Nr kat. EM03, EM04 Wersja zestawu: 1.2018 Zestaw do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych EXTRACTME jest zarejestrowanym znakiem towarowym BLIRT S.A.
www.blirt.eu
Nr kat. EM03, EM04 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA TISSUE KIT rzeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji DNA o wysokiej czystości z tkanek stałych (świeżych, mrożonych, utrwalonych w formalinie lub zatoionych w arafinie), łynów fizjologicznych, włosów, ogonów gryzoni, owadów oraz linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zotymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt rzeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI 1 Warunki rze chowywania Nr katalogowy EM03-010 EM03-050 EM03-250 Nr katalogowy * EM04-010 * EM04-050 * EM04-250 * TL Buffer (Tissue Lysis Buffer) Proteinase K ** (lyohilized) 3.8 ml 19 ml 94 ml TP 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 2 Proteinase Buffer 280 μl 1.4 ml 7 ml TP RNase A *** (lyohilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 3 RNase Buffer 100 μl 220 μl 1.1 ml TP TB Buffer (conc.) **** (Binding Buffer) TW1 Buffer (conc.) **** (Wash Buffer 1) TW2 Buffer (conc.) **** (Wash Buffer 2) 1.8 ml 10 ml 44 ml TP 3.3 ml 17 ml 82 ml TP 1.8 ml 9 ml 41 ml TP Elution Buffer 2 ml 10 ml 5 x 10 ml TP DNA Purification Columns 10 cs 50 cs 5 x 50 cs TP Collection Tubes (2 ml) 10 cs 50 cs 5 x 50 cs TP Bead-Beating Tubes * 10 cs 50 cs 5 x 50 cs TP 1 TP temeratura okojowa (+15 C do +25 C) 2 Roztwór Proteinase K należy rzechowywać w temeraturze -20 C. 3 RNase A w roztworze rzechowywana w temeraturze +4 C zachowuje całkowitą aktywność rzez kilka dni. Jeśli wymagane jest rzechowywanie RNaseA rzed dłuższy okres czasu, zaleca się rozorcjowanie roztworu RNaseA i rzechowywanie w temeraturze -20 C. * Odnosi sie wyłącznie do zestawu EXTRACTME DNA TISSUE PLUS KIT. Probówki z kulkami do homogenizacji (Bead Beating Tubes) osiadają wyełnienie cyramiczne. 3
** Przed ierwszym użyciem do robówki zawierającej liofilizat Proteinase K należy dodać 1.4 ml Proteinase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 280 μl buforu) *** Przed ierwszym użyciem do robówki zawierającej liofilizat RNase A należy dodać 220 μl RNase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 100 μl buforu) **** Przed ierwszym użyciem do TB, TW1 i TW2 Buffers należy dodać odowiednią ilość 96-100% etanolu (i nformacja na etykietach oraz w oniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM03-010 EM03-050 EM03-250 Nr katalogowy * EM04-010 * EM04-050 * EM04-250 * TB Buffer 1.8 ml 10 ml 44 ml Etanol 96 100% 2.7 ml 15 ml 66 ml Całkowita objętość 4.5 ml 25 ml 110 ml TW1 Buffer 3.3 ml 17 ml 82 ml Etanol 96 100% 3.3 ml 17 ml 82 ml Całkowita objętość 6.6 ml 34 ml 164 ml TW2 Buffer 1.8 ml 9 ml 41 ml Etanol 96 100% 4.2 ml 21 ml 96 ml Całkowita objętość 6 ml 30 ml 137 ml * Odnosi sie wyłącznie do zestawu EXTRACTME DNA TISSUE PLUS KIT. Wszystkie roztwory z zestawu należy rzechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku arowania. Data ważności Data ważności zestawu, rzechowywanego w odowiednich warunkach, odana jest na etykietach roduktu. Po otwarciu zestaw zachowuje stabilność rzez okres 12 miesięcy. www.blirt.eu 4
Nr kat. EM03, EM04 III. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY tkanka stała świeża lub mrożona: 1 30 mg tkanka utrwalona w formalinie: 1 30 mg tkanka w bloczku arafinowym: 1 30 mg linie komórkowe: 10 3 10 7 komórek łyny fizjologiczne (mocz, PMR, łyn otrzewnowy): 1 5 ml włosy: 10 30 mg ogony gryzoni: do 30 mg owady: 1 30 mg WYDAJNOŚĆ IZOLACJI 100 250 ng/μl (w zależności od rodzaju i masy tkanki użytej do izolacji) POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 50 μg DNA CZAS IZOLACJI ok. 12 minut (o etaie lizy) 30 40 minut w rzyadku homogenizacji mechanicznej 1 16 h w rzyadku zastosowania okresowego worteksowania CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1,7 1,9 5
