RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1819729 (13) T3 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 18.11.0 080211.3 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 22.04.09 Europejski Biuletyn Patentowy 09/17 EP 1819729 B1 (1) Int. Cl. C07K14/7 A61K38/22 C12N/16 A61K38/26 C07K14/60 (06.01) (06.01) (06.01) (06.01) (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania karboksy-terminalnych amidowanych peptydów (30) Pierwszeństwo: DE0408306 01.12.04 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 22.08.07 Europejski Biuletyn Patentowy 07/34 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.09.09 Wiadomości Urzędu Patentowego 09/09 (73) Uprawniony z patentu: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, Frankfurt am Main, DE (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP 1819729 T3 MANEG Oliver, Frankfurt, DE SALAGNAD Christophe, Oberursel, DE LATTEMANN Claus, Bad Soden, DE DECKER Heinrich, Frankfurt, DE HABERMANN Paul, Eppstein, DE ZOCHER Frank, Frankfurt, DE (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Sztandke Teresa 02-770 Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis 2 30 3 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy wytwarzania karboksy-terminalnych (C-terminalnych) amidowanych peptydów z C-terminalną amidowaną lizyną, w szczególności o aktywności biologicznej GLP-1 (peptydu glukagonopodobnego), ich chemicznych względnie biotechnologicznych prekursorów i produktów pośrednich, sposobu ich wytwarzania oraz ich zastosowania do wytwarzania produktów farmaceutycznych. [0002] Liczba ludzi chorych na cukrzycę lub otyłość wzrasta na całym świecie z dużym stopniem przyrostu. Dlatego oczekuje się, że muszą zostać udostępnione leki, wykazujące duże korzyści terapeutyczne w dziedzinie tych chorób, o lepszej jakości i w większej ilości. [0003] Zgłoszenie patentowe US04/0647 A1 opisuje peptydy wywodzące się z eksendyny, które ze względu na ich działanie obniżające poziom cukru we krwi, grają ważną rolę jako leki możliwe do leczenia cukrzycy i innych zaburzeń przemiany materii, które mogą prowadzić np., do otyłości. Ze względu na ich fizjologiczny mechanizm działania, należy się spodziewać obecnie w szczególności, że odległe następstwa cukrzycowe pojawią się w stopniu mniej nasilonym względnie ze znacznym opóźnieniem. [0004] Peptydy opisane w US04/0647 A1 okazały się szczególnie skuteczne ze względu na wprowadzenie jednej lub wielu C-terminalnych reszt lizyny, z których końcowa reszta C-terminalna jest amidowana. [000] W US04/0647 A1 wymieniono różne sposoby wytwarzania tych peptydów. Jeden dotyczy sposobu biotechnologicznego, w którym po wewnątrzkomórkowej ekspresji w drożdżach prowadzi się wyodrębnianie docelowej proteiny z produktu roztwarzania komórek. Peptydy, które są amidowane C- terminalnie, wytwarzane są przez mikroorganizmy tylko w śladowej ilości tak, że wytwarzanie biotechnologiczne, jak to się proponuje w US04/0647 A1, może być dokonywane tylko z wielkim nakładem względnie w kosztowny sposób. [0006] Alternatywnie, zgłoszenie opisuje pełną chemiczną syntezę każdorazowego peptydu. Proponowana jest przy tym zmodyfikowana synteza Merryheld a, która jednak wciąż jest bardzo uciążliwa i jest związana z wysokimi kosztami. Przyczyny tego leżą m.in. w tym, że aminokwasy używane do syntezy najpierw muszą zostać wytworzone i oczyszczone, aby następnie po modyfikacji chemicznej mogły być specyficznie zastosowane w syntezie peptydów jako reagenty. Na zakończenie syntezy muszą zostać usunięte grupy ochronne a peptyd docelowy względnie produkt musi być oczyszczony, zanim może zostać zastosowany jako środek farmaceutyczny do sporządzenia leku. Pełna synteza chemiczna jest możliwa do przeprowadzenia także z dużym trudem i mniej korzystnym nakładem pod względem ekologicznym. [0007] Znane są już od dawna enzymy, które są w stanie amidować C-terminalne peptydy. Te enzymy noszą nazwę (Eipper i inni, Mol. Endocrinol. 1987, listopad; 1(11): 1987) enzymu alfa-amidującego polipeptydyloglicynę (PAM). Wytwarzanie i oczyszczanie takich enzymów PAM jest znane fachowcom i jest szczegółowo opisane: Takie preparaty enzymatyczne są ponadto częstokroć dostępne na rynku (np., K. Ohsuye i inni, Cytotechnology, 31, 1999:8-94, USA 4708934, US789234, US667, US631968, JP0177184). [0008] Bradbury i inni (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112(2): 372-377 wykazali in vitro, że PAM rozpoznaje jako substrat korzystnie peptydy, których C-terminus utworzony jest przez aminokwas glicynę. 1
