(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/82 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/32 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Traustochytrydy, kompozycje kwasów tłuszczowych i sposoby ich wytwarzania, i ich zastosowania (30) Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2012/04 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/02 (73) Uprawniony z patentu: DSM IP Assets B.V., Heerlen, NL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 KIRK E. APT, Ellicott City, US JOSEPH W. III PFEIFER, Westminster, US JON MILTON HANSEN, Ellicott City, US PAUL WARREN BEHRENS, Ellicott City, US ROSS ZIRKLE, Longmont, US TRACEY LYNN STAHL, Pasadena, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Sylwia Błażej-Sosnowska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP.J. Sienna Center ul.żelazna 28/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 28072/16/ZWA/SBS EP Traustochytrydy, kompozycje kwasów tłuszczowych i sposoby ich wytwarzania, i ich zastosowania Opis TŁO WYNALAZKU Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy olejów drobnoustrojowych. Tło stanu techniki [0002] Kwasy tłuszczowe klasyfikuje się na podstawie długości i charakterystyki wysycenia łańcucha węglowego. Kwasy tłuszczowe o krótkim łańcuchu mają na ogół 12 węgli lub mniej, kwasy tłuszczowe o średnim łańcuchu mają na ogół 14 do 18 węgli, a kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu mają na ogół 20 lub więcej węgli. Kwasy tłuszczowe są określane jako nasycone kwasy tłuszczowe gdy nie są obecne wiązania podwójne pomiędzy atomami węgla, i są określane jako nienasycone kwasy tłuszczowe gdy są obecne wiązania podwójne. Nienasycone kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu są jednonienasycone, gdy obecne jest tylko jedno wiązanie podwójne i są wielonienasycone, gdy obecne jest więcej niż jedno wiązanie podwójne. [0003] Wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) klasyfikuje się na podstawie pozycji pierwszego wiązania podwójnego od strony końca metylowego kwasu tłuszczowego: kwasy tłuszczowe omega-3 (n-3) zawierają pierwsze wiązanie podwójne przy trzecim węglu, podczas gdy kwasy tłuszczowe omega-6 (n-6) zawierają pierwsze wiązanie podwójne przy szóstym węglu. Na przykład, kwas dokozaheksaenowy ( DHA ) to wielonienasycony kwas tłuszczowy omega-3 o długim łańcuchu (LC-PUFA) o długości łańcucha 22 węgle i 6 wiązaniach podwójnych, często oznaczony jako 22:6 n-3. Inne LC-PUFA omega-3 obejmują kwas eikozapentaenowy ( EPA ), oznaczony jako 20:5 n-3, i kwas dokozapentaenowy omega-3 ( DPA n-3 ), oznaczony jako 22:5 n-3. DHA i EPA określano jako niezbędne kwasy tłuszczowe. LC-PUFA omega-6 obejmują kwas arachidonowy ( ARA ), oznaczony jako 20:4 n-6, i kwas dokozapentaenowy omega-6 ( DPA n-6 ), oznaczony jako 22:5 n-6. [0004] Kwasy tłuszczowe omega-3 są biologicznie istotnymi cząsteczkami, które wpływają na fizjologię komórki ze względu na ich obecność w błonach komórkowych, regulują produkcję i ekspresję genów biologicznie aktywnych związków, i służą jako substraty do biosyntezy. Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: (1999). DHA, na przykład, stanowi w przybliżeniu 15%-20% lipidów ludzkiej kory mózgowej, 30%-60% lipidów w siatkówce, jest zatężony w jądrach i nasieniu, i stanowi ważny składnik ludzkiego mleka. Jean-Pascal Bergé & Gilles Barnathan, Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms: Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds, and Economical Aspects, w Marine Biotechnology I 49 (T. Scheper, ed., 2005). DHA stanowi aż do 97% kwasów tłuszczowych omega-3 w mózgu i a do 93% kwasów tłuszczowych omega-3 w siatkówce. Ponadto DHA ma kluczowe znaczenie zarówno w rozwoju płodów, jak i niemowląt, jak również

3 - 2 - utrzymywaniu funkcji poznawczych u osób dorosłych. Id. Kwasy tłuszczowe omega-3, w tym DHA i EPA, mają również właściwości przeciwzapalne. Patrz, np. Id. i Simopoulos, A.P., J. Am. Coll. Nutr. 21: (2002). Ze względu na to, że kwasy tłuszczowe omega-3 nie są syntetyzowane de novo w ludzkim organizmie, te kwasy tłuszczowe muszą pochodzić ze źródeł pożywienia. [0005] Olej lniany i oleje z ryb są uważane za dobre źródła żywieniowe kwasów tłuszczowych omega-3. Olej lniany nie zawiera żadnego EPA, DHA, DPA, lub ARA ale zawiera raczej kwas linolenowy (C18:3 n-3), blok budulcowy pozwalający organizmowi na wytwarzanie EPA. Istnieją jednak dowody, że szybkość konwersji metabolicznej może być mała i zmienna, szczególnie wśród tych [osobników] z problemami zdrowotnymi. Oleje z ryb różnią się w duży stopniu co do rodzaju i poziomu składu kwasów tłuszczowych, w zależności od określonych gatunków i ich diety. Na przykład, ryby pochodzące z akwakultury mają tendencję do posiadania niższego poziomu kwasów tłuszczowych omega-3 niż te ze środowiska dzikiego. Ponadto oleje z ryb obarczone są ryzykiem takim, że zawierają zanieczyszczenia środowiskowe, i mogą być powiązane z problemami ze stabilnością i rybim zapachem lub smakiem. [0006] Traustochytrydy to mikroorganizmy z rzędu Thraustochytriales. Traustochytrydy obejmują członków rodzaju Schizochytrium i są uznawane za alternatywne źródło kwasów tłuszczowych omega-3, w tym DHA. Patrz Patent US 5,130,242. Oleje wytwarzane z tych morskich mikroorganizmów heterotroficznych często mają prostszy profil wielonienasyconych kwasów tłuszczowych niż odpowiadające oleje z ryb lub mikroalg. Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: (1999). Informowano, że szczepy gatunków traustochytrydów wytwarzają kwasy tłuszczowe omega-3 jako wysoki procent całkowitych kwasów tłuszczowych wytwarzany przez organizmy. Patent US 5,130,242; Huang, J. i wsp., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: (2001); Huang, J. i wsp., Mar. Biotechnol. 5: (2003). Jednak izolowane traustochytrydy różnią się co do tożsamości i ilości wytwarzanych LC-PUFA tak, że niektóre opisane uprzednio szczepy mogą mieć niepożądane poziomy kwasów tłuszczowych omega-6 i/lub mogą wykazywać niską produktywność w hodowli. Tak więc, istnieje ciągłe zapotrzebowanie na izolację traustochytrydów wykazujących wysoką produktywność i pożądane profile LC-PUFA. KRÓTKIE PODSUMOWANIE WYNALAZKU [0007] Wynalazek dotyczy oleju drobnoustrojowego jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 1. [0008] Ujawnienie dotyczy również izolowanego traustochytrydowego mikroorganizmu z gatunku traustochytrydów zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695 lub szczepu pochodzącego od niego, przy czym ogólne kwasy tłuszczowe wytwarzane przez wymieniony mikroorganizm lub szczep pochodzący od niego zawierają około 10% lub mniej wagowo kwasu eikozapentaenowego. [0009] Ujawnienie dotyczy również izolowanego traustochytrydowego mikroorganizmu o charakterystyce z gatunku traustochytrydów zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695, przy czym ogólne kwasy tłuszczowe wytwarzane przez wymieniony

