NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII TOM XIII 2005 181 NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII TOM XIII 2005 182 WPŁYW MODYFIKACJI ŁAŃCUCHA ALIFATYCZNEGO FOSFONOFENYLODIPEPTYDÓW NA REORIENTACJĘ PIERŚCIENIA FENYLOALANINY NA POWIERZCHNI KOLLOIDALNEGO SREBRA EDYTA PODSTAWKA 1, MARCIN DRĄG, 2 PAWEŁ KAFARSKI, 2 LEONARD M. PRONIEWICZ 3 1 Środowiskowe Laboratorium Analiz Fizykochemicznych i Badań Strukturalnych, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków, e-mail:podstawk@chemia.uj.edu.pl 2 Instytut Chemii Organicznej, Politechnika Wrocawska, ul. Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław 3 Zakład Fizyki Chemicznej, Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków, e-mail: proniewi@chemia.uj.edu.pl metaloenzymów. Wykazują one także aktywność antynowotworową oraz własności bakteriostatyczne. Stosowane są również jako herbicydy [1,2]. Prezentowane w tej pracy fosfonofenylodipeptydy: L-Phe-L-Ala-PO 3 H 2 (FD1), L-Phe-L- Val-PO 3 H 2 (FD2), L-Phe-β-Ala-PO 3 H 2 (FD3), L-Phe-β-Ala-CH(OH)-PO 3 H 2 (FD4) i L-Phe-L- Ala-CH(OH)-PO 3 H 2 (FD5) (gdzie: Phe, Ala i Val oznaczają odpowiednio fenyloalanine, alaninę i walinę) są potencjalnymi inhibitorami katepsyny C [3], enzymu, który odgrywa kluczową rolę w aktywowaniu serynowych peptydaz biorących udział w zapaleniach, komórkowo sterowanej apopleksji, czy przebudowie komórkowej. Inhibitory tego enzymu mogą być wykorzystane jako potencjalne leki w leczeniu reumatoidalnego artretyzmu, dystrofii mięśni, czy zahamowaniu przerzutów pewnych typów komórek rakowych [3]. Badania techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, SERS, wykonano w celu określenia wpływu modyfikacji łańcucha alifatycznego badanych fosfonofenylodipeptydów (np. podstawienie L-Ala przez L-Val i β-ala lub wprowadzenie dodatkowych grup, takich jak: CH(OH)-) na reorientacją pierścienia fenyloalaniny zaadsorbowanej na powierzchni kolloidalnego srebra. HASŁA DO ZAPAMIĘTANIA: fosfonofenylodipeptydy; powierzchniowo wzmocniony efekt Ramana, SERS. 1. WSTĘP Fosfonofenylodipeptydy jako analogi fosforowe naturalnie występujących związków aminokarboksylowych cieszą się szerokim zastosowaniem ze względu na ich specyficzną aktywność biologiczną. Grupa fosfonowa wykazuje strukturę tetraedru, dlatego związki te z łatwością naśladują tetraedryczne związki przejściowe shydrolizowanych estrów, amidów, czy peptydów. Dlatego też, często pełnią funkcję inhibitorów esteraz, peptydaz oraz enzymów i W ostatnich dziesięciu latach spektroskopia SERS została uznana za jedną z najefektywniejszych technik do ilościowej i jakościowej analizy różnorodnych biocząsteczek obecnych w roztworze w stężeniach 10-3 10-10 M. W technice tej orientacja badanej molekuły oraz odległość jej grup funkcyjnych względem powierzchni metalu, na którym została zaadsorbowana, odgrywa kluczową rolę we wzbudzeniu indywidualnych pasm Ramana. Warunek ten pozwala na uzyskanie wyjątkowych (specyficznych) informacji na temat struktury zaadsorbowanego związku na powierzchni roztwór/ciało stałe. SERS odwołuje się do obserwacji, iż dla pewnej cząsteczki zaadsorbowanej na specyficznie przygotowanej powierzchni metalicznej obserwowane jest widmo Ramana, w którym intensywności pasm jest podwyższona o współczynnik intensywności rzędu 10 5-10 6 w
NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII TOM XIII 2005 183 NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII TOM XIII 2005 184 stosunku do sygnału obserwowanego dla molekuły nie zaadsorbowanej. Wzmocnienie to jest zależne od efektywnego ramanowskiego przekroju czynnego, od promieniowania wzbudzającego dokonano w oparciu o uprzednio opublikowane dane dla Phe zaadsorbowanej na koloidalnym srebrze [9,10-12] i jej dipeptydów [13-15]. (λ exc. ), powierzchni metalicznej, a także własności fizykochemicznych molekuły [4-6]. 2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA Synteza peptydów. Fosfonofenylodipeptydy: L-Phe-L-Ala-PO 3 H 2 (FD1) i L-Phe-L-Val-PO 3 H 2 (FD2) zsyntezowano według standardowej procedury [7], podczas gdy L-Phe-β-Ala-PO 3 H 2 (FD3), L-Phe-β-Ala-CH(OH)-PO 3 H 2 (FD4) i L-Phe-L-Ala-CH(OH)-PO 3 H 2 (FD5) otrzymano według procedury stosowanej przy syntezie kwasu 2-amino-1-hydroksyalkylofosfonowego [8], w której produktem wyjściowym jest odpowiedni N-blokowany aldehyd peptydowy. Czystość badanych związków sprawdzono przy wykorzystaniu spektroskopii 1 H, 31 P i 13 C NMR (Bruker Avance DRX 300 MHz) oraz spektroskopii masowej (Finnigan Mat TSQ 700). Pomiary SERS. Roztwory koloidalnego srebra przygotowano według standardowej procedury [9]. Kroplę wodnego roztworu badanych fosfonofenylodipeptydów o stężeniu ~10-5 M dodano do 0.3 ml koloidu srebra. Widma SERS wykonano na trójsiatkowym spektrometrze T64000 (Jobin Yvon) wyposażonym w detektor CCD chłodzony ciekłym azotem (Jobin Yvon, model CCD3000). Jako źródła promieniowania użyto lasera Ar-jonowego emitującego linię ciągłą 514.5 nm (model 2025, Spectra-Physics). Moc promieniowania laserowego na próbce wynosiła 30 mw. Widma rejestrowano przy rozdzielczość 4 cm -1. 3. WYNIKI Rys. 1 przedstawia widma SERS badanych fosfonofenylodipeptydów zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego srebra w zakresie częstości od 600 do 1750 cm -1. Natomiast Tabela 1 zawiera częstości obserwowanych pasm drgań pierścienia fenyloalaniny w widmach SERS Rys. 1. Widma SERS FD1, FD2, FD3, FD4 i FD5 zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego srebra w zakresie częstości od 600 do 1750 cm -1. wraz z ich proponowanym przypisaniem odpowiednim drganiom normalnych. Przypisania
NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII TOM XIII 2005 185 Kształt prezentowanych widm SERS pięciu badanych fosfonofenylodipeptydów różni się, jakkolwiek widma SERS FD1 i FD2 oraz FD4 i FD5 wykazują pewne podobieństwa w intensywnościach obserwowanych pasm charakterystycznych drgań pierścienia aromatycznego fenyloalaniny. Do tych charakterystycznych pasm należą pasma obserwowane przy około 620, 1002, 1030, 1205, 1583 i 1602 cm -1 (dokładne częstości obserwowanych pasm dla każdego z fosfonofenylodipeptydów zebrane są w Tabeli 1), które odpowiadają drganiom pierścienia fenyloalaniny, odpowiednio: deformacyjnym w płaszczyźnie (ν 6b ), symetrycznym oddychającym (ν 12 ), zginającym C-H w płaszczyźnie (ν 18a ), kombinacyjnym (drgania rozciągające pierścienia aromatycznego Phe z drganiami zginającymi grup C-H tego pierścienia) (ν 9a ), rozciągającym wiązania C-C 6 H 5 (ν 7a ) i dwóm drganiom rozciągającym w płaszczyźnie wiązań C=C w pierścieniu aromatycznym (ν 8b i ν 8a ). Pasma tych drgań dominują w widmie SERS FD4 i FD5. Co więcej, ich intensywność jest porównywalna do intensywności tych pasm w widmach normalnego efektu Ramana tych fosfonofenylodipeptydów. Przyjmuje się, iż wzmocnienie SERS drgań pierścienia aromatycznego jest wynikiem tworzenia się π-kompleksu pierścienia aromatycznego z