Nr kat. EM29 Wersja zestawu: 1.2018 GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT Zestaw do izolacji DNA z różnych róbek EXTRACTME jest zarejestrowanym znakiem towarowym BLIRT S.A.
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT www.blirt.eu
Nr kat. EM29 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT rzeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji genomowego, mitochondrialnego, bakteryjnego lub wirusowego DNA o wysokiej czystości z tkanek stałych (świeżych, mrożonych, utrwalonych w formalinie lub zatoionych w arafinie), łynów fizjologicznych (moczu, łynu mózgowo-rdzeniowy, łynu z otrzewnej, łynu w jamie ołucnej), świeżej i zamrożonej krwi (ludzkiej i ssaczej), błony śluzowej ludzkiej i zwierzęcej (w tym wymaz z jamy ustnej, nosowej, gardłowej i ochwowej), nasienia, włosów, ogonów gryzoni, owadów, bakterii, drożdzy oraz linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zotymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt rzeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI 1 Warunki rzechowywania Nr katalogowy * EM29-010 EM29-050 EM29-250 GL Buffer (Lysis Buffer) 3.8 ml 19 ml 94 ml TP Proteinase K * (lyohilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 2 Proteinase Buffer 280 μl 1.4 ml 7 ml TP RNase A ** (lyohilized) 1 szt. 1 szt. 5 szt. -20 C 3 RNase Buffer 100 μl 220 μl 1.1 ml TP GB Buffer (conc.) *** (Binding Buffer) GW1 Buffer (conc.) *** (Wash Buffer 1) GW2 Buffer (conc.) *** (Wash Buffer 2) 1.8 ml 10 ml 44 ml TP 2.8 ml 14 ml 69 ml TP 1.8 ml 9 ml 41 ml TP Elution Buffer 2 ml 10 ml 5x 10 ml TP DNA Purification Micro Sin Columns 10 szt. 50 szt. 5x 50 szt. TP Collection Tubes (2 ml) 10 szt. 50 szt. 5x 50 szt. TP 1 TP temeratura okojowa (+15 C do +25 C) 2 R oz t w ó r Proteinase K należy rzechowywać w temeraturze -20 C. 3 RNase A w roztworze rzechowywana w temeraturze +4 C zachowuje całkowitą aktywność rzez kilka dni. Jeśli wymagane jest rzechowywanie RNase A rzed dłuższy okres czasu, zaleca się rozorcjowanie roztworu RNase A i rzechowywanie w temeraturze -20 C. 3
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT * Przed ierwszym użyciem do robówki zawierającej liofilizat Proteinase K należy dodać 1.4 ml Proteinase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 280 μl buforu). ** Przed ierwszym użyciem do robówki zawierające liofilizat RNase A należy dodać 220 μl RNase Buffer (w zestawie na 10 izolacji należy dodać 100 μl buforu). *** Przed ierwszym użyciem do GB, GW1 i GW2 Buffer należy dodać odowiednią ilość 96 100% etanolu ( informacja na etykietach oraz w oniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 50 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM29-010 EM29-050 EM29-250 GB Buffer 1.8 ml 10 ml 44 ml Etanol 96 100% 2.7 ml 15 ml 66 ml Całkowita objętość 4.5 ml 25 ml 110 ml GW1 Buffer 2.8 ml 14 ml 69 ml Etanol 96 100% 2.8 ml 14 ml 69 ml Całkowita objętość 5.6 ml 28 ml 138 ml GW2 Buffer 1.8 ml 9 ml 41 ml Etanol 96 100% 4.2 ml 21 ml 96 ml Całkowita objętość 6 ml 30 ml 137 ml Wszystkie roztwory z zestawu należy rzechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku arowania. Data ważności Data ważności zestawu, rzechowywanego w odowiednich warunkach, odana jest na etykietach roduktu. Po otwarciu zestaw zachowuje stabilność rzez okres 12 miesięcy. www.blirt.eu 4
Nr kat. EM29 III. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY tkanka stała świeża lub mrożona: do 15 mg tkanka utrwalona w formalinie: do 15 mg tkanka w bloczku arafinowym: do 15 mg linie komórkowe: do 10 7 komórek łyny fizjologiczne (mocz, PMR, łyn otrzewnowy): do 5 ml włosy: do 15 mg owady: do 15 mg Bakteryjna lub drożdżowa hodowla łynna, owierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny. wymaz z nosa, gardła, ochwy, krwi, śliny lub nasienia świeża lub zamrożona krew: do 0.15 ml POJEMNOŚĆ ZŁOŻA 6 μg DNA CZAS IZOLACJI ok. 12 minut (o etaie lizy) 10 60 minut na rzygotowanie róbki CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1,7 1,9 5