Opisują oni dalej, że zasadowe aminokwasy w pozycji N-terminalnej do glicyny silnie spowalniają szybkość reakcji PAM. [0009] Obecnie znaleziono, że pochodne eksendyny z C-terminalną sekwencją zasadowych aminokwasów, w szczególności sekwencją oligo- względnie polilizyny, które dalej zawierają C-terminalną resztę glicyny, są niespodziewanie dobrze rozpoznawane przez PAM jako substrat. [00] Dzięki temu został niespodziewanie umożliwiony, według wynalazku, znacznie bardziej ekonomiczny, biotechnologiczny sposób wytwarzania amidowanych peptydów, w szczególności takich amidowanych peptydów, jakie są opisane w US04/0647 A1, przy czym żądany produkt daje się wytworzyć ze swojego prekursora peptydu/białka przedłużonego C-terminalnie o glicynę za pomocą pojedynczego etapu enzymatycznego. [0011] W sposobie według wynalazku przedstawione są biologicznie czynne peptydy, które zawierają jeden lub więcej zasadowych aminokwasów, korzystnie reszty lizyny, histydyny i/lub argininy, w szczególności reszty lizyny z C-terminalną resztą lizyny, przy czym ostatnia C-terminalna reszta lizyny jest C-terminalnie amidowana. Korzystnie, peptydy wytworzone sposobem według wynalazku wykazują aktywność biologiczną GLP-1, eksendyny-4 lub ich biologicznie czynnych analogów lub pochodnych. Niniejszy wynalazek umożliwia zatem w szczególności biotechnologiczne wytworzenie związku Nr 2 z US04/0647. Omawiany związek Nr 2 ma sekwencję (Seq ID Nr 1): NH 2 -HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH 2 [0012] Przedmiotem niniejszego wynalazku są [0013] Sposób wytwarzania C-terminalnie amidowanych peptydów o wzorze ogólnym II (AS) n -Xm-NH 2 (wzór II) w którym AS oznacza jeden lub więcej aminokwasów dających się kodować genetycznie; n wynosi -00, korzystnie -00, w szczególności -00, a szczególnie korzystnie -400; 2 i 30 (AS) n X lizynę, m n i m i/lub (AS) n -Xm, oznacza biologicznie czynny peptyd względnie białko, oznacza jeden lub więcej zasadowych aminokwasów lub ich pochodnych, korzystnie histydynę i/lub argininę, w szczególności lizynę; wynosi 1-, korzystnie 3-, w szczególności 6-8; i oznaczają liczby całkowite, i w którym 3 a) komórki gospodarza według wynalazku są hodowane w odpowiedniej ośrodku odżywczym, b) eksprymowany jest peptyd według wynalazku, c) ewentualnie peptyd według wynalazku jest uwalniany z odpowiedniego prekursora peptydu za pomocą rozszczepiania enzymatycznego; 2
d) produkty ekspresji z etapu b) względnie produkty pośrednie z etapu c) - ewentualnie po przeprowadzonym oczyszczaniu poddawane są reakcji z alfa-amidującym enzymem do związków o wzorze ogólnym II; i e) związki o wzorze ogólnym II są oczyszczane w odpowiedni sposób, korzystnie za pomocą sposobów preparatywnej chromatografii. 2 30 3 [0014] Jest ogólnie znane fachowcom, że także kombinacje znanych biochemicznych względnie biofizycznych metod rozdzielania mogą prowadzić do żądanego wyniku oczyszczania. [00] Sposób według wynalazku służy do wytwarzania związków o wzorze I zgodnie z Seq ID Nr 2: NH 2 -HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKKG (Seq ID Nr 2) oraz ich biologicznie czynnych pochodnych o homologii co najmniej 60%, korzystnie 80%, w szczególności 90%. [0016] Korzystnie sposób według wynalazku służy do wytwarzania C-terminalnie amidowanych peptydów, wytwarzania związków o Seq ID Nr 1. [0017] W pierwszym rzędzie, w ramach sposobu według wynalazku wykorzystuje się zdolność mikroorganizmów do wytwarzania heterologicznych peptydów/białek. W tym celu dokonuje się translacji żądanej sekwencji peptydu/białka do odpowiedniej sekwencji DNA, która jest sprzęgana z sekwencją promotora specyficzną dla gospodarza. W zależności od strategii ekspresji można przy tym tak eksprymować docelowy peptyd, że jest on wytwarzany przez komórki wewnątrzkomórkowo, pozostając w komórkach bezpośrednio