PL/EP 1606318 T3 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1606318 (13) T3 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 26.03.2004 047232.8 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 0.08.2009 Europejski Biuletyn Patentowy 2009/32 EP 1606318 B1 (1) Int. Cl. C07K14/47 C07K14/2 C07K14/4 C07K14/70 C07K14/71 C07K14/47 C07K14/2 C07K19/00 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (4) Tytuł wynalazku: Ulepszone białka fuzyjne FC (30) Pierwszeństwo: EP20030006949 26.03.2003 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 21.12.200 Europejski Biuletyn Patentowy 200/1 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 29.01.20 Wiadomości Urzędu Patentowego 01/20 (73) Uprawniony z patentu: Apogenix GmbH, Heidelberg, DE Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts, Heidelberg, DE (72) Twórca (y) wynalazku: WALCZAK Henning, Heidelberg, DE (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o rzecz. pat. Żebrowska-Kucharzyk Agnieszka 02-770 Warszawa 130 skr. pocz. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis wynalazku [0001] Przedmiotem wynalazku są białka fuzyjne zawierające co najmniej domenę biologicznie aktywnego polipeptydu i drugą domenę wybraną z domeny stałej immunoglobuliny. 1 20 2 30 [0002] Białka fuzyjne zawierające dimer łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego immunoglobuliny albo tetramer łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego immunoglobuliny, w którym sekwencja aminokwasowa partnera wiążącego ligand, którym jest receptor, nośnik białkowy, hormon, czynnik wzrostowy lub enzym, zastępuje region zmienny co najmniej jednego łańcucha immunoglobuliny, są opisane w opisie EP-A-0 26 42. W opisie WO 9/2773 opisane jest białko fuzyjne zawierające dodatkową domenę komórkową receptora śmierci CD9 (APO-1; Fas) połączoną z fragmentem Fc immunoglobuliny. Ucięte na N-końcu pochodne cząsteczki APO-1 ewentualnie połączone z fragmentami Fc immunoglobulin są ujawnione w EP-A-0 96 637. Białko fuzyjne składające się z rozpuszczalnego IL-1Rα i fragmentów Fc jest ujawnione w WO 98/36768. Białko fuzyjne składające się z mutanta antagonisty IL-1 i fragmentu Fc IgG2a ujawnili Kim i in. (J. Immunol. 160 (1998), 742-748). [0003] Chociaż wykazano, że białka fuzyjne jak opisano powyżej mają wysoką aktywność biologiczną in vitro i in vivo, to pojawiają się problemy wynikające z potencjału immunogennego takich cząsteczek, gdyż pomiędzy dwiema domenami białek o różnym pochodzeniu istnieje region połączenia stanowiący sekwencję aminokwasów nie występującą w przyrodzie, która może wywoływać niepożądaną odpowiedź immunologiczną w organizmie, któremu podaje się białko fuzyjne. [0004] Opis WO 02/06614 opisuje sztuczne białka fuzyjne posiadające zmniejszoną w porównaniu z niezmodyfikowaną macierzystą cząsteczką immunogenność wówczas, gdy wystawia się je na działanie gatunku in vivo. Te białka zasadniczo składają się z cząsteczki immunoglobuliny, lub jej fragmentu, kowalencyjnie połączonej przez jej C-koniec z N-końcem cząsteczki aktywnej biologicznie niebędącej immunoglobuliną, korzystnie polipeptydu lub białka lub jego aktywnego biologicznie fragmentu. Cząsteczki mają sekwencje aminokwasowe, które w jednej lub w wielu pozycjach reszt aminokwasów są zmienione, ale w porównaniu z cząsteczkami niezmienionymi mają w zasadzie taką samą aktywność biologiczną. Zmiany są dokonywane w regionach cząsteczek, które są zidentyfikowane jako epitopy limfocytów T, które przyczyniają się do odczynu immunologicznego u żywego gospodarza. Wadą tej procedury jest jednak to, że nie wszystkie epitopy, zwłaszcza nie epitopy limfocytów B, mogą zostać w sposób rzetelny wyeliminowane. Ponadto, wprowadzenie sekwencji aminokwasowych niewystępujących w przyrodzie może prowadzić do wytwarzania neo-epitopów. [000] Tak więc, celem niniejszego wynalazku było dostarczenie białka fuzyjnego mającego co najmniej dwie domeny różnego pochodzenia o zredukowanym potencjale immunogennym. [0006] Opisane jest białko fuzyjne zawierające 3 (i) co najmniej jedną pierwszą domenę zawierającą polipeptyd aktywny biologicznie i (ii) heterologiczną drugą domenę zawierającą co najmniej część domeny stałej immunoglobuliny, w którym w regionie fuzji występuje nakładanie się (ang. overlap) o długości co najmniej jednego aminokwasu pomiędzy pierwszą domeną i drugą domeną. 1