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT IV. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: do 15 mg. Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie (mięśnie, wątroba, serce, mózg, nerka, szik kostny i inne). Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę odzielić za omocą ęsety i nożyczek lub skalela na jak najmniejsze fragmenty. Przejść do wyboru metod homogenizacji (oniżej) lub rzejść do kt. 1 Protokołu izolacji (sekcja VI). Ciekły azot, suchy lód (LN 2, CO 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 lub CO 2 tkankę umieścić w jałowym, urzednio schłodzonym moździerzu i za omocą schłodzonego istonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, nastęnie rozetrzeć. 2. Otrzymany roszek rzenieść do robówki (2 ml) zawierającej 375 μl GL Buffer i rzejść do kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). c Jeśli o roztarciu owstaje cienka kleista warstwa zamiast roszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 375 μl GL Buffer i orzez staranne ietowanie zebrać całość i rzenieść do robówki (2 ml), nie zaominając o starannym rzemyciu istonu z resztek tkanki. Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w robówce (2 ml), dodać 100 μl GL Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. P o u z y s k a n i u h o m o g e n a t u, o ł u k a ć k o ń c ó w k ę n o ż o w ą z a o m o c ą 275 μl GL Buffer, a nastęnie rzenieść całość do nowej robówki (2 ml). 3. Przejść do kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). www.blirt.eu 6
Nr kat. EM29 Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych (olecamy robówki z kulkami Bead Beating Tubes; nr kat. HPLM100, HPLM1000a) 1. Do robówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 150 μl GL Buffer i rzenieść ociętą tkankę. Nastęnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać rzez 30 s rzy 3000 4000 x g. Procedurę owtórzyć w razie konieczności. c W rzyadku braku możliwości oceny stonia rozdrobnienia tkanki sowodowanej ienieniem buforu robówkę zwirować rzez 120 s rzy 11 000 x g. c W rzyadku braku homogenizatora róbkę można rozdrobnić, korzystając z odowiedniej rzystawki do worteksu; min. 5 min rzy maksymalnych obrotach. 2. Dodać 225 μl GL Buffer, wymieszać rzez ietowanie. 3. Przejść do kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). B. TKANKA UTRWALONA W FORMALINIE Ilość: do 15 mg. Materiał: tkanki zwierzęce rzechowywane w 4% formalinie w warunkach chłodniczych rzez minimum 60 minut. 1. Usunąć formalinę orzez dwu- lub trzykrotne rzełukanie tkanki roztworem PBS lub H 2 O. c Formalina jest drażniąca. Nie zaleca się srawdzania rawidłowości odłukania formaliny rzez wąchanie oarów z robówki. 2. Dalej ostęować jak w rzyadku tkanek świeżych (sekcja IV). 7
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT C. TKANKA ZATOPIONA W PARAFINIE Ilość: do 15 mg. Materiał: tkanki zwierzęce zatoione w bloczkach arafinowych według standardowej rocedury histologicznej. 1. Z bloczka arafinowego wyciąć fragment o masie max 30 mg i umieścić w robówce (2 ml). 2. Dodać 1 ml ksylenu. Worteksować rzez 30 s. c Ksylen jest toksyczny, drażniący i bardzo alny. Pracować od włączonym wyciągiem. 3. Wirować 5 min rzy 15 000 x g. Usunąć suernatant rzez ietowanie. 4. Powtórzyć etay 2 3. 5. Dodać 1 ml 96-100% etanolu. Wymieszać rzez ietowanie lub worteksowanie 15 s. 6. Wirować 120 s rzy 15 000 x g. Usunąć suernatant rzez ietowanie. 7. Powtórzyć etay 5 6. 8. Suszyć osad w tem. 50 C w otwartej robówce rzez 5 20 min celem ozbycia się etanolu. 9. Dodać 375 μl GL Buffer, wymieszać rzez worteksowanie rzez 20 s. 10. Przejść do kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). D. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: do 10 7 komórek. Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. 