lub pośrednio jako białko fuzyjne. Białko fuzyjne może być albo poddane bezpośrednio reakcji z PAM przed przeróbką chemiczną lub enzymatyczną do żądanego białka docelowego lub może być - w odwrotnej kolejności najpierw poddane rozszczepieniu na części fuzyjne przed przeprowadzeniem amidowania w reakcji z PAM. Jeśli wybierze się strategię fuzji, to jest jasne dla fachowców, że partnerzy fuzyjni muszą być wzajemnie związani ze sobą za pomocą członu mostka, który umożliwi rozszczepienie partnerów w taki sposób, żeby po przeróbce występował prawidłowy N-terminus peptydu docelowego przedłużony o Lys-X m -Gly. Istnieje wiele możliwości ukształtowania członu mostka. Jeśli wybierze się np., aminokwas metioninę, to możliwe jest chemiczne rozszczepienie za pomocą halogenocyjaniny. Jeśli jako człon mostka wybierze się np., pentapeptyd z sekwencją DDDDK, to możliwe jest rozszczepienie za pomocą enterokinazy. Jeśli jako człon mostka wybierze się np., tetrapeptyd z sekwencją IEGR, to rozszczepienie można prowadzić za pomocą czynnika Xa. Przy odpowiednim ukształtowaniu, dla białka, którego N-terminus zaczyna się histydyną, jako enzym procesowy można stosować Genenase. W części obejmującej przykłady zostanie opisane następnie rozszczepianie za pomocą enterokinazy. [0018] Alternatywnie można jednak także peptyd docelowy, gdy nadaje się on do wyjścia z komórki, wyciągnąć do ośrodku albo w postaci białka fuzyjnego lub bezpośrednio w formie natywnej. Do tego celu można zastosować komórki modyfikowane genetycznie, w szczególności mikroorganizmy, korzystnie bakterie lub drożdże. Jeśli jako system ekspresji wybierze się komórki bakterii, uzyskuje się dodatkowo opcję wyciągnięcia białka docelowego lub odpowiedniego białka fuzyjnego, które obejmuje białko docelowe, bezpośrednio do periplazmy lub do ośrodka hodowlanego. [0019] Fachowcom znane są organizmy gospodarza i metody stojące zasadniczo do dyspozycji do tego celu. Są one do uzyskania w dużej mierze także na rynku od wielu dostawców. Jako przedstawicieli można 3
2 30 3 tu wymienić firmy New England Biolabs, Invitrogen i Roche. W opisach katalogowych takich firm znajdują się cytaty z literatury, które dostarczają przeglądu technologii. [00] Jasne jest także dla fachowców, że spektrum mikroorganizmów do stosowania wchodzących w grę stale się zwiększa, tak jak repertuar metod biotechnologicznych. Także i tego rodzaju specjalne postaci wykonania są objęte przedmiotem niniejszego wynalazku. [0021] Przykładowo, jako przedstawicieli można wymienić następujące układy gospodarzy/wektorów: bakterie typu E. coli, S. carnosus, Salmonella, Bacillus subtilis lub Pseudomonas oraz drożdże typu K. lactis, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe i S. cerevisiae. [0022] Następnie opisane jest przykładowo zastosowanie systemów opartych na E. coli K12 względnie E. coli B. Fachowcy wiedzą jednak, że te wymienione przykładowo systemy oferują wielką ilość możliwości wariacji, które np., wywodzą się z wyboru odpowiednich promotorów lub innych regulatorowych sekwencji kwasów nukleinowych, genetycznych własności komórek gospodarza i stosowanych wektorów (np., ilość kopii DNA, środek selekcyjny itd.). Jest ponadto jasne dla fachowców, że opisane w tekście przykłady wykonania przedstawiają tylko bardzo małą paletę w odniesieniu do możliwości rzeczywiście możliwych do zrealizowania. [0023] Alternatywę do amidowania in vitro za pomocą PAM stanowi sposób, w którym enzym eksprymuje się wspólnie z prekursorem białka przeznaczonym do amidowania w tej samej komórce gospodarza. Uzyskuje się to, wprowadzając do komórki gospodarza sekwencję genów, która koduje aktywność PAM pod kontrolą sekwencji regulatorowych specyficznych dla gospodarza. Ta sekwencja ekspresji może być albo na trwale wbudowana w każdorazową chromozomalną sekwencję DNA, lub występować na drugim plazmidzie równolegle do plazmidu ekspresji dla białka docelowego, lub być zintegrowana jako druga kaseta ekspresji na tym samym wektorze, lub nawet być sklonowana do policistronicznego wsadu do ekspresji w fazie z sekwencją genów, które kodują białko docelowe pod kontrolą tej samej sekwencji promotora. [0024] Niniejszy wynalazek obejmuje