powierzchnią metalu [1-12]. Dodatkowo, Creighton [16] wykazał dla aromatycznych aminokwasów wykazujących symetrię punktową C 2 v, iż ułożenie pierścienia aromatycznego zaadsorbowanego na powierzchni metalu może zostać przewidziane na podstawie reguł wyboru, które określają różne wzmocnienie drgań o różnej symetrii. Stosunek współczynników wzmocnienia SERS dla drgań o symetrii A 2, B 1 i B 2 wynosi 4:1:1 dla równoległej orientacji Phe zaadsorbowanej na powierzchni srebra, podczas gdy dla ułożenia prostopadłego ma się jak 1:4:4. Znaczna wartość wzmocnienia drgań o symetrii A 2 i B 2 może zostać jakościowa wyjaśniona na podstawie natury tych drgań (w płaszczyźnie i poza płaszczyznę, odpowiednio). A zatem, dla równoległej orientacji pierścienia Phe zaadsorbowanej na powierzchni metalu drgania o symetrii A 2 wykazują większą wartość składowej tensora polaryzowalności normalnej do powierzchni metalu aniżeli drgania o symetrii B 2. Odwrotna sytuacja jest obserwowana dla orientacji prostopadłej pierścienia Phe względem powierzchni metalu. Zgadnie z tą teorią znaczne wzmocnienie charakterystycznych Tabela 1. Częstości obserwowanych pasm w widmach SERS FD1, FD2, FD3, FD4 i FD5 wraz z ich proponowanym przypisaniem odpowiednim drganiom. częstość pasm Phe w widmach SERS (cm -1 ) przypisanie FD1 FD2 FD3 FD4 FD5 1602 1607 1602 1601 Phe (ν 8a ) 1582 1592 1604 1587 1583 Phe (ν 8b ) 1494 Phe (ν 19a ) 1235 Phe (ν 3 ) 1208 1206 1208 1206 1205 Phe (ν 7a ) 1160 1171 1182 1182 1181 Phe (ν 9a ) i/lub δ(ch 2 ) 1044 1046 1059 Phe (ν 18b ), ν(c α -N) i/lub ν(c-p) 1033 1031 1030 1030 Phe (ν 18a ) 1002 1003 1004 1002 1002 Phe (ν 12 ) 955 956 961 Phe (ν 5 ), ν s (PO 2-3 ) i/lub ν(c-ch 3 ) 828 824 820 829 829 Phe (ν 10a ) i/lub ν as (O-P-O) 748 761 786 761 761 Phe (ν 1 ), Phe (ν 11 ) i/lub ν s (O-P-O) 620 621 619 620 Phe (ν 6b ) pasm fenyloalaniny w widmach SERS FD4 i FD5 wskazuje na praktycznie prostopadłe ułożenie ich pierścienia Phe na powierzchni srebra. Odmiennie, w widmie SERS FD3 obserwuje się tylko nieznaczne wzmocnienie pasm charakterystycznych drgań Phe. Sugeruje to, iż pierścień fenyloalaniny przyjmuje położenie prawie równoległe do powierzchni srebra. Jeszcze inaczej zachowuje się pierścień Phe w pozostałych dwóch fosfonodipeptydach, FD1 i FD2, w których Phe przyjmuje ułożenie kątowe względem powierzchni metalicznego srebra, co wynika z średniej intensywności pasm drgań Phe. Profile wzbudzeń SERS wskazują, iż wzmocnienie drgań pierścienia aromatycznego zachodzi przez elektromagnetyczny mechanizm (EME), jaki i chemiczny mechanizm (CE) [6]. Opierając się na regułach wyboru, wkład od mechanizmu CE do wzmocnienia SERS przejawia się w silnym wzmocnieniu pasm drgania ν 8. Tylko w widmie SERS MD2 pasmo
tego drgania obserwowane przy 1592 cm -1 dominuje. Sugeruje to, iż CE mechanizm odgrywa znaczącą rolę w przypadku wzmocnienia pasm pierścienia Phe dla MD2. [4.] Koglin E., Sequaris J.M., Valenta P. (1979) Surface Enhanced Raman Scattering of Biomolecules, Proc. 14 th European Congress on Molecular Spectroscopy, Frankfurt/M. [5] Kneipp K., Kneipp H., Itzkan I., Dasari R.R., Feld M.S. (2002) Surface-enhanced Raman 4. WNIOSKI Analiza intensywności pasm charakterystycznych drgań Phe wskazuje, iż pierścień scattering and biophysics, J. Phys.: Condens. Mater, 14, R597-624. [6] Podstawka E., Proniewicz L.M. (2004) Powierzchniowo wzmocniony efekt Ramana, fenyloalaniny w L-Phe-L-Ala-PO 3 H 2 (FD1) przyjmuje kątowe ułożenie względem Chemiczne