[0007] Białko fuzyjne może stanowić białko monomeryczne lub białko multimeryczne, np. białko dimeryczne lub tetrameryczne, które może zostać wytworzone przez multimeryzację przez domenę stałą immunoglobuliny. 1 [0008] Konstruowanie białka fuzyjnego obejmuje i) dobór co najmniej jednej pierwszej domeny oraz drugiej domeny, która jest heterologiczna do pierwszej domeny, i ii) dobór co najmniej jednego aminokwasu końcowego, który jest wspólny dla pierwszej domeny i drugiej, np. ostatni aminokwas (aminokwasy) pierwszej domeny dobiera się tak, żeby był tożsamy z pierwszym aminokwasem (aminokwasami) drugiej domeny. Korzystnie, obszar nakładania się ma długość jednego, dwóch lub trzech aminokwasów. Otrzymuje się zatem białko fuzyjne, które jest pozbawione niewystępującego naturalnie w przyrodzie przejścia między ostatnim aminokwasem jednej domeny i pierwszym aminokwasem innej domeny. [0009] Pierwsza domena (domeny) jest umiejscowiona na N-końcu białka fuzyjnego, podczas gdy Druga domena jest umiejscowiona na C-końcu. Tak więc, co najmniej jeden aminokwas na końcu karboksylowym pierwszej domeny stanowi obszar nakładania się z co najmniej jednym aminokwasem na końcu aminowym drugiej domeny. [00] Druga domena może być umiejscowiona na N-końcu białka fuzyjnego, a domena (domeny) pierwsza jest umiejscowiona na C-końcu. Tak więc, co najmniej jeden aminokwas na końcu karboksylowym drugiej domeny stanowi obszar nakładania się z co najmniej jednym aminokwasem na końcu aminowym pierwszej domeny. 20 2 30 3 40 [0011] W przypadkach, gdy białko fuzyjne zawiera więcej niż jedną, np. dwie lub trzy, pierwsze domeny, te domeny są korzystnie umiejscowione po kolei na N-końcu lub C-końcu białka fuzyjnego, zaś druga domena odpowiednio na C-końcu lub na N-końcu. Należy zauważyć, że pierwsze domeny w takich białkach mogą być takie same lub różne. Przejścia między osobnymi domenami pierwszymi korzystnie są skonstruowane tak, że istnieje także zakładka o długości co najmniej jednego aminokwasu (a zatem nie niewystępujące w przyrodzie przejście między ostatnim aminokwasem jednej domeny i pierwszym aminokwasem innej domeny) między osobnymi pierwszymi domenami. Białka fuzyjne zawierające wiele pierwszych domen są ujawnione w WO 00/18932. [0012] Pierwsza domena białka fuzyjnego zawiera aktywny biologicznie polipeptyd, tj. polipeptyd, który jest zdolny do oddziaływania, np. wiązania się, z partnerem wiązania, np. innym polipeptydem, w jego naturalnym otoczeniu w komórce lub organizmie, i który korzystnie jest zdolny do wykazywania aktywności farmakologicznej. Pierwszą domenę korzystnie stanowi polipeptyd nie będący immunoglobuliną. Pierwszą domeną może być występujący w przyrodzie polipeptyd lub jego wariant mający pożądaną, np. zwiększoną lub zmniejszoną, aktywność biologiczną, albo fragment występującego w przyrodzie polipeptydu lub jego wariantu. Pierwszą domenę korzystnie wybiera się spośród wiążącej ligand domeny receptora i wiążącej receptor domeny ligandu. Określenia "ligand" i "receptor" są rozumiane w tym kontekście tak, że ligandy są zdefiniowane jako białka, o których wiadomo, że działają wiążąc się specyficznie do cząsteczek receptorów. Określenie "receptor" obejmuje rozpuszczalne lub zakotwiczone w błonie białka receptorowe mające hydrofobowy region transbłonowy lub kotwicę fosfolipidową. Dodatkowo, określenie "receptor" obejmuje białka nośnikowe, jak również hormony, białka adhezyjne, lektyny, czynniki wzrostowe, enzymy, itp. 2
[0013] Pierwszą domenę stanowi domena receptora wiążącego ligand zawierająca pozakomórkową domenę receptora zakotwiczonego w błonie lub jej fragment wiążący ligand. Receptor może być wybrany spośród receptorów śmierci, receptorów czynników wzrostowych i receptorów cytokin. Receptor może być wybrany spośród CD9 (APO-1; Fas), receptorów TRAIL, receptorów TNF, receptorów VEGF, receptora interleukiny takiego jak IL-1Rα. Receptorem może być CD9, receptor TRAIL, np. receptor 1 TRAIL, receptor 2 TRAIL, receptor 3 TRAIL lub receptor 4 TRAIL, albo receptor TNF, np. receptor 1 TNF lub receptor 2 TNF. [0014] Pierwszą domenę stanowi domena ligandu wiążącego receptor takiego jak ligand CD9, TRAIL, TNF, np. TNF-α lub TNF-β, czynniki wzrostowe, np. VEGF i cytokiny, takie jak interferony lub interleukiny, np. IL-1 lub jej warianty. [001] Białko fuzyjne zawiera wiele domen pierwszych, które mogą być takie same lub różne. Przykładem takiego złożonego białka fuzyjnego jest białko fuzyjne VEGF Trap zawierające drugą domenę pozakomórkową receptora VEGF 1 (Flt-1) z trzecią domeną receptora VEGF 2 (KDR/FtK-1) i regionem stałym IgG. 1 20 2 30 3 40 [0016] Białko pierwszej domeny stanowi białko ssacze, korzystniej białko ludzkie. W szczególności, dla celów terapeutycznych korzystne jest zastosowanie białek ludzkich. [0017] Druga domena białka fuzyjnego zawiera co najmniej część domeny stałej immunoglobuliny, np. domenę stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny lub domenę stałą łańcucha lekkiego