4 - 3 - mikroorganizm lub szczep pochodzący od niego zawierają około 10% lub mniej wagowo kwasu eikozapentaenowego. [0010] Ujawnienie dotyczy również izolowanego traustochytrydowego mikroorganizmu, lub szczepu pochodzącego od niego, zawierającego frakcję trójglicerydową, przy czym zawartość kwasu dokozaheksaenowego frakcji trójglicerydowej wynosi co najmniej około 40% wagowo, przy czym zawartość kwasu dokozapentaenowego n-6 frakcji trójglicerydowej wynosi od co najmniej około 0,5% wagowo do około 6% wagowo, i przy czym ogólne kwasy tłuszczowe wytwarzane przez wymieniony mikroorganizm lub szczep pochodzący od niego zawierają około 10% lub mniej wagowo kwasu eikozapentaenowego. [0011] Ujawnienie dotyczy również izolowanego traustochytrydowego mikroorganizmu z tego samego gatunku traustochytrydów zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695 lub szczepu pochodzącego od niego, przy czym ogólne kwasy tłuszczowe wytwarzane przez wymieniony mikroorganizm lub szczep pochodzący od niego zawierają około 10% lub mniej wagowo kwasu eikozapentaenowego. [0012] W niektórych przykładach wykonania szczep pochodzący z izolowanego traustochytrydowego mikroorganizmu według ujawnienia oznacza zmutowany szczep. [0013] Ujawnienie dotyczy również izolowanego mikroorganizmu zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697, lub PTA [0014] Ujawnienie dotyczy również traustochytrydowej biomasy zawierającej dowolne z traustochytrydowych mikroorganizmów według ujawnienia lub ich mieszanin. [0015] Ujawnienie dotyczy również biomasy izolowanych traustochytrydów, przy czym co najmniej około 50% wagowo suchej masy komórek biomasy stanowią kwasy tłuszczowe, i przy czym co najmniej około 50% wagowo kwasów tłuszczowych stanowią kwasy tłuszczowe omega-3. W niektórych przykładach wykonania co najmniej około 50% wagowo kwasów tłuszczowych stanowi kwas dokozaheksaenowy. Ujawnienie dotyczy również biomasy izolowanych traustochytrydów, przy czym co najmniej około 25% wagowo suchej masy komórek biomasy oznacza kwas dokozaheksaenowy. [0016] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy również biomasy izolowanych traustochytrydów, przy czym około 10% lub mniej wagowo kwasów tłuszczowych stanowi kwas eikozapentaenowy, i przy czym stosunek wagowy kwasu dokozaheksaenowego do kwasu eikozapentaenowego wynosi co najmniej około 5:1. [0017] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy również biomasy izolowanych traustochytrydów, przy czym około 1,5% lub mniej wagowo kwasów tłuszczowych stanowi kwas arachidonowy, i przy czym stosunek wagowy kwasu dokozaheksaenowego do kwasu arachidonowego wynosi co najmniej około 20:1. [0018] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy również biomasy izolowanych traustochytrydów zawierającej kwas dokozaheksaenowy i kwas dokozapentaenowy n-6 w stosunku wagowym co najmniej około 10:1. [0019] Ujawnienie dotyczy również hodowli izolowanych traustochytrydów, zawierającej

