WPŁYW CZYIKÓW FIZYKO-CHEMICZYCH ORAZ WARUKÓW PRZECHOWYWAIA A WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLEIAJĄCE WYBRAYCH PRODUKTÓW ŻYWOŚCIOWYCH Metody oznaczania przeciwutleniaczy W ciągu ostatnich kilkunastu lat ukazały się setki publikacji na temat przeciwutleniających właściwości owoców, warzyw, napojów. Olbrzymie zróżnicowanie w budowie, funkcji i pochodzeniu tak utleniaczy, jak i reaktywnych form tlenu, wymusiło powstanie licznych metod badawczych. ie jest bowiem możliwe analizowanie tym samym sposobem tak różnych związków jak enzymy, duże białka, niskocząsteczkowe przeciwutleniacze czy hormony. Z drugiej strony te rozmaite antyoksydanty mogą oddziaływać w odmienny sposób, w zależności od rodnika czy utleniacza, środowiska reakcji i obecności lub braku innych substancji. Przeciwutleniacz wyspecjalizowany w zmiataniu tlenu singletowego może nie działać na rodniki peroksylowe i odwrotnie. Właśnie z powodu tak licznych i różnorodnych mechanizmów, jak również zróżnicowania środowiska reakcji nie ma możliwości, by jedna metoda mogła dokładnie opisywać wszystkie źródła rodników i/lub przeciwutleniaczy. W czerwcu 2004 roku, w Orlando, odbył się I Międzynarodowy Kongres na temat metod oceny przeciwutleniaczy. Jego głównym zadaniem było zaproponowanie kilku metod analitycznych, które mogłyby zostać wystandaryzowane w celu rutynowej oceny pojemności antyoksydacyjnej w żywności. Jak dotąd nie ma jednej, pełnej klasyfikacji stosowanych technik pomiarowych. Większość badań opiera się na ocenie aktywności czy tzw. pojemności antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości poszczególnych związków zawartych w badanym materiale. Inne metody oceniają przeciwutleniacze ilościowo i jakościowo, nie uwzględniając ich aktywności. Wszystkie metody służące do oceny przeciwutleniaczy, zarówno ich ilości, jak i aktywności, można podzielić na: chromatograficzne - na płaszczyznach - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa (TLC), - na kolumnach - chromatografia cieczowa (HPLC) i gazowa (GC), spektrofotometryczne, kolorymetryczne, elektrochemiczne: - woltamperometria cykliczna (CV), - spektroelektrochemia, elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR). Antyoksydanty mogą inaktywować wolne rodniki na dwa sposoby, przez transfer atomu wodoru (HAT) lub pojedynczego elektronu (SET). W związku KATEDRA TECHOLOGII FERMETACJI I MIKROBIOLOGII TECHICZEJ 1
z tym metody określające pojemność antyoksydacyjną można też podzielić na odpowiednie dwie grupy. 1) Metody oparte o mechanizm HAT (np. ORAC, TRAP) mierzą zdolność przeciwutleniacza (AH) do wygaszania rodników poprzez oddanie wodoru: AH X A XH (1) Tego typu reakcje zachodzą szybko i zależą od ph, rozpuszczalnika oraz obecności innych substancji redukujących, np. metali, które mogą zawyżać wynik. 2) Metody oparte o mechanizm SET (np. FRAP, CUPRAC) wykrywają zdolność antyoksydanta do przeniesienia e i zredukowania rodnika czy jonów metali: X AH X AH (2) H2 O AH A H3O (3) X H3O XH H 2O (4) Me III AH AH Me II (5) Są to reakcje zachodzące powoli, zależne od ph i obecności jonów metali. Istnieją jednak metody, których nie można jednoznacznie zakwalifikować do żadnej z powyższych grup (TEAC, DPPH, metoda Folina-Ciocalteu). iezależnie od przyjętego podziału najczęściej wykorzystywane są metody chromatograficzne i spektrofotometryczne. Szerokie zastosowanie w badaniach glikozydów flawonoidowych znalazła chromatografia (gr. chróma, -atos kolor + gráphein pisać ). Jest to metoda analizy chemicznej polegająca na określeniu składu mieszaniny przez rozdzielenie jej na składniki lub frakcje, dzięki ich różnemu zachowaniu w dwufazowym układzie złożonym z fazy nieruchomej (stacjonarnej) oraz ruchomej, która w określonym kierunku zmienia swoje położenie względem tej pierwszej. Chromatografia pozwala nie tylko na stwierdzenie obecności związku w próbce, lecz także na wnioskowanie o jego ilości. Stosunkowo dobre zróżnicowanie glikozydów flawonoidowych ze względu na rodzaj i liczbę cząsteczek cukru