POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI I KORZENIA CZARNEJ MARCHWI METODĄ EKSTRAKCJI

ŻYWNOŚĆ. Nuk. Technologi. Jkość, 2015, 5 (102), 165 181 DOI: 10.15193/zntj/2015/102/080 RADOSŁAW DEMBCZYŃSKI, WOJCIECH BIAŁAS, ANNA OLEJNIK, PRZEMYSŁAW KOWALCZEWSKI, AGNIESZKA DROŻDŻYŃSKA, TOMASZ JANKOWSKI POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI I KORZENIA CZARNEJ MARCHWI METODĄ EKSTRAKCJI S t r e s z c z e n i e Celem dń yło oprcownie metody ekstrkcji rwników ntocyjnowych z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki orz korzeni czrnej mrchwi. Do ekstrkcji ntocyjnów zstosowno roztwory: wodę zkwszoną kwsem octowym (0,75 % m/m), wodę zkwszoną kwsem solnym (0,75 % w/w), metnol/wodę/kws octowy (40 : 60 : 0,5 v/v/v), ceton/wodę/kws octowy (70 : 29,5 : 0,5 v/v/v). W otrzymnych ekstrktch oznczono zwrtość związków fenolowych orz ntocyjnów i n ich podstwie wykonno nlizę kinetyki ekstrkcji. Zdno również włściwości przeciwutlenijące uzysknych ekstrktów metodmi ABTS + i FRAP. W procesie ekstrkcji ntocyjnów z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki optymlnymi ekstrhentmi okzły się: wodny roztwór metnolu z dodtkiem kwsu octowego orz wodny roztwór kwsu octowego, ntomist w trkcie ekstrkcji ntocyjnów z korzeni czrnej mrchwi njlepsze rezultty uzyskno przy użyciu wodnego roztworu metnolu z dodtkiem kwsu octowego orz wodnego roztworu cetonu z dodtkiem kwsu octowego. Słow kluczowe: ntocyjny, ekstrkcj, włściwości przeciwutlenijące, ABTS +, FRAP Wprowdzenie Antocyjny są wżną grupą rwników roślinnych. Ich struktur chemiczn jest rdzo złożon. Zudowne są z części niecukrowej (glikonu) połączonej wiązniem glikozydowym z resztą cukrową. Aglikon zwier szkielet ntocyjnidyny zwny ktionem 2-fenyloenzopiryliowym lu flwyliowym. Wyróżni się pond 20 typów Dr inż. R. Demczyński, dr inż. W. Biłs, dr h. A. Olejnik, mgr inż. P. Kowlczewski, mgr inż. A. Drożdżyńsk, prof. dr h. T. Jnkowski, Ktedr Biotechnologii i Mikroiologii Żywności, Wydz. Nuk o Żywności i Żywieniu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznniu, ul. Wojsk Polskiego 31, 60-624 Poznń. Kontkt: rdemcz@up.poznn.pl

166 Rdosłw Demczyński i wsp. udowy ntocyjnidyn, przy czym njczęściej spotykne są: cyjnidyn, delfinidyn, mlwidyn, pelrgonidyn, petunidyn i peonidyn. Część cukrow to njczęściej glukoz, rzdziej glktoz, rmnoz lu rinoz. Różnice w udowie części cukrowej, jk rodzj i licz cząsteczek cukru i rodzj cząsteczek cetylujących, są tkże przyczyną dużego zróżnicowni struktury ntocyjnów. Oecnie znnych jest kilkset rwników ntocyjnowych [24]. Brwniki ntocyjnowe występują w kwitch, owocch, tkże w liścich, łodygch i korzenich. Konkretny gtunek rośliny zwier zwykle chrkterystyczny zestw od kilku do kilkunstu ntocyjnów o różnej udowie i włściwościch [17]. Podstwową metodą pozyskiwni rwników ntocyjnowych jest ekstrkcj selektywnymi rozpuszczlnikmi [24]. Możliw jest tkże syntez chemiczn ntocyjnów występujących in vivo, jednk jest on rdzo kosztown i mło wydjn [5, 16]. Ekstrkcj jest rdzo istotnym etpem procesu seprcji, identyfikcji orz produkcji n szeroką sklę związków polifenolowych, w tym tkże rwników ntocyjnowych. Związki te njczęściej pozyskuje się metodą ekstrkcji w ukłdzie ciecz ciło stłe orz ekstrkcji w wrunkch ndkrytycznych [3]. Wydjność procesu zleży od szeregu czynników związnych zrówno z włściwościmi seprownych związków, jk i stosownych rozpuszczlników. Szczególną uwgę zwrc się n polrność orz ph ekstrhent. Antocyjny nie są stilne w roztworch oojętnych i zsdowych, stąd podczs ekstrkcji stosuje się wyłącznie zkwszone wodne roztwory wyrnych rozpuszczlników orgnicznych. Njpowszechniej używnymi rozpuszczlnikmi są roztwory wodno-lkoholowe zwierjące etnol lu metnol, le możn również stosowć roztwory zwierjące n-utnol, ceton, glikol propylenowy [9, 10]. Ekstrhent zkwsz się z pomocą kwsu solnego lu kwsu orgnicznego (np. kwsu octowego), co według Strck i Wry [26] jest szczególnie przydtne w seprcji złożonych policylownych ntocyjnów. Ze względu n złożoną udowę tych związków orz n rodzj mteriłu, z którego są one pozyskiwne, trudno wskzć jedną, uniwerslną metodę pozwljącą n ich wydjną seprcję. Celem dń yło oprcownie metody ekstrkcji rwników ntocyjnowych z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki orz korzeni czrnej mrchwi. Mterił i metody dń Przygotownie mteriłu roślinnego Mteriłem do dń yły owoce: ronii czrnowoocowej (Aroni melnocrp Ellit), czrnego zu (Smucus nigr L.) i czrnej porzeczki (Ries nigrum L.) orz korzenie spichrzowe czrnej mrchwi odminy Deep Purple (Ducus crot susp. stivus vr. troruens Alef). Owoce czrnego zu pochodziły z oszru Ntur 2000 Dolin Smicy Kierskiej. Korzenie czrnej mrchwi pozyskno z firmy Bejo Zden