immunoglobuliny. Korzystnie, Druga domena zawiera co najmniej część domeny stałej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny. Domenę stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny stanowi korzystnie fragment Fc zawierający domenę CH2 i CH3 i, ewentualnie, co najmniej część regionu zawiasowego. Domeną immunoglobuliny może być domena immunoglobuliny IgG, IgM, IgD lub IgE albo pochodząca od niej zmodyfikowana domena immunoglobuliny. Korzystnie, Druga domena zawiera co najmniej część domeny stałej immunoglobuliny IgG. Domena immunoglobuliny IgG może być wybrana spośród domen IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4, albo spośród domen zmodyfikowanych, takich jak te opisane w US,92,734. Domena immunoglobuliny może wykazywać funkcje efektorowe, szczególnie funkcje efektorowe wybrane spośród ADCC i/lub CDC. W niektórych wariantach wykonania można jednak zastosować zmodyfikowane domeny immunoglobulin, mające zmodyfikowane, np. co najmniej częściowo usunięte, funkcje efektorowe. [0018] Konstruowanie białka fuzyjnego według niniejszego wynalazku obejmuje dobór końcowego aminokwasu (aminokwasów) pierwszej domeny i drugiej domeny w celu stworzenia zakładki o długości co najmniej jednego aminokwasu między obiema domenami. W celu osiągnięcia tego celu zazwyczaj niezbędne jest usunięcie jednego lub kilku aminokwasów z pierwszej domeny i/lub drugiej i/lub dodanie jednego lub kilku aminokwasów z występującej w przyrodzie domeny sąsiedniej do pierwszej domeny i/lub drugiej. Na przykład, niezbędne może być wytworzenie pierwszej domeny mającej delecję wielkości korzystnie do, a korzystniej do 6 aminokwasów, np. 1, 2, 3, 4, lub 6 aminokwasów z granic domeny występującej w przyrodzie. Z drugiej strony, wymagane może być dodanie korzystnie do, a korzystniej do 6 aminokwasów, np. 1, 2, 3, 4, lub 6 aminokwasów z występującej w przyrodzie domeny sąsiedniej do pierwszej domeny i/lub drugiej. Przy usuwaniu i/lub dodawaniu aminokwasów należy jednak zadbać o to, żeby nie wpłynąć szkodliwie na aktywność biologiczną pierwszej domeny i/lub drugiej domeny. 3
[0019] Białko fuzyjne według wynalazku mogą zawierać N-końcową sekwencję sygnałową, która umożliwia wydzielenie z komórki gospodarza po wyrażeniu rekombinantu. Sekwencją sygnałową może być sekwencja sygnałowa, która jest homologiczna z pierwszą domeną białka fuzyjnego. Alternatywnie, sekwencją sygnałową może także być heterologiczna sekwencja sygnałowa, np. IgK lub IgA, sekwencja peptydu sygnałowego. W innym wariancie wykonania, białko fuzyjne nie zawiera sekwencji N-końcowej, reprezentując zatem formę dojrzałą białka fuzyjnego. [0020] Zakładka między pierwszą domeną i drugą albo między dwiema domenami pierwszymi ma długość wynoszącą korzystnie 1, 2 lub 3 aminokwasy. Korzystniej nakładanie się ma długość jednego aminokwasu. Przykłady nakładających się aminokwasów to S, E, K, H, T, P i D. 1 20 2 30 3 40 [0021] Niniejszy wynalazek jest objaśniony szczegółowo poniżej w odniesieniu do kilku konkretnych korzystnych wariantów wykonania. Należy jednak zauważyć, że analogicznymi środkami można wytwarzać dalsze białka fuzyjne według wynalazku. [0022] W pierwszym korzystnym wariancie wykonania pierwszą domenę stanowi domena pozakomórkowa ludzkiego CD9. Domena pozakomórkowa białka fuzyjnego korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową aż do aminokwasu 170, 171, 172 lub 173 ludzkiego CD9. Korzystnie, domena pozakomórkowa CD9 jest połączona z fragmentem Fc ludzkiej IgG, np. z fragmentem Fc ludzkiej IgG1. Sekwencja aminokwasowa cząsteczki ludzkiego CD9 jest pokazana na Figurze 1. Sekwencja aminokwasowa domeny łańcucha stałego ludzkiej IgG1 jest pokazana na Figurze 2. Szczególnie korzystne jest białko fuzyjne zawierające sekwencję aminokwasową jak pokazano na Figurach 3A i 3B, gdzie nakładająca się sekwencja aminokwasowa to S. [0023] Pierwszą domeną może być domena pozakomórkowa ludzkiego receptora TRAIL, np. ludzkiego receptora 1 TRAIL, ludzkiego receptora 2 TRAIL, ludzkiego receptora 3 TRAIL i ludzkiego receptora 4 TRAIL. Domena pozakomórkowa obejmuje sekwencję aminokwasową aż do aminokwasu 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239 (TRAILR-1), 204, 20, 206, 207, 208, 209, 2 (TRAILR-2 forma długa), 18, 186, 187, 188, 189, 190, 191 (TRAILR-2 forma długa - bez powtórzenia), 179, 180, 181, 182, 183, 184 (TRAILR-2 forma krótka), 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, (TRAILR-3), 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, 160,161 (TRAILR-3 bez powtórzenia) i 201, 202, 203, 204, 20, 206, 207, 208, 209, 2, 211 (TRAILR-4). Szczególnie opisany jest ludzki receptor 2 TRAIL. Domena pozakomórkowa