(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/36 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/30 ( ) C07K 16/00 ( ) A61P 35/00 ( ) A61K 47/48 ( ) A61K 39/395 ( ) C12N 15/13 ( ) C12N 15/63 ( ) C12N 5/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała anty-tat226 oraz immunokoniugaty (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/49 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/02 (73) Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., South San Francisco, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 WEI-CHING LIANG, Foster City, US CHIE SAKANAKA, San Francisco, US YAN WU, Foster City, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Dorota Rzążewska JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 13034/11/P-RO/DR/KM EP Przeciwciała anty-tat226 oraz immunokoniugaty Opis ZAKRES WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał anty-tat226 oraz ich immunokoniugatów. Wynalazek ponadto dotyczy sposobów stosowania przeciwciał anty-tat226 i ich immunokoniugatów. TŁO WYNALAZKU [0002] Wykazano, że przeciwciała wiążące się do polipeptydów ulegających ekspresji na powierzchni komórek nowotworowych są skuteczne w terapiach przeciwnowotworowych. Takie przeciwciała działają poprzez różne mechanizmy, włączając, na przykład, aktywację zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC); indukcję poprzez przeciwciało cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC); nasilenie uwalniania cytokin oraz indukcję apoptozy. Patrz np. Cardarelli i in. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51: Na przykład, HERCEPTIN oraz RITUXAN (obydwa z Genentech Inc., South San Francisco; Kalifornia) są przeciwciałami, które z powodzeniem zastosowano odpowiednio w leczeniu raka piersi oraz chłoniaka nieziarniczego. HERCEPTIN jest rekombinowanym humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym, otrzymanym technologią rekombinowanego DNA, które wiąże się selektywnie do zewnątrzkomórkowej domeny protoonkogenu receptora 2 ludzkiego epidermalnego czynnika wzrostu (HER2). Nadekspresję białka HER2 obserwuje się w 25-30% pierwotnych raków piersi. RITUXAN jest powstałym drogą inżynierii genetycznej chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym mysio/ludzkim skierowanym przeciwko antygenowi CD20 znajdowanemu na powierzchni prawidłowych oraz nowotworowych limfocytów B. Obydwa te przeciwciała są produkowane na drodze rekombinacji w komórkach CHO. HERCEPTIN, wydaje się działać, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie angiogenezy (Izumi i in. (2002) Nature 416: ), a RITUXAN wydaje się działać, przynajmniej częściowo, poprzez indukcję apoptozy (Cardarelli i in. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51: 15-24). EBI Accession No. GSP: AEG35724 ujawnia ludzką sekwencję konsensusową polipeptydu 01034/ [0003] Immunokoniugaty lub koniugaty lek-przeciwciało są przydatne do lokalnego dostarczania czynników cytotoksycznych podczas terapii nowotworów. Patrz np. Syrigos i in. (1999) Anticancer Research 19: ; Niculescu-Duvaz i in. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: ; patent amerykański nr 4,975,278. Immunokoniugaty pozwalają na celowane podawanie wyodrębnionej części cząsteczki leku do guza, podczas gdy systemowe podawanie nieskoniugowanych czynników cytotoksycznych może skutkować niedopuszczalnymi poziomami toksyczności w komórkach prawidłowych jak i w poddawanych eliminacji komórkach guza. Patrz Baldwin i in. (Mar. 15, 1986) Lancet s ; Thorpe (1985) Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review w Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications (red. A. Pinchera i in.) str Immunokoniugaty, które są nacelowane w polipeptydy na powierzchni komórki są cały czas badane w kontekście leczenia raka. Celem podsumowania patrz np. Hamann i in. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:

3 - 2 - [0004] Jest oczywistym, ze istnieje ciągłe zapotrzebowanie na czynniki oddziałujące z docelowymi polipeptydami na powierzchni komórki, dla celów diagnostyki terapeutycznej. Opisany niniejszym wynalazek wychodzi naprzeciw tej potrzebie oraz dostarcza innych korzyści. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0005] Wynalazek ten dostarcza przeciwciała anty-tat226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0006] W jednym aspekcie, dostarczane jest przeciwciało wiążące się do TAT226, gdzie przeciwciało jest jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 1, zastrzeżeniu 2 lub zastrzeżeniu 6. [0007] W niektórych przykładach wykonania wynalazku, dowolne z powyższych przeciwciał zawiera ponadto co najmniej jedną sekwencję zrębową, wyselekcjonowaną z konsensusowej sekwencji zrębowej VH podgrupy III oraz konsensusowej sekwencji zrębowej VL podgrupy I. [0008] W jednym aspekcie, dostarczone jest przeciwciało wiążące się do TAT226, w którym przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, posiadającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NO: oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NO: 27-30, w których przeciwciało ma K D 10 nm. W jednym przykładzie wykonania wynalazku, przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego posiadającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 24 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 29. W jednym przykładzie wykonania wynalazku, przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 25 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego, posiadającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 30. W jednym przykładzie wykonania wynalazku domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 25 zaś domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 30. [0009] Powyższe przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. W jednym przykładzie wykonania wynalazku, przeciwciało jest fragmentem przeciwciała wybranym spośród fragmentów Fab, Fab -SH, Fv, scfv lub (Fab ) 2. W jednym przykładzie wykonania wynalazku, przeciwciało jest humanizowane. W jednym przykładzie wykonania wynalazku przeciwciało jest ludzkie. [0010] Wynalazek następnie dostarcza immunokoniugaty jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0011] W jednym aspekcie, immunokoniugat zawiera którekolwiek z przeciwciał anty- TAT226 według wynalazku, związane kowalencyjnie z czynnikiem cytotoksycznym. W jednym przykładzie wykonania wynalazku, czynnik cytotoksyczny jest wyselekcjonowany spośród toksyny, czynnika chemoterapeutycznego, antybiotyku, izotopu promieniotwórczego oraz enzymu nukleolitycznego. [0012] W jednym aspekcie, dostarcza się immunokoniugat o wzorze Ab-(L-D)p, w którym:

4 - 3 - (a) Ab oznacza którekolwiek z przeciwciał anty-tat226 według wynalazku (b) L oznacza łącznik (c) D oznacza lek o wzorze D E lub D F i w którym każdy R 2 oraz R 6 są metylami, każdy R 3 oraz R 4 są izopropylami, R 7 jest secbutylem, każdy R 8 jest niezależnie wyselekcjonowany z CH 3, O-CH 3, OH i H; R 9 oznacza H; R 10 oznacza aryl; Z oznacza -O- lub -NH-; R 11 oznacza H, C 1 -C 8 alkil, lub -(CH 2 ) 2 -O(CH 2 ) 2 - O-(CH 2 ) 2 -O-CH 3 ; a R 18 oznacza -C(R 8 ) 2 -C(R 8 ) 2 -aryl; a (d) p zawiera się w przedziale od około 1 do 8. [0013] Dalej są dostarczone następujące przykłady wykonania dla dowolnego z powyższych immunokoniugatów. W jednym przykładzie wykonania, immunokoniugat ma aktywność uśmiercania komórek in vitro lub in vivo. W jednym przykładzie wykonania, łącznik jest związany z przeciwciałem poprzez grupę tiolową tego przeciwciała. W jednym przykładzie wykonania, łącznik jest rozszczepiany przez proteazę. W jednym przykładzie wykonania, łącznik zawiera dipeptyd Val-Cit. W jednym przykładzie wykonania, łącznik zawiera jednostkę p-aminobenzylową. W jednym przykładzie wykonania jednostka p-aminobenzylowa jest umieszczona pomiędzy lekiem a miejscem cięcia proteazy w łączniku. W jednym przykładzie wykonania, jednostka p-aminobenzylowa jest p-aminobenzyloksykarbonylem (PAB). W jednym przykładzie wykonania, łącznik zawiera 6-maleimidokaproil. W jednym przykładzie wykonania 6-maleimidokaproil jest umieszczony pomiędzy przeciwciałem a miejscem cięcia protezy w łączniku. Powyższe przykłady wykonania mogą występować pojedynczo lub w dowolnej kombinacji z innymi. [0014] W jednym przykładzie wykonania, lek jest wybrany spośród MMAE oraz MMAF. W jednym przykładzie wykonania, immunokoniugat ma wzór

5 - 4 - w którym Ab oznacza dowolne z powyższych przeciwciał anty-tat226, S oznacza atom siarki, a p zawiera się w przedziale od 2 do 5. W jednym przykładzie wykonania, immunokoniugat ma wzór w którym Ab oznacza dowolne z powyższych przeciwciał anty-tat226, S oznacza atom siarki, a p zawiera się w przedziale od 2 do 5. [0015] W jednym aspekcie, dostarczana jest kompozycja farmaceutyczna, zawierająca dowolny z powyższych immunokoniugatów oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycja może być stosowana w sposobie leczenia zaburzeń proliferacyjnych komórek. [0016] W jednym przykładzie wykonania, zaburzenie proliferacyjne komórek jest wyselekcjonowane spośród raka jajnika, raka macicy, guza mózgu lub guza Wilmsa. W jednym przykładzie wykonania, zaburzenie proliferacyjne komórek jest związane ze zwiększoną ekspresją TAT226 na powierzchni komórki. KRÓTKI OPIS FIGUR [0017] Fig. 1 przedstawia strukturę TAT226 od człowieka, małpy cynomolgus ( cyno ) (makak), myszy i szczura. Otoczone ramkami reszty są identyczne pomiędzy gatunkami. Pozostałe reszty różnią się dla co najmniej dwóch spośród czterech gatunków. Procent identyczności aminokwasowej w obrębie sekwencji TAT226 od człowieka, makaka, myszy oraz szczura pokazano w tabeli poniżej nałożonych sekwencji. Procent identyczności został obliczony za pomocą programu Clustal W. Fig. 2 przedstawia sekwencje regionu hiperzmiennego (HVR) łańcuchów ciężkich H1, H2 oraz H3 przeciwciał monoklonalnych anty-tat226 oznaczonych YWO. 2 oraz YWO.49, jak opisano w Przykładzie B. Pozycje aminokwasów są numerowane według systemu numeracji Kabata, jak opisano poniżej. Fig. 3 przedstawia sekwencje HVR łańcuchów lekkich L1, L2 oraz L3 przeciwciał monoklonalnych anty-tat226 oznaczonych YWO.32 oraz YWO.49, jak opisano w Przykładzie B. Pozycje aminokwasów są numerowane według systemu numeracji Kabata, jak opisano poniżej. Fig. 4 przedstawia sekwencje HVR-H3 i HVR-L3 YWO.49 oraz YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6, które zostały wytworzone poprzez dojrzewanie powinowactwa YWO.49 z zastosowaniem bibliotek HVR-H3 oraz HVR-L3 z randomizacją miękką, jak opisano w przykładzie B. Przedstawiono również sekwencje konsensusowe HVR-H3 oraz HVR-L3. Fig. 5A i 5B przedstawiają przykładowe ludzkie akceptorowe konsensusowe sekwencje zrębowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) do praktycznego stosowania niniejszego wynalazku z identyfikatorami sekwencji jak następuje: - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa A VH podgrupy I minus CDRy Kabata (SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35).

6 ludzkie konsensusowe sekwencje zrębowe B, C oraz D VH podgrupy I minus wydłużone regiony hiperzmienne (SEQ ID NO: 36, 37, 34, 35; SEQ ID NO: 36, 37, 38, 35 oraz SEQ ID NO: 36, 37, 39, 35). - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa A VH podgrupy II minus CDRy Kabata (SEQ ID NO: 40, 41, 42, 35). - ludzkie konsensusowe sekwencje zrębowe B, C oraz D VH podgrupy II minus wydłużone regiony hiperzmienne (SEQ ID NO: 43, 44, 42, 35; SEQ ID NO: 43, 44, 45, 35 oraz SEQ ID NO: 43, 44, 46 oraz 35). - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa A VH podgrupy III minus CDRy Kabata (SEQ ID NO: 47, 48, 49, 35). - ludzkie konsensusowe sekwencje zrębowe B, C oraz D VH podgrupy III minus wydłużone regiony hiperzmienne (SEQ ID NO: 50, 51, 49, 35; SEQ ID NO: 50, 51, 52, 35 oraz SEQ ID NO: 50, 51, 53, 35). - ludzka akceptorowa sekwencja zrębowa A VH minus CDRy Kabata (SEQ ID NO: 54, 48, 55, 35). - ludzkie akceptorowe sekwencje zrębowe B, C oraz D VH minus wydłużone regiony hiperzmienne (SEQ ID NO: 50, 51, oraz SEQ ID NO: 50, 51, 56, 35). - ludzka akceptorowa sekwencja 2 zrębowa A VH minus CDRy Kabata (SEQ ID NO: 54, 48, 57, 35). - ludzkie akceptorowe sekwencje 2 zrębowe B, C oraz D VH minus wydłużone regiony hiperzmienne (SEQ ID NO: 50, 51, 57, 35; SEQ ID NO: 50, 51, 58, 35 oraz SEQ ID NO: 50, 51, 59, 35). Fig. 6A oraz 6B przedstawiają przykładowe ludzkie akceptorowe konsensusowe sekwencje zrębowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL) do praktycznego stosowania niniejszego wynalazku z identyfikatorami sekwencji jak następuje: - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa VL podgrupy I (κv1): SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63 - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa VL podgrupy II (κv2): SEQ ID NO: 64, 65, 66, 63 - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa VL podgrupy III (κv3): SEQ ID NO: 67, 68, 69, 63 - ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa VL podgrupy IV (κv4): SEQ ID NO: 70, 71, 72, 63 Fig. 7 przedstawia sekwencje zrębowe łańcuchów lekkich i ciężkich humab4d5-8. Numeracja w indeksie górnym/wytłuszczonym drukiem wskazuje pozycje aminokwasów według Kabata. Fig. 8 przedstawia sekwencje zrębowe łańcuchów lekkich i ciężkich humab4d5-8 z zaznaczonymi modyfikacjami. Numeracja w indeksie górnym/wytłuszczonym drukiem wskazuje pozycje aminokwasów według Kabata. Fig. 9 przedstawia sekwencje regionów zmiennych (VH) łańcucha ciężkiego YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6. HVR podkreślono. Fig. 10 przedstawia sekwencje regionów zmiennych (VL) łańcucha lekkiego YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6. Sekwencje VL humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 4D5-8 ( humab4d5-8 ) oraz

7 - 6 - modyfikowanego humab4d5-8 również przedstawiono, odpowiednio w SEQ ID NO: 31 oraz SEQ ID NO: 26. YWO.32 oraz YWO.49 mają taką samą sekwencję VL jak zmodyfikowany VL humab4d5-8 (SEQ ID NO: 26), który zawiera następujące podstawienia odnośnie SEQ ID NO: 31: N30S, R66G oraz H91S. HVR podkreślono. Fig. 11 przedstawia nałożenie sekwencji regionów zmiennych łańcucha ciężkiego YWO.32, YWO.49 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6. HVR są otoczone ramkami. Zacieniowano reszty HVR-H3 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO. 49. H2 oraz YWO.49.H6, które różnią się od odpowiadających reszt HVR-H3 YWO. 49. Fig. 12 przedstawia nałożenie sekwencji regionów zmiennych łańcucha lekkiego YWO. 32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6. HVR są otoczone ramkami. Zacieniowano reszty HVR-L3 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6, które różnią się od odpowiadających reszt HVR-L3 YWO.49. Fig. 13 prezentuje graficzne przedstawienie poziomów ekspresji ludzkiego genu TAT226 w różnych tkankach, jak opisano w przykładzie A. Fig. 14 prezentuje graficzne przedstawienie poziomów ekspresji ludzkiego genu TAT226 w prawidłowym jajniku; prawidłowym jajowodzie, jasnokomórkowym raku jajnika, torbielakogruczolakoraku podtypów śluzowego oraz surowiczego, przerzutach raka jajnika oraz innych rodzajach raka jajnika, jak opisano w przykładzie A. Fig. 15 przedstawia wyniki cytometrii przepływowej metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) komórek OVCAR3 pod nieobecność lub w obecności wskazanych przeciwciał anty-tat226, jak opisano w przykładzie D. Fig. 16 przedstawia RNA TAT226 oraz ekspresję białek jak określono poprzez test 5 -nukleazy (TaqMan ) oraz immunohistochemię (IHC) przeprowadzone na komórkach OVCAR3 oraz na zestawie próbek raka jajnika, jak opisano w przykładzie F. Fig. 17 przedstawia aktywność in vitro różnych koniugatów przeciwciało-lek (ADC) YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 w oznaczeniu uśmiercania komórek OVCAR3, jak opisano w przykładzie H. Fig. 18 przedstawia aktywność in vitro różnych ADC YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 z zastosowaniem stabilnych transfektantów HCT116#9-4, jak opisano w przykładzie H. Fig. 19 przedstawia aktywność in vivo ADC YWO.49.H6, z zastosowaniem heteroprzeszczepów mysich, jak opisano w przykładzie H. Fig. 20 przedstawia aktywność in vivo ADC YWO.49.H6, z zastosowaniem heteroprzeszczepów mysich otrzymywanych z wykorzystaniem guzów od ludzkich pacjentów, jak opisano w przykładzie H. SZCZEGÓŁOWY OPIS PRZYKŁADÓW WYKONANIA WYNALAZKU [0018] Dostarczono izolowane przeciwciała, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, które wiążą się do TAT226. Dodatkowo dostarczono immunokoniugaty zawierające przeciwciała anty-tat226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. Przeciwciała oraz immunokoniugaty według wynalazku są przydatne np. w diagnostyce lub leczeniu zaburzeń związanych ze zmienioną ekspresją, np. podwyższoną ekspresją TAT226. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała lub immunokoniugaty według wynalazku są przydatne w

8 - 7 - diagnostyce lub leczeniu zaburzeń proliferacyjnych komórek, takich jak guzy lub rak. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała lub immunokoniugaty według wynalazku są przydatne do wykrywania TAT226, np. TAT226 ulegającego ekspresji na powierzchni komórki. [0019] Dostarczono polinukleotydy kodujące przeciwciała anty-tat226. Dostarczono wektory zawierające polinukleotydy kodujące przeciwciała anty-tat226 oraz komórki gospodarza zawierające takie wektory. Dostarczono także kompozycje, w tym formulacje farmaceutyczne, zawierające jeden lub więcej polinukleotydów, przeciwciał anty-tat226 lub immunokoniugatów według wynalazku. I. TECHNIKI OGÓLNE [0020] Techniki oraz procedury, opisane lub wymienione w niniejszym dokumencie są ogólnie dobrze znane i powszechnie stosowane z użyciem konwencjonalnej metodologii przez specjalistów z tej dziedziny, jak na przykład szeroko stosowane metodologie opisane przez Sambrooka i in. w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 3 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, i in., (2003)); seria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): Pcr 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames oraz G. R. Taylor (1995), Harlow i Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, oraz Animal Cell Culture (R. I. Freshney, (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture R. I. Freshney, (1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather oraz P. E. Roberts (1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths oraz D. G. Newell, ) J. Wiley i Sons; Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir oraz C. C. Blackwell; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells J. M. Miller oraz M. P. Calos, 1987; PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis i in., 1994; Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan i in. (1991); Short Protocols in Molecular Biology, Wiley i Sons (1999); ImmunobiologyC. A. Janeway i P. Travers (1997); Antibodies, P. Finch (1997); Antibodies: A Practical Approach, D. Catty; IRL Press ( ); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, P. Shepherd oraz C. Dean, Oxford University Press (2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow i D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); The Antibodies, M. Zanetti oraz J. D. Capra, Harwood Academic Publishers (1995) oraz Cancer: Principles and Practice of Oncology, V. T. DeVita i in., J.B. Lippincott Company (1993). II. DEFINICJE ORAZ SKRÓTY A. Definicje [0021] Przeciwciało izolowane to takie, które zostało zidentyfikowane i wyizolowane i/lub odzyskane ze składników jego naturalnego środowiska. Zanieczyszczeniami składników naturalnego środowiska są materiały, które mogłyby zaburzać badania, zastosowania diagnostyczne lub terapeutyczne przeciwciał i mogą obejmować enzymy, hormony oraz inne białkowe lub niebiałkowe substancje rozpuszczone. W niektórych przykładach wykonania,