zatem biotechnologiczne sposoby wytwarzania białek o wzorze I lub ich pochodnych które wykazują co najmniej 60%, korzystnie co najmniej 80%, w szczególności co najmniej 90% homologii do wzoru I. [002] Sposoby według wynalazku odznaczają się tym, że wytwarzane są rekombinowane organizmy, które syntetyzują prekursor peptydu, który następnie w obecności enzymu bezpośrednio lub przez sprzężenie z jednym lub więcej zasadowych aminokwasów lub ich pochodnych z szeregu, korzystnie reszt lizyny, histydyny i/lub argininy, w szczególności lizyny, przy czym C-terminalna sekwencja jest amidowana, może być przekształcony odpowiednio w peptyd o wzorze I. [0026] Dalsze przedmioty wynalazku stanowią także zastosowania związków według wynalazku o wzorze ogólnym I lub C-terminalnie amidowane peptydy o wzorze ogólnym II, które zostały wytworzone sposobem według wynalazku, w szczególności związki według Seq ID Nr 1 lub 2, do wytwarzania produktów farmaceutycznych lub preparatów farmaceutycznych, korzystnie do leczenia zaburzeń przemiany materii węglowodanów, szczególnie korzystnie do leczenia diabetes melitus/cukrzycy. Przykłady Przykład 1. Synteza specyficznej sekwencji DNA E. coli kodującej AVE 1-44 -Gly 4
[0027] Najpierw wytwarzana jest sekwencja genów ID Nr 3 (Seq ID Nr 3), kodująca peptyd AVE 1-44 -Gly (sekwencja ID Nr 2): [0028] Syntezę sekwencji genów prowadzi się w technologii PCR. W tym celu wytwarza się następujący primer za pomocą chemicznej syntezy DNA. Tę syntezę prowadzi się za pomocą systemu syntezy DNA Expedite. a) primer zpu ma sekwencję (Seq ID Nr 4): -TTTTTTAAGC TTGCACGGTG AAG-3 Sekwencja ID Nr 4 obejmuje zakres 1-23 nici sensownej ( sense ). b) primer zp3a ma sekwencję (Seq ID Nr ): Sekwencja ID Nr obejmuje zakres 1-9 nici kodującej ( antisense ). c) primer zp3b ma sekwencję (Seq ID Nr 6): Sekwencja ID Nr 6 obejmuje zakres 40-8 nici kodującej ( antisense ). d) primer zp3c ma sekwencję (Seq ID Nr 7): Sekwencja ID Nr 7 obejmuje zakres 91-164 nici kodującej ( antisense ). e) primer zp3d ma sekwencję 8 (seq ID Nr 8):
Sekwencja ID Nr 8 obejmuje zakres 14.4-197 nici kodującej ( antisense ). [0029] Z tymi primerami były przeprowadzone 4 kolejne reakcje PCR w standardowych warunkach w 4 o C. W reakcji 1 zastosowano każdorazowo 0 ng primera zp3a i zpu. Ilość cykli PCR wynosiła. W drugiej reakcji poddawano reakcji 1/40 produktu reakcji z każdorazowo 0 ng primera zpu i zp3b w cyklach. W trzeciej reakcji w dalszych cyklach poddawano reakcji 1/40 produktu reakcji 2 z każdorazowo 0 ng primera zpu i zp3c. Na koniec w 2 cyklach reakcji PCR z 1/40 produktu reakcji z reakcji 3 i primerów zpu i zp3d syntetyzowano żądany fragment DNA, którego długość kontrolowano przez elektroforezę na żelu. Żądany fragment DNA był oczyszczany i poddany reakcji z enzymami restrykcyjnymi EcoR1 a następnie z Hind3 według zaleceń wytwórcy (New England Biolabs). [0030] Równolegle poddano reakcji DNA plazmidu puc19 (New England Biolabs) z enzymami EcoR1 i Hind3. Fragmenty wsadu z rozszczepiania rozdzielono na żelu agarozy o stężeniu 1,2% a następnie izolowano fragment reszty wektora z puc19 i żądany produkt z reakcji 4. Oczyszczone fragmenty poddano ligacji między sobą w reakcji z ligazą T4 przez noc w 16 o C. Następnie kompetentne komórki E. coli (Stratagene, szczep E. coli XL Gold) poddano transformacji produktem ligacji i rozprowadzono na płytkach agarowych zawierających 2 mg/l ampicyliny. Z poszczególnych klonów wyodrębniano plazmid DNA i poddano badaniu za pomocą analizy sekwencyjnej DNA. [0031] Plazmidowe DNA żądanego fragmentu uzyskało oznaczenie pschpuczp. Służyło ono jako materiał wyjściowy do wytwarzania wektorów ekspresji do syntezy prekursora peptydu według wynalazku w komórkach E. coli K12. Przykład 2: Konstrukcja wektorów ekspresji kodujących prekursor peptydu AVE 1-44 -Gly 2 [0032] W celu wytworzenia peptydu AVE 1-44 -Gly, kodującą sekwencję wprowadzono do wektora pthiohisa firmy Invitrogen (Nr katalogowy K360-01). Powstawało białko fuzyjne z tioredoksyną, które związane jest ze prekursorem peptydu AVE 1-44 -Gly przez sekwencję rozpoznającą DDDDK enterokinazy. Przez reakcję z enterokinazą (Invitrogen) uwalniane było AVE 1-44 -Gly, które można było następnie przekształcać zgodnie z przykładem 7 (poniżej) w obecności PAM (Wako Pure Chemicals Ind., Ltd) w białko docelowe AVE 1-44 -NH 2. Zsyntetyzowano dwa primery o następującej sekwencji: 30 [0033] Primer Zp_thiohisf z miejscem cięcia BamH1 (Seq ID Nr 9): -TTTTTTGGAT CCGGTGATGA CGATGACAAG CACGGTGAAG GTACCTTC-3 Primer ZP_thiohisrev z miejscem cięcia EcoR1 (Seq ID Nr ): [0034] -TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGC-3 6