ludzkiego receptora TRAIL może być połączona z fragmentem Fc ludzkiej IgG-1. Sekwencje aminokwasowe ludzkich receptorów TRAIL są pokazane na Figurze 4 (TRAILR-1), Figurze 6 (TRAILR-2 forma długa), Figurze 9 (TRAILR-2 forma krótka), Figurze 11 (TRAIL-3) i Figurze 14 (TRAILR-4). Konkretne przykłady białek fuzyjnych obejmują sekwencje aminokwasowe jak pokazano na Figurze, 7, 8,, 12, 13 i 1. [0024] Białko fuzyjne mogą zawierać pierwszą domenę, którą stanowi domena pozakomórkowa ludzkiego receptora TNF, np. ludzkiego receptora 1 TNF lub ludzkiego receptora 2 TNF. Domena pozakomórkowa korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową aż do aminokwasu 203, 204, 20, 206, 207, 208, 209, 2, 211 (TNF-R1) lub 248, 249, 20, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27 (TNF-R2). Domena pozakomórkowa ludzkiego receptora TNF może być połączona z fragmentem Fc ludzkiej IgG-1. Sekwencje aminokwasowe ludzkich receptorów TNF są pokazane na Figurach 16 (TNF-R1) i 18 (TNF- R2). Konkretne przykłady białka fuzyjnego obejmują sekwencje aminokwasowe jak pokazano na Figurach 17 i 19. 4
1 20 [002] W dalszym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne jak opisano wyżej. Cząsteczką kwasu nukleinowego może być cząsteczka DNA, np. dwuniciowa lub jednoniciowa cząsteczka DNA, albo cząsteczka RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować białko fuzyjne lub jego prekursor, np. pro- lub pre-proformę białka fuzyjnego, która może zawierać sekwencję sygnałową lub inne heterologiczne porcje aminokwasów do wydzielania lub oczyszczania, które korzystnie są umieszczone na N- i/lub C-końcu białka fuzyjnego. Heterologiczne porcje aminokwasów mogą być połączone z pierwszą domeną i/lub drugą przez miejsce cięcia proteazy, np. miejsce cięcia trombokinazy (inaczej czynnika krzepnięcia X a albo czynnika Stuarta i Prowera), trombiny lub IgA. [0026] Cząsteczka kwasu nukleinowego może być funkcjonalnie połączona z sekwencją regulującą wyrażanie, np. sekwencją regulującą wyrażanie, która umożliwia wyrażanie cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce pożądanego gospodarza. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być umieszczona na wektorze, np. plazmidzie, bakteriofagu, wektorze wirusowym, wektorze chromosomalnym z miejscem zdolnym do integracji obcego DNA, itp. Przykłady przydatnych sekwencji regulujących wyrażanie oraz wektorów opisali na przykład Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, oraz Ausubel i in. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. [0027] Do wyrażania sekwencji kwasów nukleinowych kodujących białka fuzyjne według niniejszego wynalazku można stosować rozmaite układy ekspresyjne wektor/komórka gospodarza. Przydatne komórki gospodarzy obejmują, ale bez ograniczania do tego, komórki prokariotyczne takie jak bakterie, np. E. coli, eukariotyczne komórki gospodarzy takie jak komórki drożdży, komórki owadzie, komórki roślinne lub komórki zwierzęce, korzystnie komórki ssacze, a korzystniej komórki ludzkie. [0028] Dalej, zgłoszenie patentowe dotyczy innego niż ludzki organizmu transformowanego lub transfekowanego cząsteczką kwasu nukleinowego, jak opisana powyżej. Takie organizmy transgeniczne można wytwarzać znanymi sposobami przenoszenia genów, obejmującymi rekombinację homologiczną. 2 30 3 40 [0029] W dalszym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako środek aktywny co najmniej jedno białko fuzyjne, albo kodującą je cząsteczkę kwasu nukleinowego, w którym pierwszą domenę stanowi pozakomórkowa domena CD9, do stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu zaburzeń związanych z apoptozą. [0030] W tym wariancie wykonania wynalazku kompozycję można stosować w profilaktyce i/lub leczeniu zaburzeń wybranych z grupy obejmującej zaburzenia autoimmunologiczne, AIDS, zaburzenia serca, np. zawał mięśnia sercowego, zaburzenia przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu, uszkodzenie mózgu, np. udar, urazy rdzenia kręgowego, np. paraplegię, posocznicę, zapalenie wątroby, zaburzenia związane z zapaleniem, uraz niedokrwienny przy reperfuzji oraz zaburzenia nerek. Te zaburzenia oraz dalsze zaburzenia, które można leczyć przez podawanie białek fuzyjnych receptorów śmierci, szczególnie białek fuzyjnych CD9, są opisane w WO 9/2773, WO 99/0413, WO 01/41803, EP-A-0 96 637 oraz EP-A-0 992 243. [0031] Białko fuzyjne podaje się leczonemu, który tego wymaga, szczególnie pacjentowi będącemu człowiekiem, w dawce dostatecznej dla leczenia konkretnych stanów przydatnymi środkami. Na przykład, białko fuzyjne może zostać sformułowane jako kompozycja farmaceutyczna razem z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, rozcieńczalnikami i/lub adiuwantami. Skuteczność terapeutyczną i toksycz-