IV. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: 1 30 mg. Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie. Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę odzielić za omocą ęsety i nożyczek lub skalela na jak najmniejsze f r a g m e n t y. P r z e j ś ć d o w y b o r u m e t o d y h o m o g e n i z a c j i ( o n i ż e j) l u b r z e j ś ć do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). Ciekły azot, suchy lód (LN 2, CO 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 lub CO 2 tkankę umieścić w jałowym, urzednio schłodzonym moździerzu i za omocą schłodzonego istonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, nastęnie rozetrzeć. 2. Otrzymany roszek rzenieść do robówki (2 ml) zawierającej 375 μl TL Buffer i rzejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). c Jeśli o roztarciu owstaje cienka kleista warstwa zamiast roszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 375 μl TL Buffer i orzez staranne ietowanie zebrać całość i rzenieść do robówki (2 ml), nie zaominając o starannym rzemyciu istonu z resztek tkanki. Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w robówce (2 ml), dodać 100 μl TL Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. P o u z y s k a n i u h o m o g e n a t u, o ł u k a ć k o ń c ó w k ę n o ż o w ą z a o m o c ą 275 μl TL Buffer, a nastęnie rzenieść całość do nowej robówki (2 ml). 3. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych Polecamy zastosowanie robówek z kulkami ceramicznymi (HPLM100, HPLM100a) lub zawierającego je zestawu EXTRACTME DNA TISSUE PLUS (nr kat. EM04). 1. Do robówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 150 μl TL Buffer i rzenieść ociętą tkankę. Nastęnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać rzez 30 s rzy 3000 4000 x g. Procedurę owtórzyć w razie konieczności. c W rzyadku braku możliwości oceny stonia rozdrobnienia tkanki sowodowanej ienieniem buforu robówkę zwirować rzez 120 s rzy 11 000 x g. c W rzyadku braku homogenizatora róbkę można rozdrobnić korzystając z odowiedniej rzystawki do worteksu; minimum 5 min rzy maksymalnych obrotach. www.blirt.eu 6
Nr kat. EM03, EM04 2. Dodać 225 μl TL Buffer, wymieszać rzez ietowanie. 3. Do robówki dodać 25 μl Proteinase K oraz 4 μl RNase A. Zworteksować rzez 20 s. Inkubować 5 min w tem. 37 C. 4. Przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). B. TKANKA UTRWALONA W FORMALINIE Ilość: 1 30 mg. Materiał: tkanki zwierzęce rzechowywane w 4% formalinie w warunkach chłodniczych rzez minimum 60 minut. 1. Usunąć formalinę orzez dwu lub trzykrotne rzełukanie tkanki roztworem PBS lub H 2 O. c Formalina jest drażniąca. Nie zaleca się srawdzania rawidłowości odłukania formaliny rzez wdychanie oarów z robówki. 2. Dalej ostęować jak w rzyadku tkanek świeżych (kt. IV.A). C. TKANKA ZATOPIONA W PARAFINIE Ilość: 1 30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce zatoione w bloczkach arafinowych według standardowej rocedury histologicznej. 1. Z bloczka arafinowego wyciąć fragment o masie max 30 mg i umieścić w robówce (2 ml). 2. Dodać 1 ml ksylenu. Worteksować rzez 30 s. c Ksylen jest toksyczny, drażniący i bardzo alny. Pracować od włączonym wyciągiem. 3. Wirować 5 min rzy 15 000 x g. Usunąć suernatant rzez ietowanie. 4. Powtórzyć etay 2 3. 5. Dodać 1 ml 96-100% etanolu. Wymieszać rzez ietowanie lub worteksowanie 15 s. 6. Wirować 120 s rzy 15 000 x g. Usunąć suernatant rzez ietowanie. 7. Powtórzyć etay 5 6. 8. Suszyć osad w tem. 50 C w otwartej robówce rzez 5-20 min celem ozbycia się etanolu. 9. Dodać 375 μl TL Buffer, wymieszać rzez worteksowanie rzez 20 s. 10. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). 7
D. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: 10 3 10 7 komórek. Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. 1. Zamrożone komórki rozmrozić w tem. 37 C. Komórki zawieszone w ożywce lub buforze PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub robówce (2 ml) rzez 5 min rzy 3000 x g. Odrzucić suernatant. W rzyadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie rzemyć rzy omocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 375 μl TL Buffer. Wymieszać rzez intensywne worteksowanie rzez 30 s, a nastęnie ietowanie. c Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i ołączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 7 ) mogą wystąić trudności z rozuszczeniem osadu w TL Buffer. Należy wtedy rozietować ostrożnie osad z wykorzystaniem iety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do iet. 3. Całość rzenieść do nowej robówki (2 ml). 4. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). E. PŁYNY FIZJOLOGICZNE Ilość: do 5 ml łynu. Materiał: mocz, łyn mózgowo-rdzeniowy, łyn z jamy otrzewnej, ołucnej, lwocina. Do izolacji DNA z krwi olecamy dedykowany zestaw EXTRACTME DNA BLOOD KIT, a do izolacji z wymazów lub nasienia zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN KIT. c Płyny fizjologiczne są materiałem cennym diagnostycznie, a jednocześnie stanowią duże zagrożenie ze względu na otencjalną zawartość atogenów i/lub komórek nowotworowych. Należy zachować szczególną ostrożność odczas racy z tym materiałem. 1. Mocz oraz inne łyny: w zależności od objętości, zwirować w odowiedniej robówce/falkonie rzez 5 min rzy 500 x g. Suernatant odrzucić. Plwocina: rzed wirowaniem należy dodać odowiednią ilość środka mukolitycznego (bromheksyna, acetylocysteina). Wirować 5 min rzy 3000 x g. Suernatant odrzucić. 2. Osad komórkowy rzełukać za omocą 1 ml PBS lub soli fizjologicznej, wirować 60 s rzy 3 000 x g. 3. Dodać 375 μl TL Buffer. Wymieszać rzez intensywne worteksowanie 30 s. 4. Przejść do kroku 1b Protokołu izolacji (sekcja VI). www.blirt.eu 8
Nr kat. EM03, EM04 F. WŁOSY Ilość: 10 30 mg włosów (ok. 100 120 sztuk), do 30 mg cebulek włosa. Materiał: włosy, najleiej z cebulkami lub same cebulki. Tylko cebulki zawierają żywe komórki, natomiast w ozostałej części włosa znajdują się resztki komórek ze zdegradowanym gdna oraz mtdna. Stąd też alikacje, takie jak PCR lub qpcr, owinny uwzględniać rodukty o wielkościach 200 z. 1. Cebulki odciąć od włosów i umieścić w robówce (2 ml). Jeśli włosy ozbawione są cebulek, ociąć je na fragmenty o długości maksymalnie 3 mm. 2. Dodać 375 μl TL Buffer. Dodać 40 μl 1M DTT oraz 25 μl Proteinase K. Wymieszać rzez worteksowanie 30 s. c Dodatek DTT jest ocjonalny. Większość rodzajów włosów owinna ulec strawieniu bez dodatku tego odczynnika, jednakże niektóre rodzaje włosów (n. kręcone) zawierają zbyt dużą ilość mostków dwusiarczkowych, uniemożliwiających całkowitą lizę. 3. Inkubować minimum 6 h (lub rzez noc) w tem. 55 C. Należy okresowo worteksować rzez 60 120 s. Polecany jest termomikser. 4. Po całkowitym otrawieniu rzejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). c W rzyadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się rzerowadzenie elucji w 200 μl Elution Buffer, a nastęnie recyitacji DNA według standardowych rocedur. G. OGONY GRYZONI Ilość: do 30 mg. Materiał: ogon szczura lub myszy. 