[003] W reakcji PCR z DNA pschpuczp jako template/matrycą stosowano primer Zp_thiohisf i ZP_thiohisrev w standardowych warunkach. Powstał fragment PCR, który po rozszczepianiu enzymami BamH1 i EcoR1 był bezpośrednio wstawiany do wektora pthtohisa odpowiednio otwartego za pomocą BamH1 i EcoR1 - w reakcji z ligazą T4. Odpowiednie komórki E. coli BL21 poddano transformacji mieszaniną z ligacji i rozprowadzono na selektywnym agarze, który zawierał 2 mg/l ampicyliny. Z poszczególnych klonów ponownie izolowano plazmid DNA i poddawano analizie za pomocą PCR a następnie analizie sekwencyjnej DNA. Żądane pozytywne klony, które zostały nazwane pthiohisazp- Gly, przebadano w sposób analogiczny do przykładu 14 z patentu USA Nr 496924 na ekspresję białka fuzyjnego. Na podstawie pozytywnej analizy ekspresji wybrano i hodowano klon, w celu wytworzenia większej ilości materiału. Powstające białko zespolone obejmuje tioredoksynę, która jest związana z AVE 1-44 - Gly (seq. ID Nr 12) przez sekwencję rozpoznającą enterokinazy. [0036] Patent USA Nr 496924 proponuje system ekspresji, który zasadniczo umożliwia wytwarzanie białek fuzyjnych według zamierzonego projektu. Korzyść tego systemu polega na tym, że można wytworzyć białko fuzyjne z niewielkim udziałem substancji balastowej. Jeśli dokona się zespolenia odcinków sekwencji A-B przez sekwencję rozpoznającą enterokinazy z AVE 1-44 -Gly (Seq. ID Nr 12) to otrzymuje się białko fuzyjne z następującą sekwencją genów i aminokwasów (seq ID Nr 11 i 12): [0037] Wytwarzanie kodującej sekwencji genów prowadzono za pomocą technologii PCR. W tym celu syntetyzowano następujące primery: 2 1) primer psw3_zpcolf (Seq ID Nr 13): -CGTATCGACG ATGACGATAA ACACGGTGAA GGTACCTTC-3 Sekwencja primera pokrywa przy tym miejsce rozpoznające enterokinazy i początek sekwencji kodującej AVE 1-44 -Gly. 7
2) primer psw3_zpcolrev (Seq ID Nr 14): -GTGTTTATCG TCATCGTCGA TACGCGTCAG TTTCGG-3 Sekwencja odpowiada przy tym sekwencji syntetycznej interleukiny-2, która stosownie do tabeli I z US496924 pokrywa się aminokwasami 34-38 oraz 2/3 kodonu dla aminokwasu metioniny. Reszta sekwencji primera pokrywa się z primerem psw3_zpcolf. 3) pbprimef1 (Seq ID Nr ): -TGAGCGGATA ACAATTTCAC AC-3 Primer ulega hybrydyzacji wzdłuż łańcucha z miejscem cięcia EcoR1, które jest zawarte w plazmidzie pk0 (rysunek 33 z US496924). 2 4) psw3_zpcolrev z miejscem cięcia Hind3 (Seq ID Nr 16): -TTTTTTAAGC TTGCGGCCGC ACGTGCATGC TATTATCAAC CTTC-3 Przeprowadzono dwie równoległe reakcje PCR. Jedną przeprowadzano na DNA plazmidu pk0 z parą primerów pbprimef1 i psw3_zpcolrev w 0 o C a drugą reakcję z parą primerów psw3_zpcolf i psw3_zpcolrev na DNA plazmidu pthiohisazp-gly w 4 o C. Produkty reakcji oczyszczano po rozdzielaniu elektroforetycznym na żelu, każdą podwielokrotność mieszano w stosunku 1:1 a następnie w trzeciej reakcji PCR poddawano reakcji z parą primerów pbprimef1 i psw3_zpcolrev. Produkt reakcji PCR poddawano następnie reakcji z enzymami EcoR1 i Hind3 i wstawiano do równolegle otwartego za pomocą tych enzymów plazmidu pk0 w reakcji z ligazą T4. Mieszaninę z ligacji transformowano do właściwych komórek E. coli BL21, które rozprowadzano na płytce z selektywnym agarem, który zawierał 2 mg/l ampicyliny. Z poszczególnych klonów ponownie izolowano plazmid DNA i poddawano analizie za pomocą PCR a następnie analizy sekwencyjnej DNA. Pozytywne klony zostały nazwane pbzp0 i przebadane na ekspresję białka fuzyjnego. Produkty ekspresji poddano analizie spektroskopii masowej i za pomocą analizy SDS-PAGE i N- terminus został oznaczony za pomocą analizy sekwencyjnej białka. Wybrano odpowiedni klon do hodowli większej ilości materiału. Przykład 3: Hodowla szczepów skonstruowanych w