ność można określić zgodnie z normalnymi procedurami. Kompozycję farmaceutyczną można podawać układowo, np. dootrzewnowo, śródmięśniowo lub dożylnie albo miejscowo, np. donosowo, podskórnie lub dooponowo. Korzystne jest podawanie dożylne. [0032] Dawka podawanego białka fuzyjnego będzie oczywiście zależeć od leczonego pacjenta, od wagi pacjenta, typu i ciężkości urazu, sposobu podawania i osądu lekarza przepisującego leczenie. Do podawania białek fuzyjnych CD9 lub TRAIL-R przydatna jest dawka dzienna wynosząca 0,001 do 0 mg/kg. [0033] Ponadto opisany jest sposób wytwarzania białka fuzyjnego zawierającego (i) co najmniej jedną pierwszą domenę zawierającą białko aktywne biologicznie połączoną z (ii) drugą domeną zawierającą co najmniej część domeny stałej immunoglobuliny o zmniejszonym potencjale immunogennym, w którym pierwsza domena jest połączona z drugą domeną z nałożeniem się co najmniej jednego aminokwasu. [0034] Ponadto opisane jest białko fuzyjne zawierające: 1 20 2 30 3 (i) co najmniej jedną pierwszą domenę zawierającą polipeptyd aktywny biologicznie połączoną z (ii) heterologiczną drugą domeną, która jest zdolna do oligomeryzowania białka fuzyjnego, w którym w regionie fuzji występuje nakładanie się co najmniej jednego aminokwasu pomiędzy pierwszą domeną i drugą domeną. [003] Białka fuzyjne zawierające heterologiczne domeny drugie, które są zdolne do oligomeryzowania białek fuzyjnych pod nieobecność białek trzecich, są opisane w WO 01/49866 i w WO 02/0903, na przykład. Obecność nakładania się o długości co najmniej jednego aminokwasu, np. nakładania się o długości jednego, dwóch lub trzech aminokwasów, między pierwszą domeną i drugą w białkach fuzyjnych prowadzi - jak wyjaśniono powyżej - do białek fuzyjnych o zmniejszonym potencjale immunogennym. [0036] Pierwsza domena w tym oligomeryzującym białku fuzyjnym jest zdefiniowana jak wyżej. Pierwszą domeną może być domena pozakomórkowa receptora zakotwiczonego w błonie, albo jego fragment wiążący ligand. [0037] Receptor wybiera się z grupy obejmującej CD9, receptor TRAIL, szczególnie receptor 2 TRAIL oraz receptor TNF, szczególnie receptor 2 TNF. Alternatywnie, pierwszą domeną może być domena ligandu wiążącego receptor, gdzie ligand korzystnie wybiera się z grupy obejmującej ligand CD9, TRAIL i TNF. Konkretne przykłady korzystnych domen pierwszych są takie, jak opisano wyżej. [0038] Druga domena białka fuzyjnego zawiera porcję oligomeryzującą białka. Korzystnie, druga domena jest zdolna do di-, tri-, tetra-, lub pentameryzowania białka fuzyjnego. W tym kontekście, czyni się szczególne odniesienie do ujawnienia w WO 01/49866 i WO 02/0003. Korzystne przykłady domen drugich stanowią C1q, MBP (białko wiążące mannozę), SP-A (białko A surfaktanta płuc), SP-D (białko D surfaktanta płuc), BC (konglutynina z surowicy bydlęcej), CL43 (kolektyna bydlęca 43), ACRP-30 (białko z rodziny C1q) i COMP (białko oligomeryczne macierzy chrząstki) lub domena kolagenu EDA albo jej pochodna aktywna funkcjonalnie. Szczególnie korzystne są porcje z białka ACRP-30, szczególnie z ludzkiego białka ACRP-30, np. aminokwasy 18 do 8, lub 18 do 1, albo z białka COMP. 6
[0039] Jak opisano wyżej, domena (domeny) pierwsza białka fuzyjnego może być umieszczona na N- lub C-końcu, a druga domena na C- lub N-końcu. Dalej, korzystnie obie domeny pierwsza i druga pochodzą od tego samego gatunku, korzystniej są pochodzenia ludzkiego. Ponadto, cechy charakterystyczne dotyczące korzystnych wariantów wykonania białek fuzyjnych opartych na immunoglobulinach odnoszą się także do oligomeryzowania białek fuzyjnych. [0040] Zmniejszony potencjał immunogenny białka fuzyjnego wynika z braku niewystępujących w przyrodzie przejść między pierwszą domeną i drugą w białkach fuzyjnych, co z kolei prowadzi do zmniejszonego potencjału tworzenia neo-epitopów wskutek fuzji między dwoma polipeptydami heterologicznymi. [0041] Niniejszy wynalazek jest zilustrowany dalej przez następujące Figury i Przykłady. Objaśnienia do Figur [0042] 1 20 2 30 3 Figura 1: sekwencja aminokwasowa ludzkiego białka CD9 (APO-1; Fas); Figura 2: sekwencja aminokwasowa regionu C łańcucha ludzkiej IgG-1; Figury 3A i 3B: korzystny przykład białka fuzyjnego CD9-Fc IgG1 z nakładającym się aminokwasem; Figura 4: sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora 1 TRAIL; Figura : korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-1 Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami; Figura 6: sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora 2 TRAIL (forma długa); Figura 7: korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-2 (forma