oraz ich lokalizację, otrzymuje się używając w chromatografii cienkowarstwowej jako adsorbentu: poliamidu, żelu krzemionkowego G lub tlenku glinu. ajczęściej stosuje się gotowe płytki chromatograficzne. Zasadnicze znaczenie dla dobrego rozdziału ma dobór odpowiedniej fazy ruchomej i adsorbenta. W skład fazy ruchomej wchodzą najczęściej następujące rozpuszczalniki: woda, kwas octowy, n-butanol, octan etylu, kwas mrówkowy, benzen, keton metyloetylowy, chloroform, aceton. Rozdzielanie substancji na cienkich warstwach wykonuje się niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram w tej samej lub różnych fazach ruchomych. W celu rozpoznania związków stosuje się wzorzec o znanej wartości czasu retencji (R f ). Po dokonaniu rozdziału na cienkiej warstwie, można zlokalizowaną substancję wyeluować odpowiednim rozpuszczalnikiem i oznaczyć ilościowo. W wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) fazą ruchomą jest ciecz, przepływająca pod wysokim ciśnieniem poprzez warstwę złoża w kolumnie. Identyfikację i oznaczanie składników umożliwiają detektory reagujące na zmiany zachodzące w składzie fazy ruchomej podczas wymywania z kolumny składników mieszanin. Dobór rozpuszczalników zależy od właściwości badanego flawonoidu i stosowanego układu detekcyjnego, niekiedy stosuje się fazę ruchomą, o składzie KATEDRA TECHOLOGII FERMETACJI I MIKROBIOLOGII TECHICZEJ 2
zmieniającym się podczas procesu chromatograficznego (elucja gradientowa). Fazy ruchome w chromatografii cieczowej, w odróżnieniu od gazowej, są ważnym elementem zmiennym, dostarczającym wielu możliwości doboru najkorzystniejszych warunków rozdziału. Sposób postępowania podczas identyfikacji jest zbliżony w obu przypadkach, ale przy objętościach próbek większych niż 10 mm 3 nie jest konieczne stosowanie wzorców wewnętrznych, gdyż technika ich wprowadzania na kolumnę pozwala na uzyskanie dostatecznej powtarzalności. Chromatografia cieczowa znalazła zastosowanie w analizie jakościowej i ilościowej flawonoidów. Techniką HPLC można identyfikować monomery, dimery i trimery, natomiast oligomery nadal stanowią wyzwanie dla analityków, ze względu na trudności ze znalezieniem odpowiednich parametrów rozdziału [Schulz, Albroscheit, 1988]. W chromatografii gazowej (GC) fazą ruchomą jest gaz. Badania jakościowe prowadzi się na podstawie porównania czasu retencji substancji badanej i wzorcowej. Do oznaczania zawartości stosuje się najczęściej metodę wzorca wewnętrznego, która eliminuje błędy przy wprowadzaniu próbki na kolumnę. Do ilościowego oznaczania związków flawonoidowych najczęściej wykorzystuje się techniki spektrofotometryczne i kolorymetryczne. Metody spektrofotometryczne są przydatne do oznaczania czystych substancji, natomiast metodami kolorymetrycznymi można oceniać zawartość lub aktywność flawonoidów w ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu. Do tej grupy należą m.in. metody: Christa-Műllera, w której zawartość flawonoidów oznacza się poprzez pomiar natężenia zabarwienia powstałego w wyniku reakcji flawonoidu z trójchlorkiem antymonu, tlenochlorkiem cyrkonu, octanem uranylowym, azotanem berylu, kwasem borowym lub chlorkiem glinowym, Folina-Ciocalteu, gdzie flawonoidy tworzą barwny kompleks z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (mieszanina wolframianu sodowego, molibdenianu sodowego i siarczanu litu w środowisku kwasu fosforowego i solnego) dając zielono-niebieską barwę; po utlenieniu kompleks oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 750 nm lub 784 nm, opierające się na reakcjach wygaszania syntetycznych wolnych rodników (ABTS, DPPH, DMPD); barwny aktywny rodnik ulega redukcji przez antyoksydanty, obecne w badanej próbce, do bezbarwnych związków, co ilościowo mierzy się spektrofotometrem przy długości fali 734, 515 i 505 nm odpowiednio dla w/w rodników, FRAP, polegająca na pomiarze zdolności do redukcji jonu żelazowego 2,4,6- tripirydylo-s-triazyny (TPTZ); związek żelaza(iii) w reakcji z antyoksydantem daje barwny produktu, który oznacza się przy