5 - 4 - dowolne z traustochytrydowych mikroorganizmów według wynalazku lub ich mieszanin. W niektórych przykładach wykonania hodowla zawiera co najmniej około 5% rozpuszczonego tlenu. [0020] Ujawnienie dotyczy również produktu spożywczego, kosmetyku lub kompozycji farmaceutycznej dla zwierząt lub ludzi, zawierających dowolne z traustochytrydowych mikroorganizmów lub biomas według ujawnienia lub ich mieszaniny. [0021] Wynalazek dotyczy oleju drobnoustrojowego zawierającego frakcję trójglicerydową co najmniej 70% wagowo, przy czym zawartość kwasu dokozaheksaenowego frakcji trójglicerydowej wynosi co najmniej 50% wagowo, i przy czym zawartość kwasu dokozapentaenowego n-6 frakcji trójglicerydowej wynosi od 0,5% wagowo do 6% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera ponadto zawartość kwasu arachidonowego frakcji trójglicerydowej około 1,5% lub mniej wagowo. [0022] Wynalazek dotyczy również oleju drobnoustrojowego zawierającego frakcję trójglicerydową co najmniej 70% wagowo, przy czym zawartość kwasu dokozaheksaenowego frakcji trójglicerydowej wynosi co najmniej 40% wagowo, przy czym zawartość kwasu dokozapentaenowego n-6 frakcji trójglicerydowej wynosi od co najmniej 0,5% wagowo to 6% wagowo, i przy czym stosunek kwasu dokozaheksaenowego do kwasu dokozapentaenowego n-6 wynosi więcej niż 6:1. [0023] Ujawnienie dotyczy również oleju drobnoustrojowego zawierającego frakcję trójglicerydową co najmniej około 70% wagowo, przy czym zawartość kwasu dokozaheksaenowego frakcji trójglicerydowej wynosi co najmniej około 60% wagowo. [0024] W niektórych przykładach wykonania co najmniej około 20% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej oleju drobnoustrojowego zawiera kwas dokozaheksaenowy w dwóch pozycjach w trójglicerydzie, wybranych z dowolnych dwóch pozycji sn-1, sn-2, i sn-3. W niektórych przykładach wykonania co najmniej około 5% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej oleju drobnoustrojowego zawiera kwas dokozaheksaenowy we wszystkich trzech pozycjach sn-1, sn-2, i sn-3 w trójglicerydzie. [0025] W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera ponadto około 5% lub mniej wagowo kwasu heptadekanowego. [0026] Wynalazek dotyczy również produktu spożywczego, kosmetyku lub kompozycji farmaceutycznej dla zwierząt lub ludzi zawierającej dowolne z olejów drobnoustrojowych według wynalazku. W niektórych przykładach wykonania produkt spożywczy oznacza mieszankę dla niemowląt. W niektórych przykładach wykonania mieszanka dla niemowląt jest odpowiednia dla wcześniaków. W niektórych przykładach wykonania produkt spożywczy oznacza mleko, napój, napój leczniczy, napój odżywczy, lub ich kombinację. W niektórych przykładach wykonania produkt spożywczy oznacza dodatek do pożywienia dla zwierząt lub ludzi. W niektórych przykładach wykonania produkt spożywczy oznacza dodatek żywieniowy. W niektórych przykładach wykonania produkt spożywczy oznacza paszę dla zwierząt. W niektórych przykładach wykonania pasza dla zwierząt oznacza paszę dla akwakultury. W niektórych przykładach wykonania pasza dla zwierząt oznacza paszę dla

6 - 5 - zwierząt domowych, paszę dla zwierząt zoologicznych, paszę dla zwierząt roboczych, paszę dla zwierząt gospodarskich, lub ich kombinację. [0027] Ujawnienie dotyczy również sposobu wytwarzania oleju drobnoustrojowego zawierającego kwasy tłuszczowe omega-3, sposób obejmujący: (a) hodowlę dowolnego z izolowanych traustochytrydowych mikroorganizmów według wynalazku lub ich mieszanin w hodowli, w celu wytworzenia biomasy, i (b) ekstrahowanie oleju zawierającego kwasy tłuszczowe omega-3 z biomasy. W niektórych przykładach wykonania hodowla zawiera co najmniej około 5% rozpuszczonego tlenu. W niektórych przykładach wykonania ph hodowli utrzymuje się na poziomie około 6,5 do około 8,5. W niektórych przykładach wykonania temperaturę hodowli utrzymuje się na poziomie około 17 C do około 30 C. W niektórych przykładach wykonania hodowla zawiera glukozę w stężeniu około 5 g/l do około 50 g/l. [0028] Ujawnienie dotyczy również sposobu wytwarzania oleju drobnoustrojowego zawierającego kwasy tłuszczowe omega-3, sposób obejmujący ekstrahowanie oleju zawierającego kwasy tłuszczowe omega-3 z dowolnej z biomas według ujawnienia. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy jest ekstrahowany przy użyciu sposobu ekstrakcji heksanem. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy jest ekstrahowany przy użyciu sposobu ekstrakcji bez rozpuszczalnika. [0029] W niektórych przykładach wykonania sucha masa komórek biomasy izolowana z każdego litra dowolnej z hodowli według ujawnienia wynosi co najmniej około 50 g po hodowaniu przez 7 dni w około 17 C do około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5 do około ph 8,0 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. [0030] W niektórych przykładach wykonania dowolna z izolowanych hodowli według ujawnienia wykazuje produktywność kwasów tłuszczowych omega-3 co najmniej około 2 g/l/dzień po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C do około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5 do około ph 8,0 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. [0031] Olej drobnoustrojowy według wynalazku może być wytwarzany sposobem według ujawnienia. [0032] Ujawnienie dotyczy również stosowania dowolnych z izolowanych mikroorganizmów, biomas, lub olejów drobnoustrojowych według wynalazku, lub ich mieszanin, do wytwarzania leku do leczenia stanu zapalnego, lub stanu, który jest z nim powiązany. [0033] Ujawnienie dotyczy również stosowania dowolnych z izolowanych mikroorganizmów, biomas, lub olejów drobnoustrojowych według wynalazku, lub ich mieszanin, do leczenia stanu zapalnego, lub stanu, który jest z nim powiązany. [0034] Ujawnienie dotyczy również dowolnych z izolowanych mikroorganizmów, biomas, lub olejów drobnoustrojowych według wynalazku, lub ich mieszanin, do stosowania w leczeniu stanu zapalnego, lub stanu, który jest z nim powiązany. [0035] Ujawnienie dotyczy również sposobu do leczenia stanu zapalnego lub stanu, który jest