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 167 Polnd (Ożrów Mzowiecki, Polsk), ntomist owoce czrnej porzeczki i ronii pochodziły z gospodrstw ekologicznego w miejscowości Borowo (gmin Czempiń, Wielkopolsk). Mterił roślinny zerno w sezonie wegetcyjnym w 2012 roku, nstępnie zmrżno w temperturze -85 ºC i suszono sulimcyjnie w liofiliztorze Bet 1-16 (Mrtin Christ, Niemcy) przez 48 h (suszenie włściwe 40 h i dosusznie 8 h). Tempertur półek, n których umieszczno zmrożony surowiec w trkcie suszeni włściwego wynosił 15 ºC, ntomist podczs dosuszni 25 ºC. Suszenie włściwe przeiegło pod ciśnieniem równym 10 P, ntomist dosusznie odywło się ez kontroli ciśnieni. Susz mielono w młynku MF 10 Bsic (IKA -Werke GmH & Co. KG, Niemcy) do proszku o mksymlnej średnicy ziren równej 2 mm, nstępnie przechowywno we fiolkch w tmosferze gzowego zotu w temp. -85 ºC. Zwrtość suchej msy w liofiliztch oznczno metodą wgową zgodnie z normą PN-EN 12145 [19]. Ekstrkcj ntocyjnów Do ekstrkcji ntocyjnów zstosowno nstępujące roztwory: wodę zkwszoną kwsem octowym (0,75 % w/w), wodę zkwszoną kwsem solnym (0,75 % w/w), metnol/wodę/kws octowy (40 : 60 : 0,5 v/v/v), ceton/wod/kws octowy (70 : 29,5 : 0,5 v/v/v). Ekstrkcję prowdzono wielostopniowo w temp. 20 ºC. W proówce wirówkowej umieszczno 1 g zmielonego liofiliztu ronii, czrnej porzeczki lu czrnego zu orz 10 ml roztworu ekstrkcyjnego. W trkcie trwjącego 15 min pierwszego stopni ekstrkcji zwrtość proówki poddwno dziłniu ultrdźwięków przez 5 min w łźni ultrdźwiękowej (Sonic 6, Polsonic Sp. z o.o., Polsk) orz pięciokrotnie wytrząsno przy użyciu wytrząsrki worteks przez 30 s. Nstępnie zwrtość proówki wirowno (3500 g, 10 min). W czsie ekstrkcji ntocyjnów z czrnej mrchwi, 1 g suszu zwieszno w 20 ml roztworu ekstrkcyjnego. Procedur pierwszego stopni ekstrkcji ył identyczn z zstosowną do dnych owoców. Seprcję osdu od ekstrktu wykonywno w próżniowym filtrze sitkowym włsnej konstrukcji. Czs trwni ekstrkcji pierwszego stopni wynosił 17 min. Dodtkowo po ekstrkcji roztworem zwierjącym ceton/wodę/kws octowy wykonywno płuknie ekstrktu chloroformem w celu usunięci związków lipofilnych. Do ekstrktu dodwno chloroform (1 : 2 v/v), uzyskną mieszninę intensywnie mieszno przez 2 min. Po seprcji fz (4 C, 12 h) zierno górną fzę wodną. Uzyskne ekstrkty przenoszono do nowej proówki, ntomist do osdu otrzymnego po pierwszym stopniu ekstrkcji dodwno kolejną, świeżą porcję roztworu ekstrkcyjnego. Ekstrkcj w kolejnych stopnich, których yło 8, przeiegł w tki sm sposó jk w stopniu pierwszym. Ekstrkty przechowywno w temp. -86 ºC.

168 Rdosłw Demczyński i wsp. Anliz fizykochemiczn ekstrktów Ozncznie zwrtości związków fenolowych ogółem wykonywno z użyciem odczynnik Folin-Cioclteu, według Fng i wsp. [7]. Zwrtość związków fenolowych w ekstrkcie wyrżno jko równowżnik kwsu chlorogenowego w przeliczeniu n grm suchej msy ekstrhownego mteriłu roślinnego (mg CAE/g s.m.). Cłkowitą zwrtość ntocyjnów w ekstrktch z owoców oznczno spektrofotometryczną metodą różnicową według Fuleki i Frncis [8], ntomist zwrtość ntocyjnów w ekstrktch z czrnej mrchwi oznczno z pomocą procedury oprcownej przez Kidoni i Czpskiego [15]. Włściwości przeciwutlenijące mierzono jko efektywność wygszni stilnego ktionorodnik ABTS + według Re i wsp. [23]. Stężenie wygszonego ABTS przeliczno n równowżniki Troloxu. Włściwości redukujące ekstrktów określno metodą FRAP, opisną przez Benzie i Strin [2]. Mirą zdolności redukujących ył równowżnik Troloxu. Modelownie kinetyki ekstrkcji Do nlizy kinetyki ekstrkcji związków fenolowych i rwników ntocyjnowych zstosowno równnie [3]: t E = E0 + K1 + K2 t gdzie: E zwrtość związków fenolowych lu ntocyjnów [mg/g s.m.] w czsie t [min], E 0 początkow zwrtość związków fenolowych lu ntocyjnów [mg/g s.m.] wyznczon w t = t 0, K 1 stł szykości [min. g s.m./mg], K 2 stł określjąc pojemność ukłdu [g s.m./mg]. Prmetry równni oliczno w module Solver progrmu Microsoft Excel. Wyznczno je, oliczjąc minimum funkcji strty stnowiącej kwdrt różnicy pomiędzy wrtością oserwowną i przewidywną. Wrunkiem ogrniczjącym yły nieujemne wrtości estymownych prmetrów. N podstwie wielkości stłej K 1 oliczno szykość ekstrkcji B 0 [mg/min. g s.m.] w fzie początkowej (t = t 0 ): 1 B 0 = K1 Wyznczno tkże mksymlną teoretyczną zwrtość związków fenolowych lu ntocyjnów E m [mg/g s.m.]:

