(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/25 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A23D 9/007 ( ) B01D 11/04 ( ) C11B 1/10 ( ) C11B 7/00 ( ) C11C 1/00 ( ) C11C 1/08 ( ) C11C 3/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Sposób wzbogacania w DHA (30) Pierwszeństwo: FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/42 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/12 (73) Uprawniony z patentu: PIERRE FABRE MEDICAMENT, Boulogne-Billancourt, FR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FLORENCE MARCIACQ, Brens, FR MATHIEU SOULAYRES, Québec, CA BERNARD FREISS, Castres, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Wojasińska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 Opis EP B1 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu umożliwiającego przemysłowe wzbogacanie roztworu estrów etylowych naturalnych kwasów tłuszczowych (olej rybny) w konkretny kwas tłuszczowy: kwas dokozaheksaenowy (potocznie określany jako DHA). [0002] Oleje pochodzenia morskiego są źródłami naturalnie bogatymi w kwasy tłuszczowe wielonienasycone. Najbardziej korzystne są kwasy tłuszczowe wielonienasycone o następujących wzorach: kwas α-linolowy kwas eikozapentaenowy (EPA) kwas dokozapentaenowy (DPA) kwas dokozaheksaenowy (DHA) [0003] Te kwasy tłuszczowe, niezbędne do dobrego funkcjonowania organizmu, nie są naturalnie syntetyzowane przez organizm ludzki. Ich dostarczanie związane jest zatem z codziennym przyjmowaniem z żywnością. Źródłami pokarmowymi kwasów tłuszczowych wielonienasyconych są oleje roślinne (zasadniczo dostarczają one kwasów tłuszczowych typu ω-6 i ω-9) i oleje rybne, które zawierają w szczególności duże ilości kwasów tłuszczowych typu ω-3. Te ostatnie są bardzo znane z uwagi na ich dobroczynny wpływ na zdrowie (choroby układu krążenia, choroby autoimmunologiczne, zapalenia itd.). Kwasy tłuszczowe wielonienasycone klasyfikuje się według położenia pierwszego wiązania podwójnego, licząc od końcowej grupy metylowej. Za-

3 2 tem, w nomenklaturze ω-x lub n-x, x odpowiada pozycji tego pierwszego wiązania nienasyconego. Większość istotnych biologicznie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych należy do rodziny ω-6 (kwas arachidonowy) lub ω-3 (EPA, DHA). Ponadto, w nomenklaturze zdefiniowano także liczbę atomów węgla tworzących łańcuch; zatem, EPA opisuje się jako C20:5, a DHA jako C22:6. Liczby 5 i 6 odpowiadają liczbie wiązań nienasyconych w łańcuchu węglowym, obecnych odpowiednio w EPA i DHA. Oleje rybne stosuje się zasadniczo do izolowania i zwiększania stężenia kwasów tłuszczowych typu ω-3. [0004] Konwencjonalne metody wzbogacania olejów rybnych (artykuł V.K. Mishra i wsp., Food Research International, 1993, 26, ) opierają się na selektywności w odniesieniu do długości łańcuchów kwasów tłuszczowych tworzących oleje lub do stopnia ich nienasycenia. Najczęściej wykorzystywane sposoby wzbogacania polegają na przeprowadzaniu na kwasach tłuszczowych lub ich estrach następujących procesów: - krystalizacja - ekstrakcja przeciwprądowa - destylacja molekularna - chromatografia absorpcyjna Najczęściej wykorzystuje się skojarzenie różnych sposobów, żeby uzyskać wysoki poziom wzbogacania. Ponadto, te sposoby wykazują następujące wady: Sposoby wymagające zastosowania wysokiej temperatury (destylacja) powodują powstanie wielu produktów rozpadu termicznego kwasów tłuszczowych (izomeryzacja, peroksydacja, oligomeryzacja). Dlatego też zaleca się przeprowadzanie procesów w niskiej temperaturze, korzystnie w temperaturze poniżej 100 C.