9 - 8 - przeciwciało jest oczyszczane (1) powyżej 95% wagowych przeciwciała określanych, na przykład, metodą Lowry ego, a w niektórych przykładach wykonania powyżej 99% wagowych; (2) w stopniu wystarczającym do uzyskania co najmniej 15 reszt sekwencji aminokwasowej na N-końcu lub wewnętrznej, poprzez zastosowanie sekwentatora [białek] z naczynkiem obrotowym lub (3) do homogenności za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących lub nieredukujących, z zastosowaniem, na przykład, barwienia błękitem Coomassie lub srebrem. Izolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w rekombinowanych komórkach, jako że przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała nie będzie obecny. Jednak, zwykle izolowane przeciwciało będzie otrzymywane w przynajmniej jednym etapie oczyszczania. [0022] Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego, która została oddzielona od przynajmniej innej pojedynczej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą jest normalnie związana, na przykład, w swym naturalnym środowisku. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego dalej obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawartą w komórkach, które normalnie wykazują ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego, ale cząsteczka kwasu nukleinowego jest obecna poza chromosomem lub jej lokalizacja chromosomalna różni się od normalnej lokalizacji na chromosomie. [0023] Oczyszczony oznacza, że cząsteczka jest obecna w próbce w stężeniu co najmniej 95% wagowych lub co najmniej 98% wagowych próbki, w której się znajduje. [0024] Określenie zasadniczo podobny lub zasadniczo taki sam jak użyto w niniejszym opisie, oznacza wystarczająco wysoki stopień podobieństwa pomiędzy dwiema wartościami liczbowymi (na przykład, jedną związaną z przeciwciałem według wynalazku i inną związaną z przeciwciałem referencyjnym/porównawczym) tak, że specjalista w dziedzinie uznałby różnice pomiędzy tymi dwiema wartościami za biologiczne albo/i statystycznie zbyt małe (pomijalne) lub niewystępujące w odniesieniu do parametru biologicznego mierzonego wspomnianymi wartościami (np. wartościami Kd). Różnica pomiędzy dwiema wymienionymi wartościami jest, na przykład, mniejsza niż około 50%, mniejsza niż około 40%, mniejsza niż około 30%, mniejsza niż około 20% i/lub mniejsza niż około 10% w odniesieniu do wartości referencyjnej/porównawczej. [0025] Sformułowanie zasadniczo zredukowany lub zasadniczo różny, jak użyto w niniejszym opisie, oznacza wystarczająco wysoki poziom zróżnicowania pomiędzy dwiema wartościami liczbowymi (ogólnie jedną związaną z cząsteczką, a drugą związaną z cząsteczką referencyjną/porównawczą) tak, że specjalista w danej dziedzinie uznałby różnice pomiędzy tymi dwiema wartościami za istotne statystycznie w odniesieniu do parametru biologicznego mierzonego wymienionymi wartościami (np. wartościami Kd). Różnica pomiędzy dwiema wymienionymi wartościami jest, na przykład, większa niż około 10%, większa niż około 20%, większa niż około 30%, większa niż około 40% i/lub większa niż około 50% w odniesieniu do wartości dla cząsteczki referencyjnej/porównawczej. [0026] Określenie wektor, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do przenoszenia innego kwasu nukleinowego, do którego została przyłączona Jednym z rodzajów wektorów są plazmidy, co odnosi się do kolistych dwuniciowych DNA, do których można doligować dodatkowe odcinki DNA. Innym

10 - 9 - rodzajem wektora jest wektor fagowy. Innym rodzajem wektora jest wektor wirusowy, w którym dodatkowe odcinki DNA mogą być doligowane do genomu wirusa. Niektóre wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, do których zostały wprowadzone (na przykład wektory bakteryjne mające miejsce inicjacji replikacji pochodzenia bakteryjnego oraz episomalne wektory ssacze). Inne wektory (na przykład nieepisomalne wektory ssacze) mogą ulec integracji do genomu gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i w ten sposób podlegają replikacji wraz z genomem gospodarza. Ponadto, niektóre wektory maja zdolność sterowania ekspresją genów, do których są związane czynnościowo. Takie wektory są w niniejszym opisie określane jako rekombinacyjne wektory ekspresyjne lub po prostu wektory ekspresyjne. Ogólnie, wektory ekspresyjne, użyteczne w technikach rekombinacji DNA, występują często w postaci plazmidów. W przedstawianej specyfikacji plazmid oraz wektor mogą być używane zamiennie, jako ze plazmid jest najpowszechniej stosowaną postacią wektora. [0027] Polinukleotyd lub kwas nukleinowy, stosowane w niniejszym opisie zamiennie, odnoszą się do dowolnej długości polimerów nukleotydów, i obejmują DNA oraz RNA. Nukleotydy mogą być deoksyrybonukleotydami, rybonukleotydami, zmodyfikowanymi nukleotydami lub zasadami i/lub ich analogami lub jakimikolwiek substratami, które mogą być wbudowywane do polimerów poprzez polimerazy DNA lub RNA lub poprzez reakcje syntezy. Polinukleotydy mogą obejmować zmodyfikowane nukleotydy, takie jak nukleotydy metylowane oraz ich analogi. Jeśli występują zmiany w strukturze nukleotydów, mogą być one dodane przed lub po utworzeniu polimeru. Sekwencje nukleotydowe mogą być poprzedzielane komponentami nienukleotydowymi. Polinukleotydy mogą zawierać modyfikacje powstałe po syntezie, takie jak sprzężenie ze znacznikiem. Inne rodzaje modyfikacji obejmują na przykład kapowanie, substytucję jednego lub więcej naturalnie występujących nukleotydów analogiem, modyfikacje międzynukleotydowe, takie jak na przykład z nienaładowanymi wiązaniami (np. fosfoniany metylu, fosfotriestry, fosfoamidy, karbaminiany, itd.) oraz z naładowanymi wiązaniami (np. fosforotioniany, fosforoditioniany itd.), te zawierające dodatkowe wyodrębnione części cząsteczki, jak na przykład białka (nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnałowe, poli-l-lizynę, itd.), te z interkalatorami (akrydyna, psolaren itd.), te zawierające chelatory ( np. metale, metale radioaktywne, bor, metale oksydacyjne itd.), te zawierające alkilatory [czynniki alkilujące], te ze zmodyfikowanymi wiązaniami (na przykład alfa-anomeryczne kwasy nukleinowe, itd.), jak również niezmodyfikowane postaci polinukleotydu(-ów). Dalej, którekolwiek z normalnie obecnych grup wodorotlenowych mogą być zastąpione, na przykład przez grupy fosfonianowe, grupy fosforanowe, chronione przez standardowe grupy ochronne lub aktywowane do wytworzenia wiązań z dodatkowymi nukleotydami lub też mogą być sprzęgane do stałych lub na pół stałych podłoży. 5 lub 3 końcową grupę OH można poddać fosforylacji lub podstawić aminami lub wyodrębnionymi częściami cząsteczki grup kapujących, o długości od 1 do 20 atomów węgla. Inne hydroksyle mogą być również derywatyzowane do standardowych grup ochronnych. Polinukleotydy mogą zawierać także analogowe postaci cukrów rybozy lub deoksyrybozy, które są powszechnie znane w danej dziedzinie, w tym na przykład 2 -O-metyl-, 2 -O-allil-, 2 -fluoro-, 2 -azydorybozę, analogi

11 cukrów karbocyklicznych, cukry α-anomeryczne, cukry epimeryczne, takie, jak arabinoza, ksylozy lub liksozy, cukry piranozowe, cukry furanozowe, sedoheptulozy, analogi acykliczne oraz analogi zasad nukleozydów takie jak metylorybozyd. Jedno lub wiele wiązań fosfodiestrowych może być zastąpionych przez alternatywne grupy wiążące. Te alternatywne grupy wiążące obejmują, bez ograniczania się do, przykłady wykonania, gdzie fosforan jest zastępowany przez P(O)S ( tioester ), (P(S)S ( ditioester ), (O)NR 2 ( amidynian ), P(O)R, P(O)OR, CO lub CH 2, ( formacetal), w których każdy R lub R oznacza niezależnie H lub podstawiony albo niepodstawiony alkil (1-20 C) opcjonalnie zawierający wiązanie eterowe (-O-), aryl, alkenyl, cykloalkil, araldyl. Nie wszystkie wiązania w polinukleotydach muszą być identyczne. Poprzedzający opis odnosi się do wszystkich wspominanych w niniejszym opisie polinukleotydów, włączając RNA oraz DNA. [0028] Oligonukleotyd, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się na ogół do krótkiego, zazwyczaj pojedynczoniciowego, na ogół syntetycznego polinukleotydu, który najczęściej, ale niekoniecznie, ma mniej niż około 200 nukleotydów długości. Terminy oligonukleotyd i polinukleotyd nie wykluczają się wzajemnie. Zamieszczony powyżej opis polinukleotydów w równej mierze i w pełni daje się zastosować w odniesieniu do oligonukleotydów. [0029] Procentową (%) identyczność sekwencji aminokwasowej w stosunku do referencyjnych sekwencji polipeptydowych definiuje się jako procent reszt aminokwasowych w danej sekwencji, które są identyczne z resztami aminokwasów w referencyjnej sekwencji polipeptydowej, po nałożeniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli jest to konieczne, w celu osiągnięcia maksymalnej procentowej identyczności sekwencji, nie traktując żadnej konserwatywnej substytucji jako części identycznej sekwencji. Nałożenie w celu określenia procentowej identyczności sekwencji aminokwasowych można osiągnąć różnymi drogami dostępnymi w tej dziedzinie, na przykład stosując powszechnie dostępne oprogramowanie komputerowe jak BLAST, BLAST-2, ALIGN czy oprogramowanie Megalign (DNASTAR). Specjaliści w danej dziedzinie mogą określać właściwe parametry nakładania sekwencji, w tym wszelkie algorytmy, niezbędne do osiągnięcia maksymalnego nałożenia na całej długości porównywanych sekwencji. Jednakże, dla celów poniższego opisu, wartości procentowej identyczności sekwencji aminokwasowych są generowane z pomocą programu komputerowego ALIGN-2 do porównywania sekwencji. Program komputerowy ALIGN-2, porównujący sekwencje, został opracowany przez Genentech, Inc., a kod źródłowy został złożony z dokumentacją użytkownika w U. S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, gdzie został zarejestrowany jako U. S. Copyright Registration No. TXU Program ALIGN-2 jest powszechnie dostępny z Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornia lub może być kompilowany na podstawie kodu źródłowego. Program ALIGN-2 powinien podlegać kompilacji celem użytkowania na systemie operacyjnym UNIX V4.0D. Wszystkie parametry porównywania sekwencji są określane przez program ALIGN-2 i są niezmienne. [0030] W sytuacjach, kiedy ALIGN-2 jest wykorzystywany do porównywania sekwencji aminokwasowych, procentową identyczność sekwencji aminokwasowych danej sekwencji aminokwasowej A, z lub w odniesieniu do danej sekwencji aminokwasowej B (która może być alternatywnie sformułowana jako dana sekwencja aminokwasowa A, która wykazuje lub

12 zawiera pewien procent identyczności sekwencji aminokwasowej do, z, w odniesieniu do danej sekwencji aminokwasowej B), oblicza się następująco: 100 razy ułamek X/Y gdzie X jest liczbą reszt aminokwasów uznanych przez program nakładający sekwencje ALIGN-2 jako identyczne dopasowanie sekwencji, przy nakładaniu A na B w programie, i gdzie Y jest całkowitą liczbą reszt aminokwasowych w B. Należy zauważyć, że gdy długość sekwencji aminokwasowej A nie jest równa długości sekwencji aminokwasowej B, procentowa identyczność sekwencji aminokwasowej A do B nie będzie równa procentowej identyczności sekwencji aminokwasowej B do A. Jeśli wyraźnie nie stwierdzono inaczej, wszystkie wartości procentowej identyczności sekwencji aminokwasowych użyte w niniejszym opisie uzyskano, jak opisano w poprzedzającym akapicie, z zastosowaniem programu komputerowego ALIGN-2. [0031] Termin TAT226, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się do jakiegokolwiek natywnego TAT226 z dowolnego kręgowca, włączając ssaki, takie jak naczelne (np. człowiek) oraz gryzonie (np. myszy i szczury), chyba, ze zaznaczono inaczej. Termin obejmuje pełnej długości niepoddane obróbce TAT226, jak również wszelkie postaci TAT226, powstałe na skutek przetworzenia w obrębie komórki. Termin odnosi się także do naturalnie występujących wariantów TAT226, na przykład wariantów składania eksonów czy wariantów allelicznych. Dojrzała postać TAT226 jest postacią, która przeszła proces obróbki, na przykład postać TAT226, która została poddana N-końcowym (np. sekwencja sygnałowa) lub C-końcowym cięciom i/lub modyfikacjom, poprzez przyłączenie kotwicy GPI. W jednym z przykładów wykonania dojrzała postać TAT226 podlega ekspresji na powierzchni komórki. [0032] Przeciwciała (Abs) oraz immunoglobuliny (Igs) są glikoproteinami mającymi podobne parametry strukturalne. Podczas gdy przeciwciała wykazują specyficzność wiązania do swoistego antygenu, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała, jak i inne cząsteczki podobne do przeciwciał, które na ogół są pozbawione specyficzności antygenowej. Polipeptydy tego ostatniego rodzaju są, na przykład, wytwarzane na niskim poziomie przez układ limfatyczny, a na podwyższonym poziomie przez szpiczaki. [0033] Terminy przeciwciało oraz immunoglobulina są stosowane zamiennie w najszerszym tego słowa znaczeniu i obejmują przeciwciała monoklonalne (np. pełnej długości lub nienaruszone przeciwciała monoklonalne), przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monowalentne, przeciwciała poliwalwentne, przeciwciała multispecyficzne (na przykład przeciwciała dwuspecyficzne, tak długo, jak wykazują pożądaną aktywność biologiczną) i mogą także obejmować niektóre fragmenty przeciwciał (jak opisano w niniejszym opisie bardziej szczegółowo). Przeciwciało może być chimeryczne, ludzkie, humanizowane i/lub o dojrzałym powinowactwie. [0034] Termin przeciwciało anty-tat226 lub przeciwciało wiążące się do TAT226 odnosi się do przeciwciała zdolnego do wiązania TAT226 z wystarczającym powinowactwem, tak, że przeciwciało to jest użyteczne jako czynnik diagnostyczny i/lub

13 terapeutyczny do wykrywania TAT226. Korzystnie, stopień wiązania przeciwciała anty-tat226 do białek niebędących białkami docelowymi, niebędących białkami TAT226, jest mniejszy, jak zmierzono np. w oznaczeniu radioimmunologicznym (RIA), niż 10% wiązania przeciwciała do TAT226. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało, które wiąże się do TAT226 ma stałą dysocjacji (Kd) rzędu 10 nm, 1 nm lub 0,1 nm. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 wiąże się do epitopu TAT226, który jest konserwatywny pomiędzy TAT226 pochodzącym od różnych gatunków. [0035] Region zmienny lub domena zmienna przeciwciała odnosi się do domen na końcu aminowym łańcucha ciężkiego lub lekkiego przeciwciała. Domenę zmienną łańcucha ciężkiego można określać jako VH. Domenę zmienną łańcucha lekkiego można określać jako VL. Domeny te są na ogół najbardziej zmiennymi częściami przeciwciała i zawierają miejsca wiązania antygenu. [0036] Termin zmienny odnosi się do faktu, ze niektóre części domen zmiennych różnią się w znacznym stopniu, jeśli chodzi o sekwencję w odniesieniu do różnych przeciwciał i są wykorzystywane do celów wiązania i swoistości każdego określonego przeciwciała dla jego specyficznego antygenu. Jakkolwiek, zmienność nie jest równomiernie rozłożona w obrębie domen zmiennych przeciwciał. Jest ona skupiona w trzech odcinkach, zwanych regionami określającymi komplementarność (CDRy) lub regionami hiperzmiennymi (HVRy) zarówno w domenach zmiennych łańcucha lekkiego, jak i łańcucha ciężkiego. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych są nazywane regionami zrębowymi (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich oraz lekkich zawiera cztery regiony FR, głównie przyjmujące konfiguracje beta-harmonijki, połączone przez trzy CDRy, które tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach stanowią część struktury beta-harmonijki. CDRy w każdym łańcuchu są utrzymywane ze sobą w bliskim sąsiedztwie poprzez regiony FR, a razem z CDRami z innego łańcucha uczestniczą w tworzeniu w przeciwciałach miejsc wiążących antygen (patrz Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała do antygenu, ale wykazują różnorodne funkcje efektorowe, takie jak udział przeciwciała w toksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. [0037] Łańcuchy lekkie przeciwciał (immunoglobulin) pochodzących od różnych gatunków kręgowców mogą być przypisane do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, nazywanych kappa (κ) oraz lambda (λ), w oparciu o sekwencję aminokwasową ich domen stałych. [0038] Zależnie od sekwencji aminokwasowej domen stałych łańcuchów ciężkich, przeciwciała (immunoglobuliny) mogą być przypisane do różnych klas. Jest pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM, a kilka spośród nich można następnie podzielić na podklasy (izotypy), np.: IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1 oraz IgA 2. Domeny stałe łańcucha ciężkiego, które odpowiadają różnym klasom immunoglobulin, są nazwane odpowiednio α, δ, ε, y oraz μ. Struktury podjednostek oraz trójwymiarowe konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane i opisane, na przykład, w Cellular and Mol. Immunology, Abbas i in., wydanie 4 (2000). Przeciwciało może być częścią większej