1. Zamrożone komórki rozmrozić w tem. 37 C lub TP. Komórki w ożywce lub PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub robówce (2 ml) rzez 5 min rzy 3000 x g. Odrzucić suernatant. W rzyadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie rzemyć rzy omocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 375 μl GL Buffer. W y mi e sz a ć r ze z i n t e n s y w n e wo r t e k s ow a ni e 3 0 s, a nastęnie ietowanie. c Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i ołączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 7 ) mogą wystąić trudności z rozuszczeniem osadu w GL Buffer. Należy wtedy rozietować ostrożnie osad z wykorzystaniem iety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do iet. 3. Całość rzenieść do nowej robówki (2 ml). 4. Przejść do kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). www.blirt.eu 8
Nr kat. EM29 E. BAKTERIA Ilość: do 10 8 komórek Materiał: bakteryjna hodowla łynna, owierzchniowa bądź mrożony osad bakteryjny. Izolacja DNA z hodowli łynnej (0.2 3 ml) Przed obraniem odowiedniej objętości hodowli łynnej, zawiesinę komórek należy dokładnie wymieszać. Do 1.5 ml robówki tyu Eendorf rzenieść żądaną objętość hodowli bakteryjnej (maksymalnie 1.5 ml) i wirować rzy 3000 4000 x g. Zdekantować suernatant. Jeśli istnieje otrzeba izolacji z większej niż 1.5 ml objętości hodowli, do owstałego osadu dodać kolejne 1,5 ml hodowli i owtórzyć wirowanie. Osad zawiesić w 375 μl GL Buffer. Kontynuować izolację od kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). Izolacja DNA z zamrożonego osadu komórkowego Zamrożony osad należy bezzwłocznie zawiesić w 300 μl GL Buffer. Nie należy dorowadzać do rozmrożenia osadu. Kontynuować izolację od kt. 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Izolacja DNA z hodowli owierzchniowej Do robówki 1.5 ml tyu Eendorf rzenieść 300 μl GL Buffer. Ezą obrać obfitą liczbę komórek z odłoża na łytce Petriego i zawiesić w buforze. Kontynuować izolację od kt. 2 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Izolacja z bakterii Gram-dodatnich Przed rzystąieniem do izolacji DNA z bakterii Gram-dodatnich róbkę należy oddać działaniu odowiedniego enzymu. Do izolacji DNA z bakterii z rodzaju Stahylococcus zaleca się stosowanie lizostafyny, a w rzyadku bakterii z rodzaju Enterococcus lizozymu. 9
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT Stahylococcus: 1. Odwirować 1.5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Suernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** ( dokładnie rozietować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 30 μl *** roztworu lizostafyny 400 U/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać orzez ietowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować 20 60 minut *** w 37 C. 5. Dodać 300 μl GL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać rzez worteksowanie. 6. Inkubować w 55 C rzez 10 min. 7. Kontynuować izolację od kt. 5 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). Enterococcus: 1. Odwirować 1.5 ml hodowli bakteryjnej *. 2. Suernatant zdekantować, a osad bakteryjny zawiesić w 200 μl TE ** ( dokładnie rozietować). 3. Do zawiesiny komórek dodać 40 μl roztworu lizozymu 100 mg/ml i 4 μl RNase A, dokładnie wymieszać orzez ietowanie lub worteksowanie. 4. Inkubować 40 60 minut w 37 C. 5. Dodać 300 μl GL Buffer i 17 μl Proteinase K, dokładnie wymieszać. 6. Inkubować w 55 C rzez 10 min. 7. Kontynuować izolację od kt. 5 Protokołu izolacji DNA (sekcja VI). * W rzyadku gęstych hodowli, izolację należy rowadzić z mniejszych objętości hodowli bakteryjnej. ** Bufor TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, H 8.0. *** W rzyadku gronkowców koagulazo-ujemnych należy dodać 50 μl rearatu lizostafyny i inkubować 1 godzinę w tem. 37 C. www.blirt.eu 10