1. Ogon ociąć nożyczkami lub skalelem na jak najmniejsze fragmenty i umieścić w robówce (2 ml). c W celu szybkiego rozdrabniania rzydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej (atrz kt. IV.A). 2. Dodać 375 μl TL Buffer, intensywnie worteksować rzez 20 s. 3. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w tem. 37 C rzez 5 min, nastęnie w tem. 55 C w zależności od stonia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h rzy dobrej homogenizacji lub 5 16 h rzy racy na ociętych fragmentach. Worteksować rzez 20 s rzynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 4. Przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). 9
H. OWADY Ilość: 1 30 mg. Materiał: owady w różnych stadiach rozwoju; świeże, mrożone, utrwalone w formalinie lub etanolu. 1. Owady utrwalone w formalinie lub etanolu rzemyć dwukrotnie za omocą 1 ml PBS lub dh 2 O, wirować 60 s rzy 500 x g. W zależności od stonia fragmentacji utrwalonego materiału rzejść do kt. 3 lub rzerowadzić eta homogenizacji (kt. 2). 2. Homogenizacja ociąć owady na jak najmniejsze fragmenty. Ucierać w moździerzu w ciekłym azocie na roszek, nastęnie rzenieść do robówki (2 ml). Można także zastosować kulki ceramiczne (według rocedury oisanej w kt. IV.A). c W celu szybkiego rozdrabniania rzydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej. 3. Dodać 375 μl TL Buffer, intensywnie worteksować rzez 60 s. 4. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w tem. 37 C rzez 5 min, nastęnie w tem. 55 C w zależności od stonia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h rzy dobrej homogenizacji lub 5 16 h rzy racy na ociętych fragmentach. Worteksować rzez 20 s rzynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 5. Przejść do kroku 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). c W rzyadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się rzerowadzenie elucji w 200 μl Elution Buffer, a nastęnie recyitacji DNA według standardowych rocedur. www.blirt.eu 10
Nr kat. EM03, EM04 V. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy amiętać o rozuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odowiedniej ilości buforu do roteinazy (Proteinase Buffer). 3. W razie otrzeby rzygotować roztwór RNase A orzez rozuszczenie liofilizatu w odowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 4. Należy uewnić się czy do TB, TW1 i TW2 Buffers dodany został etanol. Jeśli nie, należy dodać odowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości odane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 5. W rzyadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do tem. 37 C (TB, TW1 i TW2 Buffers) lub 50 60 C (ozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut, a nastęnie schłodzić do tem. okojowej. 6. Nagrzać termoblok, termomikser lub łaźnię wodną do tem. 55 C. 7. Należy amiętać, żeby wszystkie etay izolacji rzerowadzać w tem. okojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 11
VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI KROK 1 Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w robówce (2 ml). + 375 μl GL Buffer + 25 μl Proteinase K 55 C 30-60 min. a. Dodać 375 μl TL Buffer. Worteksować rzez 20 s. c W rzyadku ienienia roztworu należy go zwirować rzez 60 120 s rzy 11 000 x g. b. Dodać 25 μl Proteinase K i wymieszać rzez odwracanie robówki. Umieścić robówkę w termobloku, termomikserze lub łaźni wodnej w tem. 55 C i inkubować do czasu całkowitego otrawienia materiału biologicznego. Po każdych 30 60 min robówkę intensywnie worteksować rzez 20 s. c. Ocjonalnie dodać 4 μl roztworu RNase A. Inkubować 5 min w tem. 37 C. KROK 