14 cząsteczki fuzyjnej, utworzonej poprzez oddziaływania kowalencyjne i niekowalencyjne przeciwciała z jednym lub wieloma innymi białkami lub peptydami. [0039] Terminy przeciwciało pełnej długości, nienaruszone przeciwciało oraz pełne przeciwciało są w niniejszym opisie stosowane zamiennie, w odniesieniu do przeciwciała w zasadniczo nienaruszonej postaci, nie fragmentów przeciwciał jak zdefiniowano poniżej. Terminy w szczególności odnoszą się do przeciwciał z łańcuchami ciężkimi zawierającymi region Fc. [0040] Fragmenty przeciwciał obejmują jedynie część nienaruszonego przeciwciała, przy czym część zachowuje przynajmniej jedną, lub tak wiele jak większość lub wszystkie spośród funkcji normalnie związanych z tym fragmentem, gdy jest on obecny w nienaruszonym przeciwciele. W jednym z przykładów wykonania, fragment przeciwciała obejmuje miejsce wiązania antygenu i tym samym zachowuje zdolność wiązania antygenu. W innym przykładzie wykonania, fragment przeciwciała, na przykład taki, który zawiera region Fc, zachowuje co najmniej jedną z funkcji biologicznych, normalnie związanych z regionem Fc, gdy jest on obecny w nienaruszonym przeciwciele, takich jak wiązanie FcRn, modulacja okresu półtrwania przeciwciała, funkcja ADCC oraz wiązanie dopełniacza. W jednym przykładzie wykonania, fragment przeciwciała jest przeciwciałem monowalentnym, które ma okres półtrwania in vivo zasadniczo podobny do tego dla nienaruszonego przeciwciała. Na przykład, taki fragment przeciwciała może zawierać ramię wiążące antygen połączone z sekwencją Fc, mającą zdolność nadawania stabilności in vivo temu fragmentowi. [0041] Trawienie przeciwciał papainą prowadzi do wytworzenia dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen, nazywanych fragmentami Fab, każdy z pojedynczym miejscem wiązania antygenu, oraz resztkowego fragmentu Fc, którego nazwa odzwierciedla zdolność do łatwej krystalizacji. Traktowanie pepsyną daje fragment F(ab ) 2, który ma dwa miejsca łączące antygen i wciąż posiada zdolność sieciowania antygenu. [0042] Fv jest najmniejszym fragmentem przeciwciała, który zawiera kompletne miejsce wiązania antygenu. W jednym przykładzie wykonania, dwułańcuchowe rodzaje Fv składają się z dimeru domen zmiennych, jednej z łańcucha ciężkiego oraz jednej z łańcucha lekkiego, ciasno połączonych w sposób niekowalencyjny. W jednołańcuchowych odmianach Fv (scfv), jedna domena zmienna łańcucha ciężkiego oraz jedna domena zmienna łańcucha lekkiego mogą być połączone kowalencyjnie poprzez elastyczny łącznik peptydowy, tak, że lekkie i ciężkie łańcuchy mogą połączyć się w strukturę dimeryczną analogiczną do tej z dwułańcuchowych odmian Fv. To w tej konfiguracji trzy CDRy z każdej domeny zmiennej oddziałują w celu utworzenia miejsca wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Łącznie, sześć CDR-ów nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jakkolwiek, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv zawierająca tylko trzy CDRy specyficzne dla antygenu) posiada zdolność rozpoznawania oraz wiązania antygenu, choć z mniejszym powinowactwem, niż całe miejsce wiążące. [0043] Fragment Fab zawiera domeny zmienne łańcucha lekkiego oraz łańcucha ciężkiego, a także domenę stałą łańcucha lekkiego oraz pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab różnią się od fragmentów Fab dodaniem kilku reszt na końcu karboksylowym domeny CH1 łańcucha ciężkiego, w tym jednej lub wielu cystein z regionu

15 zawiasowego przeciwciała. Fab -SH oznacza w niniejszym opisie Fab, w którym reszta(-y) cysteinowa(-e) domen stałych posiadają wolną grupę tiolową. Fragmenty przeciwciała F(ab ) 2 zostały oryginalnie wytworzone jako pary fragmentów Fab, które posiadają pomiędzy sobą cysteiny zawiasowe. Znane są również inne sprzężenia chemiczne fragmentów przeciwciał. [0044] Jednołańcuchowe Fv lub scfv obejmują domeny VH oraz VL przeciwciała, przy czym domeny te są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Ogólnie, polipeptyd scfv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH oraz VL, który nadaje scfv zdolność utworzenia pożądanej struktury wiążącej antygen. Dla zapoznania się z pracami przeglądowymi omawiającymi scfv, patrz Pluckthun, w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg oraz Moore, Springer-Verlag, Nowy York, str (1994). [0045] Termin dwuciała odnosi się do małych fragmentów przeciwciała z dwoma miejscami wiązania antygenu, które to fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Poprzez zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki, aby umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami w tym samym łańcuchu, domeny są zmuszone do parowania się z komplementarnymi domenami innego łańcucha i do tworzenia dwóch miejsc wiązania antygenu. Dwuciała mogą być dwuwalentne lub dwuspecyficzne. Dwuciała są obszerniej opisane na przykład w EP 404,097; WO93/1161; Hudson i in. (2003) Nat. Med. 9: oraz Hollinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: (1993). Trójciała oraz tertraciała są także opisane w Hudson i in. (2003) Nat. Med. 9: [0046] Określenie przeciwciało monoklonalne, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo jednorodnych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała populacji są identyczne, za wyjątkiem możliwych mutacji, np. naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w małych ilościach. Tak więc, modyfikator monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała, jako niebędącego mieszaniną odrębnych przeciwciał. W niektórych przykładach wykonania takie przeciwciało monoklonalne zazwyczaj obejmuje przeciwciało zawierające sekwencję polipeptydową, która wiąże obiekt docelowy, przy czym sekwencję polipeptydową wiążącą obiekt docelowy otrzymano w procesie obejmującym selekcję sekwencji polipeptydowej wiążącej pojedynczy obiekt docelowy spośród licznych sekwencji polipeptydowych. Na przykład, proces selekcji może polegać na selekcji unikalnego klonu spośród licznych klonów, takich jak pula klonów hybrydomy, klonów fagowych lub klonów rekombinowanego DNA. Należy rozumieć, że wybrana sekwencja wiążąca obiekt docelowy może być później zmieniana, na przykład w celu polepszenia powinowactwa względem obiektu docelowego, w celu humanizowania sekwencji wiążącej obiekt docelowy, w celu polepszenia produkcji w hodowli komórkowej, w celu zmniejszenia jej immunogenności in vivo, w celu stworzenia przeciwciała multispecyficznego itd., oraz że przeciwciało zawierające zmienioną sekwencję wiążącą obiekt docelowy jest także przeciwciałem monoklonalnym według niniejszego wynalazku. W przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które zwykle zawierają różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne z preparatu przeciwciał monoklonalnych jest skierowane przeciwko jednej

16 determinancie na antygenie. Poza ich specyficznością, preparaty przeciwciał monoklonalnych są korzystne dlatego, że zwykle nie są zanieczyszczone przez inne immunoglobuliny. [0047] Modyfikator monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała, jako otrzymanego z zasadniczo jednorodnej populacji przeciwciał i nie należy interpretować go jako wymagającego produkcji przeciwciał jakąkolwiek określoną metodą. Na przykład, przeciwciała monoklonalne stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, mogą być wytworzone za pomocą różnych technik, włączając, na przykład, metodę hybrydomy (np. Kohler i in., Nature, 256: 495 (1975); Harlow i in.; Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, wydanie ); Hammerling i in., w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., 1981)), metody rekombinowanego DNA (patrz np. patent amerykański nr 4,816,567), technologie prezentacji fagów (patrz, np. Clackson i in., Nature, 352: (1991); Marks i in., J. Mol. Biol. 222: (1992); Sidhu i in., J. Mol. Biol. 338(2): (2004); Lee i in., J. Mol. Biol. 340(5): (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad Sci. USA 101(34): (2004); oraz Lee i in., J. Immunol. Methods 284 (1-2): (2004) oraz technologie produkcji, ludzkich lub podobnych do ludzkich przeciwciał w zwierzętach, mających część lub wszystkie z loci ludzkich immunoglobulin lub sekwencje genów kodujących ludzkie immunoglobuliny (patrz np. WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits i in. Nature 362: (1993); Bruggemann i in. Year in Immunol. 7:33 (1993); patenty amerykańskie nr 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks i in., Bio.Technology 10: (1992); Lonberg i in., Nature 368: (1994); Morrison, Nature 368: (1994); Fishwild i in., Nature Biotechnol. 14: (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) oraz Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: (1995). [0048] Przeciwciała monoklonalne w niniejszym opisie w szczególności obejmują przeciwciała chimeryczne, w których część ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadającej sekwencji w przeciwciałach pochodzących ze specyficznych gatunków lub należących do szczególnej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha(-ów) jest identyczna z lub homologiczna do odpowiednich sekwencji w przeciwciałach, pochodzących z innego gatunku lub należących do innej klasy czy podklasy przeciwciał, jak również fragmenty przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (patent amerykański nr 4,816,567; oraz Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984)). [0049] Humanizowane postaci przeciwciał nie-ludzkich (np. mysich) są przeciwciałami chimerycznymi, które zawierają sekwencję minimalną, pochodzącą z nie-ludzkich immunoglobulin. W jednym z przykładów wykonania, humanizowane przeciwciało jest ludzką immunoglobuliną (przeciwciałem biorcą), w której reszty z regionu hiperzmiennego biorcy zastąpiono resztami z hiperzmiennego regionu gatunków innych niż człowiek (przeciwciało donorowe), takich jak mysz, szczur, królik lub niebędących człowiekiem naczelnych, mających pożądaną specyficzność, powinowactwo i/lub zdolność. W niektórych przypadkach, reszty regionów zrębowych (FR) immunoglobulin ludzkich są zastąpione przez

17 odpowiadające reszty niepochodzące od człowieka. Ponadto, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie są znajdowane w obrębie przeciwciała biorcy ani przeciwciała donorowego. Te modyfikacje mogą być przeprowadzane w celu dalszego zwiększenia funkcjonalności przeciwciał. Na ogół, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo całą jedną, a zazwyczaj dwie domeny zmienne, w których wszystkie lub w zasadzie wszystkie pętle hiperzmienne odpowiadają tym z immunoglobuliny niepochodzącej od człowieka, a wszystkie lub w zasadzie wszystkie FR są tymi z sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. Humanizowane przeciwciało opcjonalnie będzie także zawierało co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tego z immunoglobuliny ludzkiej. W celu zapoznania się ze szczegółami, patrz Jones i in., Nature 321: (1986); Riechmann i in., Nature 332: (1988); oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: (1992). Zobacz także następujące artykuły przeglądowe oraz odniesienia w nich zacytowane: Vaswani i Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: (1995); Hurle i Gross, Curr. Op. Biotech. 5: (1994). [0050] Ludzkie przeciwciało to takie, które posiada sekwencję aminokwasową odpowiadającą przeciwciału produkowanemu przez człowieka, i/lub wytworzone za pomocą technik do sporządzania przeciwciał ludzkich, jak ujawniono w niniejszym opisie. Ta definicja ludzkiego przeciwciała wyraźnie wyklucza przeciwciało humanizowane, zawierające niepochodzące od człowieka reszty wiążące antygen. [0051] Termin region hiperzmienny, HVR, czy HV, użyty w niniejszym opisie, odnosi się do regionów domeny zmiennej przeciwciała, które są hiperzmienne pod względem sekwencji i/lub postaci strukturalnie zdefiniowanych pętli. Ogólnie, przeciwciała zawierają sześć regionów hiperzmiennych: trzy w VH (H1, H2, H3) oraz trzy w VL (L1, L2, L3). W przeciwciałach natywnych, H3 oraz L3 wykazują największą różnorodność spośród sześciu regionów hiperzmiennych, a zwłaszcza H3 zdaje się odgrywać unikalną rolę w nadawaniu przeciwciałom wysokiej specyficzności. Xu i in. (2000) Immunity 13: 37-45; Johnson i Wu (2003) w Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, Human Press, Totowa, NJ). W rzeczywistości, naturalnie występujące przeciwciała wielbłądzie, składające się tylko z ciężkiego łańcucha, funkcjonują i są trwałe pod nieobecność łańcucha lekkiego. Hamers- Casterman i in. (1993) Nature 363: ; Sheriff i in. (1996) Nature Struct, Biol. 3: [0052] W użyciu, oraz ujętych w niniejszym opisie, znajduje się szereg nakreśleń regionu hiperzmiennego. Regiony determinujące komplementarność (CDRy) według Kabata są oparte o zmienność sekwencji i są najczęściej używane (Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Chothia odsyła natomiast do lokalizacji pętli strukturalnych (Chothia i Lesk; J. Mol. Biol. 196: (1987). Regiony hiperzmienne AbM stanowią kompromis pomiędzy CDR-ami Kabata, a pętlami strukturalnymi Chothii i są wykorzystane przez oprogramowanie do modelowania przeciwciał Oxford Molecular s AbM. Kontaktowe regiony hiperzmienne są oparte na analizie dostępnych struktur krystalicznych kompleksów. Reszty z każdego z tych regionów hiperzmiennych wypisano poniżej.

18 Pętla Kabat AbM Chothia Kontakt L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeracja Kabata) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeracja Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 [0053] Regiony hiperzmienne mogą zawierać wydłużone regiony hiperzmienne jak następuje: lub (L1), lub (L2) oraz lub (L3) w VL, oraz (H1), lub (H2) oraz , oraz (H3) w VH. Reszty domeny zmiennej są ponumerowane według Kabat i in., supra, dla każdej z tych definicji. [0054] Zrąb lub reszty FR są tymi resztami domeny zmiennej, innymi niż reszty regionu hiperzmiennego, jak zdefiniowano w niniejszym opisie. [0055] Termin reszty domeny zmiennej numerowane według Kabata lub pozycje aminokwasów numerowane jak u Kabata oraz ich wariacje, odnoszą się do systemu numerowania stosowanego dla domen zmiennych łańcucha ciężkiego lub domen zmiennych łańcucha lekkiego kompilacji przeciwciał w Kabat i in.; Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991). Przy stosowaniu tego systemu numerowania, rzeczywista liniowa sekwencja aminokwasowa może zawierać mniejszą liczbę aminokwasów lub dodatkowe aminokwasy, co odpowiada skróceniu lub insercji do FR lub HVR domeny zmiennej. Na przykład, domena zmienna łańcucha ciężkiego może zawierać pojedynczą insercję aminokwasową (reszta 52a według Kabata) po reszcie 52 w H2, oraz insercje reszt (np. reszt 82a, 82b i 82c itd., według Kabata) po reszcie 82 FR łańcucha ciężkiego. Numerowanie reszt według Kabata może być określane dla danego przeciwciała poprzez nałożenie regionów homologicznych sekwencji przeciwciała na standardową sekwencję numerowaną według Kabata. [0056] Przeciwciało o dojrzałym powinowactwie jest przeciwciałem z jedną lub większą liczbą zmian w jednym lub wielu HVR, co skutkuje polepszeniem powinowactwa przeciwciała do antygenu, w porównaniu do przeciwciała macierzystego, które nie posiada tej (tych) zmiany (zmian). W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało o dojrzałym powinowactwie wykazuje nanomolowe lub wręcz pikomolowe powinowactwo dla docelowego antygenu. Przeciwciała o dojrzałym powinowactwie są wytwarzane za pomocą procedur znanych w danej dziedzinie. Marks i in. Bio/Technology 10: (1992) opisuje dojrzewanie powinowactwa poprzez tasowanie domen VH oraz VL. Mutageneza losowa HVR i/lub reszt zrębowych zostały opisane przez: Barbas i in. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: (1994); Schier i in.; Gene 169: (1995); Yelton i in.; J. Immunol. 155:

19 (1995); Jackson i in., J. Immunol. 154(7): (1995) oraz Hawkins i in., J. Mol. Biol. 226: (1992). [0057] Przeciwciało blokujące lub przeciwciało antagonistyczne to takie, które inhibuje lub redukuje aktywność biologiczną wiązanego antygenu. Niektóre przeciwciała blokujące lub przeciwciała antagonistyczne znacząco lub całkowicie inhibują aktywność biologiczną antygenu. [0058] Przeciwciało antagonistyczne, jak użyto w niniejszym opisie, jest przeciwciałem, które naśladuje co najmniej jedną z aktywności funkcjonalnych polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. [0059] Funkcje efektorowe przeciwciała odnoszą się do aktywności biologicznych, możliwych do przypisania regionowi Fc (sekwencja natywna regionu Fc lub wariant sekwencji aminokwasowej regionu Fc) przeciwciała i różnią się w zależności od izotypu przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują: wiązanie C1q oraz cytotoksyczność zależną od dopełniacza, wiązanie receptora Fc, zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC); fagocytozę, spadek liczby receptorów na powierzchni komórki (np. receptorów na komórkach B) oraz aktywację komórek B. [0060] Receptor Fc lub FcR opisuje receptor, który wiąże się do regionu Fc przeciwciała. W niektórych przykładach wykonania FcR jest ludzkim natywnym FcR. W niektórych przykładach wykonania FcR jest tym, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje podklasy receptorów FcγRI, FcγRII oraz FcγRIII, włączając warianty alleliczne oraz postaci tych receptorów o alternatywnie składanych eksonach. Receptory FcγRII obejmują FcγRIIA ( receptor aktywujący ) oraz FcγRIIB ( receptor inhibujący ), które mają podobne sekwencje aminokwasowe, różniące się przede wszystkim w domenach cytoplazmatycznych. Receptor aktywujący FcγRIIA zawiera motyw aktywujący immunoreceptora oparty o tyrozynę (TTAM) w swej domenie cytoplazmatycznej. Receptor inhibujący FcγRIIB zawiera motyw inhibujący immunoreceptora oparty o tyrozynę (ITIM) w swej domenie cytoplazmatycznej (patrz Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: (1997)). FcR są omówione w pracach przeglądowych w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: (1991); Capel i in., Immunomethods 4: (1994); oraz de Haas i in., J. Lab. Clin. Med. 126: (1995). Inne FcR, w tym te, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości, są w niniejszym opisie objęte określeniem FcR. [0061] Termin receptor Fc lub FcR obejmuje także receptor noworodkowy, FcRn, który jest odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer i in., J. Immunol. 117: 587 (1976) oraz Kim i in., J. Immunol. 24: 249 (1994)) oraz za regulację homeostazy immunoglobin. Są znane metody pomiaru wiązania do FcRn (patrz np. Ghetie 1997, Hinton 2004). Można mierzyć wiązanie do ludzkiego FcRn in vivo oraz czas półtrwania w osoczu ludzkiego FcRn, o wysokim powinowactwie wiązania polipeptydów, np. u myszy transgenicznych lub w transfekowanych liniach ludzkich komórek, eksprymujących FcRn, albo u naczelnych, którym podawane są warianty polipeptydów z Fc. [0062] WO00/42072 (Presta) opisuje warianty przeciwciał o zwiększonym lub obniżonym wiązaniu do FcR. Zawartość tej publikacji patentowej została specjalnie włączona do

20 niniejszego opisu poprzez odniesienie. Zobacz także Shields i in. J. Biol. Chem. 9(2): (2001). [0063] Ludzkie komórki efektorowe oznaczają leukocyty, które wykazują ekspresję jednego lub więcej FcR oraz spełniają funkcje efektorowe. W niektórych przykładach wykonania, komórki wykazują ekspresję co najmniej FcγRIII oraz pełnią funkcję(-e) efektorowe ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC obejmują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), komórki naturalnych zabójców (NK), monocyty, cytotoksyczne komórki T oraz neutrofile. Komórki efektorowe mogą być izolowane ze źródeł natywnych, np. z krwi. [0064] Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał czy ADCC odnosi się do postaci cytotoksyczności, w której wydzielane Ig związane z receptorami Fc (FcR) występującymi na niektórych komórkach cytotoksycznych (np. komórkach naturalnych zabójców (NK), neutrofilach oraz makrofagach) umożliwiają tym cytotoksycznym komórkom efektorowym specyficzne związanie się do komórki docelowej niosącej antygen, a następnie uśmiercenie komórki docelowej za pomocą cytotoksyn. Komórki pierwotne pośredniczące w ADCC, komórki NK, wykazują tylko ekspresję FcγRIII, podczas gdy monocyty wykazują ekspresję FcγRI, FcγRII oraz FcγRIII. Ekspresja FcR na komórkach hematopoetycznych jest podsumowana w tabeli 3 na stronie 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: (1991). Aby ocenić aktywność ADCC w cząsteczce będącej przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić oznaczenie ADCC in vitro, takie jak opisano w patencie amerykańskim nr 5,500,362 lub 5,821,337 lub patencie amerykańskim nr 6,737,056, dla Presta. Do użytecznych do wykonania takich oznaczeń komórek efektorowych zalicza się komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oraz komórki naturalnych zabójców (NK). Zamiennie lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można mierzyć in vivo, np. w modelu zwierzęcym, tak jak ujawniono w Clynes i in. PNAS (USA) 95: (1998). [0065] Cytotoksyczność zależna od dopełniacza lub CDC odnosi się do lizy komórki docelowej w obecności dopełniacza. Aktywacja klasycznego szlaku dopełniacza jest inicjowana poprzez związanie pierwszego komponentu układu dopełniacza (C1q) do przeciwciał (odpowiedniej podklasy), które są związane do pokrewnego antygenu. W celu pomiaru aktywacji dopełniacza, można przeprowadzić oznaczenie CDC, np. jak opisano w Gazzano-Santoro i in., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). [0066] Warianty polipeptydów ze zmienioną sekwencją aminokwasową regionu Fc oraz zwiększoną lub obniżoną zdolnością wiązania C1q, są opisane w patencie amerykańskim nr 6,194,551B1 oraz WO99/ Zawartość tych publikacji patentowych jest specjalnie włączona do niniejszego opisu poprzez odniesienie. Zobacz także Idusogie i in., J. Immunol. 164: (2000). [0067] Termin polipeptyd zawierający region Fc odnosi się do polipeptydu, takiego jak przeciwciało lub immunoadhezyna, który zawiera region Fc. C-końcowa lizyna (reszta 447 według systemu numeracji EU) regionu Fc może zostać usunięta, na przykład podczas oczyszczania polipeptydu lub poprzez inżynierię rekombinacyjną kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd. W związku z tym, kompozycja zawierająca polipeptyd posiadający

21 region Fc zgodnie z niniejszym wynalazkiem może zawierać polipeptydy z K447, ze wszystkimi K447 usuniętymi lub mieszaninę polipeptydów z lub bez reszty K447. [0068] Ludzka akceptorowa sekwencja zrębowa dla celów niniejszego opisu oznacza sekwencję zrębową, obejmującą sekwencję aminokwasową zrębu VL lub VH, będącą pochodną sekwencji zrębowej ludzkiej immunoglobuliny lub ludzkiej konsensusowej sekwencji zrębowej. Ludzka akceptorowa sekwencja zrębowa pochodząca z sekwencji zrębowej ludzkiej immunoglobuliny lub ludzkiej konsensusowej sekwencji zrębowej może zawierać taką samą sekwencję aminokwasową lub może zawierać wcześniejsze zmiany sekwencji aminokwasowej. W niektórych przykładach wykonania, liczba wcześniejszych zmian sekwencji aminokwasowej wynosi 10 lub mniej, 9 lub mniej, 8 lub mniej, 7 lub mniej, 6 lub mniej, 5 lub mniej, 4 lub mniej, 3 lub mniej czy 2 lub mniej. W przypadku, gdy wcześniejsze zmiany sekwencji aminokwasowej występują w obrębie VH, korzystnie zmiany te występują w zaledwie trzech, dwóch lub jednej z pozycji 71H, 73H oraz 78H; na przykład resztami aminokwasowymi w tych pozycjach mogą być 71A, 73T i/lub 78A. W jednym przykładzie wykonania, ludzka zrębowa sekwencja akceptorowa VL jest identyczna co do sekwencji z sekwencją zrębową ludzkiej immunoglobuliny lub ludzką konsensusową sekwencją zrębową. [0069] Ludzka konsensusowa sekwencja zrębowa oznacza sekwencję zrębową, która przedstawia najczęściej występujące reszty aminokwasowe spośród wybranych sekwencji zrębowych VL lub VH ludzkich immunoglobulin. Ogólnie, selekcja sekwencji VL lub VH ludzkiej immunoglobuliny odbywa się spośród podgrup sekwencji domeny zmiennej. Ogólnie, podgrupa sekwencji oznacza podgrupę jak w Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). W jednym przykładzie wykonania, dla VL, podgrupa oznacza podgrupę kappa I, jak w Kabat i in., supra. W jednym przykładzie wykonania, dla VH, podgrupa oznacza podgrupę III, jak w Kabat i in., supra. [0070] Konsensusowa sekwencja zrębowa VH podgrupy III zawiera sekwencję konsensusową otrzymaną z sekwencji aminokwasowych dla domeny zmiennej łańcucha ciężkiego [VH] podgrupy III według Kabat i in., supra. W jednym przykładzie wykonania, konsensusowa aminokwasowa sekwencja zrębowa VH podgrupy III zawiera co najmniej część lub całość każdej z poniższych sekwencji: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 50)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 51)-H2- RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 59)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 35). [0071] Konsensusowa sekwencja zrębowa VL podgrupy I zawiera sekwencję konsensusową otrzymaną z sekwencji aminokwasowych w podgrupie I domeny zmiennej łańcucha lekkiego [VL] kappa według Kabata i in., supra. W jednym przykładzie wykonania, konsensusowa aminokwasowa sekwencja zrębowa VH podgrupy 1 zawiera co najmniej część lub całość każdej z poniższych sekwencji: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 60)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 61)-L2- GVPSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 62)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63).

22 [0072] Powinowactwo wiązania ogólnie odnosi się do siły sumy niekowalencyjnych oddziaływań pomiędzy pojedynczymi miejscami wiązania cząsteczki (np. przeciwciała) i jego partnera do wiązania (np. antygenu). Jeśli nie zaznaczono inaczej, jak użyto w niniejszym opisie, powinowactwo wiązania odnosi się do wewnętrznego powinowactwa wiązania, które odzwierciedla oddziaływanie 1:1 pomiędzy składnikami pary podlegającej wiązaniu (np. przeciwciało i antygen). Powinowactwo cząsteczki X do jej partnera Y może ogólnie być wyrażone poprzez stałą dysocjacji (Kd). Powinowactwo może być mierzone za pomocą powszechnych sposobów znanych w danej dziedzinie, włączając te opisane w niniejszym opisie. Przeciwciała o niskim powinowactwie na ogół wiążą antygen wolno i wykazują skłonność do szybkiej dysocjacji, podczas gdy przeciwciała o wysokim powinowactwie na ogół wiążą antygen szybciej i zwykle pozostają z nim dłużej związane. Znany jest szereg sposobów do pomiaru powinowactwa wiązania, z których dopuszcza się użycie dowolnego dla celów niniejszego wynalazku. Konkretne ilustrujące przykłady wykonania są opisane poniżej. [0073] W jednym przykładzie wykonania, Kd lub wartość Kd zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest mierzona za pomocą oznaczenia wiązania znakowanego radioaktywnie antygenu (RIA), przeprowadzanego z wersją Fab przeciwciała, będącego przedmiotem zainteresowania oraz jego antygenu, jak opisano przy pomocy następującego oznaczenia. Powinowactwo wiązania Fab do antygenu w roztworze mierzono poprzez równoważenie Fab z najmniejszym stężeniem antygenu, znakowanego, ( 125 I) w obecności szeregu rozcieńczeń nieznakowanego antygenu, a następnie wychwytywano związany antygen za pomocą płytki pokrytej przeciwciałem anty-fab (Chen i in., (1999) J. Mol. Biol. 293: ). W celu ustalenia warunków oznaczenia, płytki mikrotitracyjne (Dynex) pokrywano przez noc wychwytującym przeciwciałem anty-fab o stężeniu 5 μg/ml (Cappel Labs) w 50 mm węglanie sodu (ph 9,6) a następnie blokowano 2% (wag./obj.) albuminą bydlęcą w PBS przez dwie do pięciu godzin w temperaturze pokojowej (około 23 C). Na płytce nieadsorbującej (Nunc #269620), mieszano 100 pm lub 26 pm antygenu znakowanego ( 125 I) z kolejnymi rozcieńczeniami Fab, będącego przedmiotem zainteresowania (np. zgodnie z oznaczaniem przeciwciała anty-vegf, Fab-12, w Presta i in., (1997) Cancer Res. 57: ). Fab, będące przedmiotem zainteresowania, następnie inkubowano przez noc, jakkolwiek inkubacja może być kontynuowana przez dłuższy okres czasu (np. około 65 godzin), aby mieć pewność, że został osiągnięty stan równowagi. Następnie, mieszaniny są przenoszone na płytkę wychwytującą celem inkubacji w temperaturze pokojowej (np. przez jedną godzinę). Roztwór jest następnie usuwany, a płytka płukana osiem razy za pomocą 0,1% Tween-20 w PBS. Po osuszeniu płytki, dodaje się płyn scyntylacyjny (MicroScint-20; Packard) w ilości 150 μl/studzienka, a płytki zlicza się w liczniku Topcount promieniowania gamma (Packard), przez dziesięć minut. Stężenia każdego z Fab, które daje mniej niż 20% lub 20% maksymalnego wiązania są wybierane do użycia w oznaczeniach wiązania kompetycyjnego. [0074] Zgodnie z innym przykładem wykonania, Kd lub wartość Kd jest mierzona poprzez zastosowanie oznaczeń powierzchniowego rezonansu plazmonowego za pomocą BIAcore lub BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) w temperaturze 25 C, z czipami CM5 z immobilizowanym antygenem, na poziomie ~10 jednostek odpowiedzi

23 (RU). ~Pokrótce, chipy biosensorowe z karboksymetylowanego dekstranu (CM5, BIAcore Inc.) są aktywowane chlorowodorkiem N-etylo-N -(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) oraz N-hydroksysukcynoimidem (NHS), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Antygen rozcieńczano 10 mm octanem sodu ph 4.8, do 5μg/ml (~0,2 μm) przed wstrzyknięciem, przy natężeniu przepływu 5 μl/min, celem osiągnięcia około 10 jednostek odpowiedzi (RU) sprzężonego białka. Po iniekcji antygenu, wstrzykiwano 1 M etanolaminę w celu zablokowania grup, które nie przereagowały. Do pomiaru kinetycznego, wstrzykiwano serię dwukrotnych rozcieńczeń Fab (0,78 nm do 500 nm) w PBS z 0,05% Tween 20 (PBST) w temperaturze 25 C, przy natężeniu przepływu około 25 μl/min. Współczynniki asocjacji (k on ) oraz współczynniki dysocjacji (k off ) są obliczane w oparciu o prosty model wiązania jeden na jeden Langmuira (oprogramowanie BIAcore Evaluation Software wersja 3.2) przy jednoczesnym dopasowaniu sensorogramów asocjacji oraz dysocjacji. Równowagową stałą dysocjacji (Kd) oblicza się jako stosunek k off /k on. Patrz np. Chen, Y i in., (1999) J. Mol. Biol. 293: Jeśli stała asocjacji przekracza 10 6 M -1 s -1 w oznaczeniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego powyżej, wtedy stałą asocjacji można zmierzyć poprzez zastosowanie techniki wygaszania fluorescencji, która mierzy wzrost lub spadek intensywności emisji fluorescencji (wzbudzenie = 295 nm; emisja = 340 nm, 16 nm filtr pasmowo-przepustowy) w temperaturze 25 C dla 20 nm przeciwciała antagonistycznego względem antygenu (postać Fab) w PBS, ph 7,2, w obecności rosnących stężeń antygenu, jak mierzono w spektrometrze, takim jak spektrofotometr ze wstrzymaniem przepływu (Aviv Instruments) lub spektrofotometr SLM-Aminco serii 8000 (ThermoSpectronic) z wytrząsaną kuwetą. [0075] Stałą asocjacji, współczynnik asocjacji lub k on zgodnie z niniejszym wynalazkiem można także określić jak opisano powyżej, z użyciem systemu BIAcore lub BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). [0076] Zaburzenie oznacza jakikolwiek stan lub chorobę, w przypadku których doszłoby do osiągnięcia korzyści z leczenia za pomocą substancji/cząsteczki lub sposobu według wynalazku. To obejmuje zaburzenia przewlekłe oraz ostre, włączając stany patologiczne, predysponujące ssaki do omawianych zaburzeń. Do niepodlegających ograniczeniom przykładów zaburzeń, które mają być poddane leczeniu zalicza się w niniejszym opisie stany rakowe, takie jak guzy, np. raki (guzy nabłonkowe) oraz blastomy (guzy pochodzące z tkanek embrionalnych), a w niektórych przykładach wykonania raka jajnika, raka macicy (włączając raka endometrium), guzy mózgu (np. astrocytomy oraz glejaki), raka nerki, włączając nefroblastomy (np. guz Wilmsa). [0077] Określenia zaburzenia proliferacji komórek oraz zaburzenia proliferacyjne odnoszą się do zaburzeń, które są związane z pewnym stopniem nieprawidłowości w proliferacji komórek. W jednym przykładzie wykonania, zaburzeniem proliferacji komórkowej jest rak. [0078] Guz, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się do wszelkiego rodzaju neoplastycznego wzrostu komórek czy proliferacji, czy to złośliwych czy łagodnych oraz do wszystkich przedrakowych czy rakowych komórek oraz tkanek. Terminy rak, rakowy,

24 zaburzenie proliferacji komórek, zaburzenie proliferacyjne oraz guz, o których mowa w niniejszym opisie, nie wykluczają się nawzajem. [0079] Określenia rak oraz rakowy odnoszą się do lub opisują stan fizjologiczny u ssaków, który są zwykle charakteryzowane poprzez niepodlegający regulacji wzrost komórek/proliferację. Przykłady raków obejmują, ale nie ograniczają się do, raka, chłoniaka (np. chłoniaka Hodgkina i chłoniaka nieziarniczego), blastomy, mięsaka oraz białaczki. Bardziej szczegółowe przykłady takich raków obejmują raka płaskonabłonkowego, drobnokomórkowego raka płuc, niedrobnokomórkowego raka płuc, gruczolakoraka płuc, płaskonabłonkowego raka płuc, raka otrzewnej, raka wątrobowokomórkowego, raka żołądka i jelita, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka piersi, raka jelita grubego, raka okrężnicy i odbytnicy, raka endometrium lub macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerki, raka wątroby, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, białaczki i inne zaburzenia limfoproliferacyjne oraz różne rodzaje raka głowy i szyi. [0080] Jak użyto w niniejszym opisie, określenie leczenie (oraz odmiany jak leczyć albo traktowanie ) odnoszą się do interwencji klinicznych, mających na celu zmianę naturalnego przebiegu choroby u pacjentów poddawanych leczeniu lub w komórkach, mogących mieć zastosowania albo profilaktyczne lub podczas trwania patologii klinicznej. Pożądane efekty leczenia obejmują zapobieganie wystąpieniu lub nawrotowi choroby, łagodzenie objawów, ograniczenie jakichkolwiek bezpośrednich lub pośrednich następstw klinicznych choroby, zapobieganie przerzutom, obniżanie tempa postępu choroby, poprawę lub złagodzenie stanu choroby oraz remisję lub poprawę rokowania. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała według wynalazku są stosowane w celu opóźnienia rozwoju choroby czy zaburzenia lub do spowolnienia postępu choroby czy zaburzenia. [0081] Osobnik oznacza kręgowca. W niektórych przykładach wykonania, kręgowiec jest ssakiem. Ssaki obejmują, ale nie ograniczają się do zwierząt gospodarskich (takich jak krowy), zwierząt sportowych czy domowych (takich jak koty, psy oraz konie), naczelnych, myszy oraz szczurów. W niektórych przykładach wykonania ssakiem jest człowiek. [0082] Skuteczna ilość odnosi się do ilość skutecznej, przy dawkowaniu i przez okresy czasu niezbędne do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. [0083] Terapeutycznie skuteczna ilość substancji/cząsteczki według wynalazku może się różnić w zależności od czynników, takich jak stan chorobowy, wiek, płeć oraz waga osobnika oraz zdolność substancji/cząsteczki do wywołania pożądanej odpowiedzi u danego osobnika. Terapeutycznie skuteczna ilość odnosi się do ilości, w przypadku której jakikolwiek toksyczny czy szkodliwy wpływ substancji/cząsteczki jest zrównoważony przez efekty korzystne terapeutycznie. Profilaktycznie skuteczna ilość odnosi się do skutecznej ilości, przy dawkowaniu i przez niezbędny okres czasu, w celu osiągnięcia pożądanego skutku profilaktycznego. Zwykle, ale niekoniecznie, ze względu na to, że dawki profilaktyczne są stosowane u osobników wcześniej lub we wcześniejszym stadium choroby, ilość profilaktycznie skuteczna będzie mniejsza niż ilość terapeutycznie skuteczna. [0084] Termin czynnik cytotoksyczny, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się do substancji, która inhibuje funkcje komórkowe lub im przeciwdziała i/lub powoduje śmierć

25 komórkową lub destrukcję. Termin ma z założenia obejmować izotopy promieniotwórcze (na przykład At 211, I 131, I 125, Y 90, Re 186, Re 188, Sm 153, Bi 212, P 32, Pb 212 oraz izotopy promieniotwórcze Lu), czynniki chemoterapeutyczne (np. metotreksat, adriamycynę, alkaloidy Vinca/barwinka (winkrystyna, winblastyna, etopozyd), doksorubicynę, melfalan, mitomycynę C, chlorambucyl, daunorubicynę lub inne czynniki interkalujace, enzymy i ich fragmenty, jak enzymy nukleolityczne, antybiotyki oraz toksyny, takie jak toksyny drobnocząsteczkowe lub aktywne enzymatycznie toksyny pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnnego lub zwierzęcego, włączając ich fragmenty i/lub warianty oraz różnorodne czynniki przeciwnowotworowe lub przeciwrakowe ujawnione poniżej. Inne czynniki cytotoksyczne opisano poniżej. Czynnik guzobójczy powoduje destrukcję komórek guza. [0085] Toksyną jest jakakolwiek substancja zdolna do wywołania szkodliwego skutku, jeśli chodzi o wzrost lub proliferację komórek. [0086] Czynnik chemoterapeutyczny jest związkiem chemicznym przydatnym w leczeniu raka. Przykłady czynników chemoterapeutycznych obejmują czynniki alkilujące takie jak tiotepa oraz CYTOXAN cyklofosfamid, sulfoniany alkilowe jak busulfan, improsulfan, piposulfan; azyrydyny takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa oraz uredopa; etylenoiminy oraz metylamelaminy włączając altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforamid, trietylenotiofosforamid oraz trimetylolomelaminę; acetogeniny (szczególnie bullatacynę oraz bullatacynon); delta-9-tetrahydrokannabinol (dronabinol, MARINOL ); beta-lapachon; lapachol; kolchicyny; kwas betulinowy; kamptotecynę (włączając analog syntetyczny topotekan (HYCAMTIN ), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR ), acetylokamptotecynę, skopolektynę oraz 9-aminokamptotecynę); briostatynę; kallistatynę; CC-1065 (włączając analogi syntetyczne adozelesynę, karzelesynę oraz bizelesynę); podofilotoksynę; kwas podofilinowy; tenipozyd; kryptoficyny (szczególnie kryptoficynę 1 oraz kryptoficynę 8); dolastatynę; duokarmycynę (włączając analogi syntetyczne, KW-2189 oraz CB1-TM1); eleuterobinę; pankratystatynę; sarkodyktyinę; spongistatynę; iperyty azotowe jak chlorambucyl, chlornafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylowy; nitrozomoczniki jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna oraz ranimnustyna; antybiotyki takie jak antybiotyki enediynowe (na przykład kalicheamycyna, szczególnie kalicheamycyna gamma1i oraz kalicheamycyna omega I1 (patrz np. Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: (1994)); dynemycynę, włączając dynemycynę A; esperamycynę; jak również chromofor neokarzynostatynowy oraz pokrewne chromofory enediynowych antybiotyków chromobiałkowych), aklacynomyzyny, aktynomycynę, autramycynę, azaserynę, bleomycyny, kaktynomycynę, karabicynę, karminomycynę, karzynofilinę, chromomycyny, daktynomycynę, daunorubicynę, detorubicynę, 6-diazo-5-okso-Lnorleucynę, ADRIAMYCIN doksorubicynę (włączając morfolino-doksorubicynę, cyjanomorfolino-doksorubicynę, 2-pirolino-doksorubicynę oraz deoksydoksorubicynę), epirubicynę, ezorubicynę, idarubicynę, marcellomycynę, mitomycyny jak mitomycyna C, kwas mykofenolowy, nogalamycynę, oliwomycyny, peplomycynę, porfiromycynę,

26 puromycynę, kwelamycynę, rodorubicynę, streptonigrynę, streptozocynę, tubercydynę, ubenimeks, zynostatynę, zorubicynę; antymetabolity jak metotreksat oraz 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; analogi puryn jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidyn jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, floksurydyna; androgeny takie jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antagonistów hormonów kory nadnerczy jak aminoglutetymid, mitotan, trilostan; środki uzupełniające działanie kwasu foliowego, jak kwas frolinowy; aceglaton; glikozyd aldofosfamidu; kwas aminolewulinowy; eniluracyl; amsakrynę; bestrabucyl; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcyna; diazykwon; elfomityna; octan eliptynium; epotylon; etoglucyd; azotan galu; hydroksymocznik; lentynan; lonidaminę; majtanzynoidy jak majtanzyna oraz ansamitocyny; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerynę; pentostatynę; fenamet; pirarubicynę; losoksantron; 2-etylohydrazyd; prokarbazynę; PSK kompleks polisacharydowy (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; ryzoksyn; sizofiran; spirogerman; kwas tenuazonowy; triazykwon; 2,2,2"-trichlorotrietyloaminę; trichoteceny (szczególnie toksyna T-2, werakuryna A, rorydyna A oraz anguidyna); uretan; windezynę (ELDISINE, FILDESIN ); dakarbazynę; mannomustynę; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozynę; arabinozyd ( Ara-C ); tiotepa; taksoidy, na przykład TAXOL paklitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE nanocząsteczkowa formulacja paklitakselu związanego z albuminą, niezawierająca cremophoru (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) oraz TAXOTERE docetaksel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francja); chlorambucyl; gemcytabinę (GEMZAR ); 6-tioguaninę; merkaptopurynę; metotreksat; analogi platyny jak cisplatynę oraz karboplatynę; winblastynę (VELBAN ); platynę; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; winkrystynę (ONCOVIN ); oksaliplatynę; leukowowinę; winorelbinę (NAVELBINE ); nowantron; edatreksat; daunomycynę; aminopterynę; ibandronat; inhibitor topoizomerazy RFS 2000; difluorometylornitynę (DMFO); retinoidy jak kwas retinowy; kapecytabinę (XELODA ); farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy lub pochodne dowolnego z powyższych; jak również kombinacje dwóch lub więcej wymienionych powyżej, takie jak CHOP, skrót dla leczenia skojarzonego za pomocą cyklofosfamidu, doksorubicyny, winkrystyny oraz prednizolonu, oraz FOLFOX, skrót dla schematu leczenia z oksaliplatyną (ELOXATIN ) w połączeniu z 5-FU oraz leukowowiną. [0087] Włączono również do tej definicji czynniki anty-hormonalne, których działanie polega na regulowaniu, redukowaniu, blokowaniu lub inhibowaniu efektów hormonalnych, które mogą promować wzrost raka, oraz występują często w postaci leczenia systemowego lub całościowego. Same mogą one być hormonami. Przykłady obejmują antyestrogeny oraz selektywne modulatory receptorów estrogenowych (SERM), włączając na przykład tamoksyfen (w tym NOLVADEX tamoksyfen), EVISTA raloksyfen, droloksyfen, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY117018, onapriston oraz FARESTON toremifen; anty-progesterony; regulatory obniżające liczbę receptorów estrogenowych (ERD); czynniki, których funkcja polega na supresji lub zamknięciu jajników, na przykład, agoniści

27 hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRH) jak LUPRON oraz ELIGARD octan leuprolidu, octan gosereliny, octan busereliny oraz tripterelina; inne anty-androgeny jak flutamid, nilutamid oraz bikalutamid oraz inhibitory aromatazy, które hamują enzym aromatazę, która reguluje produkcję estrogenów w nadnerczach, tak jak na przykład, 4(5)- imidazole, aminoglutetimid, MEGASE octan megestrolu, AROMASIN eksemestan, formestan, fadrozol, RIVISOR worozol, FEMARA letrozol oraz ARIMIDEX anastrozol. Dodatkowo, taka definicja czynników chemoterapeutycznych obejmuje bisfosfoniany jak klodronat (na przykład BONEFOS czy OSTAC ), DIDROCAL etidronat, NE-58095, ZOMETA kwas zoledronowy/zoledronian, FOSAMAX alendronat, AREDIA pamidronat, SKELID tiludronat lub ACTONEL rizedronat; jak również troksacytabina (1,3-dioksolanowy analog nukleozydu cytozyny), nukleotydy antysensowne, szczególnie te, które inhibują ekspresję genów szlaków sygnałowych, zaangażowanych w nieprawidłową proliferację komórek, jak na przykład PCK-alfa, Raf, H-Ras oraz receptor epidermalnego czynnika wzrostu (EGF-R); szczepionki takie jak THERATOPE oraz szczepionki terapii genowej np. szczepionki ALLOVECTIN, LEUVECTIN i VAPID, LUTROTECAN inhibitor topoizomerazy 1, ABARELIX rmrh; ditosylan lapatynibu (ErbB-2 oraz EGFR podwójny niskocząsteczkowy inhibitor kinazy tyrozynowej, znany również jako GW572016) oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy oraz pochodne dowolnego z powyższych. [0088] Czynnik hamujący wzrost odnosi się w niniejszym opisie do związku lub kompozycji, które hamują wzrost komórek (takich jak komórki wykazujące ekspresję TAT226), in vivo lub in vitro. Tak więc, czynnikiem hamującym wzrost może być taki, który znacząco redukuje odsetek komórek (takich jak komórki wykazujące ekspresję TAT226) w fazie S. Przykłady czynników hamujących wzrost obejmują czynniki, które blokują progresję cyklu komórkowego (w miejscu innym niż faza S), takie jak czynniki indukujące zahamowanie cyklu w fazie G1 oraz zahamowanie cyklu w fazie M. Klasyczne blokery fazy M obejmują alkaloidy barwinka (winkrystynę oraz winblastynę), taksany oraz inhibitory topoizomerazy II, takie jak doksorubicyna, epirubicyna, daunorubicyna, etopozyd oraz bleomycyna. Te czynniki, które zatrzymują cykl w fazie G1, rozciągają swoje działanie także na zahamowanie cyklu w fazie S, jak na przykład czynniki alkilujące DNA jak tamoksyfen, prednison, dakarbazyna, mechloretamina, cisplatyna, metotreksat, 5-fluorouracyl oraz ara-c. Dalsze informacje można znaleźć w Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, Rozdział 1, zatytułowany Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs autorstwa Murakami i in. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), szczególnie strona 13. Oba taksany (paklitaksel oraz docetaksel) są lekami przeciwnowotworowymi, pochodzącymi z drzewa cisowego. Docetaksel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), pochodzący z europejskiego cisu, jest półsyntetycznym analogiem paklitakselu (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel oraz docetaksel sprzyjają wytwarzaniu mikrotubul z dimerów tubuliny oraz stabilizują mikrotubule poprzez zapobieganie depolimeryzacji, co skutkuje zahamowaniem mitozy w komórkach. [0089] Termin metabolit wewnątrzkomórkowy odnosi się do związku, będącego produktem procesu metabolicznego lub reakcji wewnątrz komórki na poziomie koniugatu przeciwciało-lek (ADC). Proces metaboliczny lub reakcja mogą być procesami

28 enzymatycznymi, jak proteolityczny rozpad łącznika peptydowego ADC lub hydroliza grup funkcyjnych, jak hydrazon, ester lub amid. Metabolity wewnątrzkomórkowe obejmują, ale nie ograniczają się do: przeciwciał oraz wolnych leków, które przeszły rozszczepienie wewnątrzkomórkowe po wejściu, dyfuzji, pobraniu lub transporcie do komórki. [0090] Terminy poddany rozszczepieniu wewnątrzkomórkowemu oraz cięcie wewnątrzkomórkowe odnoszą się do procesów metabolicznych lub reakcji wewnątrz komórki na poziomie koniugatu przeciwciało-lek (ADC), przy czym wiązanie kowalencyjne, tj. łącznik pomiędzy ugrupowaniem leku (D) a przeciwciałem (Ab) ulega rozcięciu, co skutkuje dysocjacją wolnego leku z przeciwciała, wewnątrz komórki. Poddane cięciu wyodrębnione części cząsteczki ADC są więc metabolitami wewnątrzkomórkowymi. [0091] Termin biodostępność odnosi się do dostępności układowej (tj. na poziomie krwi/osocza) danej ilości leku podawanego pacjentowi. Biodostępność jest terminem absolutnym, który wskazuje zarówno pomiar czasu (tempo) jak i całkowitą ilość (zasięg) leku, który trafia do krążenia układowego z postaci podanej dawki. [0092] Określenie aktywność cytotoksyczna odnosi się do efektów uśmiercania komórek, cytostatycznych lub hamujących wzrost, związanych z koniugatami przeciwciało-lek lub metabolitami wewnątrzkomórkowymi koniugatów przeciwciało-lek. Aktywność cytotoksyczną można wyrażać jako wartość IC 50, która oznacza stężenie (molowe lub masowe) na jednostkę objętości, przy to stężeniu połowa komórek przeżyje. [0093] Alkil" oznacza C 1 -C 18 węglowodór, zawierający normalne, drugorzędowe, trzeciorzędowe lub cykliczne atomy węgla. Przykładami są: metyl (Me, -CH 3 ), etyl (Et, -CH 2 CH 3 ), 1-propyl (n-pr, n-propyl, -CH 2 CH 2 CH 3 ), 2-propyl (i-pr, i-propyl, -CH(CH 3 ) 2 ), 1-butyl (n-bu, n-butyl, -CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 2-metylo-1-propyl (i-bu, i-butyl, -CH 2 CH(CH 3 ) 2 ), 2-butyl (s-bu, s-butyl, -CH(CH 3 )CH 2 CH 3 ), 2-metylo-2-propyl (t-bu, t-butyl, -C(CH 3 ) 3 ), 1-pentyl (n-pentyl, -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 2-pentyl (-CH(CH 3 )CH 2 CH 2 CH 3 ), 3-pentyl (-CH(CH 2 CH 3 ) 2 ), 2-metylo-2-butyl (-C(CH 3 ) 2 CH 2 CH 3 ), 3-metylo-2-butyl (-CH(CH 3 )CH(CH 3 ) 2 ), 3-metylo-1-butyl (-CH 2 CH 2 CH(CH 3 ) 2 ), 2-metylo-1-butyl (-CH 2 CH(CH 3 )CH 2 CH 3 ), 1-heksyl (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 2-heksyl (-CH(CH 3 )CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 3-heksyl (-CH(CH 2 CH 3 )(CH 2 CH 2 CH 3 )), 2-metylo-2-pentyl (-C(CH 3 ) 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 3-metylo-2-pentyl (-CH(CH 3 )CH(CH 3 )CH 2 CH 3 ), 4-metylo-2-pentyl (-CH(CH 3 )CH 2 CH(CH 3 ) 2 ), 3-metylo-3-pentyl (-C(CH 3 )(CH 2 CH 3 ) 2 ), 2-metylo-3-pentyl (-CH(CH 2 CH 3 )CH(CH 3 ) 2 ), 2,3-dimetylo-2-butyl (-C(CH 3 ) 2 CH(CH 3 ) 2 ), 3,3-dimetylo-2-butyl (-CH(CH 3 )C(CH 3 ) 3. [0094] Termin C 1 -C 8 alkil, jak użyto w niniejszym opisie, odnosi się do prostego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego łańcucha węglowodorowego, mającego od 1 do 8 atomów węgla. Reprezentatywne grupy C 1 -C 8 alkilowe obejmują, bez ograniczania się do: -metyl, -etyl, -n-propyl, -n-butyl, -n-pentyl, -n-heksyl, -n-heptyl, -n-oktyl, -n-nonyl oraz -n-decyl; podczas gdy rozgałęzione alkile C 1 -C 8 obejmują, bez ograniczania się do: izopropyl, -sec-butyl, -izobutyl, -tert-butyl, -izopentyl, 2-metylobutyl, nienasycone alkile C 1 -C 8 obejmują, ale nie ograniczają się do: -winyl, -allil, -1-butenyl, -2-butenyl, -izobutylenyl, -1-pentenyl, -2-pentenyl, - 3-metylo-1-butenyl, -2-metylo-2-butenyl, -2,3-dimetylo-2-butenyl, 1-heksyl, 2-heksyl, 3-heksyl, -acetylenyl, -propynyl, -1-butynyl, -2-butynyl, -1-pentynyl,

29 pentynyl, -3-metylo-1-butynyl, metyl, etyl, propyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, izopentyl, neopentyl, n-heksyl, izoheksyl, 2-metylopentyl, 3-metylopentyl, 2,2-dimetylobutyl, 2,3-dimetylobutyl, 2,2-dimetylopentyl, 2,3-dimetylopentyl, 3,3-dimetylopentyl, 2,3,4-trimetylopentyl, 3-metyloheksyl, 2,2-dimetyloheksyl, 2,4-dimetyloheksyl, 2,5-dimetyloheksyl, 3,5-dimetyloheksyl, 2,4-dimetylopentyl, 2-metyloheptyl, 3-metyloheptyl, n-heptyl, izoheptyl, n-oktyl, oraz izooktyl. Grupy alkilowe C 1 -C 8 mogą być podstawione lub niepodstawione jedną lub większą liczbą grup, obejmujących, ale nie ograniczających się do: -C 1 -C 8 alkilu, -O-(C 1 -C 8 alkilu), -arylu, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH 2, -C(O)NHR, -C(O)N(R ) 2 -NHC(O)R, -SO 3 R, -S(O) 2 R, -S(O)R, -OH, -halogenu, -N 3, -NH 2, -NH(R ), -N(R ) 2 oraz -CN; gdzie każdy R jest niezależnie wybrany spośród H, -C 1 -C 8 alkilu oraz arylu. [0095] Alkenyl oznacza węglowodór C 2 -C 18, zawierający normalne, drugorzędowe, trzeciorzędowe lub cykliczne atomy węgla z co najmniej jednym miejscem nienasyconym, tj. wiązaniem podwójnym węgiel-węgiel, sp 2. Przykłady obejmują, bez ograniczania się do: etylen lub winyl (-CH=CH 2 ), allil (-CH 2 CH=CH 2 ), cyklopentyl (-C 5 H 7 ) oraz 5-heksenyl (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH=CH 2 ). [0096] Alkinyl oznacza C 2 H 18 węglowodór, zawierający normalne, drugorzędowe, trzeciorzędowe lub cykliczne atomy węgla z co najmniej jednym miejscem nienasyconym, wiązaniem potrójnym węgiel-węgiel, sp. Przykłady obejmują, bez ograniczania się do: acetylen (-C CH) oraz propargil (-CH 2 C CH) [0097] Alkilen odnosi się do nasyconego, o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym lub cyklicznego rodnika węglowodorowego zawierającego 1-18 atomów węgla, posiadającego dwa jednowartościowe centra rodnikowe, uzyskane poprzez oderwanie dwóch atomów wodoru od tego samego lub od dwóch różnych atomów węgla macierzystego alkanu. Typowe rodniki alkilenowe obejmują, bez ograniczania się do: metylen (-CH 2 -), 1,2-etyl (-CH 2 CH 2 -), 1,3-propyl (-CH 2 CH 2 CH 2 -), 1,4-butyl (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -) i tym podobne. [0098] Alkilen C 1 -C 10 jest nasyconą grupą węglowodorową, o prostym łańcuchu i wzorze (CH 2 ) 1*10 -. Przykłady alkilenu C 1 -C 10 obejmują metylen, etylen, propylen, butylen, pentylen, heksylem, heptylen, oktylen, nonylen oraz dekalen. [0099] Alkenylen odnosi się do nienasyconego rodnika węglowodorowego, o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu lub cyklicznego, zawierającego 2-18 atomów węgla oraz posiadającego dwa jednowartościowe centra rodnikowe uzyskane poprzez oderwanie dwóch atomów wodoru od tego samego lub od dwóch różnych atomów węgla macierzystego alkenu. Typowe rodniki alkenylowe obejmują, bez ograniczania się do: 1,2-etylen (-CH=CH-). [0100] Alkinylen odnosi się do nienasyconego rodnika węglowodorowego, o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu lub cyklicznego, zawierającego 2-18 atomów węgla oraz posiadającego dwa jednowartościowe centra rodnikowe, uzyskane poprzez oderwanie dwóch atomów wodoru od tego samego lub od dwóch różnych atomów węgla macierzystego alkinu. Typowe rodniki alkinylenowe zawierają, bez ograniczania się do: acetylen (-C C-), propargil (-CH 2 C C-) oraz 4-pentenyl (-CH 2 CH 2 CH 2 C C-). [0101] Aryl odnosi się do karbocyklicznej grupy aromatycznej. Przykłady grup arylowych obejmują, bez ograniczania się do: fenyl, naftyl oraz antracenyl. Karbocykliczna grupa

30 aromatyczna lub heterocykliczna grupa aromatyczna może być niepodstawiona lub podstawiona jedną lub większą liczbą grup, włączając, bez ograniczania się do: C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 alkil), -aryl, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH 2, -C(O)NHR, -C(O)N(R ) 2 -NHC(O)R, -S(O) 2 R, -S(O)R, -OH, -halogen, -N 3, -NH 2, -NH(R ), -N(R ) 2 oraz -CN; gdzie każdy R jest niezależnie wybrany spośród H, -C 1 -C 8 alkilu i arylu. [0102] Arylen oznacza grupę arylową, posiadającą dwa wiązania kowalencyjne i mogącą występować w konfiguracjach orto, meta lub para, jak pokazano w następujących strukturach: w których grupa fenylowa może być niepodstawiona lub podstawiona aż do czterech grup, obejmujących, bez ograniczania się do: -C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 -alkil), -aryl, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH 2, -C(O)NHR, -C(O)N(R ) 2 -NHC(O)R, -S(O) 2 R, -S(O)R, -OH, -halogen, -N 3, -NH 2, -NH(R ), -N(R ) 2 oraz -CN; gdzie każdy R jest niezależnie wybrany spośród H, -C 1 -C 8 alkilu oraz arylu. [0103] Aryloalkil odnosi się do acyklicznego rodnika alkilowego, w którym jeden z atomów wodoru związany z atomem węgla, zwykle z końcowym lub atomem węgla sp 3, jest zastąpiony rodnikiem arylowym. Typowa grupa aryloalkilowa obejmuje, bez ograniczania się do: benzyl, 2-fenyloetan-1-yl, 2-fenyloeten-1-yl, naftylometyl, 2-naftyloetan-1-yl, 2-naftyloeten-1-yl, nafobenzyl, 2-naftofenyloetan-1-yl i tym podobne. Grupa aryloalkilowa zawiera 6 do 20 atomów węgla, np. wyodrębnioną alkilową część cząsteczki, włączając grupy alkanylowe, alkenylowe lub alkinylowe, co stanowi 1 do 6 atomów węgla grupy aryloalkilowej, a wyodrębniona arylowa część cząsteczki stanowi 5 do 14 atomów węgla. [0104] Heteroaryloalkil odnosi się do acyklicznego rodnika alkilowego, w którym jeden z atomów wodoru związany z atomem węgla, zwykle z końcowym lub atomem węgla sp 3, jest zastąpiony rodnikiem heteroarylowym. Typowa grupa heteroaryloalkilowa obejmuje, bez ograniczania się do: 2-benzoimidazolilometyl, 2-furyloetyl i tym podobne. Grupa heteroaryloalkilowa zawiera 6 do 20 atomów węgla, np. wyodrębniona alkilowa część cząsteczki, włączając grupy alkanylowe, alkenylowe lub alkinylowe, stanowi 1 do 6 atomów węgla grupy heteroaryloalkilowej, a wyodrębniona heteroarylową część cząsteczki stanowi 5 do 14 atomów węgla oraz 1 do 3 heteroatomów wybranych spośród N, O, P oraz S. Wyodrębniona heteroarylowa część grupy heteroaryloalkilowej może być monokliczna mająca 3 do 7 członów (2 do 6 atomów węgla) lub bicykliczna, mająca od 7 do 10 członów (4 do 9 atomów węgla oraz 1 do 3 heteroatomów wybranych spośród N, O, P oraz S), na przykład: układ bicyklo [4,5], [5,5], [5,6] lub [6,6]. [0105] Podstawiony alkil, podstawiony aryl oraz podstawiony aryloalkil oznacza odpowiednio alkil, aryl oraz aryloalkil, w którym jeden lub więcej atomów wodoru zastąpiono niezależnie podstawnikiem. Typowe podstawniki obejmują, bez ograniczania się do: -X, -R, -O -, -OR, -SR, -S -, -NR 2, -NR 3, =NR, -CX 3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NHS, -NO, -NO 2, =N 2, -N 3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR 2, -SO 3 -, -SO 3 H, -S(=O) 2 R,

31 OS(=O) 2 OR, -S(=O) 2 NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR) 2, -P(=O)(OR) 2, -PO 3, -PO 3 H 2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO 2 R, -CO 2 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR 2, -C(=S)NR 2, -C(=NR)NR 2, gdzie każdy X oznacza niezależnie halogen: F, Cl, Br lub I; a każdy R jest niezależnie -H, C 2 -C 18 alkilem, C 6 -C 20 arylem, C 3 -C 14 heterocyklem, grupą ochronną lub wyodrębnioną częścią cząsteczki proleku. Grupy alkilenowe, alkenylowe oraz alkinylowe, jak opisano powyżej, mogą być również podstawione w podobny sposób. [0106] Heteroaryl oraz heterocykl odnoszą się do układu pierścieniowego, w którym jeden lub więcej atomów pierścienia oznacza heteroatomy, np. azot, tlen oraz siarkę. Rodnik heterocykliczny zawiera 1 do 20 atomów węgla oraz 1 do 3 heteroatomów wybranych spośród N, O, P oraz S. Heterocykl może być monocykliczny, posiadający od 3 do 7 członów pierścienia (2 do 6 atomów węgla oraz od 1 do 3 heteroatomów wybranych spośród N, O, P oraz S), lub bicykliczny, posiadający od 7 do 10 członów pierścienia (4 do 9 atomów węgla oraz 1 do 3 heteroatomów wybranych spośród N, O, P oraz S), na przykład układ bicyklo [4,5], [5,5], [5,6] lub [6,6]. [0107] Heterocykle są opisane w Paquette, Leo A.; Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin, Nowy Jork, 1968), szczególnie rozdziały 1, 3, 4, 6, 7 oraz 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs (John Wiley & Sons, New York, 1950 do współczesności), w szczególności tomy 13, 14, 16, 19 i 28; oraz J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: [0108] Przykłady heterocykli obejmują, bez ograniczania się do: pirydyl, dihydropirydyl, tetrahydropirydyl (piperydyl), tiazolil, tetrahydrotiofenyl, tetrahydrotiofenyl z utlenioną siarką, pirymidynyl, furanyl, tienyl, pirolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranyl, tianaftalenyl, indolil, indolenyl, chinolinyl, izochinolinyl, benzoimidazolil, piperydynyl, 4-piperydonyl, pirolidynyl, 2-pirolidonyl, pirolinyl, tetrahydrofuranyl, bis-tetrahydrofuranyl, tetrahydropiranyl, bis-tetrahydropiranyl, tetrahydrochinolinyl, tetrahydroizochinolinyl, dekahydrochinolinyl, oktahydroizochiinolinyl, azocynyl, triazynyl, 6H-1,2,5-tiadiazynyl, 2H,6H-1,5,2-ditiazynyl, tienyl, tiantrenyl, piranyl, izobenzofuranyl, chromenyl, ksantenyl, fenoksantynyl, 2H-pirolil, izotiazolil, izoksazolil, pirazynyl, pirydazynyl, indolizynyl, izoindolil, 3H-indolil, 1H-indazolil, purynyl, 4H-chinolizynyl, ftalazynyl, naftyrydynyl, chinoksalinyl, chinazolinyl, cynolinyl, pterydynyl, 4aH-karbazolil, karbazolil, β-karbolinyl, fenantrydynyl, akrydynyl, pirymidynyl, fenantrolinyl, finazynyl, fenotiazynyl, furazanyl, fenoksazynyl, izochromanyl, chromanyl, imidazolidynyl, imidazolinyl, pirazolidynyl, pirazolinyl, piperazynyl, indolinyl, izoindolinyl, chinuklidynyl, morfolinyl, oksazolidynyl, benzotriazolil, benzoizoksazolil, oksyindolil, benzoksazolinyl oraz izatynoil. [0109] Tytułem przykładu, bez ograniczania się do, pierścienie heterocykliczne połączone za pomocą atomów węgla, są połączone w pozycji 2, 3, 4, 5 lub 6 pirydyny, w pozycji 3, 4, 5 lub 6 pirydazyny, w pozycji 2, 4, 5 lub 6 pirymidyny, pozycji 2, 3, 5, lub 6 pirazyny, pozycji 2, 3, 4 lub 5 furanu, tetrahydrofuranu, tiofuranu, tiofenu, pirolu or tetrahydropirolu, w pozycji 2, 4 lub 5 oksazolu, imidazolu lub tiazolu, w pozycji 3, 4 lub 5 izoksazolu, pirazolu, lub izotiazolu, w pozycji 2 lub 3 azyrydyny, w pozycji 2, 3 lub 4 azetydyny, w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8 chinoliny lub w pozycji 1, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8 izochinoliny. Jeszcze bardziej typowo, do pierścieni heterocyklicznych połączonych za pomocą atomów węgla, zalicza się 2-pirydyl,

32 pirydyl, 4-pirydyl, 5-pirydyl, 6-pirydyl, 3-pirydazynyl, 4-pirydazynyl, 5-pirydazynyl, 6-pirydazynyl, 2-pirymidynyl, 4-pirymidynyl, 5-pirymidynyl, 6-pirymidynyl, 2-pirazynyl, 3-pirazynyl, 5-pirazynyl, 6-pirazynyl, 2-tiazolil, 4-tiazolil, lub 5-tiazolil. [0110] Tytułem przykładu, bez ograniczania się do, pierścienie heterocykliczne połączone za pomocą atomów azotu, są połączone w pozycji 1 azyrydyny, azetydyny, pirolu, pirolidyny, 2- piroliny, 3-piroliny, imidazolu, imidazolidyny, 2-imidazoliny, 3-imidazoliny, pirazolu, pirazoliny, 2-pirazoliny, 3-pirazoliny, piperydyny, piperazyny, indolu, indoliny, 1H-indazolu, w pozycji 2 izoindolu lub izoindoliny, w pozycji 4 morfoliny oraz w pozycji 9 karbazolu lub β-karboliny. Jeszcze bardziej typowo, do pierścieni heterocyklicznych połączonych za pomocą atomów azotu zalicza się 1-azyrydyl, 1-azetedyl, 1-pirolil, 1-imidazolil, 1-pirazolil oraz 1-piperydynyl. [0111] C 3 -C 8 heterocykl odnosi się do C 3 -C 8 karbocykli aromatycznych lub niearomatycznych, w których jeden do czterech atomów węgla pierścienia zostało niezależnie zastapionych heteroatomami z grupy, wktórej skład wchodzi O, S oraz N. Typowe przykłady C 3 -C 8 heterocykli obejmują, bez ograniczania się do: benzofuranyl, benzotiofen, indolil, benzopirazolil, kumarynyl, izochinolinyl, pirolil, tiofenyl, furanyl, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, chinolinyl, pirymidynyl, pirydynyl, pirydonyl, pirazynyl, pirydazynyl, izotiazolil, izoksazolil oraz tetrazolil. C 3 -C 8 heterocykl może być niepodstawiony lub podstawiony maksymalnie siedmioma grupami, obejmującymi, bez ograniczania się do: -C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 alkil), -aryl, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH 2, -C(O)NHR, - C(O)N(R ) 2 -NHC(O)R, -S(O) 2 R, -S(O)R, -OH, -halogen, -N 3, -NH 2, -NH(R ), -N(R ) 2 oraz -CN; gdzie każdy R jest niezależnie wybrany spośród H, C 1 -C 8 alkilu i arylu. [0112] C 3 -C 8 heterocyklo odnosi się do grup heterocyklicznych C 3 -C 8, zdefiniowanych powyżej, w których jeden z atomów wodoru grupy heterocyklicznej jest zastąpiony wiązaniem. C 3 -C 8 heterocyklo może być niepodstawione lub podstawione maksymalnie sześcioma grupami, obejmującymi, bez ograniczania się do: C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 alkil), -aryl, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH 2, -C(O)NHR, -C(O)N(R ) 2 -NHC(O)R, -S(O) 2 R, -S(O)R, -OH, -halogen, -N 3, -NH 2, -NH(R ), -N(R ) 2 oraz -CN; gdzie każdy R jest niezależnie wybrany spośród H, -C 1 -C 8 alkilu i arylu. [0113] Karbocykl oznacza nasycony lub nienasycony pierścień mający od 3 do 7 atomów węgla w przypadku związku monocyklicznego lub od 7 do 12 atomów węgla w przypadku związku bicyklicznego. Monocykliczne karbocykle mają od 3 do 6 atomów węgla w pierścieniu, zwykle od 5 do 6 atomów węgla w pierścieniu. Bicykliczne karbocykle mają od 7 do 12 atomów węgla w pierścieniu, np. ułożonych w układzie bicyklicznym: [4,5], [5,5], [5,6] lub [6,6] lub 9 czy 10 atomów węgla w pierścieniu ułożonych w układzie bicyklicznym [5,6] lub [6,6]. Przykłady monocyklicznych karbocykli obejmują cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, 1-cyklopent-1-enyl, 1-cyklopent-2-enyl, 1-cyklopent-3-enyl, cykloheksyl, 1-cykloheks-1-enyl, 1-cykloheks-2-enyl, 1-cykloheks-3-enyl, cykloheptyl oraz cyklooktyl. [0114] C 3 -C 8 karbocykl oznacza 3-, 4-, 5-, 6-, 7- lub 8-członowy nasycony lub nienasycony niearomatyczny pierścień karbocykliczny. Typowe C 3 -C 8 karbocykle obejmują, bez ograniczania się do: cyklopropyl, -cyklobutyl, -cyklopentyl, -cyklopentadienyl, -cykloheksyl, -cykloheksenyl, -1,3-cykloheksadienyl, -1,4-cykloheksadienyl, -cykloheptyl,

33 ,3-cykloheptadienyl, -1,3,5-cycloheptatrienyl, -cyklooktyl oraz -cyklooktadienyl. Grupa karbocykliczna C 3 -C 8 może być niepodstawiona lub podstawiona jedną lub większą liczbą grup włączając, bez ograniczania się do: -C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 alkil), -aryl, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH 2, -C(O)NHR, -C(O)N(R ) 2 -NHC(O)R, -S(O) 2 R, -S(O)R, -OH, -halogen, -N 3, -NH 2, -NH(R ), -N(R ) 2 oraz -CN; gdzie każdy R jest niezależnie wybrany spośród H, -C 1 -C 8 alkilu oraz arylu. [0115] C 3 -C 8 karbocyklo odnosi się do grupy C 3 -C 8 karbocyklicznej, zdefiniowanej powyżej, w której jeden z atomów wodoru grupy karbocyklicznej jest zastąpiony wiązaniem. [0116] Łącznik odnosi się do wyodrębnionej części cząsteczki chemicznej, zawierającej wiązanie kowalencyjne lub łańcuch atomów, które kowalencyjnie przyłączają przeciwciało do wyodrębnionej części cząsteczki leku. W różnych przykładach wykonania, łącznik obejmuje dwuwartościowe rodniki jak: alkilodiyl, arylodiyl, heteroarylodiyl, wyodrębnione części cząsteczki, takie jak: -(CR 2 ) n O(CR 2 ) n -, powtarzające się jednostki alkiloksy (np. polietylenoksy, PEG, polimetylenoksy) oraz alkiloamino (np. polietylenoamino, Jeffamine ) oraz estry dwukwasów i amidy, włączając bursztynian, sukcynoamid, dwuglikolan, malonian oraz kaproamid. [0117] Termin chiralny odnosi się do cząsteczek, które posiadają własność nienakładania się na swoje odbicie lustrzane, podczas gdy termin achiralny odnosi się do cząsteczek, których odbicia lustrzane nakładają się. [0118] Termin stereoizomery odnosi się do związków, które mają identyczny skład chemiczny, ale różnią się przestrzennym ułożeniem atomów lub grup. [0119] Diastereoizomer odnosi się do stereoizomeru z dwoma lub większą liczbą centrów chiralności i którego cząsteczki nie są wzajemnymi odbiciami lustrzanymi. Diastereoizomery mają różne właściwości fizyczne, np. punkty topnienia, punkty wrzenia, właściwości widmowe oraz reaktywności. Mieszaniny diastereoizomerów można rozdzielić za pomocą procedur analitycznych wysokiej rozdzielczości, jak elektroforeza oraz chromatografia. [0120] Termin enancjomery odnosi się do dwóch stereoizomerów związku, które nie są wzajemnymi lustrzanymi odbiciami. [0121] Definicje stereochemiczne oraz użyte w niniejszym opisie konwencje są na ogół oparte na S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nowy Jork oraz Eliel, E. i Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork. Wiele związków organicznych istnieje w postaciach aktywnych optycznie, tj. mają one zdolność rotacji płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo. Przy opisie związków optycznie czynnych, przedrostki D oraz L lub R oraz S, są używane do opisania absolutnej konfiguracji cząsteczki w odniesieniu do jej centrum(-ów) chiralności. Przedrostki d oraz 1 lub (+) i (-) są wykorzystywane do określenia kierunku rotacji płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo przez związek, gdzie (-) lub 1 oznacza, ze związek jest lewoskrętny. Związek z przedrostkiem (+) lub d jest prawoskrętny. Dla danej struktury chemicznej, te stereoizomery są identyczne, za wyjątkiem tego, że są swymi odbiciami lustrzanymi. Specyficzny stereoizomer może być także określany jako enancjomer, a mieszanina takich izomerów jest często nazywana mieszaniną enancjomeryczną. Mieszanina enancjomerów w proporcji 50: 50 jest określana jako

34 mieszanina racemiczna lub racemat, do której powstania może dochodzić wtedy, gdy nie było stereoselekcji lub stereospecyficzności w reakcji czy procesie chemicznym. Terminy mieszanina racemiczna oraz racemat odnoszą się do równomolowej mieszaniny dwóch rodzajów enancjomerów, pozbawionej aktywności optycznej. [0122] Grupa opuszczająca odnosi się do grupy funkcyjnej, która może być podstawiona przez inna grupę funkcyjną. Niektóre grupy opuszczające są dobrze znane w dziedzinie, a przykłady obejmuja, bez ograniczania się do: halogenki (np. chlorki, bromki, jodki), metanosulfonyl (mesyl), p-toluenosulfonyl (tosyl), trifluorometylosulfonyl (triflat) oraz trifluorometylosulfonian. B. Skróty SKŁADNIKI ŁĄCZNIKA [0123] MC = 6-maleimidokaproil Val-Cit lub VC = walino-cytrulina (przykładowy dipeptyd łącznika rozszczepiany proteazą) Cytrulina = kwas 2-amino-5-ureidopentanowy PAB = p-aminobenzyloksykarbonyl (przykład autodestrukcyjnego składnika łącznika) Me-Val-Cit = N-metylo-walino-cytrulina (gdzie wiązanie peptydowe łącznika zostało zmodyfikowane w celu przeciwdziałania trawieniu przez katepsynę B) MC(PEG)6-OH = glikol maleimidokaproilo-polietylenowy (może być dołączony do cystein przeciwciała) LEKI CYTOTOKSYCZNE: [0124] MMAE = monometyloaurystatyna E (MW [masa cząsteczkowa] 718) MMAF = wariant aurystatyny E (MMAE) z fenyloalaniną na końcu C leku (MW 731,5) MMAF-DMAEA = MMAF z DMAEA (dimetylaminoetyloamina) dołączoną wiązaniem amidowym do fenyloalaniny na końcu C (MW 801,5) MMAF-TEG = MMAF z glikolem tetraetylenowym estryfikowanym do fenyloalaniny MMAF-NtBu = N-t-butyl, przyłączony jako amid do końca C MMAF [0125] Dalsze skróty są jak następuje: AE oznacza aurystatynę E, Boc oznacza N-(t-butoksykarbonyl), cit oznacza cytrulinę, dap oznacza dolaproinę, DCC oznacza 1,3-dicykloheksylokarbodiimid, DCM oznacza dichlorometan, DEAR oznacza dietylaminę, DEAD oznacza dietyloazodikarboksylan, DEPC oznacza dietylofosforylocyjanidat, DIAD oznacza diizopropyloazodikarboksylan, DIEA oznacza N,N-diizopropyloetyloaminę, dil oznacza dolaizoleucynę, DMA oznacza dimetyloacetamid, DMAP oznacza 4-dimetyloaminopirydynę, DME oznacza eter dimetylowy glikolu etylenowego (lub 1,2-dimetoksyetan), DMF oznacza N,N-dimetyloformamid, DMSO oznacza dimetylosulfotlenek, doe oznacza dolafeninę, dov oznacza N,N-dimetylowalinę, DTNB oznacza kwas 5,5 -ditiobis-(2-nitrobenzoesowy), DTPA oznacza kwas dietylenotriaminopentaoctowy, DTT oznacza ditiotreitol, EDCI oznacza chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu, EEDQ oznacza 2-etoksy-1- etoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolinę, ES-MS oznacza spektrometrię mas z