Nr kat. EM29 F. DROŻDŻE Ilość: do 10 7 komórek. Materiał: drożdżowa hodowla łynna, owierzchniowa bądź mrożony osad drożdżowy. 1. Zwirować 1.5 ml hodowli drożdżowej rzy 3000 4000 x g rzez 5 min. 2. Suernatant zdekantować, a osad komórkowy dokładnie zawiesić w 200 μl YS Buffer (EM10-YS Sheroblast Buffer nie wchodzi w skład zestawu). 3. Dodać 50 200 U litykazy i wymieszaj orzez worteksowanie. 4. Inkubować w 30 C rzez co najmniej 30 minut, mieszając od czasu do czasu orzez odwracanie robówki. 5. Po inkubacji wiruj rzez 10 minut rzy 1000 x g. 6. Ostrożnie usunąć suernatant ietą. Zwrócić szczególną uwagę, aby nie naruszyć osadu sferolastów. 7. Kontynuować izolację od kroku 1 rotokołu izolacji (sekcja VI). G. PŁYNY FIZJOLOGICZNE Ilość: do 5 ml łynu. Materiał: mocz, łyn mózgowo-rdzeniowy, łyn z jamy otrzewnej, ołucnej, lwocina. c Płyny fizjologiczne są materiałem cennym diagnostycznie, a jednocześnie stanowią duże zagrożenie ze względu na otencjalną zawartość atogenów i/lub komórek nowotworowych. Należy zachować szczególną ostrożność odczas racy z tym materiałem. 1. Mocz oraz inne łyny: w zależności od objętości, zwirować w odowiedniej robówce/falkonie rzez 5 min rzy 500 x g. Suernatant odrzucić. 2. Plwocina: rzed wirowaniem należy dodać odowiednią ilość środka mukolitycznego (bromheksyna, acetylocysteina). Wirować 5 min rzy 3000 x g. Suernatant odrzucić. 3. Osad komórkowy rzełukać za omocą 1 ml PBS lub soli fizjologicznej, wirować 60 s rzy 3000 x g. 4. Dodać 375 μl TL Buffer. Wymieszać rzez intensywne worteksowanie 30 s. 5. Przejść do kt. 2 Protokołu izolacji (sekcja VI). 11
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT H. KREW Ilość: do 0.15 ml. Materiał: świeża lub mrożona krew. 1. Przenieść do 150 μl krwi do sterylnej robówki Eendorf 1.5 2 ml i dodać taką samą objętość buforu RBC Lysis Bufor (EM05-RBC nie wchodzi w skład zestawu). Na rzykład dodaj 100 μl buforu do lizy RBC do 100 μl krwi. Gdy objętość róbki krwi jest mniejsza niż 100 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztworu PBS (nie wchodzi w skład zestawu) do całkowitej objętości 100 μl, a nastęnie dodać 100 μl buforu RBC Lysis Buffer. 2. Dokładnie wymieszać rzez odwracanie robówki, aż owstanie klarowny czerwony roztwór. 3. Wirować 4 minuty rzy 8600 x g. c Nie zaleca się zwiększania rędkości wirowania, gdyż może to utrudnić óźniejsze zawieszanie owstałego osadu białych krwinek w buforze lizującym. 4. Ostrożnie usunąć ietą suernatant znad osadu białych krwinek. 5. Dokładnie zawiesić osad komórek w 375 μl GL Buffer i worteksować rzez 20 sekund. 6. Dodać 10 μl Proteinase K i wymieszać orzez kilkukrotnie odwracanie robówki lub worteksowanie. 7. Inkubować w 55 C rzez 10 min. 8. Kontynuować izolację od kroku 5 rotokołu izolacji (sekcja VI). I. NASIENIE Ilość: do 100 μl. Materiał: nasienie. 1. Przenieść 100 μl nasienia do sterylnej robówki Eendorf 1.5 2 ml. c Gdy objętość róbki jest mniejsza niż 100 μl, należy dodać Elution Buffer lub roztwór PBS (nie wchodzi w skład zestawu) do całkowitej objętości 100 μl. Należy zauważyć, że wydajność izolacji DNA będzie wtedy niższa. 2. Dodać 375 μl GL Buffer, 10 μl Proteinase K i 20 μl 1M DTT, worteksować rzez 3 s. 3. Inkubować w 55 C rzez 30 min, mieszając od czasu do czasu orzez odwracanie robówki. 4. Kontynuować izolację od kroku 5 rotokołu izolacji (sekcja VI). www.blirt.eu 12
Nr kat. EM29 J. WYMAZY Materiał: wymazy (m.in. z oliczka, nosa, gardła, ochwy, krwi, śliny). 1. Końcówkę ałeczki wymazowej z obranym materiałem biologicznym umieścić w 1.5 ml robówce tyu Eendorf, a nastęnie odciąć wystającą część ałeczki tak, aby możliwe było swobodne zamknięcie robówki. 2. Dodać 375 μl GL Buffer oraz 10 μl Proteinase K, worteksować 3 s. 3. Inkubować rzez 30 min w temeraturze 55 C. Podczas inkubacji kilka razy mieszać róbkę orzez odwracanie robówki. 4. Dokładnie wycisnąć o ściankę robówki końcówkę ałeczki wymazowej tak, aby odzyskać jak największą ilość lizatu. Odrzucić ałeczkę wymazową. 5. Kontynuować izolację od kroku 5 rotokołu izolacji (sekcja VI). K. WŁOSY Ilość: do 15 mg włosów (ok. 80 sztuk). Materiał: włosy, najleiej z cebulkami lub same cebulki. Tylko cebulki zawierają żywe komórki, natomiast w ozostałej części włosa znajdują się resztki komórek ze zdegradowanym gdna oraz mtdna. Stąd też alikacje, takie jak PCR lub qpcr, owinny uwzględniać rodukty o wielkościach 200 z. 1. Cebulki odciąć od włosów i umieścić w robówce (2 ml). Jeśli włosy ozbawione są cebulek, ociąć je na fragmenty o długości maksymalnie 3 mm. 2. Dodać 375 μl GL Buffer. Dodać 40 μl 1M DTT oraz 25 μl Proteinase K. Wymieszać rzez worteksowanie 30 s. c Dodatek DTT jest ocjonalny. Większość rodzajów włosów owinna ulec strawieniu bez dodatku tego odczynnika, jednakże niektóre rodzaje włosów (n. kręcone) zawierają zbyt dużą ilość mostków dwusiarczkowych, uniemożliwiających całkowite otrawienie samą Proteinazą K. 3. Inkubować minimum 6 h (lub rzez noc) w tem. 55 C. Należy okresowo worteksować rzez 60 120 s. Polecany jest termomikser. 4. Po całkowitym otrawieniu rzejść do kt. 5 Protokołu izolacji (sekcja VI). 13
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT L. OWADY Ilość: do 15 mg. Materiał: owady w różnych stadiach rozwoju; świeże, mrożone, utrwalone w formalinie lub etanolu. 1. Owady utrwalone w formalinie lub etanolu rzemyć dwukrotnie za omocą 1 ml PBS lub dh 2 O, wirować 60 s rzy 500 x g. W zależności od stonia fragmentacji utrwalonego materiału rzejść do kt. 3 lub rzerowadzić eta homogenizacji (kt. 2). 2. Homogenizacja ociąć owady na jak najmniejsze fragmenty. Ucierać w moździerzu w ciekłym azocie na roszek, nastęnie rzenieść do robówki (2 ml). Można także zastosować kulki ceramiczne (według rocedury oisanej w kt. IV). c W celu szybkiego rozdrabniania rzydatne są wskazówki dotyczące homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej. 3. Dodać 375 μl GL Buffer, intensywnie worteksować rzez 60 s. 4. Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w tem. 37 C rzez 5 min, nastęnie w tem. 55 C w zależności od stonia rozdrobnienia tkanki: 2 3 h rzy dobrej homogenizacji lub 5 16 h rzy racy na ociętych fragmentach. Worteksować rzez 20 s rzynajmniej co 1 2 h. Polecany jest termomikser. 5. Przejść do kt. 5 Protokołu izolacji (sekcja VI). c W rzyadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się rzerowadzenie elucji w 200 μl Elution Buffer, a nastęnie recyitacji DNA według standardowych rocedur. www.blirt.eu 14
Nr kat. EM29 V. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy amiętać o rozuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odowiedniej ilości buforu do roteinazy (Proteinase Buffer). 3. W razie otrzeby rzygotować roztwór RNase A orzez rozuszczenie liofilizatu w odowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer). 4. Należy uewnić się czy do GB, GW1 i GW2 Buffers dodany został etanol. Jeśli nie, należy dodać odowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości odane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 5. W rzyadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do tem. 37 C (GB, GW1 i GW2 Buffers) lub 50 60 C (ozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut, a nastęnie schłodzić do tem. okojowej. 6. Nagrzać termoblok, termomikser lub łaźnię wodną do tem. 55 C. 7. Należy amiętać, żeby wszystkie etay izolacji rzerowadzać w tem. okojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 15
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT VI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w robówce (2 ml). Dodać 375 μl GL Buffer. Worteksować rzez 10 s. c W rzyadku ienienia roztworu należy go zwirować rzez 60 120 s rzy 11 000 x g. 2. Dodać 25 μl Proteinase K i wymieszać rzez odwracanie robówki. 3. Umieścić robówkę w termobloku, termomikserze lub łaźni wodnej w tem. 55 C i inkubować do czasu całkowitego otrawienia materiału biologicznego. Po każdych 30 60 min robówkę intensywnie worteksować rzez 20 s. 4. Ocjonalnie dodać 4 μl roztworu RNase A. Inkubować 5 min w tem. 37 C. 5. Dodać 400 μl GB Buffer i wymieszać rzez worteksowanie 10 s. 6. Wirować 120 s rzy 11 000 21 000 x g. 7. Przenieść ostrożnie suernatant do DNA Purification Micro Sin Column, umieszczonej w robówce odbierającej, uważając, żeby nie zaciągnąć resztek nieotrawionej tkanki. c W rzyadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych należy ostrożnie obrać odowiednią ilość suernatantu wrowadzając końcówkę iety o oj. 200 μl omiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć suernatant. Resztki tkanki owinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie robówki. 8. Wirować 60 s rzy 11 000 15 000 x g. c Po wirowaniu w minikolumnie nie owinno być łynu. W rzyadku ozostania niezwirowanego łynu w górnej części minikolumny należy owtórzyć wirowanie rzez 120 s rzy maksymalnej rędkości. www.blirt.eu 16
Nr kat. EM29 9. Przenieść DNA Purification Micro Sin Column do nowej robówki odbierającej (2 ml). 10. Dodać 500 μl buforu łuczącego GW1 Buffer i wirować 30 s rzy 11 000 15 000 x g. Wylać rzesącz z robówki odbierającej i umieścić w niej onownie DNA Purification Micro Sin Column. 11. Dodać 500 μl GW2 Buffer i wirować 30 s rzy 11 000 15 000 x g. Wylać rzesącz z robówki odbierającej i umieścić w niej onownie DNA Purification Micro Sin Column 12. Wirować 60 120 s rzy 15 000 21 000 x g. c Bufor łuczący zawiera alkohol, który może owodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie rzed etaem elucji. 13. Ostrożnie wyjąć suchą DNA Purification Micro Sin Column z robówki odbierającej i umieścić ją w jałowej robówce 1.5 ml tyu Eendorf. 14. Nanieść 5 μl Elution Buffer centralnie na złoże w DNA Purification Micro Sin Column. 15. Inkubować DNA Purification Micro Sin Column z buforem rzez 120 s. 16. Wirować 60 s rzy 11 000 15 000 x g. 17. DNA Purification Micro Sin Column usunąć, a wyizolowane DNA rzechowywać w tem. +4 C lub tem. -20 C w zależności od dalszych analiz. 17
GENOMIC DNA MICRO SPIN KIT VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM Proteinase K (lyohilized) Niebezieczeństwo H315, H319, H334, H335 P261, P271, P304+P340, P342+P311 GL Buffer Uwaga H319 P264, P305+P351+P338 GB Buffer GW1 Buffer Niebezieczeństwo H318, H302, H332, H315, H412 P280, P261, P305+P351+P338, P301+P312 P330, P304+P340 P312 Niebezieczeństwo H318, H315, H412 P280, P305+P351+P338 P310 H302 Działa szkodliwie o ołknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje oważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H332 Działa szkodliwie w nastęstwie wdychania. H334 Może owodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w nastęstwie wdychania. H335 Może owodować odrażnienie dróg oddechowych. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, owodując długotrwałe skutki. P261 Unikać wdychania yłu/ dymu/gazu/mgły/ar/rozylonej cieczy. P264 Dokładnie umyć ręce o użyciu. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym omieszczeniu. P280 Stosować rękawice ochronne / odzież ochronną / ochronę oczu / ochronę twarzy. P305+P351+P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie łukać wodą rzez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal łukać. P342+P311 W rzyadku wystąienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. www.blirt.eu 18
Nr kat. EM29 P304+P340 W rzyadku dostania się do dróg oddechowych: Wyrowadzić lub wynieść oszkodowanego na świeże owietrze i zaewnić warunki do odoczynku w ozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. P312 W rzyadku złego samooczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. P301+P312 P330 W rzyadku ołknięcia: W rzyadku złego samooczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. Wyłukać usta. P310 Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. 19
www.blirt.eu