4 3 Wadą metod chromatograficznych jest stosowanie znacznych ilości rozpuszczalników, często toksycznych. Ponadto, produkcja na dużą skalę z wykorzystaniem takich metod jest problematyczna. [0005] Z tego powodu opracowano metody alternatywne. Opierają się one na zastosowaniu płynów nadkrytycznych: - sposób frakcjonowania z użyciem nadkrytycznego CO 2 - chromatografia nadkrytyczna [0006] Sposób frakcjonowania estrów etylowych kwasów tłuszczowych z użyciem nadkrytycznego CO 2 opisywano już obszernie w literaturze. Należy jednak zauważyć, że w większości z cytowanych sposobów opisuje się wzbogacanie w ω-3 lub w kwas eikozapentaenowy (EPA), a nie w DHA. Jednym z parametrów przeprowadzania frakcjonowania z użyciem nadkrytycznego CO 2 jest poziom nadkrytycznego CO 2. Ten poziom definiuje się poprzez stosunek przepływu CO 2 do przepływu wstrzykiwanego roztworu kwasów tłuszczowych. Zatem, przy podwyższonym poziomie nadkrytycznego CO 2 zwiększa się selektywność kosztem wydajności. Niski poziom nadkrytycznego CO 2 sprzyja wydajności, która zwiększa się, podczas gdy selektywność ulega zmniejszeniu. [0007] Zatem, Nilsson i wsp. (JAOCS 1988, 65(1), ) opisują proces wsadowy, umożliwiający otrzymanie kilku frakcji (od 0,1 do 0,2g) bogatych, odpowiednio, w EPA i DHA. W tym celu autorzy przeprowadzają procesy przy ciśnieniu wynoszącym od 220*10 5 Pa do 250*10 5 Pa. Ponadto, wykorzystują oni gradient temperatury w kolumnie do powodowania refluksu wewnętrznego (od 20 C na dole kolumny do 100 C na górze kolumny). Zdefiniowany poziom nadkrytycznego CO 2 jest bardzo wysoki, rzędu

5 4 Pewne doświadczenia umożliwiają otrzymanie z estrów etylowych, poddanych obróbce wstępnej mocznikiem, frakcji wykazujących zawartość DHA rzędu 90%, lecz przy poziomie nadkrytycznego CO 2 wynoszącym 500. Przy zastosowaniu niepoddanych obróbce estrów etylowych, autorzy opisują frakcje bogate w DHA (zawartość od 53 do 60%), jednak przy poziomie nadkrytycznego CO 2 rzędu Sposób ten wykazuje zatem następujące wady: jest to proces wsadowy. Poziom stosowanego nadkrytycznego CO 2 jest nadmiernie wysoki, przez co sposób wykazuje małą wydajność i nie nadaje się do wykorzystania przemysłowego. W istocie powoduje to dodatkowy wydatek energetyczny i przez to mniejszą produktywność. Temperatura 100 C na górze kolumny może powodować rozpad kwasów tłuszczowych. Chociaż jest to temperatura zalecana przez autorów. Zastosowane ciśnienie jest zbyt wysokie, a obniżenie go spowodowałoby zwiększenie poziomu nadkrytycznego CO 2. W tym artykule zaleca się ponadto zastosowanie gradientu temperatury wewnątrz kolumny, a szczególnie refluksu wewnętrznego, żeby poprawić rozdział i przez to wzbogacanie. Chociaż obecność takiego refluksu zmniejsza produktywność sposobu. [0008] Kado i wsp. (JP ) w swoim patencie opisują sposób wzbogacania estrów etylowych oleju rybnego w EPA i DHA. Zastrzegany zakres temperatury i ciśnienia podano jako C i 100*10 5 Pa-500*10 5 Pa. Autorzy zalecają przeprowadzenie kolejno dwóch ekstrakcji celem uzyskania podwyższonej zawartości. Pierwszą ekstrakcję przeprowadza się na surowcach, a drugą ekstrakcję na pozostałości z pierwszej operacji. Wysokość zastosowanej kolumny wynosi 3 m, a jej średnica wewnętrzna wynosi 50 mm. Zawiera ona 6 odrębnych komór grzew-