35 elektrorozpraszaniem, EtOAc oznacza octan etylu, Fmoc oznacza N-(9-fluorenylometoksykarbonyl), gly oznacza glicynę, HATU oznacza heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N,N -tetrametyluroniowy, HOBt oznacza 1-hydroksybenzotriazol, HPLC oznacza wysokociśnieniową chromatografię cieczową, ile oznacza izoleucynę, lys oznacza lizynę, MeCN (CH 3 CN) oznacza acetonitryl, MeOH oznacza metanol, Mtr oznacza 4-anizylodifenylometyl (lub 4-metoksytrytyl), nor oznacza (1S,2R)-(+)- norefedrynę, PBS oznacza roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (ph 7,4), PEG oznacza glikol polietylenowy, Ph oznacza fenyl, Pnp oznacza p-nitrofenyl, MC oznacza 6-maleimidokaproil, phe oznacza L-fenyloalaninę, PyBrop oznacza heksafluorofosforan bromo-tris-pirolidynofosfoniowy, SEC oznacza chromatografię wykluczania, Su oznacza sukcynoimid, TFA oznacza kwas trifluorooctowy, TLC oznacza chromatografię cienkowarstwową, UV oznacza ultrafiolet, a val oznacza walinę. III KOMPOZYCJE ORAZ SPOSOBY ICH WYTWARZANIA [0126] Dostarczone są przeciwciała, które wiążą się do TAT226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. Dostarczone są immunikoniugaty zawierające przeciwciała anty-tat226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. Przeciwciała oraz immunokoniugaty według wynalazku są przydatne np. w diagnostyce lub leczeniu zaburzeń, związanych ze zmienioną ekspresją, np. zwiększoną ekspresją TAT226. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała oraz immunokoniugaty według wynalazku są przydatne w diagnostyce lub leczeniu zaburzeń proliferacji komórek, takich jak rak. A. Przeciwciała anty-tat226 [0127] TAT226 ( Antygen docelowy związany z nowotworem, o numerze 226 ) jest białkiem, które podlega obróbce i ekspresji na powierzchni niektórych rodzajów komórek, włączając komórki nowotworu. W szczególności, wcześniejsze doniesienia mówią o nadekspresji ludzkiego TAT226 w niektórych rodzajach guzów, włączając guzy jajnika, macicy, śluzówki macicy, nerki, płuca, trzustki, nadnerczy oraz guzy wątrobowokomórkowe. Patrz np. amerykańskie zgłoszenia patentowe o numerach US 2003/ A1, US 2004/ A1 oraz US 2003/ A1 (gdzie TAT226 nazywane jest PRO9917 ); oraz patent amerykański nr 6,710,170 B2 (SEQ ID NO: 215). Pozostałe wystąpienia w bazach danych oraz ujawnienia związane z TAT226 są jak następuje: NCBI numer akcesyjny AY358628_1 (gdzie ludzkie TAT226 nazywane jest PSCA Hlog ); NCBI numer akcesyjny AAQ oraz gi nr (gdzie ludzkie TAT226 nazywane jest PSCA Hlog ); RIKEN cdna C12; US 2003/ A1 (SEQ ID NO: 16); US 2003/ A1 (SEQ ID NO: 215); US 2003/ A1 (Przykład 5; SEQ ID NO: 215); US 2003/ A1 (SEQ ID NO: 215); US 2004/ A1 (SEQ ID NO: 16); US 2004/ A1 (SEQ ID NO: 16); US 2005/ A1 (gdzie ludzkie TAT226 nazywane jest PSCA Hlog ); WO 2003/ (SEQ ID NO: 292); WO 2003/ (SEQ ID NO: 14); oraz EP (SEQ ID NO: 2640). [0128] Pełnej długości TAT226 przechodzi obróbkę w komórce w celu wytworzenia dojrzałej postaci białka, które ulega ekspresji na powierzchni komórki. Na przykład, pełnej długości ludzkie TAT226, jak pokazano w SEQ ID NO: 75, zawiera przewidywaną peptydową

36 sekwencję sygnalną z aminokwasów 1-20 lub 1-22, która jest przewidziana do odcięcia z białka. Aminokwasy z końca C są przewidziane do usunięcia z białka, a z białkiem zwiąże się wyodrębniona część cząsteczki GPI, przy aminokwasie 115. Dojrzała postać ludzkiego TAT226, z aminokwasów lub według SEQ ID NO: 75, jest przewidziana do przyłączenia się do powierzchni komórki poprzez wyodrębnioną część cząsteczki GPI. TAT226 małp oraz gryzoni (patrz np. SEQ ID NO: 76-78) są bardzo podobne do ludzkiego TAT226 i tym samym uważa się, ze podlegają cięciu i modyfikacji w równorzędnych pozycjach aminokwasowych. Patrz Fig. 1. Uzyskane dojrzałe postaci ludzkiego TAT226 oraz TAT226 małp i gryzoni są w 100% identyczne od aminokwasów lub (jak pokazano na Fig. 1). [0129] Inne cechy ludzkiego TAT226 obejmują przewidywane miejsce N-glikozylacji przy aminokwasie 45, którego obecność potwierdzono doświadczalnie, oraz przewidywaną domenę Ly6/u-PAR z aminokwasów według SEQ ID NO: 75. Ludzki TAT226 ma około 32% homologii aminokwasowej z antygenem komórek macierzystych stercza (PSCA), specyficznym dla raka stercza antygenem nowotworowym, którego ekspresja zachodzi na powierzchni komórki poprzez łącznik GPI. Patrz Reiter i in. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: Nadekspresję PSCA obserwuje się w ponad 80% raków stercza. Id. Podobnie jak TAT226, zawiera on przewidywaną domenę Ly6/u-PAR, której udział domniemywa się w powiązaniu z takimi funkcjami komórkowymi jak transdukcja sygnału oraz adhezja komórkowa. Id. [0130] W jednym z aspektów, wynalazek dostarcza przeciwciała, które wiążą się do TAT226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. W niektórych przykładach zastosowań, dostarcza się przeciwciała, które wiążą się z dojrzałą postacią TAT226. W jednym z takich przykładów wykonania dojrzała postać TAT226 posiada sekwencję aminokwasową z aminokwasów lub według SEQ ID NO: 75. W niektórych przykładach zastosowań, przeciwciało przeciwko TAT226 wiąże się z dojrzałą postacią TAT226, która ulega ekspresji na powierzchni komórki. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało, przeciwko TAT226, które wiąże się do dojrzałej postaci TAT226 ulegającej ekspresji na powierzchni komórki, hamuje wzrost komórki. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty- TAT226 wiąże się z dojrzałą postacią TAT226, ulegającą ekspresji na powierzchni komórki, i inhibuje proliferację komórek. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty- TAT226 wiąże się z dojrzałą postacią TAT226, podlegającą ekspresji na powierzchni komórki, i indukuje śmierć komórkową. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 wiąże się z dojrzałą postacią TAT226, ulegającą ekspresji na powierzchni komórek nowotworowych. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 wiąże się z dojrzałą postacią TAT226, które jest nadeksprymowane na powierzchni komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami prawidłowymi, pochodzącymi z tej samej tkanki. [0131] Przeciwciało anty-tat226 wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym. W jednym aspekcie, przeciwciało anty-tat226 stanowi fragment przeciwciała, np. fragment Fab, Fab'- SH, Fv, scfv lub (Fab') 2. W jednym aspekcie, przeciwciało anty-tat226 jest przeciwciałem

37 chimerycznym, humanizowanym lub ludzkim. W jednym aspekcie, dowolne spośród opisanych w niniejszym opisie przeciwciał anty-tat226 jest oczyszczane. [0132] Dostarcza się przykładowe przeciwciała monoklonalne, pochodzące z biblioteki fagowej, jak opisano w niniejszym opisie w przykładzie B. Antygen zastosowany do przeszukiwania biblioteki, był polipeptydem, posiadającym sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 75, odpowiadającą postaci TAT226 pozbawionej aminokwasów C-końcowych z przypuszczalnego miejsca przyłączenia GPI. Przeciwciała uzyskane w wyniku przeszukania biblioteki oznaczono YWO.32 oraz YWO.49. YWO.49 posiadały dojrzałe powinowactwo do wygenerowania YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6. Nałożenia sekwencji domen zmiennych łańcucha ciężkiego oraz lekkiego dla YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 pokazano odpowiednio na Fig. 11 oraz 12. [0133] Dostarcza się przeciwciała monoklonalne rywalizujące z YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 albo YWO.49.H6 o wiązanie do TAT226. Dostarcza się także przeciwciała monoklonalne, które wiążą się do tych samych epitopów, co YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 czy YWO.49.H6. [0134] W niniejszym opisie ujawnia się polinukleotydy kodujące przeciwciała anty-tat226. W niniejszym opisie ujawnia się także wektory zawierające polinukleotydy kodujące przeciwciała anty-tat226. Ujawnia się komórki gospodarza, zawierające takie wektory. Ujawnia się kompozycje zawierające przeciwciała anty-tat226 lub polinukleotydy kodujące przeciwciała anty-tat226. W niektórych przykładach wykonania, kompozycja według wynalazku oznacza formulację farmaceutyczną, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, do leczenia zaburzeń proliferacyjnych komórek, takich, takich jak te wyliczone w niniejszym opisie. [0135] Szczegółowy opis przykładowych przeciwciał anty-tat226, jest jak następuje: 1. Szczegółowe przykłady wykonania przeciwciał anty-tat226 [0136] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciało, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0137] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciało monoklonalne anty-tat226 obejmujące (a) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 9; (d) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (f) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 17. [0138] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciało monoklonalne anty-tat2-26 obejmujące (a) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 10; (d) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 zawierające sekwencję

38 aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (f) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 18. [0139] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 oznacza przeciwciało o dojrzałym powinowactwie, pozwalającym na uzyskanie pożądanego powinowactwa wiązania obiektu docelowego. W niektórych przykładach wykonania, jeden dowolny lub więcej aminokwasów przeciwciała ulega substytucji w następujących pozycjach HVR (numeracja Kabata): H98, H99, H100, H100B, L90, L92, L93, L96 oraz L97. Na przykład, w niektórych przykładach wykonania, dowolna, jedna lub więcej następujących substytucji może być przeprowadzona w którejkolwiek kombinacji: - w HVR-H3 (SEQ ID NO: 6): V981; S99T; R100L lub 1; G100bA, S lub P - w HVR-L3 (SEQ ID NO: 14): Q90R, K, H lub N; Y92V; T93F, N, G lub A; P96F; T971 lub A Wszystkie możliwe kombinacje powyższych substytucji są objęte przez sekwencje konsensusowe SEQ ID NO: 11 (HVR-H3) oraz SEQ ID NO: 19 (HVR-L3). [0140] Przeciwciało anty-tat226 może zawierać jakąkolwiek odpowiednią sekwencję zrębową domeny zmiennej, pod warunkiem, że przeciwciało zachowa zdolność do wiązania TAT226. Na przykład, w niektórych przykładach wykonania, przeciwciała anty-tat226 według wynalazku zawierają ludzką konsensusową sekwencję zrębową łańcucha ciężkiego podgrupy III. W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, konsensusowa sekwencja zrębowa łańcucha ciężkiego zawiera substytucję(-e) w pozycji 71, 73 i/lub 78. W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, pozycja 71 oznacza A, pozycja 73 oznacza T i/lub pozycja 78 oznacza A. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciała te zawierają sekwencję zrębową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego humab4d5-8, np. SEQ ID NO: 50, 51, 59, 35 (odpowiednio FR1, 2, 3, 4). HuMAb4D5-8 jest znane pod nazwą komercyjną jako HERCEPTIN, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA; jest także wzmiankowane w patentach amerykańskich o numerach 6,407,213 & 5,821,337 oraz w Lee i in., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): W jednym takim przykładzie wykonania, przeciwciała te zawierają dodatkowo konsensusową sekwencję zrębową ludzkiego łańcucha lekkiego κi. W jednym takim przykładzie wykonania, przeciwciała te zawierają sekwencję zrębową domeny zmiennej łańcucha lekkiego humab4d5-8. [0141] W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję zrębową oraz regiony hiperzmienne, przy czym sekwencja zrębowa zawiera sekwencje FR1-FR4, wybrane spośród tych pokazanych na Fig. 5A oraz 5B; HVR-H1 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; HVR-H2 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; a HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną z sekwencji SEQ ID NO: W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 9 lub 10. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję zrębową oraz regiony hiperzmienne, przy czym sekwencja zrębowa zawiera sekwencje FR1-FR4, wybrane spośród tych pokazanych na Fig. 6A oraz 6B; HVR-L1 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; HVR-L2 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13; a

39 HVR-L3 zawiera sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną z sekwencji SEQ ID NO: W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, HVR-L3 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 17 lub 18. [0142] W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą sekwencję zrębową oraz regiony hiperzmienne, przy czym sekwencja zrębowa zawiera sekwencje FR1-FR4 według SEQ ID NO: 50, 51, 59 oraz 35, jak pokazano na Fig. 7; HVR-H1 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO 4: HVR-H2 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5, a HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NO: W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 9 lub 10. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało antytat226 zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję zrębową oraz regiony hiperzmienne, przy czym sekwencja zrębowa zawiera sekwencje FR1-FR4 sekwencji według SEQ ID NO: 60, 61, 62 oraz 63, jak pokazano na Fig. 6A oraz 6B; HVR-L1 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; HVR-L2 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13, a HVR-L3 zawiera sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną z SEQ ID NO: W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 17 lub 18. [0143] W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą sekwencję zrębową oraz regiony hiperzmienne, przy czym sekwencja zrębowa zawiera sekwencje FR1-FR4 według SEQ ID NO: 50, 51, 53 oraz 35, jak pokazano na Fig. 8; HVR-H1 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO 4: HVR-H2 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5, a HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną z SEQ ID NO: W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 9 lub 10. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję zrębową oraz regiony hiperzmienne, przy czym sekwencja zrębowa zawiera sekwencje FR1-FR4 według SEQ ID NO: 60, 61, 62 oraz 74, jak pokazano na Fig. 8; HVR-L1 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; HVR-L2 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13, a HVR-L3 zawiera sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną z SEQ ID NO: W jednym przykładzie wykonania tych przeciwciał, HVR-H3 zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 17 lub 18. [0144] W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciało anty-tat226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, zawierające domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową posiadającą co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasów, wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: W niektórych przykładach wykonania, sekwencja aminokwasowa, posiadająca co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji, zawiera substytucje, insercje lub delecje w stosunku do sekwencji referencyjnej, ale przeciwciało zawierające tę sekwencję aminokwasową zachowuje zdolność do wiązania TAT226. W niektórych przykładach wykonania, suma od 1 do 10 aminokwasów została

40 poddana substytucji, insercji lub delecji w ramach sekwencji wyselekcjonowanej spośród SEQ ID NO: W niektórych przykładach wykonania, substytucje, insercje czy delecje występują w regionach na zewnątrz HVR (tj. w FR). W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: [0145] W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciało anty-tat225, zawierające domenę zmienną łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała 4D5 (humab4d5-8) (HERCEPTIN, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA; także wzmiankowane w patentach amerykańskich o numerach 6,407,213 & 5,821,337 oraz w Lee i in., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): ), jak przedstawiono w SEQ ID NO: 31 poniżej. 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Tbr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108 (SEQ ID NO:31) (reszty HVR podkreślono). [0146] W niektórych przykładach wykonania, sekwencja domeny zmiennej łańcucha lekkiego humab4d5-8 jest zmodyfikowana w jednej lub więcej pozycji 30, 66 oraz 91 (Asn, Arg oraz His, jak zaznaczono odpowiednio wytłuszczonym drukiem/kursywą poniżej). W jednym przykładzie wykonania, zmodyfikowana sekwencja humab4d5-8 zawiera Ser w pozycji 30, Gly w pozycji 66 i/lub Ser w pozycji 91. Zgodnie z przykładem wykonania, przeciwciało według wynalazku zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO: 26 poniżej: podkreślono) (Reszty HVR Podstawione reszty, w odniesieniu do humab4d5-8, są zaznaczone wytłuszczonym drukiem/kursywą powyżej. [0147] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciało anty-tat226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, zawierające domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową posiadającą co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową, wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: W niektórych przykładach wykonania, sekwencja aminokwasowa mająca co

41 najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji, zawiera substytucje, addycje lub delecje w stosunku do sekwencji referencyjnej, ale przeciwciało zawierające tę sekwencję aminokwasową zachowuje zdolność wiązania do TAT226. W niektórych przykładach wykonania, suma od 1 do 10 aminokwasów została poddana substytucji, insercji lub delecji w ramach sekwencji wyselekcjonowanej spośród SEQ ID NO: W niektórych przykładach wykonania, substytucje, insercje czy delecje występują w regionach na zewnątrz HVR (tj. w FR). W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: [0148] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciało anty-tat226, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, zawierające (a) domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową posiadającą co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową, wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: oraz (b) domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji w stosunku do sekwencji aminokwasowej, wyselekcjonowanej spośród SEQ ID NO: W niektórych przykładach wykonania, sekwencja aminokwasowa mająca co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji, zawiera substytucje, addycje lub delecje w stosunku do sekwencji referencyjnej, ale przeciwciało zawierające tę sekwencję aminokwasową zachowuje zdolność wiązania do TAT226. W niektórych przykładach wykonania, suma od 1 do 10 aminokwasów została poddana substytucji, insercji lub delecji w ramach sekwencji wyselekcjonowanej spośród SEQ ID NO: W niektórych przykładach wykonania, substytucje, insercje czy delecje występują w regionach na zewnątrz HVR (tj. w FR). W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą sekwencję aminokwasową wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: [0149] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego, zawierający sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 24 oraz region zmienny łańcucha lekkiego, zawierający sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 29. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego, zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 25 oraz region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: Fragmenty przeciwciał [0150] Niniejszy wynalazek obejmuje fragmenty przeciwciał. Fragmenty przeciwciał mogą być wytwarzane za pomocą tradycyjnych środków, jak trawienie enzymatyczne lub techniki rekombinacji. W niektórych okolicznościach korzystniejsze jest zastosowanie fragmentów przeciwciał niż całych przeciwciał. Mniejszy rozmiar fragmentów przeciwciał umożliwia szybszy klirens (oczyszczanie) i może ułatwiać dostęp do guzów litych. W celu zapoznania się z pracami przeglądowymi dotyczącymi niektórych fragmentów przeciwciał, patrz Hudson i in. (2003) Nat. Med 9:

42 [0151] Opracowano różne techniki produkcji fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie, fragmenty te otrzymywano poprzez trawienie proteolityczne nienaruszonych przeciwciał (patrz np. Morimoto i in., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: (1992) oraz Brennan i in., Science, 229:81 (1985)). Jakkolwiek, fragmenty te mogą być obecnie produkowane bezpośrednio, przez rekombinowane komórki gospodarza. Wszystkie fragmenty przeciwciał spośród Fab, Fv oraz ScFv mogą ulegać ekspresji i wydzielaniu przez E. coli, umożliwiając w ten sposób łatwą produkcję dużych ilości tych fragmentów. Fragmenty przeciwciał mogą być izolowane z fagowych bibliotek przeciwciał, omówionych powyżej. Zamiennie, fragmenty Fab -SH można odzyskiwać bezpośrednio z E. coli i sprzęgać chemicznie do postaci fragmentów F(ab ) 2. (Carter i in., Bio/Technology 10: (1992)). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab ) 2 mogą być izolowane bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek gospodarza. Fragmenty Fab oraz F(ab ) 2 z wydłużonym okresem półtrwania in vivo, zawierające reszty epitopu wiążącego tzw. receptor ratujący (ang. salvage receptor) opisano w amerykańskim patencie nr 5,869,046. Inne techniki produkcji fragmentów przeciwciał będą znane specjaliście w danej dziedzinie. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało jest fragmentem jednołańcuchowym Fv (scfv). Patrz WO 93/16 185; patenty amerykańskie o numerach 5,571,894 oraz 5,587,458. Fv oraz scfv są jedynymi rodzajami z nienaruszonymi miejscami łączenia, które są pozbawione regionów stałych, tym sposobem, mogą być odpowiednie do zredukowanego wiązania niespecyficznego podczas użycia in vivo. W celu uzyskania fuzji białka efektorowego albo na końcu aminowym albo na końcu karboksylowym scfv, mogą być konstruowane białka fuzyjne scfv. Patrz Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. Fragment przeciwciała może być także przeciwciałem liniowym, jak opisano na przykład w patencie amerykańskim nr 5,641,870. Takie przeciwciała liniowe mogą być monospecyficzne lub bispecyficzne. 3. Przeciwciała humanizowane [0152] Zakres wynalazku obejmuje przeciwciała humanizowane. W dziedzinie znane są różne sposoby humanizowania przeciwciał, niebędących pochodzenia ludzkiego. Na przykład, humanizowane przeciwciało może posiadać jedną lub więcej reszt aminokwasowych, wprowadzonych do niego, pochodzących ze źródła innego niż ludzkie. Te niepochodzące od człowieka reszty aminokwasowe są często określane jako reszty importowane, które są zwykle pobrane z importowej domeny zmiennej. Humanizowanie może być zasadniczo prowadzone według sposobu Winter i in. (Jones i in. (1986) Nature 321: ; Riechmann i in. (1988) Nature 332: ; Verhoeyen i in. (1988) Science 239: ), poprzez podstawienie sekwencji regionów hiperzmiennych odpowiadającymi sekwencjami ludzkiego przeciwciała. W związku z tym, takie humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (patent amerykański nr 4,816,567), gdzie zasadniczo mniej niż nienaruszona ludzka domena zmienna została podstawiona odpowiadającą sekwencją, pochodzącą od innego niż człowiek gatunku. W praktyce, przeciwciała humanizowane są zwykle przeciwciałami ludzkimi, w których kilka reszt regionu hiperzmiennego i ewentualnie kilka reszt FR zostało podstawionych resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.