przykładzie 2 30 3 [0038] Komórki z E. coli BL21, transformowane różnymi wektorami plazmidowymi kodującymi pochodne docelowego białka (-białka fuzyjnego), były hodowane w fermenterze w pożywce soli mineralnych lub pożywce kompleksowej (patrz przykład 1) w 30 o C lub 37 o C o ph 7,0. Nastawianie ph prowadzono za pomocą roztworu NH + 4 (stężenie 26% w wodzie). Napowietrzanie hodowli zapewniano za pomocą strategii sterującej, która utrzymywała poziom rozpuszczonego tlenu w ośrodku hodowlanym na stałym poziomie 30%. Dla procesu hodowli wsadowej uzupełnianej w pożywce soli mineralnych, po zakończeniu fazy wsadowej do pożywki dodawano roztwór glukozy (60% stężenia masowego kg/m 3 ) (8 g/l/h do 26 g/l/h). Indukcję ekspresji białka wywoływano przez dodawanie IPTG (1-4 mm stężenie końcowe (f.c.)). Czas indukcji wynosił 6-8 h. Ekspresję docelowego białka sprawdzano za pomocą elektroforezy żelowej na żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE). [0039] Ekspresję AVE 1-44 -Gly(-białko fuzyjne) w E. coli BL21/pBZP0 przeprowadzono jak to opisano dalej: 8
Z długotrwałej hodowli komórek E. coli BL21 składowanej w -80 o C pobrano 0 µl zawiesiny komórek i wstrząsając inkubowano w 0, l ośrodka do wstępnej hodowli w 37 o C przez -16 h. Główną hodowlę w fermenterze zaszczepiano z gęstością szczepionych mikroorganizmów 0,01 do 0,0 OD 600 za pomocą odpowiedniej ilości hodowli wstępnej. [0040] Pożywka dla hodowli wstępnej: g/l Bacto trypton g/l ekstraktu z drożdży g/l NaCl [0041] Pożywka dla hodowli głównej: Określona pożywka soli mineralnych (pożywka minimalna) bazująca na glukozie, jako źródle węgla (Jeffrey H. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)). [0042] Po wyczerpaniu glukozy istniejącej początkowo w ośrodku do hodowli głównej wprowadzano dodatkowo roztwór glukozy. Ekspresję białka indukowano przez dodawanie IPTG (1 mm f.c.) i po indukcji obserwowano maksymalną ekspresję białka fuzyjnego. [0043] Z zastosowaniem np., systemu analizy SDS-PAGE firmy Novex (układ żelowy NuPage Novex 12%, Invitrogen ) odpowiednio do danych wytwórcy poddawano analizie podczas fermentacji każde 0,02 OD 600nm zawiesiny komórek, które zostały pobrane z fermentera w różnych momentach hodowli. Przykład 4: Oczyszczanie białek fuzyjnych 2 30 3 [0044] WyodrębnianieBZP- AVE 1-44 -Gly(-białko fuzyjne) Z 0 g biomasy rekombinowanego szczepu E. coli ponownie sporządzono zawiesinę w 300 ml buforu Tris (0 mm Tris/HCl, ph 7,4; 1 mm EDTA). Produkt roztwarzania komórek uzyskiwano przez dwukrotną homogenizację pod wysokim ciśnieniem (homogenizator wysokociśnieniowy Rannie, 00 barów). Nierozpuszczalne składniki homogenizatu oddzielano przez wirowanie. Ciecz znad osadu poddano filtracji pod ciśnieniem (filtr Sartorius 0,22 µm, typ 111) i podawano na kolumnę chromatograficzną (Source S, Amersham Biosciences) wcześniej zrównoważoną za pomocą buforu (0 mm Tris/HCl, ph 7,3; 1 mm EDTA). Po naniesieniu próbki prowadzono etap wymywania za pomocą buforu równoważącego (2 objętości kolumny) po czym prowadzono etap dalszego wymywania za pomocą buforu solnego o stężeniu % (0 mm Tris/HCl, ph 7,3; 1M NaCl, 1 mm EDTA). Frakcjonowanie prowadzono przez przyłożenie gradientu soli za pomocą buforu solnego przez objętości kolumny. Sprawdzanie zawartości białka fuzyjnego w poszczególnych frakcjach prowadzono za pomocą elektroforezy żelowej SDS (układ żelowy NuPage Novex 12%, Invitrogen). Frakcje zawierające białko fuzyjne połączono i zatężono od - do -krotnie (komora do ultrafiltracji Millipore, membrana odcinająca kda). Koncentrat stosowano po wymianie buforu na bufor enterokinazowy (0 mm Tris/HCl, ph 7,4; 0 mm NaCl, 2 mm CaCl 2 ) bezpośrednio do reakcji rozszczepiania proteazą, lub przed reakcją odszczepiania dodatkowo oczyszczano przez filtrację żelową (Superdex 7, Amersham Biosciences). 9
