoxylylenes in the Injector of GC/MS System, W. Danikiewicz, K. Wojciechowski, M. lejnik, Tetrahedron Lett., 36, 1099 (1995). N 2 Abundance m/z--> Scan 1108 ( min) a M

36 Zastosowania techniki GC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe) Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne (np. profil kwasowy) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska

37 Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas LC/MS lub HPLC/MS

38 Problemy związane z techniką LC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf cieczowy Spektrometr mas Próbka w formie rozcieńczonego roztworu, często z zawartością bufora Problemy do rozwiązania: EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI: wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI konieczność odparowania dużej ilości rozpuszczalnika problem substancji buforujących szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Niska lotność Rozpuszczalność w wybranym rozpuszczalniku (eluencie) Trwałość w warunkach HPLC

39 Podstawowa zależność: dwukrotnie mniejsza średnica = czterokrotnie mniejszy przepływ Dopasowanie rodzaju źródła jonów do warunków chromatografii cieczowej Średnica wewnętrzna kolumny chromatograficznej 4 4,6 mm 1-2 mm µm µm Przepływ eluenta 0,5 1 ml/min µl/min 0,5 50 µl/min nl/min Rodzaj źródła jonów TurboIonSpray, APCI Electrospray standardowy, APCI Microspray Nanospray

40 Warunki, które musza byc spełnione podczas pomiaru HPLC/MS Próbka musi być wystarczająco polarna, aby ulec jonizacji w technice electrospray (ESI), ewentualnie APCI. Analiza z zastosowaniem faz odwróconych. Akceptowalne eluenty to: metanol, woda, acetonitryl, izopropanol i ich mieszaniny. Dopuszczalny jest pomiar w gradiencie składu eluenta. Kolumna z wypełnieniem najlepiej C-18, C-8 lub analogicznym, służącym do analiz w fazach odwróconych. Eluent nie może zawierać nielotnych buforów, np. fosforanowych. Dopuszczalne są octan i mrówczan amonu, kwasy octowy i mrówkowy itp. lotne związki; Czas analizy nie powinien przekraczać 60 min.

41 ANALIZA ZANIECZYSZCZEŃ DIGKSYNY H H H H H H

42 ANALIZA DIGKSYNY Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H Widmo APCI(-) digoksyny w układzie MeH-CHCl 3. Jon pseudomolekularny [M + Cl] - ulega fragmentacji tracąc kolejne reszty cukrowe i zachowując jon Cl -. H -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff Max. 2.6e6 cps. 2.6e H H H H = = = e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e = e6 1.0e e e5 4.0e e m/z, amu

43 ANALIZA DIGKSYNY Chromatogram całkowitego prądu jonowego Intensity, cps TIC of -Q1: from CH3ClDigoxin.wiff 3.1e8 3.0e8 2.8e8 2.6e8 2.4e8 2.2e8 2.0e8 1.8e8 1.6e8 1.4e8 1.2e8 1.0e8 8.0e7 6.0e7 4.0e7 2.0e Max. 3.1e8 cps Chromatogram prądu jonowego wybranych jonów (jony [M+Cl] - digoksyny i acetylodigoksyny) Intensity, cps e7 8.0e7 7.5e7 7.0e7 6.5e7 6.0e7 5.5e7 5.0e7 4.5e7 4.0e7 3.5e7 3.0e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 5.0e Time, min XIC of -Q1: to amu from CH3ClDigoxin.wiff, Added <XIC of -Q1: to amu fro... Max. 8.4e7 cps Time, min

44 Widma masowe APCI(-) digoksyny (M = 780,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Digoksyn a Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H H H H = = = = H H 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e m/z, amu -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc + Cl] - M = Max. 1.5e6 cps. 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e m/z, amu

45 Widma masowe APCI(-) digoksyny (M = 780,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Digoksyn a Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H H Ac H H = = H H = = e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e m/z, amu -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc + Cl] - M = Max. 1.5e6 cps. 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e m/z, amu

46 Widma masowe APCI(-) digoksyny (M = 780,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Digoksyn a Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = Exact Mass = Molecular Formula = C 41 H Ac H H H = = H H = = e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e m/z, amu -Q1: to min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 Pochodna acetylowa digoksyny [MAc + Cl] - M = Max. 1.5e6 cps. 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e m/z, amu

47 WYKRYWANIE PACLITAXELU (TAKSLU) W MATERIALE BILGICZNYM NHBz Ac H H H H Bz Ac

48 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym +Q1: to min from Sample 1 (widmoq+) of taxol.wiff Intensity, cps 4.3e6 4.2e6 4.0e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.0e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 Widmo ESI(+) próbki taksolu Max. 4.3e6 cps. 6.0e5 4.0e e m/z, amu [M + Na + ] NHBz H Ac H H Bz Ac Paclitaxel (taksol) M = Product (876.5): to min from Sample 2 (fragmentacja CE 35) of taxol.wiff Intensity, cps 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e H Widmo CID jonu [M + Na + ] + taksolu Max. 2.0e5 cps m/z, amu 694.2

49 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym TIC of +Q1: from Sample 1 (powtorka001) of 103HPLC.wiff Max. 9.4e7 cps. 9.4e7 9.0e e7 Chromatogram całkowitego prądu jonowego badanej mieszaniny Intensity, cps 8.0e7 7.5e7 7.0e7 6.5e7 6.0e7 5.5e7 5.0e7 4.5e7 4.0e7 3.5e7 3.0e e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 5.0e Time, min Base Peak Chrom. of +Q1: from Sample 1 (powtorka001) of 103HPLC.wiff Max. 4.2e6 cps. Chromatogram maksymalnych pików badanej mieszaniny Intensity, cps 4.2e6 4.0e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.0e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e Time, min

50 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym XIC of +Q1: to amu from Sample 1 (powtorka001) of 103HPLC.wiff Max. 2.2e5 cps. Chromatogram jonu m/z 876,4 badanej mieszaniny Intensity, cps 2.1e5 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e Time, min Q1: to min from Sample 1 (powtorka001) of 103HPLC.wiff, subtracted ( to 1... Max. 5.9e4 cps. Widmo masowe (po odjęciu tła) dla piku z powyższego chromatogramu Intensity, cps 5.9e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e m/z, amu

51 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym +Q1: to min from Sample 1 (widmoq+) of taxol.wiff Intensity, cps 4.3e6 4.2e6 4.0e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.0e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 Widmo ESI(+) próbki taksolu Max. 4.3e6 cps. 6.0e5 4.0e e m/z, amu [M + Na + ] NHBz H Ac H H Bz Ac Paclitaxel (taksol) M = Product (876.5): to min from Sample 2 (fragmentacja CE 35) of taxol.wiff Intensity, cps 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e H Widmo CID jonu [M + Na + ] + taksolu Max. 2.0e5 cps m/z, amu 694.2

52 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/591.4 amu from Sample 2 (powtorka002) of 103HPLC.wiff Max cps. XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/531.2 amu from Sample 2 (powtorka002) of 103HPLC.wiff Max cps Chromatogram MRM Chromatogram MRM Intensity, cps Intensity, cps Time, min Time, min XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/308.2 amu from Sample 2 (powtorka002) of 103HPLC.wiff Intensity, cps Max cps Time, min Chromatogram MRM XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/591.4 amu from Sample 2 (powtorka002) of 103HPLC.wiff Intensity, cps Nałożone chromatogramy MRM Max cps Time, min

53 Zastosowania techniki LC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza białek i produktów ich hydrolizy enzymatycznej Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne (np. oznaczanie stężenia leków i ich metabolitów we krwi) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska