Enzymologia I Kinetyka - program Gepasi Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Zakład Regulacji Metabolizmu
I zasada + II zasada termodynamiki zmiana entalpii i entropii może zostać wyrażona ilościowo jako zmiana energii Gibbsa G G jest ilościowym pomiarem netto "siły napędowej procesów termodynamicznych W procesach w których następuje spadek energii Gibbsa ( G<) zachodzi wzrost netto entropi układu i otoczenia - proces zachodzi spontanicznie G = H-T S
zmiana energii Gibbsa G - G A B + G A - G + G G = B.1K.1K.1K K 1K 1K 1K Iloraz masowy [B]/[A]
Reakcja wzajemnej przemiany A i B w C i D przebiega w układzie zamkniętym: Stała równowagi reakcji K aa + bb cc + dd Stała równowagi reakcji K K c eq [ C] [ D] a eq [ A] [ B] d eq b eq gdzie stężenia reagentów przyjmują wartości równowagowe (eq).
Iloraz masowy ( ) w stanie odległym od stanu równowagi c obs [ C] [ D] a obs [ A] [ B] d obs b obs gdzie stężenia reagentów odpowiadają wartościom obserwowanym (obs) G = 2,3 RT log 1 /K Zmianę energii Gibbsa, kiedy a moli A i b moli B ulega przemianie w c moli C i d moli D, przy ilorazie masowym różnym od stałej równowagi reakcji K gdzie R - stała gazowa a T - temperatura w skali bezwzględnej
zmiana energii Gibbsa G - G A B + G A - G + G G = B.1K.1K.1K K 1K 1K 1K Iloraz masowy [B]/[A]
Wartość G jest funkcją oddalenia reakcji od stanu równowagi. W 25 o C wartość G dla reakcji oddalonej od stanu równowagi o jeden rząd wielkości (1 razy) będzie wynosiła zatem 5.7 kj mol -1. Gdy iloraz masowy G<, a jeśli >K to G>. jest mniejszy niż stała równowagi K to
Gdy obserwowany iloraz masowy ( ) równa się jedności, funkcja G określana jest jako G o czyli standardowa zmiana energii Gibbsa (wzór *). Podstawienie tej zależności do ogólnego wzoru na zmianę energii Gibbsa ( G) umożliwia napisanie równania w którym można pominąć wartość stałej równowagi (wzór **). Jest to najczęściej spotykana postać tego równania. * G = -2,3 RT log 1 K ** G = G + 2,3 RT log 1
warunkiem zajścia reakcji jest utrzymanie układu w stanie oddalonym od stanu równowagi warunkiem zachodzenia reakcji w komórce jest utrzymywanie stężeń reagentów w stanie oddalonym od stanu równowagi (ds komórki ) + (ds otoczenia )
A. Kinetyka reakcji niekatalizowanej Reakcje odwracalne i nieodwracalne
Reakcja nieodwracalna 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 [S]t [P]t
Reakcja odwracalna k1=k2=1 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 [S]t [P]t
Reakcja odwracalna k1=1 k2=2 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 [S]t [P]t
Reakcja odwracalna k1=2 k2=1 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 [S]t [P]t
S + S -> P 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 [S]t [P]t
S + S -> P 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 [S]t [P]t
.7 Reakcja niekatalizowana V reakcji zmienna, można wyznaczyć V 1/2.6.5 V 1 V 2 V 1/2.4.3 V 3.2. 1. 2. 3. 4. czas [min]
B. Model kinetyki reakcji enzymatycznej wg. Michaelisa-Menten
wg Michaelisa - Menten 1 8 6 4 2 5 1 15 2 25 [E]t [S]t [ES]t [P]t
k 1 k 2 E S ES E P k 1 czas [jednostki umowne]
k 1 k 2 E S ES E P k 1 Założenia teorii Michealisa-Menten Definicja stanu stacjonarnego d [ES] dt E = const v d [S] dt k 2 [ES] V - szybkość reakcji wyznaczona w stanie stacjonarnym ekstrapolowana do czasu t i odniesiona do [S]
V początkowa reakcji enzymatycznej -,6 -,12 -,18 -,24 -,3, 1, 2, 3, 4, Czas [min]
k 1 k 2 E S ES E P k 1 Założenia teorii Michealisa-Menten Równanie M-M i stałe kinetyczne k +1 [E][S ]= (k +2 +k -1 )[ES] K k + k k m + 1-1 + 2
V początkowa reakcji enzymatycznej -,6 -,12 -,18 -,24 -,3, 1, 2, 3, 4, Czas [min]
Model M-M, różne początkowe stężenia substratu 25 1.9 2.8.7 15.6.5 1.4.3 5.2.1 5 1 15 2 25 [P]t Krzywe progresji 5 1 15 2 25 J(R2) Zmiana szybkości w czasie
V = k +2 [ES] [E]= [E cał ]-[ES] V max = k +2 [E cał ] V k [E ] 2 cal [S] [S] + K m V V [S] max [S] + K m
V = k +2 [ES] [E]= [E cał ]-[ES] V max = k +2 [E cał ] k 1 k 2 E S ES E P k 1 V k [E ] 2 cal Założenia teorii Michealisa-Menten Równanie M-M i stałe kinetyczne [S] [S] + K m k +1 [E][S ]= (k +2 +k -1 )[ES] V m V [S] max [S] + K k K k + k - 1 + 2 + 1 m
V = k +2 [ES] [E]= [E cał ]-[ES] V max = k +2 [E cał ] V k [E ] 2 cal [S] [S] + K m V V [S] max [S] + K m
V = k +2 [ES] [E]= [E cał ]-[ES] V max = k +2 [E cał ] V k [E ] 2 cal [S] [S] + K m V V [S] max [S] + K m
.3 S 4 V 4 S 5 V 5 S 3 V 3.2 S 2 V 2 S 1 V 1.1...2.4.6.8.1 S [mm]
Odczytywanie wartości S i V z symulacji w programie Gepasi Stężenie początkowe substratu Odpowiadajaca szybkość początkowa
V max.3.2 V 1 2 V V max.1 V [S] [S] + K max m...2.4.6.8.1 [S] = K m [S] [mm]
E ES E + P Wykres Lineweavera-Burke'a tg K m V max -1/K m 1/V max 1 1 Km 1 V V max Vmax S 1/[S] pocz. [1/mM]
C. Hamowanie reakcji enzymatycznych Współzawodnicze
Model hamowania współzawodniczego - inhibitor nieobecny 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 1.5 -.5-1 1 2 3 4 5 6 7 1.5 -.5-1 1 2 3 4 5 6 7 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7
Model hamowania współzawodniczego - inhibitor obecny 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 6 7 5 49.9 49.8 49.7 49.6 49.5 49.4 49.3 49.2 1 2 3 4 5 6 7.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7 5 48 46 44 42 4 38 36 34 32 3 1 2 3 4 5 6 7 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7.4.35.3.25.2.15.1.5 1 2 3 4 5 6 7
Hamowania współzawodnicze - stałe początkowe stężenie substratu i inhibitora 1 [ES] 1 [EI].9.8.7.5.6.5.4.3.2 -.5.1 1 2 3 4 5 6 7-1 1 2 3 4 5 6 7.4.8.35.7.3.6.25.5.2.4.15.3.1.2.5.1 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu, stałe stężenie inhibitora 6 5 4 3 2 1 5 49.9 49.8 49.7 49.6 49.5 49.4 49.3 49.2.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
5 5 45 4 A 45 4 B 35 35 3 3 25 25 2 2 15 15 1 1 5 5 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 5 45 C 4 A - bez inhibitora B- z inhibitorem C- inhibitor + wzrastające początkowe stężenie substratu, 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu, stałe stężenie inhibitora Strzałki wskazują wzrastające stężenie substratu.9.8.8.7.7.6.6.5.5.4.4.3.3.2.2.1.1 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu, stałe stężenie inhibitora Stała szybkości tworzenia kompleksu EI zwiększona do 5 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 5 49.9 49.8 49.7 49.6 49.5 49.4 49.3 49.2 49.1 49 1 2 3 4 5 6 7 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7.12.1.8.6.4.2 1 2 3 4 5 6 7
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu, stałe stężenie inhibitora Stała szybkości tworzenia kompleksu EI zwiększona do 5 wybrane rysunki 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7.12.1.8.6.4.2 1 2 3 4 5 6 7 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7
EI E ES Inhibicja współzawodnicza E + P + Inhibitor Kontrola K EI i E+I -1/K m * 1 1 K m [I] 1 V Vmax Vmax K 1 [S] I 1/V max -1/K m 1/[S] pocz. [1/mM]
C. Hamowanie reakcji enzymatycznych Niewspółzawodnicze
Hamowania niewspółzawodnicze 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 45 4 [I] = 35 [I] = 5 3 25 2 15 1 5 5 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1.6 1.4 1.2 1 [I] = 5 [S] i od 5 do 5.8.6.4.2 1 2 3 4 5 6 7 Wykres w innej skali niż pozostałe
1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 Hamowania niewspółzawodnicze [I] = 5 [S] i od 5 do 5 1 2 3 4 5 6 7.2.18.16.14.12.1.8.6.4.2 1 2 3 4 5 6 7.25.2.15.1.5 1 2 3 4 5 6 7
Inhibicja niewspółzawodnicza E + P Kontrola E ES + Inhibitor EI ESI -1/V max * K EI i E+I EIS ES I -1/K m 1/V max 1 1 1 [I] Km 1 V V max KI Vmax [S] 1/[S] pocz. [1/mM]