7 - 6 - z nim powiązany u osobnika, który tego wymaga, obejmującego podawanie osobnikowi dowolnych z izolowanych mikroorganizmów, biomas, lub olejów drobnoustrojowych według wynalazku, lub ich mieszanin, i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0036] Tak więc, wynalazek dotyczy oleju drobnoustrojowego jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 1. Ponadto ujawnienie dotyczy izolowanych traustochytrydowych mikroorganizmów, jak również ich szczepów i mutantów, jak również biomas, olejów drobnoustrojowych, kompozycji i ich hodowli. Wynalazek dotyczy również sposobów wytwarzania olejów drobnoustrojowych z traustochytrydów według ujawnienia, i sposobów stosowania olejów drobnoustrojowych. Traustochytrydy przedstawione w opisie są wysoce produktywne w porównaniu do wcześniejszych izolatów i wytwarzają unikatowe profile kwasów tłuszczowych, charakteryzujące się częściowo wysokimi poziomami kwasów tłuszczowych omega-3, a zwłaszcza wysokimi poziomami DHA. Traustochytrydowe mikroorganizmy [0037] Ujawnienie dotyczy izolowanych traustochytrydów, w tym mutantów, rekombinantów, i ich wariantów. [0038] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy traustochytrydu z gatunku zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA Izolowany traustochytryd jest również znany w opisie jako Schizochytrium sp. ATCC PTA Traustochytryd powiązany z ATCC numer akcesyjny PTA-9695 został zdeponowany na mocy Traktatu Budapeszteńskiego w dniu 7 stycznia, 2009 r. w Amerykańskiej Kolekcji Czystych Kultur, Depozyt Patentowy, University Boulevard, Manassas, VA [0039] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy izolowanego traustochytrydowego szczepu zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy izolowanego traustochytrydowego mikroorganizmu z tego samego gatunku jak traustochytryd zdeponowany pod numerem akcesyjnym ATCC PTA [0040] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy izolowanego traustochytrydu mającego charakterystykę z gatunku zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695 lub szczepu pochodzącego od niego. Charakterystyka gatunku traustochytrydowego zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695 obejmuje jego wzrost i właściwości fenotypowe (przykłady właściwości fenotypowych obejmują właściwości morfologiczne i reprodukcyjne), jego właściwości fizyczne i chemiczne (takie jak sucha masa i profile lipidów), i jego sekwencje genów. W niektórych przykładach wykonania izolowane traustochytrydy według ujawnienia mają zasadniczo identyczne właściwości fenotypowe jak traustochytrydy zdeponowane pod numerem akcesyjnym ATCC PTA W niektórych przykładach wykonania izolowane traustochytrydy według ujawnienia mają zasadniczo identyczne właściwości wzrostu jak traustochytryd zdeponowany pod numerem akcesyjnym ATCC PTA-9695.

8 - 7 - [0041] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy mutanta, wariantu, lub rekombinowanego izolowanego traustochytrydu według ujawnienia, przy czym kwasy tłuszczowe ogółem wytwarzane przez mutanta, wariant, lub rekombinanta zawierają około 10% lub mniej wagowo kwasu eikozapentaenowego. Zmutowane szczepy mogą być wytwarzane za pomocą dobrze znanych procedur. Powszechne procedury obejmują napromieniowanie; obróbkę w wysokich temperaturach; i traktowanie mutagenem. Wariantowe szczepy mogą oznaczać inne naturalnie występujące izolaty i/lub subizolaty z gatunku przedstawionego w opisie. Rekombinowane szczepy mogą być wytwarzane za pomocą dowolnych dobrze znanych sposobów z zakresu biologii molekularnej, do ekspresji egzogennych genów lub zmiany funkcji lub ekspresji endogennego genu. W niektórych przykładach wykonania mutant, wariant, lub rekombinowany szczep wytwarza większą ilość kwasów tłuszczowych omega-3, w tym DHA i/lub EPA, niż szczep typu dzikiego. W niektórych przykładach wykonania mutant, wariant, lub rekombinowany szczep wytwarza mniejszą ilość jednego lub większej liczby kwasów tłuszczowych, taką jak mniejsze ilości EPA, ARA, DPA n-6, lub ich kombinacji. W niektórych przykładach wykonania mutant, wariant, lub rekombinowany szczep wytwarza więcej suchej masy komórek na litr hodowli niż szczep typu dzikiego. Taki mutant, wariant, lub rekombinowane szczepy stanowią przykłady szczepów pochodzących z izolowanego traustochytrydu według ujawnienia. [0042] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy zmutowanego szczepu traustochytrydu zdeponowanego pod numerem akcesyjnym ATCC PTA W dalszych przykładach wykonania zmutowany szczep oznacza szczep zdeponowany pod numerami akcesyjnymi ATCC PTA-9696, PTA-9697, lub PTA Traustochytrydowe szczepy powiązane z numerami akcesyjnymi ATCC PTA-9696, PTA-9697, i PTA-9698 były zdeponowane na mocy Traktatu Budapeszteńskiego w dniu 7 stycznia, 2009 r. w Amerykańskiej Kolekcji Czystych Kultur, Depozyt Patentowy, University Boulevard, Manassas, VA Te zdeponowane zmutowane szczepy to pochodne traustochytrydów zdeponowanych pod numerem akcesyjnym ATCC PTA [0043] W niektórych przykładach wykonania izolowany traustochytryd według ujawnienia, w tym jego mutanty, warianty, lub rekombinanty, zawiera profil kwasów tłuszczowych w jednej lub większej liczbie frakcji izolowanych z traustochytrydu. Jedna lub większa liczba frakcji izolowanych z traustochytrydu obejmuje ogólną frakcję kwasów tłuszczowych, frakcję estrów steroli, frakcję trójglicerydową, frakcję wolnych kwasów tłuszczowych, frakcję steroli, frakcję diglicerydów, frakcję polarną (w tym frakcję fosfolipidową), i ich kombinacje. Hodowle traustochytrydów i izolowane biomasy traustochytrydowe [0044] Ujawnienie dotyczy ponadto hodowli zawierającej jeden lub większą liczbę izolowanych traustochytrydów według ujawnienia. Różne parametry fermentacji w zakresie zaszczepiania, prowadzenia hodowli i odzyskiwania mikroflory są znane w stanie techniki, takie jak opisane w patencie US 5,130,242. Można stosować dowolne konwencjonalne pożywki do wzrostu traustochytrydów. Ciekłe lub stałe pożywki mogą zawierać naturalną lub sztuczną wodę morską. Źródła węgla obejmują, nieograniczająco, glukozę, fruktozę, ksylozę, sacharozę, maltozę, skrobię rozpuszczalną, melasy, fuktozę, glukozaminę, dekstran, tłuszcze,