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 169 E m = E + 0 1 K 2 Anliz sttystyczn W celu oceny związku pomiędzy prmetrmi równń modelowych opisujących ekstrkcję polifenoli i ntocyjnów wyznczono współczynniki korelcji liniowej Person. Wyniki przedstwijące zwrtość ntocyjnów i polifenoli w ekstrktch nlizowno z pomocą jednoczynnikowej nlizy wrincji orz testu wielokrotnych porównń post-hoc Tukey. Anlizy sttystyczne wykonno w progrmie Sttistic 12.0 PL (p = 0,05). Wyniki i dyskusj Kinetyki ekstrkcji W niniejszej prcy do mtemtycznego opisu kinetyki procesu zstosowno model Peleg [3]. N jego podstwie wyznczono szykość ekstrkcji B 0 w fzie początkowej procesu orz mksymlną zwrtość związków fenolowych lu ntocyjnów w ekstrkcie E m, odpowidjącą stężeniu równowgowemu. Przykłdowe dne dotyczące kinetyki ekstrkcji wspomninych wyżej związków przedstwiono n rys. 1. Zwrtość suchej msy w liofiliztch ronii, czrnego zu, czrnej porzeczki i czrnej mrchwi, które nstępnie poddno ekstrkcji, średnio wynosił odpowiednio [%]: 88, 90, 89 i 88. Krzyw ekstrkcji mił przeieg nieliniowy. Njwiększą szykość ekstrkcji oserwowno w pierwszych 25 min, co wynikło z dużej różnicy stężeń. W kolejnych 25 min szykość ekstrkcji zncznie mlł n skutek zmniejszeni się różnicy stężeni ekstrhownych sustncji pomiędzy ekstrhentem mteriłem poddnym ekstrkcji. Po 75 minutch ekstrkcji ukłd osiągł stn zliżony do równowgowego, co ozncz, że podczs kolejnych wymin rozpuszczlnik stężenie dnych sustncji w ekstrkcie zmieniło się w niewielkim zkresie. Prmetry równń modelowych orz współczynniki dopsowni (R 2 ) modelu opisującego kinetykę ekstrkcji do dnych doświdczlnych przedstwiono w t. 1. i 2. Oliczone współczynniki dowodzą, że w przypdku wszystkich dnych surowców njwiększą szykością ekstrkcji rwników ntocyjnowych w początkowej fzie procesu cechowł się ukłd, w którym ekstrhentem ył wodny roztwór metnolu z dodtkiem kwsu octowego. Njwiększą szykością odznczł się ekstrkcj owoców ronii (B 0 = 3,717 mg/min g s.m). Mniejszą szykość ekstrkcji ntocyjnów uzyskno przy użyciu wodnych roztworów cetonu i kwsu solnego. Wielkości otrzymne w oręie tych dwóch

170 Rdosłw Demczyński i wsp. Ojśnieni: / Explntory notes: Dne doświdczlne: - mg cyjnidyno-3-glukozydu/g s.m./ mg cynidin-3-glusoside/g DM; mg CAE/g s.m./ mgcae/g DM Linie / lines model ekstrkcji /extrction model. Rys. 1. Kinetyk ekstrkcji ntocyjnów orz polifenoli ogółem z owoców czrnego zu z pomocą metnolu/wody/kwsu octowego (40 : 60 : 0,5 v/v/v) Fig. 1. Extrction kinetics of nthocynins nd totl phenolics from fruits of eldererry using methnol/wter/cetic cid (40 :60 : 0.5 v/v/v) rozpuszczlników yły porównywlne dl większości dnych surowców. Z njmniejszą szykością przeiegł ekstrkcj wodnym roztworem kwsu octowego. Szczególnie wyrźne różnice zoserwowno w przypdku ronii (B 0 = 0,52 mg/min g s.m.) szykość ekstrkcji z pomocą wodnego roztworu kwsu octowego ył pond siedmiokrotnie mniejsz od szykości osiągniętej przy zstosowniu wodnego roztworu metnolu z dodtkiem kwsu octowego. Mksymlne teoretyczne zwrtości ntocyjnów w ekstrkcie E m, odpowidjące stężeniu równowgowemu (czs ekstrkcji, t ) uzyskne podczs ekstrkcji wodnym roztworem kwsu octowego yły w większości przypdków porównywlne do tych, jkie uzyskno podczs ekstrkcji wodnym roztworem metnolu z dodtkiem kwsu octowego. Elimincj metnolu, który chrkteryzuje się rdzo wysoką toksycznością, jest korzystn ze względów ezpieczeństw produktu, jego ewentulne pozostłości zwykle usuw się z pomocą destylcji, co dodtkowo zwiększ koszty procesu. Przedstwione dne są zgodne z dnymi literturowymi [1, 14, 27]. Różnice w kinetyce ekstrkcji możn wyjśnić różną polrnością stosownych rozpuszczlników. Jk podje Snyder [25], njwyższym wskźnikiem