6 5 czych. Dwie kolejne ekstrakcje komplikują metodę i powodują, że nie jest ona stosowana w przemyśle. Poziom nadkrytycznego CO 2 zastosowany do uzyskania zwiększonej zawartości DHA jest wysoki (rzędu 127). Wydajność w zakresie DHA jest zatem niewielka. Autorzy zalecają ponadto zastosowanie gradientu temperatury (co pozwala uzyskać efekt rektyfikacji) w kolumnie. Produktywność jest zatem ograniczona. [0009] Lucien i wsp. (Australasian biotechnology, 1993, 3 (3), ) opisują sposób uzyskiwania wyciągów wzbogaconych w estry etylowe EPA i DHA z oleju z sardynek 17/12 (EPA/DHA). Refluks wewnętrzny, wytworzony przez komorę grzewczą umieszczoną na górze kolumny, pozwala ulepszyć uzyskaną zawartość kwasów tłuszczowych: można uzyskać zawartość, odpowiednio, EPA i DHA wynoszącą 42% i 54%. Najlepsze warunki działania w tej konfiguracji to 150*10 5 Pa, 40 C w kolumnie i temperatura refluksu wynosząca 100 C. Nie podano zastosowanego poziomu nadkrytycznego CO 2. W poniższej tabeli podano uzyskane wyniki: Ciśnienie Temperatura eks- Temperatura re- [EPA] [DHA] (Pa) trakcji ( C) fluksu ( C) (%) (%) 150* * * [0010] Ten sposób ma zatem następujące wady: temperatura 100 C na górze kolumny może powodować rozpad kwasów tłuszczowych. Chociaż jest to temperatura zalecana przez autorów. W tym artykule zaleca się ponadto zastosowanie gradientu temperatury wewnątrz kolumny, a szczególnie refluksu wewnętrznego, żeby poprawić rozdział i przez to wzbogacanie. Jednakże obecność takiego refluks zmniejsza produktywność sposobu.

7 6 [0011] Fleck i wsp. (Journal of Supercritical Fluids, 1998, 14 (1), 67-74) opisują sposób wzbogacania estrów etylowych oleju rybnego w EPA i DHA, przeciwprądowo w kolumnie frakcjonowania, z wykorzystaniem nadkrytycznego CO 2. Warunki operacyjne to 60 C, 145*10 5 Pa i poziom nadkrytycznego CO 2 rzędu 255. [0012] Na koniec, Zhu i wsp. (Proceedings of the 3rd International Symposium on supercritical fluids - Strasburg, 1994) opisują sposób ekstrakcji/frakcjonowania roztworu estrów etylowych kwasów tłuszczowych w celu uzyskania frakcji bogatych, odpowiednio, w EPA i w DHA. W tym celu stosuje się strumień CO 2, który ekstrahuje estry kwasów tłuszczowych znajdujących się w ekstraktorze, po czym ten strumień CO 2 zawierający estry jest frakcjonowany w kolumnie. Wewnątrz kolumny istnieje gradient temperatury i stosuje się programowanie ciśnienia, w celu ulepszenia selektywności względem pożądanych związków. Ten proces wsadowy umożliwia izolowanie frakcji odpowiadającej 12% obecnego DHA z czystością powyżej 50%. Sposób ten ma zatem następujące wady: jest to proces wsadowy i dlatego może obejmować programowanie ciśnienia. Poziom zastosowanego nadkrytycznego CO 2 jest zbyt wysoki (211), metoda wykazuje zatem małą wydajność, przez co nie nadaje się do zastosowania w przemyśle. W rzeczywistości powoduje to dodatkowy wydatek energetyczny i przez to mniejszą produktywność. W tym artykule zaleca się zresztą zastosowanie gradientu temperatury wewnątrz kolumny, a szczególnie refluksu wewnętrznego, żeby poprawić rozdział, a przez to wzbogacanie. Jednakże obecność takiego refluks zmniejsza produktywność procesu. [0013] W większości procesów opisywanych w literaturze stosuje się zatem wysoki poziom nadkrytycznego CO 2, co daje bardzo