2 Dodać 400 μl TB Buffer i intensywnie worteksować rzez 10 s. 11-21 000 x g 120 s 11-15 000 x g 60 s Wirować 120 s rzy 11 000 21 000 x g. Przenieść ostrożnie suernatant do minikolumny ze złożem, umieszczonej w robówce odbierającej, uważając, żeby nie obrać resztek nieotrawionej tkanki. c W rzyadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych należy ostrożnie obrać odowiednią ilość suernatantu wrowadzając końcówkę iety o oj. 200 μl omiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć suernatant. Resztki tkanki owinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie robówki. Wirować 60 s rzy 11 000 15 000 x g. c Po wirowaniu w minikolumnie nie owinno być łynu. W rzyadku ozostania niezwirowanego łynu w górnej części minikolumny należy owtórzyć wirowanie rzez 120 s rzy maksymalnej rędkości. Przenieść minikolumnę do nowej robówki odbierającej (2 ml). www.blirt.eu 12
Nr kat. EM03, EM04 KROK 3 Dodać do minikolumny 600 μl buforu łuczącego TW1 Buffer i wirować 30 s rzy 11 000 15 000 x g. Wylać rzesącz z robówki odbierającej i umieścić w niej onownie minikolumnę. Dodać do minikolumny 500 μl TW2 Buffer i wirować 30 s rzy 11 000 15 000 x g. Wyjąć minikolumnę, wylać rzesącz i umieścić onownie minikolumnę w robówce odbierającej. Wirować 60 120 s rzy 15 000 21 000 x g. c Wash Buffer zawiera alkohol, który może owodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie rzed etaem elucji. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z robówki odbierającej i umieścić ją w jałowej robówce 1.5 ml tyu Eendorf. 11-15 000 x g 30 s 15-21 000 x g 60-120 s KROK 4 Nanieść 100 200 μl Elution Buffer centralnie na złoże w minikolumnie. Inkubować minikolumnę z buforem rzez 120 s. Wirować 60 s rzy 11 000 15 000 x g. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA rzechowywać w tem. +4 C lub tem. -20 C do czasu dalszych analiz. 11-15 000 x g 60 s 13
VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Proteinase K (lyohilized) TL Buffer TB Buffer TW1 Buffer Niebezieczeństwo H315, H319, H334, H335 P261, P271, P304+P340, P342+P311 Uwaga H319 P264, P305+P351+P338 Niebezieczeństwo H318, H302, H332, H315, H412 P280, P261, P305+P351+P338, P301+P312 P330, P304+340 P312 Niebezieczeństwo H318, H315, H412 P280, P305+P351+P338 P310 H302 Działa szkodliwie o ołknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje oważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H332 Działa szkodliwie w nastęstwie wdychania. H334 Może owodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w nastęstwie wdychania. H335 Może owodować odrażnienie dróg oddechowych. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, owodując długotrwałe skutki. P261 Unikać wdychania yłu/dymu/gazu/ mgły/ar/rozylonej cieczy. P264 Dokładnie umyć ręce o użyciu. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym omieszczeniu. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P305+P351+P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie łukać wodą rzez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal łukać. P342+P311 W rzyadku wystąienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P304+P340 W rzyadku dostania się do dróg oddechowych: Wyrowadzić lub wynieść oszkodowanego na świeże owietrze i zaewnić warunki do odoczynku w ozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. P312 W rzyadku złego samooczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P301+P312 P330 W rzyadku ołknięcia: W rzyadku złego samooczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. Wyłukać usta. P310 Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. www.blirt.eu 14
15 Nr kat. EM03, EM04
www.blirt.eu