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 171 polrności chrkteryzuje się wod, nstępnie metnol, ceton i kws octowy. Antocyjny, ze względu n oecność w cząsteczce grup hydroksylowych, kroksylowych orz metoksylowych, związnych z pierścieniem romtycznym, zliczne są do grupy związków polrnych, stąd zncznie lepiej rozpuszczją się w rozpuszczlnikch polrnych niżeli w niepolrnych [11]. Zncznie większe różnice pomiędzy dnymi surowcmi stwierdzono w odniesieniu do kinetyki ekstrkcji związków fenolowych. Njwiększą szykością ekstrkcji owoców ronii i czrnej porzeczki chrkteryzowły się ukłdy, w których zstosowno ceton wrtość liczow współczynnik B 0 wynosił odpowiednio: 53,17 orz 12,47 mg/min. g s.m. Szykość ekstrkcji korzeni czrnej mrchwi z zstosowniem kwsu octowego (B 0 = 4,06 mg/min. g s.m.) ył około dwukrotnie wyższ niżeli z zstosowniem kwśnego roztworu metnolu (B 0 = 2,31 mg/min. g s.m.) czy cetonu (B 0 = 2,16 mg/min. g s.m). Zdecydownie inczej przeiegł kinetyk ekstrkcji związków fenolowych z owoców czrnego zu. Njskuteczniejszym ekstrhentem zrówno pod względem szykości ekstrkcji (B 0 ), jk i mksymlnej zwrtości związków fenolowych w ekstrkcie (E m ) ył wodny roztwór kwsu solnego. Pondto, podonie jk w prcy Piljc-Zegrc i wsp. [18], nie yło zsdniczo sttystycznie istotnej (p > 0,05) korelcji pomiędzy współczynnikmi określjącymi kinetykę ekstrkcji związków polifenolowych i ntocyjnów. Występownie sttystycznie istotnej korelcji stwierdzono jedynie w przypdku współczynnik K 1 wyznczonego dl ekstrkcji ntocyjnów i polifenoli z owoców ronii (r = 0,95, p = 0,042) i czrnej porzeczki (r = 0,96, p = 0,034). Wrto zuwżyć, że kżdy z dnych surowców zliczny jest do innej rodziny: roni do różowtych, czrny ez do piżmczkowtych, czrn porzeczk do grestowtych, czrn mrchew do selerowtych. Zróżnicowne pochodzenie otniczne orz wrunki wzrostu mogą yć przyczyną zncznych różnic w oręie skłdu chemicznego poszczególnych surowców, co w istotny sposó ędzie wpływło n przeieg ekstrkcji orz wyniki nliz chemicznych. Według Escrp i Gonzles [6], odczynnik Folin-Cioclteu chrkteryzuje się niską selektywnością, któr wynik z jego rektywności tkże z innymi sustncjmi redukującymi znjdującym się w owocch (cukry, krotenoidy, minokwsy, witmin C). Poszczególne ekstrkty, w zleżności od zstosownego surowc orz rozpuszczlnik, mogą różnić się pod względem zwrtości sustncji regujących z odczynnikiem Folin- Cioclteu, co przekłd się n wspomniny wyżej rk wyrźnej korelcji pomiędzy kinetyką ekstrkcji związków polifenolowych i ntocyjnów.

Tel 1. Współczynniki równni modelowego opisującego kinetykę ekstrkcji ntocyjnów i polifenoli z owoców ronii i czrnego zu Tle 1. Coefficients of model eqution to descrie extrction kinetics of nthocynins nd totl phenolics from fruits of chokeerry nd eldererry Surowiec Mteril Aroni Chokeerry Czrny ez Eldererry Kws octowy Acetic cid Ekstrhent Extrctnt Kws solny Hydrochloric cid Metnol/wod/kws octowy Methnol/wter/cetic cid Aceton/wod/kws octowy Acetone/wter/cetic cid Kws octowy Acetic cid Kws solny Hydrochloric cid Metnol/wod/kws octowy Methnol/wter/cetic cid Aceton/wod/kws octowy Acetone/wter/cetic cid Prmetry ekstrkcji ntocyjnów Extrction prmeters of nthocynins Prmetry ekstrkcji polifenoli Extrction prmeters of totl phenolics K 1 K 2 B 0 E m R 2 K 1 K 2 B 0 E m R 2 1,914 0,049 0,522 20,553 0,98 0,233 0,008 4,296 123,079 0,99 0,462 0,062 2,167 16,057 0,99 0,069 0,008 14,568 125,102 0,98 0,269 0,042 3,717 23,999 0,99 0,058 0,007 17,133 152,234 0,98 0,466 0,09 2,148 11,073 0,98 0,019 0,008 53,173 130,729 0,97 0,727 0,037 1,375 26,674 0,98 0,147 0,008 6,814 122,745 0,99 0,302 0,056 3,313 17,983 0,97 0,062 0,007 16,134 142,812 0,99 0,283 0,042 3,532 23,942 0,98 0,103 0,009 9,703 108,791 0,98 0,342 0,082 2,921 12,23 0,99 0,1 0,009 10,003 107,291 0,98 Ojśnieni: / Explntory notes: we wszystkich równnich E 0 = 0, dltego nie zostło ujęte w t. 1./ in ll the equtions, E 0 = 0, thus, it ws not included in T. 1; K 1 stł szykości [min g s.m./mg] / rte constnt [min g DM/mg]; K 2 stł określjąc pojemność ukłdu [g s.m./mg] / cpcity constnt [g DM/mg]; B 0 szykość ekstrkcji [mg/min g s.m.] w fzie początkowej (t = t 0 ) / extrction rte [mg/min g DM] during initil phse (t = t 0 ); E m mksymln, teoretyczn zwrtość związków fenolowych lu ntocyjnów [mg/g s.m.] / theoreticl mximum of extrction yield [mg/g DM]; R 2 współczynnik determincji / coefficient of determintion.