9 - 8 - oleje, glicerol, octan sodu, i mannitol. Źródła azotu obejmują, nieograniczająco, pepton, ekstrakt drożdżowy, polipepton, ekstrakt słodowy, ekstrakt z mięsa, kwasowy hydrolizat kazeiny, płyn ze sfermentowanej kukurydzy, organiczne źródła azotu, glutaminian sodu, mocznik, nieorganiczne źródła azotu, octan amonu, siarczan amonu, chlorek amonu, azotan amonu, siarczan sodu. Typowe pożywki pokazano w Tabeli 1: Tabela 1: Pożywki do naczyń [hodowlanych] Składnik stężenie zakresy NaCl g/l 12,5 0-25, 5-20, lub KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3, lub 0,5-2 MgSO 4 7H 2 O g/l 5,0 0-10, 2-8, lub 3-6 (NH 4 ) 2 SO 4 g/l 0,6 0-10, 0,25-5, lub 0,5-3 CaCl 2 g/l 0,29 0,1-5, 0,15-3, lub 0,2-1 T 154 (ekstrakt drożdżowy) g/l 6,0 0-20, 1-15, lub 5-10 KH 2 PO 4 g/l 1,2 0,1-10, 0,5-5, lub 1-3 Po autoklawowaniu (Metale) Kwas cytrynowy mg/l 3,5 0,1-100, 1-50, lub 2-25 FeSO 4 7H 2 O mg/l 10,30 0,1-100, 1-50, lub 5-25 MnCl 2 4H 2 O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50, lub 2-25 ZnSO 4 7H 2 O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50, lub 2-25 CoCl 2 6H 2 O mg/l 0,04 0,001-1, 0,005-0,5, lub 0,01-0,1 Na 2 MoO 4 2H 2 O mg/l 0,04 0,001-1, 0,005-0,5, lub 0,01-0,1 CuSO 4 5H 2 O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, lub 1-25 NiSO 4 6H 2 O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, lub 1-25 Po autoklawowaniu (witaminy) Tiamina** mg/l 9,75 0,1-100, 1-50, lub 5-25 Witamina B12** mg/l 0,16 0,1-100, 0,1-10, lub 0,1-1 Ca1/2-pantotenian** mg/l 3,33 0,1-100, 0,1-50, lub 1-10 Po autoklawowaniu (węgiel) Glukoza g/l 30, , , lub Składnik Stężenie Zasilanie w azot:

10 - 9 - NH 4 OH ml/l 21, , , lub Typowe warunki hodowli będą obejmować poniższe: ph około 6,5 - około 8,5, około 6,5 - około 8,0, lub około 7,0 - około 7,5 temperatura: około 17 - około 30 stopni Celsjusza, około 20 - około 25 stopni Celsjusza, lub około 22 do około 23 stopni Celsjusza rozpuszczony tlen: około 5 - około 100% wysycenia, około 10 - około 80% wysycenia, lub około 20 - około 50% wysycenia kontrola glukozą przy: około 5 - około 50 g/l, około 10 - około 40 g/l, lub około 20 - około 35 g/l. [0045] W niektórych przykładach wykonania pożywka hodowlana zawiera co najmniej około 5%, co najmniej około 10%, co najmniej około 20%, co najmniej około 30%, co najmniej około 40%, co najmniej około 50%, co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 80%, lub co najmniej około 90% rozpuszczonego tlenu, jako procent poziomu wysycenia. W niektórych przykładach wykonania pożywka hodowlana zawiera od około 5% do około 20%, około 5% do około 50%, około 5% do około 100%, około 10% do około 20%, około 10% do około 50%, około 10% do około 100%, około 20% do około 50%, lub około 20% do około 100% rozpuszczonego tlenu, jako procent poziomu wysycenia. [0046] Ujawnienie dotyczy ponadto izolowanej biomasy traustochytrydu według ujawnienia. Biomasa izolowanych traustochytrydów według ujawnienia oznacza zebraną komórkową biomasę uzyskaną dowolnym konwencjonalnym sposobem do izolowania traustochytrydowej biomasy, takim jak opisany w patencie US 5,130,242 i publikacji zgłoszenia patentowego US 2002/ [0047] W niektórych przykładach wykonania sucha masa komórek biomasy izolowanej z każdego litra hodowli wynosi co najmniej około 50 g, co najmniej około 60 g, co najmniej około 70 g, co najmniej około 80 g, co najmniej około 100 g, co najmniej około 120 g, co najmniej około 140 g, co najmniej około 160 g, co najmniej około 180 g, lub co najmniej około 200 g po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C do około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5 do około 8,5 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. W niektórych przykładach wykonania sucha masa komórek biomasy izolowanej z każdego litra hodowli wynosi co najmniej około 50 g, co najmniej około 60 g, co najmniej około 70 g, co najmniej około 80 g, co najmniej około 100 g, co najmniej około 120 g, co najmniej około 140 g, co najmniej około 160 g, co najmniej około 180 g, lub co najmniej około 200 g po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C, w około 18 C, w około 19 C, w około 20 C, w około 21 C, w około 22 C, w około 23 C, w około 24 C, w około 25 C, w około 26 C, w około 27 C, w około 28 C, w około 29 C, lub w około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5, około ph 7, około ph 7,5, około ph 8,0, lub około ph 8,5 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych.

