Oznaczanie bilirubiny cakowitej w pynach ustrojowych metod utleniania z uyciem wanadanu jako czynnika utleniajacego Wprowadzenie Bilirubina jest organicznym zwizkiem chemicznym, ótym barwnikiem produktem degradacji cz ci porfirynowej hemu (cz # biakowa globina degradowana jest do pojedynczych aminokwasów, atom elaza zostaje wczony do ogólnej puli elaza organizmu, a hem ulega przeksztaceniu w linearn czsteczk biliwerdyn, redukowan z kolei do bilirubiny) uwolnionego wcze niej z hemoglobiny w ledzionie, wtrobie lub szpiku kostnym. COO - COO - 2 C 2 C 3 C 3 C C 3 3 C O O Dla celów klinicznych bilirubin wyraa si jako dwie frakcje: zwizan i woln. W hepatocytach bilirubina jest enzymatycznie zwizana z dwoma resztami kwasu glikuronowego tworzc ester. Tak form bilirubiny nazywa si bezpo redni lub inaczej zwizan, cholebilirubin, bilirubin A. ie czy si ona z biakami krwi, dziki czemu z atwo ci przedostaje si do moczu, jest rozpuszczalna w wodzie. Wydzielana przez wtrob do óci bilirubina przedostaje si do jelita, gdzie ulega przemianie pod wpywem enzymów i bakterii jelitowych w urobilinogen, a nastpnie w barwnik urobilin. Bilirubina niezmodyfikowana kwasem glukuronowym wie si z albumin i jest okre lana jako po rednia lub te wolna, hemobilirubina, bilirubina B. Oblicza si j jako rónic bilirubiny cakowitej i bezpo redniej. Jest ona nierozpuszczalna w wodzie, w tej postaci nie moe przenikn# do kbuszków nerkowych i przedosta# si do moczu. Moe za to przenika# przez barier krew-mózg i w duych steniach dziaa# neurotoksycznie. Po dostaniu si do komórek wtrobowych bilirubina po rednia jest dwukrotnie sprzgana z kwasem glukuronowym. Przez to traci zdolno # przenikania bariery krew-mózg i przestaje by# zwizkiem neurotoksycznym. Prawidowy poziom bilirubiny cakowitej w surowicy krwi czowieka wynosi 0,3 1,0 mg/dl lub 5,1 17,0 µmol/l. Po przekroczeniu stenia 2-2,5 mg/100 ml krwi,
bilirubina dyfunduje do tkanek, powodujc ich óknicie (ótaczka). Zwikszenie stenia bilirubiny w osoczu okre la si jako hiperbilirubinemi - moe by# ona spowodowana zwikszonym wytwarzaniem bilirubiny w wyniku ótaczki mechanicznej, zespou Dubina- Jonsona, schorzenia dróg óciowych czy pcherzyka óciowego lub te niezdolno ci wydzielania bilirubiny powstajcej w prawidowych ilo ciach przez uszkodzon wtrob. Bilirubina zostaa w ostatnich latach po raz pierwszy odkryta u pozbawionych krwi ro lin, gdzie bilirubina nie jest produktem rozkadu hemoglobiny, lecz chlorofilu. Dzieje si tak, gdy oba barwniki maj podobn budow. Odkrycia dokonano dopiero teraz, pomimo e ro liny z rodziny strelicjowatych s bardzo popularne. Owoce strelicji Sebastian Stabinger, GU FDL Okazao si, e cechy intensywnie pomara:czowego barwnika meszku na owocach strelicji (Strelitzia nicolai) (skórzasty pkajcy owoc osiga rozmiary grochu) nie pasuj do wa ciwo ci chemicznych znanych pigmentów ro linnych. Pochania on promieniowanie o dugo ci fali innej ni w przypadku karotenoidów, poza tym w nietypowy sposób reagowa z rozpuszczalnikami polarnymi i niepolarnymi. Struktur bilirubiny potwierdzono badaniami MR. Obecnie biochemicy badaj poszczególne etapy rozkadu chlorofilu do bilirubiny. [>ródo: Science] Cel wiczenia: Celem wiczenia jest oznaczenie zawartoci bilirubiny ca kowitej w p ynach ustrojowych metod% spektrofotometryczn% z udzia em metawanadanu sodu. Bilirubina ca kowita w obecnoci soli kwasu wanadowego i detergentu jest w rodowisku kwanym utleniana do barwnej biliwerdyny. Rozpuszczalny w wodzie glukuronian bilirubiny wchodzi w reakcj* bezporednio, natomiast bilirubina zwi%zana z albumin% wymaga wczeniejszej hydrolizy pod wp ywem detergentów. Reakcja utleniania powoduje