długa) Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami, obejmujące sekwencję powtórzenia; Figura 8: korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-2 (forma długa) Fc z nakładającymi się aminokwasami (bez sekwencji powtórzenia); Figura 9: sekwencja aminokwasowa ludzkiego TRAILR-2 (forma krótka); Figura : korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-2 (forma krótka) Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami; Figura 11: sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora R-3 TRAIL; Figura 12: korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-3 Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami (z powtórzeniami); Figura 13: korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-3 Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami (bez powtórzeń); Figura 14: sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora 4 TRAIL; Figura 1: korzystne przykłady białek fuzyjnych TRAILR-4 Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami; Figura 16: sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora 1 czynnika martwicy nowotworów; Figura 17: korzystne przykłady białek fuzyjnych TNFR-1 Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami; Figura 18: sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora 2 czynnika martwicy nowotworów; Figura 19: korzystne przykłady białek fuzyjnych TNF-R2 Fc IgG1 z nakładającymi się aminokwasami. 7
Przykład 1 Białko fuzyjne zawierające domenę pozakomórkową ludzkiego CD9 i domenę Fc ludzkiej IgG-1 z nakładającymi się aminokwasami. Domena pozakomórkowa ludzkiego CD9 [0043] Zasady 221-736 ludzkiego CD9 (Genbank, nr dost. X63717). Wykorzystano sekwencję z: Oehm, A., "Purification and Molecular Cloning of APO-1 Cell Surface Antigen, a Member of the Tumour Necrosis Factor/Nerve Growth Factor Receptor Superfamily," Journal of Biological Chemistry tom 267, nr 1, str. 709-71, 1992. cdna wytworzono z RNA całkowitego wydzielonego z limfocytów krwi obwodowej (PBL) z krwi dawcy metodą RT-PCR przy użyciu startera Oligo dt. PCR stosowano do amplifikacji cdna domeny pozakomórkowej CD9 przez włączenie sekwencji restrykcyjnej Hind III oraz sekwencji Kozaka przy ' domeny pozakomórkowej i przy 3' miejsca Bgl II (zakończenia domeny pozakomórkowej). [0044] Startery PCR do amplifikacji cdna CD9 przy użyciu polimerazy Taq: Sensowny hucd9-hind III: TATA AAGCTT GCC ACC ATG CTG GGC ATC TG (SEKW. NR ID. 21) 1 Antysensowny hucd9-bgl II: TATAAGATCT GGA TCC TTC CTC TTT GC (SEKW. NR ID. 2) Domena Fc ludzkiej IgG1 20 [004] Sekwencja: pary zasad 200-274. Wykorzystano sekwencję z: Ellison, J., "The nucleotide sequence of human immunoglobulin C gene", Nucleic Acid Research, tom, numer 13, 1982. cdna wytworzono z RNA całkowitego wydzielonego z limfocytów krwi obwodowej (PBL) z krwi dawcy metodą RT-PCR przy użyciu startera Oligo dt. PCR stosowano do amplifikacji cdna Fc ludzkiej IgG1 (częściowy zawias-ch3) przez włączenie miejsca restrykcyjnego Bgl II przy ' startera i przy 3' startera za kodonem stop, miejsca Xho I. [0046] Startery PCR do amplifikacji cdna Fc IgG1 przy użyciu polimerazy Taq: Sensowny huigg1fc-bgiii: TATA AGATCT TGT GAC AAA ACT GAG ACA TG (SEKW. NR ID. 3) 2 Antysensowny HuIgG1Fc-Xhol: TATA CTCGAG TCA TTT ACC CGG AGA GAG GG (SEKW. NR ID. 4) Procedura klonowania: [0047] Po amplifikacji Fc IgG1 produkt PCR strawiono przy użyciu Bgl II oraz Xho I. Produkt PCR CD9 strawiono przy użyciu Hind III oraz Bgl II, a pcdna3.1 (z promotorem CMV) przy użyciu Hind III oraz Xho I. Produkty oczyszczono przez ekstrakcję żelową (przy użyciu zestawu Qiagen Kit). 30 3 [0048] Fragmenty HuIgG1Fc i CD9 przy użyciu ligazy T4 ligowano do pcdna3.1. Po transfekcji kompetentnych chemicznie komórek (E. coli) One Shot Top z firmy Invitrogen, nr zam. C4040- i amplifikacji, przeprowadzono przygotowanie plazmidu przy użyciu zestawu Qiagen Plasmid Prep Kit. [0049] Przeprowadzono trzypunktową ligację przez strawienie pcdna3.1 przy użyciu HindIII i Xhol, CD9EC przy użyciu HindIII i BgIII, oraz HuIgG1 Fc przy użyciu BgIII i Xhol. Obecność wstawki CD9- HuIgG1 Fc w pcdna3.1 zweryfikowano przez sekwencjonowanie i analizę enzymami restrykcyjnymi. Wektor zawierający wstawkę strawiono przy użyciu HindIII i Xbal i wstawkę ligowano do pcdna3.1 zawierającego promotor EF-1. 8