Tel 2. Współczynniki równni modelowego opisującego kinetykę ekstrkcji ntocyjnów i polifenoli z owoców czrnej porzeczki i korzeni czrnej mrchwi Tle 2. Coefficients of model eqution to descrie extrction kinetics of nthocynins nd totl phenolics from fruits of lckcurrnt nd roots of lck crrot Surowiec Mteril Czrn porzeczk Blckcurrnt Kws octowy Acetic cid Ekstrhent Extrctnt Kws solny Hydrochloric cid Metnol/wod/kws octowy Methnol/wter/cetic cid Aceton/wod/kws octowy Acetone/wter/cetic cid Kws octowy Acetic cid Prmetry ekstrkcji ntocyjnów Extrction prmeters of nthocynins Prmetry ekstrkcji polifenoli Extrction prmeters of totl phenolics K 1 K 2 B 0 E m R 2 K 1 K 2 B 0 E m R 2 2,443 0,08 0,409 12,55 0,98 0,256 0,011 3,903 91,046 0,97 0,706 0,109 1,416 9,17 0,98 0,088 0,01 11,342 98,794 0,98 0,511 0,077 1,958 12,957 0,97 0,109 0,011 9,177 93,998 0,98 0,747 0,159 1,338 6,282 0,96 0,08 0,011 12,473 87,301 0,96 3,419 0,755 0,293 1,324 0,98 0,246 0,031 4,064 32,368 0,98 Kws solny Czrn 3,985 0,532 0,251 1,88 0,97 0,669 0,062 1,496 16,192 9,97 Hydrochloric cid mrchew Metnol/wod/kws octowy Blck crrot 1,876 0,371 0,533 2,694 0,99 0,433 0,059 2,311 17,005 0,98 Methnol/wter/cetic cid Aceton/wod/kws octowy 2,523 0,612 0,396 1,634 0,99 0,461 0,073 2,169 13,674 0,99 Acetone/wter/cetic cid Ojśnieni jk pod t.1. / Explntory notes s in T. 1.

174 Rdosłw Demczyński i wsp. Włściwości fizykochemiczne ekstrktów Zwrtości ntocyjnów i polifenoli w ekstrktch po zkończeniu procesu ekstrkcji przedstwiono n rys 2. i 3. Uzyskne wielkości yły zsdniczo niższe od współczynników E m (E m ozncz mksymlną, teoretyczną zwrtość skłdnik, który może zostć wyekstrhownny z dnego surowc). W prktyce uzysknie ekstrktów o zwrtości skłdnik odpowidjącego E m wymgłoy zncznego wydłużeni czsu procesu, poniewż ekstrkcj w stopniu większym niż trzeci w niewielkim stopniu wpływł n stężenie ekstrhownych sustncji. Pod względem ekonomicznym uzsdnione jest ztem wcześniejsze zkończenie procesu ekstrkcji, znim zostnie osiągnięt wielkość E m. Po ekstrkcji wodnym roztworem kwsu octowego, w zleżności od rodzju mteriłu poddnego ekstrkcji, stnowiły one w odniesieniu do polifenoli i ntocyjnów odpowiednio: 77 87 % E m i 70 82 % E m. Jedynie po zkończeniu ekstrkcji korzeni czrnej mrchwi rzeczywist zwrtość ntocyjnów w ekstrkcie ył jeszcze mniejsz i równ 62 % mksymlnej, teoretycznej zwrtości. Z kolei po ekstrkcji wodnym roztworem kwsu solnego zwrtość polifenoli w ekstrkcie ył równ 55 78 % E m, zś zwrtość ntocyjnów 54 68 % E m. Zwrtości polifenoli i ntocyjnów rdziej zliżone do współczynników E m uzyskno podczs ekstrkcji wodnym roztworem metnolu z dodtkiem kwsu octowego (polifenole 73 100 % E m ; ntocyjny 75 87 % E m ). Njwiększą zieżność rzeczywistej zwrtości polifenoli i ntocyjnów w ekstrktch do współczynników E m osiągnięto w trkcie ekstrkcji wodnym roztworem cetonu z dodtkiem kwsu octowego (polifenole 82 100 % E m ; ntocyjny 88 100 % E m ). Niemniej zstosownie do ekstrkcji wodnego roztworu cetonu z dodtkiem kwsu octowego spowodowło, że ilość uzysknych ntocyjnów z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki ył zcznie mniejsz niż otrzymn w trkcie ekstrkcji wodnym roztworem kwsu octowego czy wodnym roztworem metnolu z dodtkiem kwsu octowego. Przykłdowo, po ekstrkcji wodnym roztworem metnolu z dodtkiem kwsu octowego ekstrkt z owoców czrnego zu zwierł lisko dw rzy więcej ntocyjnów niż ekstrkt po ekstrkcji wodnym roztworem cetonu z dodtkiem kwsu octowego. Podoną zleżność stwierdzono po ekstrkcji ntocyjnów wodnym roztworem kwsu solnego z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki. Uzyskne wyniki wskzują, że zrówno ceton, jk i kws solny nie są odpowiednimi rozpuszczlnikmi do ekstrkcji ntocyjnów z wymienionych owoców. Wniosek ten potwierdzją tkże wyniki eksperymentów przeprowdzonych przez innych utorów [4]. Inną zleżność między rodzjem zstosownego ekstrhent zwrtością ntocyjnów zoserwowno w ekstrktch z korzeni czrnej mrchwi. Njwiększą zwrtość ntocyjnów uzyskno, gdy jko ekstrhent stosowno wodny roztwór metnolu z dodtkiem kwsu octowego, njmniejszą ntomist gdy ekstrkcję wykonywno przy użyciu wodnych roztworów kwsu solnego i octowego.