8 7 małą wydajność w zakresie DHA, przez co proces nie nadaje się do zastosowania przemysłowego. Aby proces nadawał się do zastosowania przemysłowego, nie może wymagać zbyt wysokiego ciśnienia. Gdy bowiem ciśnienie zmniejsza się, zmniejsza się gęstość; żeby zatem uzyskać równoważną zawartość DHA, trzeba więc podwyższyć poziom nadkrytycznego CO 2. Aby uzyskać pożądane wzbogacanie w DHA, to znaczy co najmniej 50%, konieczne jest zatem wypracowanie kompromisu między ciśnieniem, poziomem nadkrytycznego CO 2 a wydajnością. Ponadto, do zastosowania przemysłowego nadają się tylko procesy ciągłe. Na koniec, aby uniknąć rozpadu kwasów tłuszczowych, zwłaszcza DHA, procesy należy przeprowadzać w niskiej temperaturze, to znaczy w temperaturze poniżej 100 C, korzystnie, nie więcej niż 70 C. Należy również opracować sposób umożliwiający wzbogacanie roztworu kwasów tłuszczowych w DHA z wykorzystaniem tylko jednego etapu frakcjonowania przeciwprądowego i niewymagający obróbki wstępnej kwasów tłuszczowych mocznikiem. [0014] Autorzy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że w temperaturze nie większej niż 70 C, przy ciśnieniu wynoszącym od 100*10 5 Pa do 160*10 5 Pa i poziomie nadkrytycznego CO 2 wynoszącym od 30 do 70, możliwe jest, w procesie ciągłym, w jednym etapie frakcjonowania przeciwprądowego przez nadkrytyczne CO 2, uzyskanie wzbogacania w DHA wynoszącego co najmniej 50%, gdy surowcem wyjściowym jest roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych zawierający mniej niż 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych roztworu lub ich pochodnych, niepoddany wstępnej obróbce mocznikiem. [0015] Niniejszy wynalazek dotyczy zatem ciągłego sposobu wzbogacania w DHA roztworu kwasów tłuszczowych lub ich po-

9 8 chodnych, zawierającego poniżej 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych roztworu lub ich pochodnych, przy czym ten sposób obejmuje następujące etapy: (a) jednoczesny wtrysk przeciwprądowy do kolumny frakcjonowania strumienia roztworu kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych i strumienia nadkrytycznego CO 2 w temperaturze nieprzekraczającej 70 C i pod ciśnieniem wynoszącym od 100*10 5 Pa do 160*10 5 Pa, korzystnie od 120* 10 5 Pa do 140*10 5 Pa, przy czym poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi od 30 do 70, korzystnie od 30 do 40; (b) odzyskiwanie pozostałości, zawierającej co najmniej 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych w pozostałości, przy czym wydajność w odniesieniu do DHA jest nie mniejsza od 60%. Jeżeli nie wskazano inaczej, odsetki DHA (lub EPA) w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych wyrażono w procencie pola powierzchni. W istocie te wartości odpowiadają ilorazowi pola pod pikiem przypisywanym DHA (lub EPA) i sumy pól pod wszystkimi pikami przypisywanymi kwasom tłuszczowym obecnym w roztworze lub pozostałości. Te piki uzyskuje się w wyniku chromatografii gazowej przeprowadzanej metodą opisaną w części doświadczalnej, a pole pod nimi mierzy się na uzyskanych chromatogramach. [0016] W rozumieniu niniejszego wynalazku pod pojęciem pochodne kwasów tłuszczowych rozumie się estry kwasów tłuszczowych, korzystnie estry metylowe lub etylowe. Korzystnie, pod tym pojęciem rozumie się estry etylowe. Korzystnie, zastosowany roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych stanowi roztwór surowy, to znaczy roztwór niepoddany obróbce wstępnej mocznikiem, tak więc kwasy tłuszczowe i

10 9 ich pochodne nie uległy połączeniu w kompleksy z mocznikiem. Korzystnie, stosuje się roztwór estrów etylowych. Korzystnie, zastosowany roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych zawiera co najmniej 20%, korzystnie co najmniej 25% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych roztworu lub ich pochodnych. W korzystnej postaci wykonania wynalazku zastosowany roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych stanowi olej z ryb lub z alg, korzystnie olej rybny. Korzystnie jest to olej z tuńczyka lub z wątroby dorsza. [0017] Korzystnie, ten olej zawiera co najmniej 20%, korzystnie co najmniej 25% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych oleju lub ich pochodnych. Korzystnie, olej z wątroby dorsza zastosowany w poniższej kompozycji ma następujący skład w odniesieniu do głównych kwasów tłuszczowych: Kwas tłuszczowy Olej z wątroby dorsza (%) 14: 0 1,1 16: 0 18,5 16: 1 3,7 18: 0 5,3 18: 1 14,7 18: 2 ω 6 1,7 20: 1 9,8 20: 4 ω 6 0,4 20: 5 ω 3 (EPA) 6,4 22: 1 2,3 22: 6 ω3 (DHA) 27,4 Całkowita ilość związków 29,1 nasyconych