[000] Sekwencję Kozaka pierwotnego konstruktu CD9-Fc zmieniono z GCCACCATGC na GGGGCCAGCATGG przez amplifikację całego produktu CD9-Fc przy użyciu starterów o SEKW. NR ID. i SEKW. NR ID. 6. [001] Startery do zmiany sekwencji Kozaka z GCCACCATGC na GCCGCCACCATGG: ShuCD9EC_alKozak TATA AAGCTT GCC GGC ACC ATG GTG GGC ATG (SEKW. NR ID. ) AS698 HuIgG1Fc-Xo1TATA CTCGAG TCA TTT ACC CGG ALGA GAG GG (SEKW. NR ID. 6) Procedura klonowania: [002] Produkt PCR sklonowano do wektora pcdna3.1/v His Topo z firmy Invitrogen (nr zam. K4800-01), strawiono przy użyciu Hind III oraz Xba I jak również pcdna3.1 zawierający promotor pef i ligowano przy użyciu ligazy T4. Wyrażanie i wyodrębnianie 1 [003] Konstrukt kodujący produkt końcowy transfekowano do linii komórkowych przydatnych do wyrażania białka. Transfekcję można przeprowadzić dowolnym standardowym sposobem znanym specjalistom. Przykłady obejmują elektroporację, transfer za pośrednictwem liposomów, transfekcję przy użyciu fosforanu wapnia. Linie komórkowe przydatne do wyrażania obejmują komórki 293T, COS-1, COS-7 i komórki CHO. Można stosować inne linie komórkowe. [004] W tym przykładzie komórki 293T tymczasowo transfekowano metodą przy użyciu fosforanu wapnia. Alternatywnie, komórki CHO transfekowano z wykorzystaniem FuGene6 i wybrano klony stabilne. 20 2 [00] Pożądane białko można oczyścić z pożywki do hodowli komórkowych sposobami chromatograficznymi. Sposoby te obejmują, ale bez ograniczania do tego, chromatografię powinowactwa na kolumnach z białkiem G lub białkiem A, chromatografię jonowymienną, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię ekskluzyjną lub połączenie tych sposobów. W przykładzie supernatant oczyszczono na kolumnach IgG (Amersham Pharmacia) zgodnie z instrukcją wytwórcy, otrzymując w jednym etapie produkt o wysokiej czystości. Przykład 2. Białko fuzyjne złożone z receptora 2 TRAIL i domeny Fc ludzkiej IgG1 z nakładającymi się aminokwasami Domena Fc ludzkiej IgG1: 30 3 [006] Wykorzystano sekwencję z: Ellison, J., "The nucleotide sequence of human immunoglobulin C gene", Nucleic Acid Research, tom, numer 13, 1982. cdna wytworzono z RNA całkowitego wydzielonego z limfocytów krwi obwodowej (PBL) z krwi dawcy metodą RT-PCR przy użyciu startera Oligo dt. PCR stosowano do amplifikacji cdna Fc ludzkiej IgG1 (częściowy zawias-ch3) z sekwencją tworzącą zakładkę do TRAILR2 przy końcu ' i przy końcu 3' za kodonem stop miejscem EcoRI. I. Starter: Sensowny_huIgG1 (SEKW. NR ID. 7) cca ggg act cct gcc TCT TGT GAG AAA ACT CAC ACA TG (wielkie litery => część HuIgG1) II. Starter: Antysensowny_ERIHuIgG1 (SEKW. NR ID. 8) TATA gaa ttc tca ttt acc egg aga cag gg 9
TRAILR2: [007] Wykorzystano sekwencję z: Walczak H., "TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL" The EMBO Journal tom 16, nr 17, str. 386-397,1997. (numer dostępowy DDBJ/EMBU GenBank: AF016849). cdna wytworzono z RNA całkowitego wydzielonego z limfocytów krwi obwodowej (PBL) z krwi dawcy metodą RT-PCR przy użyciu startera Oligo dt. PCR stosowano do amplifikacji cdna domeny TRAILR2 przez włączenie miejsca restrykcyjnego dla Hind III i sekwencji Kozaka przy końcu ' i przy końcu 3' sekwencji tworzącej zakładkę do ludzkiej IgG1. III. Starter. Sensowny_HII_TRAILR2 (SEKW. NR ID. 9) TATA aag ctt gcc gcc acc atg gaa caa cgg gga cag aac IV. Starter: Antysensowny_TRAILR2 (SEKW. NR ID. ) gtg agt ttt gtc aca aga GGC AGG TGT CCC TGG (wielkie litery => część hutrail-r2, w odwrotnej kolejności) Procedura klonowania: 1 20 [008] Po amplifikacji przeprowadzono ekstrakcję żelową w celu wydzielenia zmodyfikowanych wstawek. Następnie przeprowadzono trzecią PCR wykorzystującą oba fragmenty. Wskutek zachodzenia na siebie obu fragmentów i starterów na końcu, ta PCR łączy w jeden produkt. Następnie produkt strawiono przy użyciu Hind III i EcoR I, i ligowano do przydatnego wektora ekspresyjnego, np. pcdna3.1 (Invitrogen). III. Starter: Sensowny_HIII_TRAILR2 (SEKW. NR ID. 11) TATA aag ctt gcc gcc acc atg gaa caa cgg gga cag aac II. Starter: Antysensowny_ERIHuIgGI (SEKW. NR ID. 12) Wyrażanie TATA gaa ttc tca ttt acc cgg aga cag gg 2 [009] Konstrukt sklonowano i wyrażono w przydatnych komórkach gospodarza, jak opisano w Przykładzie 1. Przykład 3. Zastosowanie konstruktu CD9-Fc do odtworzenia i przywrócenia funkcji po urazie rdzenia kręgowego. 30 [0060] Konstrukt CD9-Fc z nakładającymi się aminokwasami, jak opisano w Przykładzie 1, zastosowano do leczenia urazu rdzenia kręgowego w modelu mysim, jak opisali Demjen i in., Nat Med. (7 marca 2004). Stwierdzono, że podawanie konstruktu sprzyja odtworzeniu i przywróceniu funkcji po urazie rdzenia kręgowego. Przykład 4. Zastosowanie konstruktu CD9-Fc do osłabiania niszczenia mózgu w udarze. 3 [0061] Badano wpływ konstruktu CD9-Fc ze stanowiącymi zakładkę aminokwasami na pierwotną śmierć niedokrwienną oraz wtórny uraz zapalny na modelu mysim, jak opisali Martin-Villalba i in. (Cell Death Differ. 8 (2001), 679-686). Stwierdzono, że podawanie konstruktu CD9-Fc spowodowało znaczący spadek zarówno objętości zawału jak i śmiertelności.