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 175 25,0 20,0 kws octowy cetic cid kws solny hydrochloric cid metnol/wod/kws octowy methnol/wter/cetic cid ceton/wod/kws octowy cetone/wter/cetic cid mg cyjnidyno-3-glukozydu/g s.s mg cynidin-3-glucoside/g DM 15,0 10,0 5,0 c 0,0 roni chokeerry czrny ez eldererry czrn porzeczk lckcurrnt czrn mrchew lck crrot Ojśnieni: / Explntory notes: wyniki podno jko wrtość średni ± odchylenie stndrdowe / results re expressed s men vlue ± stndrd devition, n = 3;,, c różne litery oznczją występownie sttystycznie istotnych różnic (p < 0,05) w oręie dnego rodzju mteriłu roślinnego/ different letters denote sttisticlly significnt differences t p < 0.05 for specified type of plnt mteril. Rys. 2. Fig. 2. Zwrtość ntocyjnów w dnych ekstrktch Content of nthocynins in extrcts nlyzed W zleżności od rodzju zstosownego ekstrhent, otrzymne ekstrkty różniły się tkże zwrtością ntocyjnów w stosunku do ogólnej zwrtości związków fenolowych. Podczs ekstrkcji ntocyjnów z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki njwiększą selektywnością w stosunku do tych związków wyróżniły się wodne roztwory kwsu octowego i metnolu z dodtkiem kwsu octowego. W ekstrktch wodnego roztworu kwsu octowego ntocyjny stnowiły 15,4 19,6 % związków fenolowych, ntomist ekstrkty wodnego roztworu metnolu z dodtkiem kwsu octowego zwierły 13,8 22,3 % ntocyjnów w stosunku do ogólnej zwrtości związków fenolowych. Njmniejszą selektywnością w stosunku do ntocyjnów odznczł się wodny roztwór cetonu z dodtkiem kwsu octowego. Wymywł on njmniejszą ilość ntocyjnów z owoców, przy stosunkowo njwiększym ociążeniu ekstrktu innymi związkmi fenolowymi. Dltego w tych ekstrktch ntocyjny

176 Rdosłw Demczyński i wsp. stnowiły tylko 7,8 11,1 % związków fenolowych. Ponownie inne tendencje dotyczyły ekstrktów z korzeni czrnej mrchwi. Njwiększą selektywność w stosunku do ntocyjnów zwrtych w tym surowcu wykzywły wodne roztwory cetonu i metnolu z dodtkiem kwsu octowego. Wyekstrhowne związki fenolowe zwierły 14,2 % ntocyjnów w przypdku pierwszego z wymienionych rozpuszczlników orz 11,9 %, gdy zstosowno drugi z ekstrhentów. Z kolei zwrtość ntocyjnów w stosunku do związków fenolowych ył njmniejsz i równ 3,1 %, gdy jko rozpuszczlnik zstosowno wodny roztwór kwsu octowego. 160 140 c kws octowy cetic cid kws solny hydrochloric cid metnol/wod/kws octowy methnol/wter/cetic cid ceton/wod/kws octowy cetone/wter/cetic cid 120 mg CAE/g s.s. mg CAE/g DM 100 80 60 40 20 c 0 roni chokeerry czrny ez eldererry czrn porzeczk lckcurrnt czrn mrchew lck crrot Ojśnieni jk pod rys. 2. / Explntory notes s in Fig. 2. Rys. 3. Fig. 3. Zwrtość polifenoli w dnych ekstrktch Content of totl phenolics in extrcts Po zkończeniu ekstrkcji zmierzono tkże potencjł przeciwutlenijący poszczególnych ekstrktów. W tym celu zstosowno dwie metody nlizy włściwości przeciwutlenijących: ABTS + (rys. 4) i FRAP (rys. 5). Wyniki uzyskne z pomocą metody ABTS + yły zncznie większe od osiągniętych przy wykorzystniu metody FRAP. Trudno jednk porównywć rezultty uzyskne z pomocą ou metod, poniewż kżd z nich chrkteryzuje się odmiennym mechnizmem detekcji związków przeciwutlenijących. Metod FRAP wykryw związki, które inktywują wolne rodniki n zsdzie trnsferu pojedynczego elektronu, ntomist metod ABTS + uwzględni tkże związki, które mją zdolność wygszni wolnych rodników poprzez oddnie wodoru

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 177 [20]. Niemniej wyniki uzyskne z pomocą ou metod yły ze soą silnie skorelowne (r = 0,92). Njwyższym potencjłem przeciwutlenijącym chrkteryzowły się ekstrkty uzyskne z owoców po ekstrkcji wodnym roztworem cetonu z dodtkiem kwsu octowego. Ntomist włściwości przeciwutlenijące ekstrktów z korzeni czrnej mrchwi yły podone, niezleżnie od rodzju użytego ekstrhent. Jedynie potencjł przeciwutlenijący ekstrktów otrzymnych przy udzile wodnego roztworu cetonu z dodtkiem kwsu octowego ył niezncznie niższy w porównniu z pozostłymi ekstrktmi z korzeni czrnej mrchwi. Potencjł przeciwutlenijący ekstrktów ył silniej skorelowny z zwrtością związków fenolowych (metod ABTS r = 0,96; metod FRAP r = 0,97) niż z zwrtością ntocyjnów (metod ABTS r = 0,76; metod FRAP r = 0,79). Podoną korelcję pomiędzy włściwościmi przeciwutlenijącymi zwrtością polifenoli zoserwowli tkże Wu i wsp. [28]. N zwrtość związków fenolowych, jk i n potencjł przeciwutlenijący, wpływ rdzo wiele czynników. Są one zdeterminowne nie tylko przez cechy gtunkowe, le zleżą tkże m.in. od sezonu wegetcyjnego, nsłonecznieni uprwy, dojrzłości zernego mteriłu czy sposou jego przechowywni po ziorze [12, 21, 22]. Potwierdzją 1000,0 900,0 kws octowy cetic cid kws solny hydrochloric cid metnol/wod/kws octowy methnol/wter/cetic cid ceton/wod/kws octowy cetone/wter/cetic cid 800,0 mol Troloxu/ g s.s. mol Troloxu/g s.s. M Trolox/g DM M Trolox/g DM 700,0 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 roni chokeerry czrny ez eldererry czrn porzeczk lckcurrnt czrn mrchew lck crrot Ojśnieni jk pod rys. 2. / Explntory notes s in Fig. 2. Rys. 4. Fig. 4. Włściwości przeciwutlenijące dnych ekstrktów oznczone metodą ABTS Antioxidnt cpcity of the extrcts mesured y the ABTS method