11 10 Całkowita ilość związków 29,7 jednonasyconych Całkowita ilość ω 6 2,1 (LA+AA) Całkowita ilość ω 3 33,8 (EPA+DHA) [0018] Korzystnie, stosowany olej z tuńczyka zawiera 5,5% EPA i 26,6% DHA. Korzystnie, jego chromatogram uzyskany metodą chromatografii gazowej opisaną poniżej w przykładach przedstawiono na Fig. 1. Korzystnie, jest to olej z tuńczyka 25 DHA sprzedawany przez firmę POLARIS lub PRONOVA BIOCARE. [0019] W rozumieniu niniejszego opisu pod pojęciem poziom nadkrytycznego CO 2 rozumie się stosunek przepływu CO 2 nadkrytycznego do szybkości przepływu roztworu kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych. [0020] Sposób według niniejszego wynalazku obejmuje zatem jednoczesne wtryskiwanie do kolumny frakcjonowania, przeciwprądowo, roztworu kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych i nadkrytycznego CO 2. Ten ostatni jest wtryskiwany na dole kolumny, podczas gdy roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych wtryskuje się wyżej w kolumnie. Strumień CO 2 zawiera stopniowo coraz więcej związków najbardziej lotnych, które ekstrahuje. Te związki odzyskuje się po spadku ciśnienia w separatorach cyklonowych. [0021] W korzystnej postaci wykonania wynalazku temperatura na dole kolumny jest niższa od temperatury na górze kolumny. Wewnątrz kolumny istnieje zatem gradient temperatury. Korzystnie temperatura na górze kolumny wynosi od 55 do 70 C, a temperatura na dole kolumny wynosi od 35 do 50 C.

12 11 Obecność tego gradientu zmniejsza produktywność sposobu, lecz zwiększa wydajność w zakresie DHA. W istocie, gradient temperatury powoduje refluks wewnętrzny, co może powodować przepełnienie kolumny. Należy zatem stosować mniejszy przepływ roztworu. [0022] W innej postaci wykonania wynalazku temperatura w etapie (a) wewnątrz kolumny jest stała. Nie ma zatem gradientu temperatury. Korzystnie temperatura wynosi od 40 do 70 C. Brak tego gradientu poprawia produktywność, lecz zmniejsza wydajność w zakresie DHA. [0023] W korzystnej postaci wykonania długość kolumny frakcjonowania wynosi co najmniej 1,5 m, a średnica wewnętrzna wynosi co najmniej 20 mm; korzystnie, długość wynosi co najmniej 8 m, a średnica wewnętrzna wynosi co najmniej 126 mm. [0024] W innej postaci wykonania ciśnienie stosowane w kolumnie wynosi 135*10 5 Pa. Sposób według niniejszego wynalazku umożliwia zatem otrzymywanie pozostałości zawierającej co najmniej 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych w pozostałości lub ich pochodnych, korzystnie od 50 do 70% DHA. Tę pozostałość otrzymuje się w sposób ciągły na dole kolumny. Korzystnie, ta pozostałość zawiera co najmniej 52% DHA, korzystnie co najmniej 55% DHA, jeszcze korzystniej co najmniej 60% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych w pozostałości lub ich pochodnych. Korzystnie, wydajność w zakresie DHA sposobu według niniejszego wynalazku wynosi co najmniej 60%, korzystnie co najmniej 65%, jeszcze korzystniej co najmniej 70%. W przypadku gradientu temperatury w kolumnie ta wydajność wynosi korzystnie co najmniej 80%.

13 12 [0025] Wynalazek będzie można lepiej zrozumieć po zapoznaniu się z poniższymi rysunkami i przykładami. Fig. 1 przedstawia chromatogram uzyskany z chromatografii gazowej oleju z tuńczyka wykorzystywanego w przykładach. Fig. 2 przedstawia chromatogram uzyskany z chromatografii gazowej wzbogaconej pozostałości uzyskanej w przykładzie 1. [0026] Protokół analizy wzbogaconych roztworów i wyjściowego oleju z tuńczyka opisano poniżej. Skład wzbogaconych roztworów i wyjściowego oleju z tuńczyka bada się następującą metodą chromatografii gazowej: Sprzęt: Chromatograf gazowy z detektorem płomieniowojonizacyjnym. Warunki operacyjne: [0027] Kolumna Typ: Długość (m): Średnica (mm): CP-WAX 52CB 25 0,25 Gaz Gaz nośny: Ciśnienie na górze kolumny: 0,20 Hel 1,38*10 5 Pa Przepływ w kolumnie (ml/min): Temperatura ( C): 1,4 250 Tryb ciśnienia lub przepływu cią- Przepływ ciągły głego: Wtryskiwacz: Przepływ wycieku (z dzieleniem 280 strumienia) (ml/min): Typ linera (dezaktywowany/niedezaktywowany): Dezaktywowany Objętość linera (μl): 860