długości fali 593 nm, TRAP, w której przeciwutleniacz redukuje rodnik ABAP. CUPRAC, w której jony miedzi(ii) ulegają pod wpływem antyoksydantów redukcji do jonów miedzi(i); analizę spektrofotometryczną wykonuje się przy długości fali 450 nm, ORAC, oceniająca zdolność antyutleniacza do opóźniania fluorescencji R-fikoerytryny, indukowanej przez AAPH, długość fali wzbudzającej to 540 nm, a emisji 570 nm. Do oceny aktywności przeciwutleniającej służą także metody elektrochemiczne. Wykorzystują one prąd jaki powstaje w czasie elektrochemicznej reakcji tlenu na elektrodzie. Przeciwutleniacze, reagując z tlenem i jego pochodnymi, zmniejszają natężenie tego prądu. Istnieje kilka wariantów elektrochemicznego pomiaru aktywności antyoksydacyjnej. ajważniejsze z nich, cykliczna woltametria (CV) i różnicowa woltametria pulsowa (DPV), pozwalają na pomiar siły działania przeciwutleniaczy zawartych w badanych próbkach za KATEDRA TECHOLOGII FERMETACJI I MIKROBIOLOGII TECHICZEJ 3
pomocą specjalnej szklanej elektrody węglowej. Zróżnicowanie ph pozwala na selektywną ocenę samych flawonoidów (ph=7,5) lub flawonoidów i kwasów fenolowych (ph=2,0). Zaletą tych metod jest to, że nie wymagają żadnych dodatkowych odczynników. Szklana elektroda węglowa jest najlepszą do tych celów, gdyż antyoksydanty fenolowe utleniają się na niej przy podobnych potencjałach jak na elektrodach metalicznych (400-450), jednak bez zakłóceń interferencyjnych związanych z utlenianiem etanolu. Do technik oceniających zawartość związków przeciwutleniających należy zaliczyć również wszystkie oznaczenia poszczególnych antyoksydantów, a więc metody analizy witaminy C, tokoferoli, antocyjanie itd. Ze względu na ograniczony zakres tej pracy nie będą one omawiane szerzej. Wyżej wymienione metody służą do analizy ilościowej lub jakościowej przeciwutleniaczy oraz oceny ich aktywności. Odmienne podejście do problemu reprezentuje następna technika. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) pozwala na wykrycie związków posiadających niesparowane elektrony (paramagnetyków), czyli będących wolnymi rodnikami. Zjawisko pochłaniania energii promieniowania mikrofalowego o odpowiedniej częstotliwości po raz pierwszy zaobserwował w 1944 roku Zawojski. Badanie polega na wprowadzeniu próbki w zmienne pole magnetyczne, po czym niesparowane elektrony orientują się równolegle lub antyrównolegle względem kierunku pola (rozszczepienie poziomów energetycznych to tzw. efekt Zeemana) i następuje absorpcja doprowadzonego promieniowania o częstości pasującej do różnicy energii tych orientacji. Warunki pomiaru można zmienić poprzez zmianę indukcji pola magnetycznego, natomiast jego częstotliwość pozostaje stała. Badania przeprowadza się zazwyczaj w temp. ciekłego azotu 77 o K, gdyż przedłuża to czas życia wolnych rodników. Pochłonięcie energii może zostać zmienione, odpowiednio przekształcone przez układ odbiorczy spektrometru elektronowego rezonansu paramagnetycznego i wyświetlone na ekranie, bądź zapisane przez układ rejestrujący. Otrzymywane widma są porównywane ze wzorcem zewnętrznym, którym najczęściej jest DPPH i analizowane przez programy komputerowe. Metoda EPR posiada szereg zalet wobec innych spektroskopii promieniowania elektromagnetycznego: jest to metoda specyficzna dla wolnych rodników, inne substancje nie mają żadnego udziału w rejestrowanym sygnale, energia stosowanych do napromieniania próbki mikrofal jest niewielka, zatem i możliwość powstania uszkodzeń analizowanej próbki przez sam pomiar jest znikoma, objętość badanej próbki to zaledwie około 200 µl, możliwe są pomiary próbek nieprzezroczystych, sygnał wolnych rodników w tle jest znikomy, pozwala to w sposób niezaburzony obserwować upatrzone substancje wolnorodnikowe. Poważnym utrudnieniem obserwacji bezpośredniej wolnych rodników może być ich bardzo krótki czas życia. Aby ominąć ten problem stosowane są tzw. pułapki spinowe (T). Są to związki diamagnetyczne, które dzięki obecności wiązań typu O, z łatwością wchodzą w reakcję z nietrwałym rodnikiem tworząc trwałe addukty spinowe: R T R T (25) KATEDRA TECHOLOGII FERMETACJI I MIKROBIOLOGII TECHICZEJ 4