178 Rdosłw Demczyński i wsp. to doniesieni, w których nie stwierdzono sttystycznie istotnych korelcji pomiędzy ktywnością przeciwutlenijącą zwrtością związków fenolowych w ekstrktch [13]. 600,0 500,0, kws octowy cetic cid kws solny hydrochloric cid metnol/wod/kws octowy methnol/wter/cetic cid ceton/wod/kws octowy cetone/wter/cetic cid mol Troloxu/ g s.s. M mol Trolox/g Troloxu/g DM s.s. M Trolox/g DM 400,0 300,0 200,0 c 100,0 0,0 roni chokeerry czrny ez eldererry czrn porzeczk lckcurrnt czrn mrchew lck crrot Ojśnieni jk pod rys. 2. / Explntory notes s in Fig. 2. Rys. 5. Fig. 5. Włściwości przeciwutlenijące dnych ekstrktów oznczone metodą FRAP Antioxidnt properties of extrcts s determined y FRAP method Wnioski 1. W procesie ekstrkcji ntocyjnów z owoców ronii, czrnego zu i czrnej porzeczki optymlnymi ekstrhentmi spośród zdnych są: wodny roztwór metnolu z dodtkiem kwsu octowego (metnol/wod/kws octowy 40 : 60 : 0,5 v/v/v) orz wodny roztwór kwsu octowego (0,75 % m/m). 2. Wyrne rozpuszczlniki umożliwiją uzysknie zliżonej zwrtości ntocyjnów w ekstrktch orz njwiększej zwrtości ntocyjnów w stosunku do wszystkich związków fenolowych. Szykość ekstrkcji z pomocą wodnego roztworu metnolu z dodtkiem kwsu octowego jest zncznie większ. Jednk metnol chrkteryzuje się rdzo wysoką toksycznością, jego usuwnie jest kosztowne. Dltego w prktyce zlec się, y zmist tego ekstrhent użyć wodnego roztworu kwsu octowego.

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 179 3. W procesie ekstrkcji ntocyjnów z korzeni czrnej mrchwi njlepsze rezultty, zrówno pod względem szykości procesu, jk i zwrtości ntocyjnów w ekstrktch, uzyskuje się przy zstosowniu wodnego roztworu metnolu z dodtkiem kwsu octowego (metnol/wod/kws octowy 40 : 60 : 0,5 v/v/v) orz wodnego roztworu cetonu z dodtkiem kwsu octowego (ceton/wod/kws octowy 70 : 29,5 : 0,5 v/v/v). Bdni zrelizowno w rmch projektu NN 312 211 338 finnsownego przez MNiSW. Litertur [1] Awik J.M., Rooney L.W., Wnisk R.D.: Properties of 3-deoxynthocynins from sorghum. J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 4388-4394. [2] Benzie I.F.F., Strin J.J.: The ferric reducing ility of plsm (FRAP) s mesure of ntioxidnt power : the FRAP ssy. Anl. Biochem., 1996, 239, 70-76. [3] Bucic-Kojic A.., Plninic M., Toms S., Bilic M., Velic D.: Study of solid liquid extrction kinetics of totl polyphenols from grpe seeds. J. Food Eng., 2007, 81, 236-242. [4] Cstñed-Ovndo A., de Lourdes Pcheco-Hernández M., Páez-Hernández M.E., Rodríguez J.A., Glán-Vidl C.A.: Chemicl studies of nthocynins: A review. Food Chem., 2009, 113, 859-871. [5] Cruz L., Mteus N., de Freits V.: First chemicl synthesis report of n nthocynin metolite with in vivo occurrence: cynidin-4 -O-methyl-3-glucoside. Tetrhedron Lett., 2013, 54, 2865-2869. [6] Escrp A., González M.C.: Approch to the content of totl extrctle phenolic compounds from different food smples y comprison of chromtogrphic nd spectrophotometric methods. Anl. Chim. Act, 2001, 427, 119-127. [7] Fng Z., Zhng M., Sun Y., Sun J.: How to improve yerry (Myric rur Sie. et Zucc.) juice color qulity: effect of juice processing on yerry nthocynins nd polyphenolics. J. Agric. Food Chem., 2006, 54, 99-106. [8] Fuleki T., Frncis F.J.: Quntittive methods for nthocynins. 1. Extrction of totl nthocynins nd degrdtion index for crnerry juice. J. Food Sci., 1968, 33, 78-83. [9] Grci-Viguer C., Zfrill P., Toms-Brern F.A.: The use of cetone s n extrction solvent for nthocynins from strwerry fruit. Phytochem. Anl., 1998, 9, 274-277. [10] Giusti M.M., Rodriguez-Son L.E., Bggett J.R., Reed G.L., Durst R.W., Wrolstd R.E.: Anthocynin pigment composition of red rdish cultivrs s potentil food colornts. J. Food Sci., 1998, 63, 219-224. [11] Hrone J.B., Gryer R.J.: The nthocynins. In: The Flvonoids. Ed. J.B. Hrorne. Chpmn nd Hll Ltd, London 1988, pp 1-20. [12] Howrd L.R., Clrk J.R., Brownmiller C.: Antioxidnt cpcity nd phenolic content in lueerries s ffected y genotype nd growing seson. J. Sci. Food Agric., 2003, 83, 1238-1247. [13] Khkonen M.P., Hopi A.I., Vuorel H.J., Ruh J.-P., Pihlj K., Kujl T.S., Heinonen M.: Antioxidnt ctivity of plnt extrcts contining phenolic compounds. J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 3954-3962. [14] Kpsklidis P.G., Rstll R.A., Gordon M.H.: Extrction of polyphenols from processed lck currnt (Ries nigrum L.) residue. J Agric. Food Chem., 2006, 54, 4016-4021.