11 W niektórych przykładach wykonania sucha masa komórek biomasy izolowanej z każdego litra hodowli wynosi od około 50 g do około 200 g po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C do około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5 do około ph 8,5 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. W niektórych przykładach wykonania sucha masa komórek biomasy izolowana z każdego litra hodowli wynosi od około 50 g do około 200 g po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C, w około 18 C, w około 19 C, w około 20 C, w około 21 C, w około 22 C, w około 23 C, w około 24 C, w około 25 C, w około 26 C, w około 27 C, w około 28 C, w około 29 C, lub w około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5, około ph 7, około ph 7,5, około ph 8,0, lub około ph 8,5 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. [0048] W niektórych przykładach wykonania izolowana hodowla traustochytrydów ma produktywność kwasów tłuszczowych omega-3 co najmniej około 2 g/l/dziennie, co najmniej około 4 g/l/dziennie, lub co najmniej około 8 g/l/dziennie po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C do około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5 do około ph 8,5 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. W niektórych przykładach wykonania izolowana hodowla traustochytrydów ma produktywność kwasów tłuszczowych omega-3 pomiędzy około 1 g/l/dziennie do około 20 g/l/dziennie, około 2 g/l/dziennie do około 15 g/l/dziennie, około 2 g/l/dziennie do około 10 g/l/dziennie, około 3 g/l/dziennie do około 10 g/l/dziennie, lub około 4 g/l/dziennie do około 9 g/l/dziennie, po hodowaniu przez około 7 dni w około 17 C do około 30 C w pożywce hodowlanej około ph 6,5 do około ph 8,5 zawierającej źródła węgla, azotu i substancji odżywczych, i około 950 ppm do około 8500 ppm jonów chlorkowych. [0049] W niektórych przykładach wykonania objętość fermentacji (objętość hodowli) wynosi co najmniej około 2 litry, co najmniej około 10 litrów, co najmniej około 50 litrów, co najmniej około 100 litrów, co najmniej około 200 litrów, co najmniej około 500 litrów, co najmniej około 1000 litrów, co najmniej około litrów, co najmniej około litrów, co najmniej około litrów, co najmniej około litrów, co najmniej około litrów, co najmniej około litrów, lub co najmniej około litrów. W niektórych przykładach wykonania objętość fermentacji wynosi około 2 litry do około 300,000 litrów, około 2 litrów, około 10 litrów, około 50 litrów, około 100 litrów, około 200 litrów, około 500 litrów, około 1000 litrów, około litrów, około litrów, około litrów, około litrów, około litrów, około litrów, około litrów, lub około litrów. [0050] W niektórych przykładach wykonania ujawnienie dotyczy biomasy izolowanych traustochytrydów zawierających profil kwasów tłuszczowych według ujawnienia. W niektórych przykładach wykonania co najmniej około 50%, co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, lub co najmniej około 80% suchej masy komórek biomasy stanowią kwasy tłuszczowe. W niektórych przykładach wykonania więcej niż około 50%, więcej niż około 55%, lub więcej niż około 60% suchej masy komórek biomasy stanowią kwasy tłuszczowe. W niektórych przykładach wykonania od około 50% do około 60%, około 50%

12 do około 70%, około 50% do około 80%, około 55% do około 70%, około 55% do około 80%, około 60% do około 70%, lub około 60% do około 80% wagowo suchej masy komórek biomasy stanowią kwasy tłuszczowe. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera co najmniej około 50%, co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, lub co najmniej około 80% wagowo kwasów tłuszczowych jako kwasy tłuszczowe omega-3. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera od około 50% do około 60%, około 50% do około 70%, około 50% do około 80% wagowo kwasów tłuszczowych jako kwasy tłuszczowe omega-3. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera co najmniej około 50%, co najmniej około 55%, co najmniej około 60%, co najmniej około 65%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, lub co najmniej około 80% wagowo kwasów tłuszczowych jako DHA. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera od około 50% do około 60%, około 50% do około 70%, lub około 50% do około 80% wagowo kwasów tłuszczowych jako DHA. W niektórych przykładach wykonania co najmniej około 25%, co najmniej około 30%, co najmniej około 40%, co najmniej około 50%, lub co najmniej około 60% wagowo suchej masy komórek biomasy stanowi kwas dokozaheksaenowy. W niektórych przykładach wykonania około 25% do około 65%, około 25% do około 50%, około 30% do około 40%, lub około 25% do około 35% wagowo suchej masy komórek biomasy stanowi kwas dokozaheksaenowy. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera około 10% lub mniej, około 9% lub mniej, około 8% lub mniej, około 7% lub mniej, około 6% lub mniej, około 5% lub mniej, około 4% lub mniej, około 3% lub mniej, około 2% lub mniej, lub około 1% lub mniej wagowo kwasów tłuszczowych jako EPA. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera od około 1% do około 10%, około 1% do około 5%, około 2% do około 5%, około 3% do około 5%, lub około 3% do około 10% wagowo kwasów tłuszczowych jako EPA. W niektórych przykładach wykonania biomasa jest zasadniczo wolna od EPA. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera stosunek wagowy DHA do EPA co najmniej około 5:1, co najmniej około 7:1, co najmniej około 10:1, co najmniej około 11:1, co najmniej około 14:1, co najmniej około 15:1, co najmniej około 17:1, co najmniej około 20:1, co najmniej około 25:1, co najmniej około 50:1, lub co najmniej około 100:1, przy czym biomasa zawiera około 10% lub mniej wagowo kwasów tłuszczowych jako EPA. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera od około 0,1% do 0,2%, około 0,1% do około 0,3%, około 0,1% do około 0,4%, około 0,1% do około 0,5%, lub około 0,1% do około 1,5% wagowo kwasów tłuszczowych jako ARA. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera około 1,5% lub mniej, około 1% lub mniej, około 0,5% lub mniej, około 0,4% lub mniej, około 0,3% lub mniej, około 0,2% lub mniej, lub około 0,1% lub mniej wagowo kwasów tłuszczowych jako ARA. W niektórych przykładach wykonania biomasa jest zasadniczo wolna od ARA. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera stosunek wagowy DHA do ARA co najmniej około 20:1, co najmniej około 40:1, co najmniej około 60:1, co najmniej około 80:1, co najmniej około 100:1, co najmniej około 150:1, co najmniej około 200:1, co najmniej około 250:1, lub co najmniej około 300:1. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera od około 0,5% do około 1%, około 0,5% do około 2%, około 0,5% do około 5%, około 0,5% do około 6%, około 1% do około 5%, około 1% do około 6%, około 2% do około 5%, lub około 2% do około 6% wagowo kwasów tłuszczowych