Funkcje pułapek spinowych mogą spełniać duże połączenia organiczne typu nitrozozwiązków lub nitronów, np. 2,4,6-tri-tert-butylonitrobenzen, a także kompleksy nieorganiczne (Fe 2+ (DETC) 2 ). Oprócz wyżej wymienionych metod istnieje jeszcze mnóstwo innych, ale zwykle nie są one wykorzystywane do badań żywności. Do pomiaru zdolności zmiatania wolnych rodników czystych związków chemicznych lub do oceny pojemności antyoksydacyjnej osocza czy innych płynów ustrojowych służy między innymi badanie peroksydacji lipidów. Ocenia się wydajność hamowania tego procesu przez antyutleniacze. Istnieje wiele wariantów tej metody, najczęściej stosuje się reakcję aldehydu malonowego (MDA) z kwasem tiobarbiturowym. Produkt tej reakcji (rys.1.) to addukt o charakterystycznym różowym zabarwieniu, który oznacza się spektrofotometrycznie. H 2 HS + H C H 2 C O S HO CH CH CH SH HO C H O Rys.1. Reakcja powstawania barwnego adduktu kwasu tiobarbiturowego i MDA Mimo powszechnego stosowania tej metody nie można jej uznać za najlepszą. Jest bardzo czuła, ale wysoce niespecyficzna. Z kwasem tiobarbiturowym addukty tworzą bilirubina, kwas sjalowy, produkty degradacji cukrowców i inne aldehydy. Poza oznaczaniem zahamowania peroksydacji lipidów przez przeciwutleniacze ocenia się także produkty utleniania białek i nukleotydów oraz uszkodzenia kwasów nukleinowych prowadzące do mutacji. Metody te jednak nie mają praktycznie żadnego zastosowania w badaniach właściwości antyoksydacyjnych produktów żywnościowych. Czynniki wpływające na zafałszowania wyników Jak dotąd nie ma jednej uniwersalnej i idealnej metody oznaczania aktywności przeciwutleniajacej. Pomimo tego, że większość z nich jest prosta, interpretacja wyników bywa skomplikowana, np. kiedy analizowane próbki mają pokrywające się widma. DPPH ma stosunkowo mały zasięg liniowy, ponadto istnieje wiele antyoksydantów reagujących szybko z rodnikami propylowymi, ale wolno bądź wcale z DPPH. Przy jego użyciu można oznaczyć tylko związki hydrofobowe w przeciwieństwie do metody z zastosowaniem rodnika ABTS, która oznacza zarówno hydrofobowe, jak i hydrofilowe. W metodzie Folina-Ciocalteu czynnikiem, który najbardziej wpływa na zafałszowania jest mieszanie się substancji, szczególnie cukrów, aromatycznych amin, dwutlenku siarki, kwasu askorbinowego i kwasów organicznych. Dlatego należy wprowadzać korekty. Dodatkowo niefenolowe substancje organiczne (adenina, adenozyna, alanina, anilina, kwas aminobenzoesowy, kwas askorbinowy, benzaldehyd, kreatynina, cysteina, cytozyna, dimetyloalanina, EDTA, fruktoza, guanina, glicyna, histamina, histydyna, uracyl, kwas KATEDRA TECHOLOGII FERMETACJI I MIKROBIOLOGII TECHICZEJ 5
olejowy, tryptofan, białka, sacharoza), jak i nieorganiczne (hydrazyna, siarczan amonu, siarczan manganu, fosforan sodu) reagujące z odczynnikiem Folina dają w efekcie zawyżony wynik końcowy aktywności przeciwutleniającej. iektóre metody opierają się na założeniu, że reakcje redoks przebiegają tak szybko, że wszystkie kompletne reakcje zachodzą w przeciągu 4 do 6 minut. W rzeczywistości to nie zawsze jest prawda. Szybko reagujące fenole, które wiążą żelazo i rozbijają niższe związki najlepiej analizować w krótkim czasie (ok. 4 min). Jednakże, niektóre polifenole reagują nieco wolniej i potrzebują dłuższego czasu reakcji dla wykrycia (ok. 30 min.). Źle dobrany czas reakcji również powoduje, że wyniki są obarczone błędem. ie wszystkimi metodami można oznaczyć te same przeciwutleniacze. Metoda FRAP nie mierzy np. glutationu. Wykrywa się go za pomocą oznaczenia TRAP, opierającego się na fazie opóźnienia, zakładając, że wszystkie przeciwutleniacze ją wykazują i że jej długość jest proporcjonalna do aktywności przeciwutleniającej. Jednakże, nie wszystkie antyoksydanty posiadają oczywistą fazę opóźnienia. Ponadto wartość otrzymana na podstawie samej fazy obniża rzeczywisty wynik. KATEDRA TECHOLOGII FERMETACJI I MIKROBIOLOGII TECHICZEJ 6