180 Rdosłw Demczyński i wsp. [15] Kidoń M., Czpski J.: Spektrofotometryczn różnicow metod oznczni cylownych ntocyjnów n przykłdzie rwników mrchwi purpurowej. Aprtur Bdwcz i Dydktyczn, 2008, 4, 82-86. [16] Oym K., Kwguchi S., Yoshid K., Kondo T.: Synthesis of pelrgonidin 3-O-6 -O-cetyl-β-Dglucopyrnoside, n cylted nthocynin, vi the corresponding kempferol glucoside. Tetrhedron Lett., 2007, 48, 6005-6009. [17] Piątkowsk E., Kopeć A., Leszczyńsk T.: Antocyjny chrkterystyk, występownie i oddziływnie n orgnizm człowiek. Żywność. Nuk. Technologi. Jkość, 2011, 4 (77), 24-35. [18] Piljc-Zegrc J., Vlek L., Mrtinez S., Belsck A.: Fluctutions in the phenolic content nd ntioxidnt cpcity of drk fruit juices in refrigerted storge. Food Chem., 2009, 113, 394-400. [19] PN-EN 12145:2001. Soki owocowe i wrzywne. Ozncznie cłkowitej suchej sustncji. Metod grwimetryczn oznczni uytku msy w wyniku suszeni. [20] Prior R.L., Wu X., Schich K.: Stndrdized methods for the determintion of ntioxidnt cpcity nd phenolics in foods nd dietry supplements. J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 4290-4302. [21] Rdziejewsk-Kuzdel E., Biegńsk-Mrecik R., Kidon M.: Applicility of vcuum impregntion to modify physico-chemicl, sensory nd nutritive chrcteristics of plnt origin products A review. Int. J. Mol. Sci., 2014, 15, 16577-16610. [22] Rdziejewsk-Kuzdel E., Biegńsk-Mrecik R.: A comprison of the composition nd ntioxidnt cpcity of novel everges with n ddition of red cge in the frozen, purée nd freeze-dried forms. LWT- Food Sci. Technol., 2015, 62, 821-829. [23] Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pnnl A., Yng M., Rice-Evns C.: Antioxidnt ctivity pplying n improved ABTS rdicl ction decoloriztion ssy. Free Rdicl Bio. Med., 1999, 26, 1291-1237. [24] Sluk-Juszczk J.: Antocyjny jko skłdnik żywności funkcjonlnej stosownej w profilktyce choró ukłdu krążeni. Post. Hig. Med. Dośw. [online], 2010, 64, 451-458. [25] Snyder L.R.: Clssifiction of the solvent properties of common liquids. J. Chromtogr. A., 1974, 92, 223-230. [26] Strck D., Wry V.: Anthocynins. In: Methods in Plnt Biochemistry-Vol 1. Eds. P.M. Dey nd J.B. Hrorne. Acdemic Press, New York 1989, pp. 325-356. [27] Wng Z.Y., Xu M.L., Zhu B.W.: Optimum conditions for extrction of nthocynidin from lueerry. J. Dlin Inst. Light Ind., 2007, 26, 196-198. [28] Wu X., Gu L., Prior R.L., Mcky S.: Chrcteriztion of nthocynins nd pronthocynidins in some cultivrs of Ries, Aroni, nd Smucus nd their ntioxidnt cpcity. J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 7846-7856. OBTAINING ANTHOCYANINS FROM CHOKEBERRY, BLACKCURRANT AND ELDERBERRY FRUITS, AND FROM ROOTS OF BLACK CARROT USING EXTRACTION METHOD S u m m r y The ojective of the reserch study ws to develop method of extrcting nthocynins from fruits of chokeerry, eldererry nd lckcurrnt s well s from lck crrot roots. The following solutions were used to extrct nthocynins: wter cidified with cetic cid (0.75 % w/w), wter cidified with hydrochloric cid (0.75 % w/w), methnol/wter/cetic cid (40: 60: 0.5 v / v / v), nd cetone/wter/cetic cid (70: 29.5: 0.5 v / v / v). In the extrcts produced, the content of phenolic compounds nd nthocynins ws determined, nd, on the sis thereof, the extrction kinetics ws nlyzed. Furthermore, the ntioxidnt

POZYSKIWANIE ANTOCYJANÓW Z OWOCÓW ARONII, CZARNEGO BZU, CZARNEJ PORZECZKI 181 properties of the extrcts otined were nlyzed with the use of ABTS nd FRAP tests. During the process of extrcting nthocynins from fruits of chokeerry, eldererry, nd lckcurrnt, the queous methnol with cetic cid dded nd the queous solution of cetic cid ppered to e the optiml extrctnts, while, during the extrction of nthocynins from lck crrot roots, the est results were chieved when using the queous solution of methnol with cetic cid dded nd the queous solution of cetone with cetic cid dded. Key words: nthocynins, extrction, ntioxidnt properties, ABTS +, FRAP