14 13 Detektor Temperatura ( C): Przepływ wodoru (ml/min): Przepływ tlenu (ml/min): Dopełnienie + kolumna (ml/min): Program pieca Gradient ( C/min) Temperatura ( C) Czas trwania (min) , ,30 Czas 28,03 trwania analizy (min) Objętość 1 wtrysku (µl) Metodologia: Sporządzanie roztworu kontrolnego: [0028] Do kolby o objętości 5,0 ml wprowadzić 30 mg estru etylowego kwasu dokozaheksaenowego SCR (DHA), 45 mg estru etylowego kwasu eikozapentaenowego SCR (EPA). Rozpuścić w roztworze butylohydroksytoluenu R w stężeniu 50 mg/l w trimetylopentanie R i dopełnić do pożądanej objętości tym samym roztworem. Sporządzanie roztworu do analizy (dwa doświadczenia): [0029] Do kolby o objętości 10,0 ml wprowadzić 0,5 g badanej substancji. Rozpuścić w roztworze butylohydroksytoluenu R w stężeniu 50 mg/l w trimetylopentanie R i dopełnić do pożądanej objętości tym samym roztworem.

15 14 Opracowanie wyników: [0030] Odnotować % powierzchni estru etylowego kwasu eikozapentaenowego (EPA) i estru etylowego kwasu dokozaheksaenowego (DHA) w roztworze do analizy. [0031] Poniższe przykłady podano jako przykład i nie mają one stanowić ograniczenia. Przykład 1 [0032] Na kolumnę laboratoryjną z wypełnieniem, o wysokości 1,5 m i średnicy wewnętrznej 20 mm, wtryskuje się 1520 g oleju z tuńczyka z 25 DHA sprzedawanego przez firmę POLARIS, którego chromatogram przedstawiono na Fig. 1, zawierającego 5,5% EPA i 26,6% DHA. Całkowity czas trwania wtrysku wynosi 4 godziny. Parametry działania są następujące: - ciśnienie i temperatura w kolumnie: 135*10 5 Pa, 60 C - przepływ wtrysku roztworu: 280 g/godz. - przepływ CO 2 : 19 kg/godz. Poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi zatem 67,8. Na dole kolumny ekstrahuje się w sposób ciągły roztwór wzbogacony. Odzyskuje się w ten sposób 534 g roztworu estrów etylowych kwasów tłuszczowych, zawierającego 55,0% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych. Wydajność odzyskiwania DHA wynosi 77%. Przykład 2 [0033] Na przemysłową kolumnę z wypełnieniem, o wysokości 8 m i średnicy wewnętrznej 126 mm, wtryskuje się 210,6 kg oleju z tuńczyka z 25 DHA sprzedawanego przez firmę POLARIS, którego chromatogram przedstawiono na Fig. 1, zawierającego 5,5% EPA i 26,6% DHA. Całkowity czas trwania wtrysku wynosi 9 godzin. Parametry działania są następujące: - ciśnienie i temperatura w kolumnie: 135*10 5 Pa, 60 C

16 15 - przepływ wtrysku roztworu: 23 kg/godz. - przepływ CO 2 : 900 kg/godz. Poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi zatem 39,1. Na dole kolumny ekstrahuje się w sposób ciągły roztwór wzbogacony. Odzyskuje się w ten sposób 63,3 kg roztworu estrów etylowych kwasów tłuszczowych, zawierającego 63,7% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych. Wydajność odzyskiwania DHA wynosi 64%. Przykład 3 [0034] Na przemysłową kolumnę z wypełnieniem, o wysokości 8 m i średnicy wewnętrznej 126 mm, wtryskuje się 203,0 kg oleju z tuńczyka z 25 DHA sprzedawanego przez firmę POLARIS, którego chromatogram przedstawiono na Fig. 1, zawierającego 5,5% EPA i 26,6% DHA. Całkowity czas trwania wtrysku wynosi 8,5 godziny. Parametry działania są następujące: - ciśnienie i temperatura w kolumnie: 135*10 5 Pa, 60 C - przepływ wtrysku roztworu: 24 kg/godz. - przepływ CO 2 : 800 kg/godz. Poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi zatem 33,3. Na dole kolumny ekstrahuje się w sposób ciągły roztwór wzbogacony. Odzyskuje się w ten sposób 85,4 kg roztworu estrów etylowych kwasów tłuszczowych, zawierającego 53,5% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych. Wydajność odzyskiwania DHA wynosi 75%. Przykład 4 [0035] Na kolumnę laboratoryjną z wypełnieniem o wysokości 1,5 m i średnicy wewnętrznej 20 mm wtryskuje się 333 g oleju z tuńczyka z 25 DHA sprzedawanego przez firmę POLARIS, którego chromatogram przedstawiono na Fig. 1, zawierającego 5,5%