zmian*,ó tego zabarwienia charakterystycznego dla bilirubiny, do barwy zielonej charakterystycznej dla biliwerdyny. Intensywno zabarwienia powsta ej pochodnej, mierzona przy d ugoci fali 420 nm, jest proporcjonalna do st*,enia bilirubiny ca kowitej w badanej próbce. Sprz!t i materiay: Roztwór wzorcowy bilirubiny CORMAY MULTICALIBRATOR LEVEL 1 o steniu podanym przez prowadzcego, Surowica krwi ludzkiej, Zestaw diagnostyczny do oznaczania stenia bilirubiny cakowitej Lquick Cor-BIL TOTAL sk ada si* z dwóch oddzielnych odczynników 1-BIL TOTAL i 2- BIL TOTAL. Skad i stenie skadników w zestawie : 1-BIL TOTAL Bufor cytrynianowy (p 2,8) 90 mmol/l detergent 2- BIL TOTAL bufor fosforanowy (p 7,0) 4,6 mmol/l metawanadan sodu 3,0 mmol/l 6 ciemnych probówek typu eppendorf, pipety automatyczne, ko:cówki do pipet, 1 kuweta polistyrenowa do pomiarów spektrofotometrycznych (d = 10 mm), termostat, Spektrofotometr UV-Vis SP-830 PLUS. Bilirubina jest wraliwa na #wiato (ulega fotooksydacji), dlatego próbki naley chroni przed #wiatem zarówno sonecznym, jak i sztucznym. Wykonanie wiczenia: 1. Próba wzorcowa: do probówki typu eppendorf doda# 1 ml odczynnika do oznacze: 1-BIL TOTAL. Ogrza# do temperatury oznaczenia 37 C. astpnie doda# 100 l roztworu wzorcowego. Dokadnie wymiesza# i inkubowa# 2 min. w temp. 37 C. astpnie przenie # 800 µl roztworu do kuwetki. Odczyta# absorbancj A1 prób wzorcowych przy dugo ci fali 420 nm wzgldem powietrza. Po pomiarze dokadnie ca zawarto # przenie # do eppendorfa. Pomiar wykona# trzykrotnie.
2. Próba badana: do probówki typu eppendorf doda# 1 ml odczynnika do oznacze: 1-BIL TOTAL. Ogrza# do temperatury oznaczenia 37 C. astpnie doda# 100 l roztworu badanego (surowicy). Dokadnie wymiesza# i inkubowa# 2 min. w temp. 37 C. astpnie przenie # 800 µl roztworu do kuwetki. Odczyta# absorbancj A1 prób badanych przy dugo ci fali 420 nm wzgldem powietrza. Po pomiarze dokadnie ca zawarto # przenie # do eppendorfa. 3. Do eppendorfów z próbami wzorcowymi i badanymi doda# 200 l odczynnika do oznacze: 2-BIL TOTAL. 4. Próba wzorcowa: Po dodaniu odczynnika do oznacze: 2-BIL TOTAL zawarto # dokadnie wymiesza# i po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37 C odczyta# absorbancj A2 prób wzorcowych wobec powietrza przy tej samej dugo ci fali. Zabarwienie jest stabilne przez 30 min. Obliczy# OA = A1 A2. Pomiar wykona# trzykrotnie. 5. Próba badana: Po dodaniu odczynnika do oznacze: 2-BIL TOTAL zawarto # dokadnie wymiesza# i po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37 C odczyta# absorbancj A2 prób badanych wobec powietrza przy tej samej dugo ci fali. Zabarwienie jest stabilne przez 30 min. Obliczy# OA = A1 A2. Pomiar wykona# trzykrotnie. Próba Wzorcowa Badana Skadnik (PW) (PB) próbki 1-BIL TOTAL 1000l 1000l Multikalibrator 100l --- Roztwór badany --- 100l Dokadnie wymiesza# i po 2 min. inkubacji w temp. 37 C odczyta# absorbancj A1 prób wzorcowych (PW) i badanych (PB). astpnie doda#: 2-BIL TOTAL 200l 200l Dobrze wymiesza# i dokadnie po 10 min. inkubacji w temp. 37 C przenie # 800 µl roztworu do kuwetki i odczyta# absorbancj A2 próby wzorcowej(pw) i badanej (PB) wobec powietrza przy dugo ci fali 420 nm. Pomiar wykona# trzykrotnie. Opracowanie wyników: Obliczy# OA = A1 A2 dla obydwu prób;
Obliczy# stenie bilirubiny cakowitej w badanej próbie korzystajc ze wzoru: Stenie bilirubiny cakowitej = OA(PB) / OA(PW) x stenie kalibratora Warto ci prawidowe (surowica): doro li 0,3-1,2 mg/dl (5-21 mol/l) Zalecane jest opracowanie przez kade laboratorium wasnych zakresów warto ci prawidowych charakterystycznych dla lokalnej populacji. Przeprowadzi# analiz statystyczn wyników, obliczajc redni zawarto # bilirubiny cakowitej w próbce, odchylenie standardowe oraz procentowy bd oznaczenia. Literatura uzupeniajca: 1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PW Warszawa 1996. 2. L. Kyszejko-Stefanowicz, 9wiczenia z biochemii, PW Warszawa 1999. 3. L. Stryer, Biochemia, PW Warszawa 1999. Zagadnienia: 1. Bilirubina (budowa, poznanie zagroe: wynikajcych z zachwiania równowagi bilirubiny w organizmie, metody oznaczania bilirubiny we krwi). 2. Spektrofotometria UV-Vis (prawa absorpcji i odchylenia od tych praw, aparatura). 3. Opracowanie wyników i ich ocena statystyczna.