aspekty badań środowiska, G. Schroeder (red.), Betagraf, Poznań 2004. powierzchni srebra. Podstawienie L-Ala przez większą przestrzennie L-Val (FD2) praktycznie nie powoduje zmiany w orientacji pierścienia Phe na powierzchni srebra, podczas gdy zastąpienie L-Ala przez jej izomer β-ala (FD3) sprawia, że pierścień Phe kładzie się na tej powierzchni. Natomiast wprowadzenie do łańcucha alifatycznego FD1 dodatkowej grupy CH(OH)- (FD4) wywołuje reorientacje tegoż pierścienia i przyjęcie przez niego ułożenia niemalże prostopadłego do powierzchni metalu. Dalsza modyfikacja, czyli wymiana L-Ala na β-ala (FD5) nie zmienia orientacji pierścienia Phe względem powierzchni srebra. [7] Kafarski P., Lejczak B., Mastalerz P., Szewczyk J., Wasielewski Cz. (1982) R)-( )- Phospholeucine, mp 288-291 C; [α] D 25 28 (1 M NaOH, c 1), Can. J. Chem., 60, 3081-3090. [8] Drąg M., Latarka R., Gumienna-Kontecka E., Kozłowski H., Kafarski P. (2003) Stereoselective synthesis, solution structure and metal complexes of (1S,2S)-2-amino-1- hydroxyalkylphosphonic acids, Tetrahedron: Asymm. 14, 1837-1845. [9]. Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Part I: Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Investigation of Amino Acids and Their Homodipeptides Adsorbed on Literatura [1.] Zboinska E., Sztajer H., Lejczak B., Kafarski P. (1990) Antibacterial activity of phosphono dipeptides based on 1-amino-1-methylethanephosphonic acid, Microbiol. Lett. 70, 23-28. [2.] Tacke M., Cuffe L.P., Gallagher W.M., Lou Y., Mendiza O., Müller-Bunz H., Rehmann F.J.K., Sweeney M. (2004) Methoxy-phenyl substituted ansa-titanocenes as potential anticancer drugs derived from fulvenes and titanium dichloride, J. Inorg. Biochem. 98, 1987-1994. [3.] Kafarski P., Drąg M., Pawełczyk M., Berlicki Ł. (2003) Synthesis and evaluation of phosphonopeptide cathepsin C inhibitors, Biopolymers 71, O79-Q85. Colloidal Silver, Appl. Spectrosc., 58, 570-580. [10]. Kim S.K., Kim M.S., Suh S.W. (1987) Surface-enhanced raman Scattering (SERS) of Aromatic Amino Acids and Their Glycyl Dipeptides in Silver Sol, J. Raman Spectrosc. 18, 171-175. [11.] Nabiev I.R., Savchenko V., Efremom E.S. (1983) Surface-enhanced Raman Spectra of Aromatic Amino Acids and Proteins Adsorbed by Silver Hydrosols, J. Raman Spectrosc. 14, 375-379. [12.] Herne T.M., Ahern A.M., Garrell R.L. (1991) Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of peptides: Preferential N-Terminal Adsorption on Colloidal Silver, J. Am. Chem. Soc. 113, 846-854.
[13.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Part II: Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Investigation of Methionine Containing Heterodipeptides Adsorbed on Colloidal Silver, Appl. Spectrosc., 58, 581-590. [14.] Podstawka E., Kozłowski H., Proniewicz L.M. (2005) Molecular structure study of dimethoxyphenyl-substituted phosphonodipeptides by infrared, Raman, and surface enhanced Raman spectroscopies, J. Raman Spectrosc., w druku. [15.] Podstawka E., Borszowska R., Grabowska M., Drąg M., Kafarski P., Proniewicz L.M. (2005) Investigation of Molecular Structures and Adsorption Mechanisms of Phosphonodipeptides by Surface-Enhanced Raman, Raman, and Infrared Spectroscopies, Surf. Sci., w druku. [16.] Creighton J.A. (1983) Surface Raman electromagnetic enhancement factors for molecules at the surface of small isolated metal spheres: The determination of adsorbate orientation from SERS relative intensities, Surf. Sci. 124, 209-21