17 16 EPA i 26,6% DHA. Całkowity czas trwania wtrysku wynosi 1 godzinę i 45 minut. Parametry działania są następujące: - ciśnienie w kolumnie: 135*10 5 Pa - gradient temperatury w kolumnie: 45 C na dole kolumny i 65 C na górze kolumny - przepływ wtrysku roztworu: 220 g/godz. - przepływ CO 2 : 15 kg/godz. Poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi zatem 68. Na dole kolumny ekstrahuje się w sposób ciągły roztwór wzbogacony. Odzyskuje się w ten sposób 166 g roztworu estrów etylowych kwasów tłuszczowych, zawierającego około 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych. Wydajność odzyskiwania DHA wynosi 88%, a produktywność wynosi 95 g/godz. Przykład 5 [0036] Na kolumnę laboratoryjną z wypełnieniem o wysokości 1,5 m i o średnicy wewnętrznej 20 mm wtryskuje się 800 g oleju z tuńczyka z 25 DHA sprzedawanego przez firmę POLARIS, którego chromatogram przedstawiono na Fig. 1, zawierającego 5,5% EPA i 26,6% DHA. Całkowity czas trwania wtrysku wynosi 1 godzinę i 50 minut. Parametry działania są następujące: - ciśnienie i temperatura w kolumnie: 135*10 5 Pa, 60 C. - przepływ wtrysku roztworu: 440 g/godz. - przepływ CO 2 : 29 kg/godz. Poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi zatem 65,9. Na dole kolumny ekstrahuje się w sposób ciągły roztwór wzbogacony. Odzyskuje się w ten sposób 272 g roztworu estrów etylowych kwasów tłuszczowych, zawierającego 51,0% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych lub ich pochod-

18 17 nych. Wydajność odzyskiwania DHA wynosi 65%. Produktywność wynosi 160 g/godz. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób ciągły wzbogacania w DHA roztworu kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych, zawierającego poniżej 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych w roztworze lub ich pochodnych, obejmujący następujące etapy: (a) jednoczesny wtrysk przeciwprądowy do kolumny frakcjonowania strumienia roztworu kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych i strumienia nadkrytycznego CO 2 w temperaturze nieprzekraczającej 70 C i pod ciśnieniem wynoszącym od 100*10 5 Pa do 160*10 5 Pa, przy czym poziom nadkrytycznego CO 2 wynosi od 30 do 70; (b) odzyskiwanie pozostałości zawierającej co najmniej 50% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych w pozostałości lub ich pochodnych, przy czym wydajność DHA wynosi 60% i więcej. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura na dole kolumny jest niższa od temperatury na górze kolumny, korzystnie temperatura na górze kolumny wynosi od 55 do 70 C, a temperatura na dole kolumny wynosi od 35 do 50 C. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura etapu (a) wewnątrz kolumny jest stała, korzystnie wynosi od 40 do 70 C. 4. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że etap (a) przeprowadza się pod ciśnieniem wynoszącym od 120*10 5 Pa do 140*10 5 Pa. 5. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych stano-

19 18 wi roztwór oleju rybnego, korzystnie oleju z tuńczyka lub z wątroby dorsza. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że roztwór oleju rybnego zawiera co najmniej 20% DHA w stosunku do całkowitej ilości kwasów tłuszczowych w roztworze oleju rybnego lub ich pochodnych. 7. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że roztwór kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych stanowi roztwór estrów etylowych kwasów tłuszczowych. 8. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że poziom nadkrytycznego CO 2 w etapie (a) wynosi od 30 do 40.

20 19 Fig. 1

21 20 Fig. 2