[004] Rozszczepianie białka fuzyjnego prowadzono za pomocą enterokinazy (Invitrogen) w buforze enterokinazowym ( mm Tris/HCl, 0 mm NaCl, 2 mm CaCl 2, ph 7,4) zgodnie z danymi wytwórcy. Przykład : Oczyszczanie białka fuzyjnego-tioredoksyna zawierającego Seq ID Nr 3 2 [0046] Z 0 g biomasy rekombinowanego szczepu E. coli ponownie sporządzono zawiesinę w 0 mm buforze Tris (ph 7,4; 1 mm EDTA). Produkt roztwarzania komórek uzyskiwano przez dwukrotną homogenizację pod wysokim ciśnieniem (homogenizator wysokociśnieniowy Rannie, 00 barów). Nierozpuszczalne składniki homogenizatu oddzielano przez wirowanie. Ciecz znad osadu filtrowano pod ciśnieniem (filtr Sartorius 0,22 µm, typ 111) i podawano na kolumnę chromatograficzną (Source Q, Amersham Biosciences) wcześniej zrównoważoną za pomocą buforu (0 mm Tris/HCl, ph 7,4; 1 mm EDTA). Po naniesieniu próbki prowadzono etap wymywania za pomocą buforu równoważącego (2 objętości kolumny) a frakcjonowanie prowadzono przez przyłożenie gradientu soli za pomocą buforu solnego (0 mm Tris/HCl, ph 7,4; 0,3 M NaCl, 1 mm EDTA) przez 6 objętości kolumny. Sprawdzanie zawartości białka fuzyjnego w poszczególnych frakcjach prowadzono za pomocą elektroforezy żelowej SDS (układ żelowy NuPage Novex 12%, Invitrogen). Frakcje zawierające białko fuzyjne połączono i zatężono od - do - krotnie (komora do ultrafiltracji Millipore, membrana odcinająca kda). Koncentrat frakcjonowano dalej przez filtracyjną chromatografię żelową (Superdex 7, Amersham Biosciences). Zrównoważoną wcześniej kolumnę (0 mm Tris/HCl, ph 7,4; 0 mm NaCl) załadowano do % objętości kolumny zatężonym roztworem białka fuzyjnego. Elucję prowadzono przez płukanie buforem równoważącym. Sprawdzanie zawartości białka fuzyjnego w poszczególnych frakcjach prowadzono ponownie za pomocą elektroforezy żelowej SDS (układ żelowy NuPage Novex 12%, Invitrogen ). Odpowiednie frakcje połączono i zatężono do około mg/ml (koncentratory Vivaspin z odcinaniem kd, Vivascience) i za pomocą wsadów do diafiltracji (Vivascience) prowadzono wymianę buforu na bufor enterokinazowy ( mm Tris/HCl, ph 7,4; 0 mm NaCl). [0047] Przetwórstwo prekursora AVE 1-44 -Gly prowadzono następnie za pomocą enterokinazy analogicznie do przykładu 4. Przykład 6: Rozdzielanie produktów rozszczepienia z reakcji rozszczepiania enterokinazą 30 3 [0048] Po rozszczepieniu białka fuzyjnego za pomocą enterokinazy produkty rozszczepiania rozdzielano od siebie przez chromatografię jonowymienną (Source 30S, Amersham Biosciences). Moc jonową roztworu doprowadzono do około ms/cm przez dodawanie chlorku sodu. Po podaniu roztworu białka na wcześniej zrównoważoną kolumnę ( mm Tris/HCl, ph 7,4; nastawiony za pomocą NaCl na przewodność około ms/cm) niezwiązany materiał wymywano buforem ( mm Tris/HCl, ph 7,4; nastawiony za pomocą NaCl na przewodność około ms/cm). Elucję peptydu AVE 1-44 -Gly prowadzono przez przyłożenie gradientu przez objętości kolumny do 00 mm NaCl. [0049] Identyfikację frakcji zawierających AVE 1-44 lub prekursorów AVE 1-44 prowadzono za pomocą elektroforezy SDS, HPLC i spektrometrii masowej. Łączono odpowiednie frakcje i po usunięciu organicznego rozpuszczalnika liofilizowano.
[000] Wyodrębnione AVE 1-44 -Gly poddano następnie całkowitemu sekwencjonowaniu w celu upewnienia się co do sekwencji aminokwasów zgodnie z Edmanem. Przykład 7: Przekształcenie AVE 1-44 -Gly do AVE 1-44 -NH 2 [001] Reakcję prowadzono za pomocą enzymu PAM (enzym amidujący peptydyloglicynę Wako Pure Chemicals Ind., Ltd (Numer do zamówienia 161-16971)) zgodnie z danymi odnośnie warunków reakcji podanymi przez producenta. [002] Stosowano następujący roztwór: 1 µm CuSO 4 mm KJ 3 mm askorbinianu Na 230 U(jednostek)/ml katalazy (Rind, Fluka) 600 U(jednostek)/ml PAM (Wako Chemicals) 0,1 M Tris/HCl ph 7,0 z 0,001% Triton X-0 [003] Roztwór inkubowano wstępnie przez 1 h w 37 o C a następnie dodano roztwór białka AVE 1-44 -Gly (Tris/HCl ph 7,0, stężenie końcowe 80 µg/ml). Mieszaninę reakcyjną następnie inkubowano dalej w 37 o C. Przebieg reakcji śledzono przez pobieranie próbek w różnych momentach. Przy maksymalnym stopniu przemiany reakcję zatrzymano przez dodawanie roztworu 0 mm EDTA. [004] Mieszaniną reakcyjną następnie rozdzielano za pomocą chromatografii jonowymiennej (firma Shodex, kolumna typ IEC CM-82 (8x7 mm)). Do tej kolumny przyłożono następujący gradient: Eluent A 40 mm bufor fosforanowy ph 7 + % acetonitrylu Eluent B 0 mm bufor fosforanowy ph 7 + 1 M NaCl 2 30 [00] Kolumna pracowała w temperaturze pokojowej z szybkością przepływu 2 ml/min lub 1 ml/min. [006] Wyłapywano