13 jako DPA n-6. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera około 6% lub mniej, około 5% lub mniej, około 2% lub mniej, około 1% lub mniej, lub około 0,5% lub mniej wagowo kwasów tłuszczowych jako DPA n-6. W niektórych przykładach wykonania biomasa jest zasadniczo wolna od DPA n-6. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera stosunek wagowy DHA do DPA n-6 więcej niż około 6:1, co najmniej około 8:1, co najmniej około 10:1, co najmniej około 15:1, co najmniej około 20:1, co najmniej około 25:1, co najmniej około 50:1, lub co najmniej około 100:1. W niektórych przykładach wykonania biomasa zawiera kwasy tłuszczowe mające około 5% lub mniej, około 4% lub mniej, około 3% lub mniej, lub około 2% lub mniej wagowo każdego z kwasów linolowego (18:2 n-6), kwasu linolenowego (18:3 n-3), kwasu eikozenowego (20:1 n-9), i kwasu erukowego (22:1 n- 9). [0051] Charakterystyka izolowanej biomasy według ujawnienia jest powiązana z endogennymi lub natywnymi właściwościami izolowanej biomasy raczej niż egzogennie wprowadzanych materiałów. Oleje drobnoustrojowe [0052] Ujawnienie dotyczy ponadto sposobów wytwarzania olejów drobnoustrojowych. W niektórych przykładach wykonania sposób obejmuje hodowanie traustochytrydu według ujawnienia w hodowli, dla wytworzenia biomasy i ekstrahowanie oleju zawierającego kwasy tłuszczowe omega-3 z biomasy. Olej może być ekstrahowany ze świeżo zebranej biomasy lub może być ekstrahowany z uprzednio zebranej biomasy, którą przechowywano w warunkach, które zapobiegają psuciu. Można stosować znane sposoby do hodowania traustochytrydu według ujawnienia, do izolowania biomasy z hodowli, do ekstrahowania oleju drobnoustrojowego z biomasy, i do analizowania profilu kwasów tłuszczowych olejów ekstrahowanych z biomasy. Zob. np. patent US 5,130,242. [0053] Wynalazek dotyczy ponadto oleju drobnoustrojowego zawierającego profil kwasów tłuszczowych według wynalazku. Olej drobnoustrojowy według wynalazku może oznaczać dowolny olej pochodzący z mikroorganizmu, w tym, na przykład: surowy olej ekstrahowany z biomasy mikroorganizmu bez dalszej obróbki; rafinowany olej, uzyskany przez traktowanie surowego oleju drobnoustrojowego dalszymi etapami obróbki takimi jak rafinowanie, wybielanie, i/lub dezodoryzowanie; rozcieńczony olej drobnoustrojowy uzyskany przez rozcieńczanie surowego lub rafinowanego oleju drobnoustrojowego; lub wzbogacony olej uzyskiwany, na przykład, przez traktowanie surowego lub rafinowanego oleju drobnoustrojowego dalszymi sposobami oczyszczania, dla zwiększenia stężenia kwasu tłuszczowego (takiego jak DHA) w oleju. [0054] W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję estrów steroli około 0%, co najmniej około 0,1%, co najmniej około 0,2%, co najmniej około 0,5%, co najmniej około 1%, co najmniej około 1,5%, co najmniej około 2%, lub co najmniej około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję estrów steroli od około 0% do około 1,5%, około 0% do około 2%, około 0% do około 5%, około 1% do około 1,5%, około 0,2% do około 1,5%, około 0,2% do około 2%, lub około 0,2% do około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy

14 zawiera frakcję estrów steroli mniej niż około 5%, mniej niż około 4%, mniej niż około 3%, lub mniej niż około 2% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową co najmniej około 65%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85%, lub co najmniej około 90% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową od około 65% do około 95%, około 75% do około 95%, lub około 80% do około 95% wagowo, lub około 97% wagowo, lub około 98% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję wolnych kwasów tłuszczowych co najmniej około 0,5%, co najmniej około 1%, co najmniej około 1,5%, co najmniej około 2%, co najmniej około 2,5%, lub co najmniej około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję wolnych kwasów tłuszczowych od około 0,5% do około 5%, około 0,5% do około 2,5%, około 0,5% do około 2%, około 0,5% do około 1,5%, około 0,5% do około 1%, około 1% do około 2,5%, około 1% do około 5%, około 1,5% do około 2,5%, około 2% do około 2,5%, lub około 2% do około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję wolnych kwasów tłuszczowych mniej niż około 5%, mniej niż około 4%, mniej niż około 3%, mniej niż około 2%, lub mniej niż około 1% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję steroli co najmniej około 0,5%, co najmniej około 1%, co najmniej około 1,5%, co najmniej około 2%, lub co najmniej około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję steroli od około 0,5% do około 1,5%, około 1% do około 1,5%, około 0,5% do około 2%, około 0,5% do około 5%, około 1% do około 2%, lub około 1% do około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję steroli mniej niż około 5%, mniej niż około 4%, mniej niż około 3%, mniej niż około 2%, lub mniej niż około 1% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję diglicerydów co najmniej około 1,5%, co najmniej około 2%, co najmniej około 2,5%, co najmniej około 3%, co najmniej około 3,5%, lub co najmniej około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję diglicerydów od około 1,5% do około 3%, około 2% do około 3%, około 1,5% do około 3,5%, około 1,5% do około 5%, około 2,5% do około 3%, około 2,5% do około 3,5%, lub około 2,5% do około 5% wagowo. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera substancje niezmydlające się mniej niż około 2%, mniej niż około 1,5%, mniej niż około 1%, lub mniej niż około 0,5% wagowo oleju. Klasy lipidów obecne w oleju drobnoustrojowym, takie jak frakcja trójglicerydowa, można rozdzielać za pomocą chromatografii typu flash i analizować za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), lub rozdzielać i analizować przy użyciu innych sposobów znanych w stanie techniki. [0055] W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, i ich kombinacji, zawiera co najmniej około 40%, co najmniej około 45%, co najmniej około 50%, co najmniej około 55%, co najmniej około 60%, co najmniej około 65%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, lub co najmniej około 80% wagowo DHA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub

15 jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, i ich kombinacji, zawiera od około 40% do około 45%, około 40% do około 50%, około 40% do około 60%, około 50% do około 60%, około 55% do około 60%, około 40% do około 65%, około 50% do około 65%, około 55% do około 65%, około 40% do około 70%, około 40% do około 80%, około 50% do około 80%, około 55% do około 80%, około 60% do około 80%, lub około 70% do około 80% wagowo DHA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję estrów steroli zawierającą około 45% lub mniej, około 40% lub mniej, około 35% lub mniej, około 30% lub mniej, około 25% lub mniej, około 20% lub mniej, około 15% lub mniej, lub około 13% lub mniej wagowo DHA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, i ich kombinacji, zawiera około 10% lub mniej, około 9% lub mniej, około 8% lub mniej, około 7% lub mniej, około 6% lub mniej, około 5% lub mniej, około 4% lub mniej, około 3% lub mniej, około 2% lub mniej, lub około 1% lub mniej wagowo EPA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, i ich kombinacji, zawiera od około 2% do około 3%, około 2% do około 3,5%, około 2,5% do około 3,5%, około 2% do około 6%, około 2,5% do około 6%, około 3,0% do około 6%, około 3,5% do około 6%, około 5% do około 6%, lub około 2% do około 10% wagowo EPA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, jest zasadniczo wolna od EPA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera stosunek wagowy DHA do EPA co najmniej około 5:1, co najmniej około 7:1, co najmniej około 9:1, co najmniej około 10:1, co najmniej około 15:1, co najmniej około 20:1, co najmniej około 25:1, co najmniej około 30:1, lub co najmniej około 50:1, przy czym olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji zawiera 10% lub mniej wagowo EPA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera stosunek wagowy DHA do EPA co najmniej około 5:1, ale mniej niż około 20:1. W niektórych przykładach wykonania stosunek wagowy DHA do EPA wynosi od około 5:1 do około 18:1, od około 7:1 do około 16:1, lub od około 10:1 do około 15:1. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji zawiera od około 0,1% do około 0,25%, około 0,2% do

16 około 0,25%, około 0,1% do około 0,5%, lub około 0,1% do około 1,5% wagowo ARA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera około 1,5% lub mniej, około 1% lub mniej, około 0,5% lub mniej, około 0,2% lub mniej, lub około 0,1% lub mniej wagowo ARA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, jest zasadniczo wolna od ARA. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera stosunek wagowy DHA do ARA co najmniej około 20:1, co najmniej około 30:1, co najmniej około 35:1, co najmniej około 40:1, co najmniej około 60:1, co najmniej około 80:1, co najmniej około 100:1, co najmniej około 150:1, co najmniej około 200:1, co najmniej około 250:1, lub co najmniej około 300:1. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera od około 0,5% do około 1%, około 0,5% do około 2%, około 0,5% do około 2,5%, około 0,5% do około 3%, około 0,5% do około 3,5%, około 0,5% do około 5%, około 0,5% do około 6%, około 1% do około 2%, około 2% do około 3%, około 2% do około 3,5%, około 1% do około 2,5%, około 1% do około 3%, około 1% do około 3,5%, około 1% do około 5%, lub około 1% do około 6% wagowo DPA n-6. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera około 6% lub mniej, około 5% lub mniej, około 3% lub mniej, około 2,5% lub mniej, około 2% lub mniej, około 1% lub mniej, lub około 0,5% lub mniej wagowo DPA n-6. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, jest zasadniczo wolna od DPA n-6. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera stosunek wagowy DHA do DPA n-6 więcej niż około 6:1, co najmniej około 8:1, co najmniej około 10:1, co najmniej około 15:1, co najmniej około 20:1, co najmniej około 25:1, co najmniej około 50:1, lub co najmniej około 100:1. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów

17 tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera około 5% lub mniej, około 4% lub mniej, około 3% lub mniej, około 2% lub mniej, około 1,5% lub mniej, około 1% lub mniej, lub około 0,5% lub mniej wagowo każdego z kwasów linolowego (18:2 n-6), kwasu linolenowego (18:3 n-3), kwasu eikozenowego (20:1 n-9), i kwasu erukowego (22:1 n-9). W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji wybrana z frakcji estrów steroli, frakcji trójglicerydowej, frakcji wolnych kwasów tłuszczowych, frakcji steroli, frakcji diglicerydów, frakcji polarnej (w tym frakcja fosfolipidowa), i ich kombinacji, zawiera około 5% lub mniej, około 4% lub mniej, około 3% lub mniej, około 2% lub mniej, około 1,5% lub mniej, lub około 1% lub mniej wagowo kwasu heptadekanowego (17:0). W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy i/lub jedna lub większa liczba jego frakcji zawierają około 0,01% do około 5% wagowo, około 0,05% do około 3% wagowo, lub około 0,1% do około 1% wagowo kwasu heptadekanowego. [0056] Cząsteczka trójglicerydu zawiera 3 centralne atomy węgla (C sn-1 H 2 R1-C sn-2 H 2 R2-CS sn- 3H 2 R3), co umożliwia utworzenie różnych izomerów pozycyjnych. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową, w której co najmniej około 20%, co najmniej około 30%, co najmniej około 35%, lub co najmniej około 40% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej zawiera DHA w dwóch pozycjach w trójglicerydzie (dwupodstawiony DHA) wybranych z dowolnych dwóch pozycji sn-1, sn-2, i sn-3, na podstawie względnych procentów powierzchni pików na chromatogramie HPLC. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową, w której od około 20% do około 40%, około 20% do około 35%, około 30% do około 40%, lub około 30% do około 35% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej zawiera DHA w dwóch pozycjach w trójglicerydzie, wybranych z dowolnych dwóch pozycji sn-1, sn-2, lub sn-3, na podstawie względnego procentu powierzchni pików na chromatogramie HPLC. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową, w której co najmniej około 5%, co najmniej około 10%, co najmniej około 15%, lub co najmniej około 20% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej zawiera DHA we wszystkich z pozycji sn-1, sn-2, i sn-3 (trójpodstawiony DHA), na podstawie względnego procentu powierzchni pików na chromatogramie HPLC. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową, w której od około 5% do około 20%, około 5% do około 15%, około 10% do około 20%, lub około 10% do około 15% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej zawiera DHA we wszystkich z pozycji sn-1, sn-2, i sn-3, na podstawie względnego procentu powierzchni pików na chromatogramie HPLC. Kontrastowo, elementy TAG zgłoszone w patencie US 6,582,941 w ogóle nie zawierają DHA w trzech pozycjach. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową, w której co najmniej około 50%, co najmniej około 55%, co najmniej około 60%, co najmniej około 65%, co najmniej około 70%, lub co najmniej około 75% trójglicerydów we frakcji trójglicerydowej zawiera DHA w jednej pozycji w trójglicerydzie, wybraną z dowolnej z pozycji sn-1, sn-2, lub sn-3, na podstawie względnego procentu powierzchni pików na chromatogramie HPLC. W niektórych przykładach wykonania olej drobnoustrojowy zawiera frakcję trójglicerydową, w której od około 50% do około 75%,