1 20 2 30 3 40 Zastrzeżenia patentowe 1. Białko fuzyjne zawierające (i) co najmniej jedną pierwszą domenę zawierającą domenę wiążącą ligand receptora CD9 połączoną z (ii) heterologiczną drugą domeną zawierającą fragment Fc domeny stałej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierającej domenę CH2 i CH3 i ewentualnie co najmniej część regionu zawiasowego, w którym w regionie fuzji występuje nakładanie się co najmniej jednego aminokwasu pomiędzy pierwszą domeną i drugą domeną, przy czym białko fuzyjne zawiera sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na Figurach 3A lub 3B, do zmniejszania potencjału immunogennego białka fuzyjnego w zastosowaniach terapeutycznych. 2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, którego zastosowania terapeutyczne są wybrane spośród profilaktyki i/lub leczenia udaru, urazów rdzenia kręgowego i zaburzeń przeszczep przeciw gospodarzowi. 3. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, w którym domena immunoglobuliny wykazuje funkcje efektorowe, zwłaszcza funkcje efektorowe wybrane spośród ADCC i/lub CDC. 4. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, w którym pierwsza domena i/lub druga domena białka fuzyjnego obejmuje delecję korzystnie do 6 aminokwasów.. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 1 do 4, w którym pierwsza domena i/lub druga domena białka fuzyjnego obejmuje addycję korzystnie do 6 aminokwasów. 6. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 1 do, które to białko fuzyjne zawiera N- końcową sekwencję sygnałową. 7. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 1 do, które to białko fuzyjne jest pozbawione N-końcowej sekwencji sygnałowej. 8. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. 1 do 7 do zmniejszania potencjału immunogennego białka fuzyjnego w zastosowaniach terapeutycznych. 9. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 8, gdzie zastosowania terapeutyczne są wybrane spośród profilaktyki i/lub leczenia udaru, urazów rdzenia kręgowego i zaburzeń przeszczep przeciw gospodarzowi.. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 8 albo 9, która to cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z sekwencją regulującą wyrażanie. 11. Cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z zastrz. 8 do, która to cząsteczka kwasu nukleinowego jest umiejscowiona na wektorze. 12. Kompozycja farmaceutyczna do zmniejszania potencjału immunogennego białka fuzyjnego w zastosowaniach terapeutycznych zawierająca jako środek aktywny białko fuzyjne jak określone którymkolwiek z zastrz. 1 do 7 lub cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określona w którymkolwiek z zastrz. 8 do 11. 13. Kompozycja według zastrz. 12 do zastosowania w profilaktyce i/lub leczeniu zaburzeń wybranych spośród udaru, urazów rdzenia kręgowego i zaburzeń przeszczep przeciw gospodarzowi. 11
Figura 1 CD9 >sp P244 TNR6_HUMAN Prekursor członka 6 nadrodziny czynników martwicy nowotworów (Receptor FASL) (Antygen powierzchniowy FAS pośredniczący w apoptozie) (Antygen Apo-1) (CD9) - Homo sapiens (Człowiek) Aminokwasy 1-16 Peptyd sygnałowy (potencjalny) Aminokwasy 17-173 Domena pozakomórkowa (potencjalna) Aminokwasy 47-83 CRD1 Aminokwasy 84-127 CRD2 Aminokwasy 128-166 CRD3 Aminokwasy 174-190 transbłonowa (potencjalna) Aminokwasy 191-22 cytoplazmatyczna (potencjalna) 1 12
Figura 2 IgG1 >sp P0187 GC1_HUMAN region łańcucha C Ig gamma 1 - Homo sapiens (Człowiek). Aminokwasy 99-1 Region zawiasowy Aminokwasy 111-223 region CH2 Aminokwasy 224-330 region CH3 Warianty D239E, L241M 13
Figura 3A CD-9 Fc (aminokwasy 1-172 CD9 i aminokwasy 2-330 IgG1) Figura 3B Przykład korzystnego białka fuzyjnego CD9-Fc z aminokwasem stanowiącym zakładkę: 14
Figura 4 3. TRAIL-R1 >sp 000220 TA_HUMAN Prekursor członka A nadrodziny czynników martwicy nowotworów (Receptor śmierci 4) (Receptor 1 ligandu indukującego apoptozę pokrewnego TNF) (Receptor 1 TRAIL) (TRAIL-R1) - Homo sapiens (Człowiek). Aminokwasy 1-23 Peptyd sygnałowy (potencjalny) Aminokwasy 24-239 Domena pozakomórkowa (potencjalna) Aminokwasy 7-14 CRD1 Aminokwasy 147-188 CRD2 Aminokwasy 189-229 CRD3 Aminokwasy 240-262 transbłonowa (potencjalna) Aminokwasy 263-468 cytoplazmatyczna (potencjalna) 1 1
Figura Przykłady białek fuzyjnych Trail-R1-Fc z nakładającymi się aminokwasami: 16
Figura 6 4. TRAIL-R2 (forma długa) >sp 014763 TB_HUMAN Prekursor członka B nadrodziny czynników martwicy nowotworów (Receptor śmierci ) (Receptor 2 ligandu indukującego apoptozę pokrewnego TNF) (receptor 2 TRAIL) (TRAIL-R2) - Homo sapiens (Człowiek). 1 Aminokwasy 1- Peptyd sygnałowy (potencjalny) Aminokwasy 6-2 Domena pozakomórkowa (potencjalna) Aminokwasy 7-94 CRD1 Aminokwasy 97-137 CRD2 Aminokwasy 138-178 CRD3 Aminokwasy 192-206 TAPE Aminokwasy 211-231 transbłonowa (potencjalna) Aminokwasy 232-440 cytoplazmatyczna (potencjalna) 17
Figura 7 Przykłady białek fuzyjnych Trail-R2(forma długa)-fc z nakładającymi się aminokwasami (z powtórzeniem): 18
Figura 8 Przykłady białek fuzyjnych Trail-R2(forma długa)-fc z nakładającymi się aminokwasami (bez powtórzenia): 19