wymywane frakcje (detekcja przy 280 nm) i określano masę każdego peptydu za pomocą MALDI-MS. Analizy spektrometrii masowej przeprowadzano za pomocą aparatu typu BRUKER Reflex IV. Próbki stosowano bezpośrednio do analizy MALDI-MS, względnie rozcieńczano do stężenia około 0 pmoli/µl za pomocą wodnego roztworu TA 0% ([1+1] 0,1% TFA + 0% acetonitrylu). [007] Potwierdzono oczekiwaną masę dla AVE 1-44 -NH 2. Otrzymany produkt można wprowadzić do dalszego farmaceutycznego zastosowania. [008] Preparaty farmaceutyczne mogą zostać wytworzone dalej przez dodanie odpowiednich farmaceutycznych substancji pomocniczych do biologicznie czynnego peptydu względnie pochodnej peptydu w sposób znany dla fachowców. PROTOKÓŁ SEKWENCJI [009] <1> Aventis Pharma Deutschland GmbH 11
<1> Sposób wytwarzania karboksy-terminalnych amidowanych peptydów o działaniu GLP1 <130> DEAV04/0076 <140> <141> <160> 16 <170> Ogłoszenie patentowe 2.1 <2> 1 <211> 44 <212> PRT <2> <223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny peptyd; amidacja MOD_RES K44 <400> 1 <2> 2 <211> 4 <212> PRT <2> <223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny peptyd; <400> 2 12
<2> 3 <211> 198 <2> <223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny DNA <400> 3 <2> 4 <211> 23 <2> <400> 4 ttttttaagc ttgcacggtg aag 23 <2> <211> 9 <2> 2 <400> cttccatctg tttggacagg tcggaggtga aggtaccttc accgtgcaag cttaaaaaa 9 13
<2> 6 <211> 69 <2> <400> 6 <2> 7 <211> 74 <2> <400> 7 <2> 8 <211> 4 <2> <400> 8 ttttttgaat tcgtcgacca ggtgcggccg cacgtgcatg ctattatcaa cctt 4 2 <2> 9 <211> 48 <2> 14
<400> 9 ttttttggat ccggtgatga cgatgacaag cacggtgaag gtaccttc 48 <2> <211> 2 <2> <400> ttttttgaat tcgtcgacca ggtgc 2 <2> 11 <211> 321 <2> <223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny DNA <400> 11 <2> 12 <211> 90 <212> PRT 2 <2> <223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny peptyd <400> 12
<2> 13 <211> 39 <2> <400> 13 cgtatcgacg atgacgataa acacggtgaa ggtaccttc 39 <2> 14 <211> 36 <2> <400> 14 gtgtttatcg tcatcgtcga tacgcgtcag tttcgg 36 <2> <211> 22 16
<2> <400> tgagcggata acaatttcac ac 22 <2> 16 <211> 44 <2> <400> 16 ttttttaagc ttgcggccgc acgtgcatgc tattatcaac cttc 44 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania C-terminalnych amidowanych peptydów o wzorze ogólnym II (AS) n -Xm-NH 2 (wzór II) w którym AS oznacza jeden lub więcej aminokwasów dających się kodować genetycznie; n wynosi -00, korzystnie -00, w szczególności -00, a szczególnie korzystnie -400; i (AS) n i/lub (AS) n -Xm, korzystnie oznacza biologicznie czynny peptyd względnie białko, 2 X oznacza jeden lub więcej zasadowych aminokwasów lub ich pochodnych, korzystnie lizynę histydynę i/lub argininę, w szczególności lizynę; m wynosi 1-, korzystnie 3-, zwłaszcza 6-8; i n i m oznaczają liczby całkowite, i w którym 17
a) komórki gospodarza są hodowane w odpowiedniej pożywce bakteryjnej, b) eksprymowany jest związek o wzorze ogólnym I (AS) n -Xm-Yp (wzór I), w którym Y oznacza jeden lub więcej aminokwasów o ładunku obojętnym, korzystnie glicynę, p wynosi 1-, korzystnie 1-, w szczególności 1; c) ewentualnie związek o wzorze I jest uwalniany z odpowiedniego prekursora peptydu za pomocą rozszczepiania enzymatycznego lub chemicznego; d) produkty ekspresji z etapu b) względnie produkty pośrednie z etapu c) - ewentualnie po etapie oczyszczania - poddawane są reakcji z alfa-amidującym enzymem (PAM); i e) C-terminalnie amidowany peptyd o wzorze ogólnym II jest oczyszczany w odpowiedni sposób, korzystnie za pomocą sposobów preparatywnej chromatografii. 2. Sposób według zastrzeżenia 1 w którym związek o wzorze I jest zdefiniowany przez sekwencję Seq ID Nr 2, oraz jego biologicznie czynne pochodne z homologią co najmniej 60 %. 3. Sposób według jednego lub więcej z zastrzeżeń 1-2, w którym związek o wzorze I jest uwalniany z odpowiednich prekursorów peptydów za pomocą rozszczepiania enzymatycznego. 4. Sposób według zastrzeżenia 3, w którym związek o wzorze I jest uwalniany z odpowiednich prekursorów peptydów za pomocą rozszczepiania za pomocą enzymu enterokinazy.. Sposób według zastrzeżenia 1 wytwarzania związku o wzorze II, który jest zdefiniowany przez sekwencję Seq ID Nr 1. 18