43 [0153] Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno lekkich jak i ciężkich, do wykorzystania przy tworzeniu przeciwciał humanizowanych może być ważny dla obniżenia antygenowości. Według tak zwanego sposobu najlepszego dopasowania, sekwencję domeny zmiennej przeciwciała gryzoni stosuje się do przeszukiwania całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domen zmiennych. Ludzka sekwencja, najbardziej zbliżona do tej z gryzonia jest przyjmowana jako ludzki zrąb humanizowanego przeciwciała (Sims i in. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia i in. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Inny sposób wykorzystuje specyficzny zrąb pochodzący z sekwencji konsensusowej wszystkich ludzkich przeciwciał określonych podgrup łańcuchów lekkich i ciężkich. Ten sam zrąb może być wykorzystany dla kilku różnych humanizowanych przeciwciał (Carter i in. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta i in. (1993) J. Immunol., 151: [0154] Jest dodatkowo powszechnie pożądanym, aby przeciwciała humanizowano z zachowaniem wysokiego powinowactwa do antygenu oraz innych korzystnych właściwości biologicznych. Aby osiągnąć ten cel, zgodnie z jednym ze sposobów, humanizowane przeciwciała otrzymuje się w procesie analizy sekwencji macierzystych oraz różnych koncepcyjnie humanizowanych produktów z wykorzystaniem trójwymiarowych modeli sekwencji macierzystych i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i są znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, obrazujące oraz wyświetlające prawdopodobne przestrzenne struktury konformacyjne wybranych sekwencji immunoglobulin. Analiza tych struktur umożliwia analizę prawdopodobnej roli reszt w działaniu analizowanej sekwencji immunoglobuliny, tj. analizę reszt, które mają wpływ na zdolność kandydującej immunoglobuliny do wiązania jej antygenu. W ten sposób, można wyselekcjonować reszty FR oraz połączyć sekwencje biorcy z sekwencji importowanymi tak, że pożądana cecha przeciwciała, taka jak zwiększone powinowactwo do docelowego antygenu, zostanie osiągnięta. Ogólnie, reszty regionów hiperzmiennych są bezpośrednio i w najbardziej znaczący sposób zaangażowane w kształtowanie wiązania antygenu. 4. Przeciwciała ludzkie [0155] Ludzkie przeciwciała anty-tat226 według wynalazku mogą być utworzone przez połączenie klonu Fv sekwencji domeny zmiennej, wyselekcjonowanej z biblioteki fagowej pochodzenia ludzkiego, ze znaną sekwencją (sekwencjami) ludzkiej domeny stałej, jak opisano powyżej. Zamiennie, ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-tat226 według wynalazku można wytworzyć metodą hybrydom. Linie komórkowe szpiczaka ludzkiego oraz hetero-szpiczaka mysio-ludzkiego, wykorzystywane do produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych opisane zostały, na przykład, przez Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i in., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str (Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1987) oraz Boerner i in., J. Immunol., 147: 86 (1991). [0156] Obecnie możliwa jest produkcja zwierząt transgenicznych (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do produkowania pełnego zestawu przeciwciał ludzkich, przy braku produkcji endogennych immunoglobin. Na przykład, opisano, że homozygotyczna delecja genu ciężkołańcuchowego regionu łącznikowego przeciwciała (JH) w chimerycznej linii zarodkowej myszy poddanych mutacji, skutkuje całkowitą inhibicją endogennej produkcji

44 przeciwciał. Przeniesienie zestawu genów immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej do takiej linii zarodkowej zmutowanych myszy będzie skutkować produkcją przeciwciał ludzkich, pod wpływem antygenu. Patrz np. Jakobovits i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i in., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann i in., Year in Immunol., 7: 33 (1993). [0157] Tasowanie genów może być także wykorzystywane do uzyskiwania przeciwciał ludzkich ze źródeł innych niż ludzkie, np. przeciwciał gryzoni, kiedy ludzkie przeciwciało ma podobne powinowactwa oraz specyfikę do wyjściowego przeciwciała niepochodzącego od człowieka. Zgodnie z tą metodą, która jest także nazywana odciskaniem epitopu ciężki albo lekki łańcuch regionu zmiennego fragmentu przeciwciała niepochodzącego od człowieka, otrzymanego technikami prezentacji fagowej, jak opisano w niniejszym opisie, jest przemieszczany wraz zestawem ludzkich genów domeny V, tworząc populację chimer scfv lub Fab, łańcuchów niepochodzących od człowieka/ludzkich. Selekcja z antygenami skutkuje wyizolowaniem chimerycznych scfv lub Fab, łańcuchów niepochodzących od człowieka/ludzkich, gdzie ludzkie łańcuchy przywracają miejsce wiązania antygenu, zniszczone przy usunięciu odpowiadającego niepochodzącego od człowieka łańcucha w pierwotnym klonie prezentacji fagowej; tj. epitop narzuca (odciska) wybór współuczestniczącego ludzkiego łańcucha. Kiedy proces jest powtarzany w celu zastąpienia pozostałego, niepochodzącego od człowieka łańcucha, uzyskiwane jest ludzkie przeciwciało (patrz PCT WO 93/06213 opublikowane 1 kwietnia 1993). W odróżnieniu od tradycyjnych metod humanizowania przeciwciał niepochodzących od człowieka, poprzez szczepienie CDR, ta technika dostarcza kompletne przeciwciała ludzkie, które nie zawierają reszt FR czy CDR, niepochodzących od człowieka. 5. Przeciwciała bispecyficzne [0158] Przeciwciała bispecyficzne są przeciwciałami monoklonalnymi, które posiadają specyficzność wiązania co najmniej dwóch różnych antygenów. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała bispecyficzne są przeciwciałami ludzkimi lub przeciwciałami humanizowanymi. W niektórych przykładach wykonania jedno specyficzne wiązanie jest wykorzystywane wobectat226, a drugie wobec dowolnego innego antygenu. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała bispecyficzne mogą się wiązać do dwóch rożnych epitopów TAT226. Przeciwciała bispecyficzne mogą także być stosowane do umiejscawiania czynników cytotoksycznych w komórkach, w których dochodzi do ekspresji TAT226. Przeciwciała te posiadają ramię wiążące TAT226 oraz ramię, które wiąże czynnik cytotoksyczny, np. taki jak saporyna, anty-interferon-α, alkaloid barwinka, łańcuch A rycyny, metotreksat czy promieniotwórczy izotop haptenu. Przeciwciała bispecyficzne mogą być otrzymywane jako przeciwciała pełnej długości lub fragmenty przeciwciał (np. przeciwciała bispecyficzne F(ab') 2 ). [0159] Sposoby wytwarzania przeciwciał bispecyficznych są znane specjalistom w danej dziedzinie. Tradycyjnie, rekombinowana produkcja przeciwciał bispecyficznych jest oparta o koekspresję dwóch par łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobulin, gdzie dwa łańcuchy ciężkie mają różne specyficzności (Milstein oraz Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Ze względu na losowy wybór łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin, te hybrydomy (kwadromy) wytwarzają potencjalną mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, spośród

45 których tylko jedna posiada prawidłową strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, zwykle wykonywane za pomocą etapów chromatografii powinowactwa, jest raczej niewygodne i wydajność produktu jest niska. Podobne procedury są pokazane w WO 93/08829 opublikowanym 13 maja, 1993 oraz w Traunecker i in., EMBO J., 10: 3655 (1991). [0160] Według innego podejścia, zmienne domeny przeciwciała o pożądanej swoistości wiązania (miejsca połączeń antygen-przeciwciało) są poddawane fuzji z sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Taka fuzja, na przykład, zachodzi z łańcuchem ciężkim domeny stałej immunoglobuliny, zawierającej co najmniej część zawiasu, regiony CH2 oraz CH3. W niektórych przykładach wykonania, pierwszy region stały łańcucha ciężkiego (CH1), zawierający miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego, jest obecny w co najmniej jednej fuzji. DNA kodujący fuzje łańcuchów ciężkich immunoglobulin oraz, w razie potrzeby, łańcuchów lekkich immunoglobulin, jest wprowadzany do odrębnych wektorów ekspresyjnych i ulega kotransfekcji do odpowiedniego organizmu gospodarza. To zapewnia dużą elastyczność dostosowania wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w przykładach wykonania, kiedy nierówne proporcje trzech łańcuchów polipeptydowych użytych w konstrukcji, zapewniają optymalną wydajność. Jakkolwiek, jest możliwe włączenie sekwencji kodujących dla dwóch lub wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, kiedy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach skutkuje wysoką wydajnością lub kiedy proporcje nie mają szczególnego znaczenia. [0161] W jednym z przykładów wykonania według tego podejścia, przeciwciała bispecyficzne są zbudowane z hybryd łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, z pierwszą specyficznością wiązania na jednym ramieniu oraz hybrydową parą łańcuchów ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny (zapewniających drugą specyficzność wiązania) na drugim ramieniu. Odkryto, ze ta asymetryczna struktura ułatwia oddzielenie pożądanych związków bispecyficznych od niechcianych połączeń łańcuchów immunoglobulin, jako że obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny tylko w jednej połowie cząsteczki bispecyficznej, dostarcza łatwy sposób rozdziału. To podejście ujawniono w WO 94/ W celu zapoznania się z dalszymi szczegółami dotyczących wytwarzania przeciwciał bispecyficznych zobacz, np., Suresh i in., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). [0162] Zgodnie z innym podejściem, interfejs pomiędzy parą cząsteczek przeciwciał może być zaprojektowany w celu maksymalizowania procenta heterodimerów, odzyskiwanych z hodowli rekombinowanych komórek. Interfejs zawiera co najmniej część domeny C H 3 domeny stałej przeciwciała. W tej metodzie, jeden lub więcej małych łańcuchów bocznych aminokwasów z interfejsu cząsteczki pierwszego przeciwciała jest zastąpionych większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyny czy tryptofanu). Na interfejsie cząsteczki drugiego przeciwciała wytworzone są kieszenie kompensacyjne, identycznej lub podobnej wielkości, co duży(-e) łańcuch(y) boczny(-e), poprzez zastąpienie aminokwasów o dużych łańcuchach bocznych aminokwasami o mniejszych łańcuchach bocznych (np. treoniny alaniną). Zapewnia to mechanizm zwiększania wydajności heterodimeru w porównaniu z innymi niepożądanymi produktami ubocznymi, takimi jak homodimery.

46 [0163] Przeciwciała bispecyficzne obejmują przeciwciała sieciowane lub heterokoniugaty. Na przykład, jedno z przeciwciał w heterokoniugacie może być sprzężone z awidyną, a inne z biotyną. Takie przeciwciała zaproponowano na przykład do nakierowywania komórek układu immunologicznego przeciwko komórkom niechcianym (patent amerykański nr 4,676,980) oraz w leczeniu infekcji HIV (WO 91/00360, WO 92/00373 i EP 03089). Heterokoniugaty przeciwciał mogą być wytwarzane za pomocą jakiegokolwiek sposobu dogodnego sieciowania. Odpowiednie czynniki sieciujące są dobrze znane w dziedzinie i są ujawnione w patencie amerykańskim nr 4,676,980, wraz z szeregiem technik sieciowania. [0164] Techniki wytwarzania przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał również zostały opisane w literaturze. Na przykład, bispecyficzne przeciwciała mogą być otrzymywane z użyciem wiązań chemicznych. Brennan i in., Science, 229: 81 (1985) opisuje procedurę, gdzie nienaruszone przeciwciała są trawione proteolitycznie w celu wytworzenia fragmentów F(ab') 2. Fragmenty te są redukowane w obecności ditiolowego czynnika kompleksującego arseninu sodowego w celu stabilizacji sąsiadujących ditioli oraz zapobieżenia powstawaniu międzycząsteczkowego dwusiarczku. Powstałe fragmenty Fab' są następnie przekształcane do pochodnych tionitrobenzoesanu (TNB). Jedna z pochodnych Fab'-TNB jest następnie ponownie przekształcana do tiolu-fab', poprzez redukcję z merkaptoetyloaminą i mieszana z równomolową ilością drugiej pochodnej Fab'-TNB celem wytworzenia przeciwciała bispecyficznego. Produkowane przeciwciała bispecyficzne mogą być stosowane jako czynniki do selektywnej immobilizacji enzymów. [0165] Ostatnie postępy ułatwiły bezpośrednie pozyskiwanie fragmentów Fab'-SH od E.coli, które to fragmenty mogą być chemicznie sprzęgane, tworząc przeciwciała bispecyficzne. Shalaby i in., J. Exp. Med., 175: (1992) opisuje produkcję cząsteczek w pełni humanizowanych przeciwciał bispecyficznych F(ab') 2. Każdy fragmen Fab był oddzielnie wydzielany z E. coli i poddawany ukierunkowanemu chemicznemu sprzęganiu in vitro, w celu utworzenia bispecyficznego przeciwciała. Tak wytworzone przeciwciała bispecyficzne były zdolne do wiązania się do komórek nadeksprymujących receptor HER2 oraz do prawidłowych ludzkich komórek T, jak również do wyzwalania aktywności litycznej ludzkich limfocytów cytotoksycznych przeciwko docelowemu ludzkiemu guzowi piersi. [0166] Opisane zostały także różne techniki wytwarzania oraz izolowania fragmentów przeciwciał bispecyficznych bezpośrednio z hodowli komórek rekombinowanych. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne były produkowane z użyciem suwaków leucynowych, Kostelny i in., J. Immunol., 148(5): (1992). Peptydy suwaków leucynowych z białek Fos oraz Jun przyłączano do fragmentów Fab' dwóch różnych przeciwciał poprzez fuzję genów. Homodimery przeciwciał redukowano w regionie zawiasowym w celu utworzenia monomerów, a następnie ponownie utleniano w celu utworzenia heterodimerów przeciwciał. Ten sposób może być również wykorzystany do produkcji homodimerów przeciwciał. Technologia dwuciał opisana przez Hollingera i in., w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: (1993) zapewniła alternatywny mechanizm wytwarzania fragmentów przeciwciał bispecyficznych. Fragmenty zawierają ciężkołańcuchową domenę zmienną (VH) połączoną z lekkołańcuchową domeną zmienną (VL) poprzez łącznik, który jest zbyt krótki, aby umożliwiał tworzenie par pomiędzy dwoma

47 domenami tego samego łańcucha. Stosownie do tego, domeny VH oraz VL jednego fragmentu są zmuszone do parowania się z komplementarnymi domenami VH oraz VL innego fragmentu, tworząc w ten sposób dwa miejsca wiązania antygenu. Opisano także inną strategię wytwarzania fragmentów przeciwciał bispecyficznych za pomocą dimerów pojedynczych łańcuchów Fv (sfv). Patrz Gruber i in., J. Immunol., 152: 5368 (1994). [0167] Rozważano przeciwciała o więcej niż dwóch specyficznościach. Na przykład, można wytwarzać przeciwciała trójspecyficzne, Tutt i in., J.Immunol. 147: 60 (1991). 6. Przeciwciała multiwalentne [0168] Przeciwciało multiwalentne może być internalizowane (i/lub katabolizowane) przez komórkę, wykazującą ekspresję antygenu, do którego wiąże się to przeciwciało szybciej, niż przeciwciało biwalentne. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być przeciwciałami multiwalentnymi (innymi niż klasa IgM) z trzema lub większą liczbą miejsc wiązania antygenu (np. przeciwciała czterowalentne), które mogą być łatwo produkowane poprzez rekombinowaną ekspresję kwasów nukleinowych kodujących łańcuchy polipeptydowe przeciwciała. Przeciwciało multiwalentne może zawierać domenę dimeryzacji oraz trzy lub większą liczbę miejsc wiążących antygen. W niektórych przykładach wykonania, domena dimeryzacji zawiera (lub składa się z nich) region Fc lub region zawiasowy. Przy takim scenariuszu, przeciwciało będzie zawierało region Fc oraz trzy lub większą liczbę miejsc wiązania antygenu na końcu aminowym w stosunku do regionu Fc. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało multiwalentne zawiera (składa się z) trzy do około ośmiu miejsc wiążących antygen. W jednym z takich przykładów wykonania przeciwciało multiwalentne zawiera (lub składa się z) czterech miejsc wiążących antygen. Przeciwciało multiwalentne zawiera co najmniej jeden łańcuch polipeptydowy (na przykład. dwa łańcuchy polipeptydowe), przy czym łańcuch(y) polipeptydowy(-e) zawiera(ją) dwie lub więcej domen zmiennych. Na przykład, łańcuch(y) polipeptydowy(-e) mogą zawierać VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, w którym VD1 jest pierwszą domeną zmienną, VD2 jest drugą domeną zmienną, Fc jest jednym łańcuchem polipeptydowym regionu Fc, X1 oraz X2 przedstawiają aminokwas lub polipeptyd, a n wynosi 0 lub 1. Na przykład, łańcuch(y) polipeptydowy(-e) mogą zawierać: łańcuch VH-CH1-elastyczny łącznik-vh-ch1-łańcuch regionu Fc lub VH-CH1-VH-CH1-łańcuch regionu Fc. Przeciwciało multiwalentne, według niniejszego opisu, może ponadto zawierać co najmniej dwa (na przykład cztery) polipeptydy domeny zmiennej łańcucha lekkiego. Przeciwciało multiwalentne, według niniejszego opisu, może ponadto zawierać od około dwóch do około ośmiu polipeptydów domeny zmiennej łańcucha lekkiego. Analizowane w niniejszym opisie polipeptydy domeny zmiennej łańcucha lekkiego zawierają domenę zmienną łańcucha lekkiego oraz, opcjonalnie, dodatkowo zawierają domenę CL. 7. Przeciwciała jednodomenowe [0169] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem jednodomenowym. Przeciwciało jednodomenowe jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym, zawierającym wszystkie fragmenty domeny zmiennej łańcucha ciężkiego lub wszystkie fragmenty domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało jednodomenowe jest ludzkim

48 przeciwciałem jednodomenowym (Domantis, Inc., Waltham MA; patrz np. patent amerykański nr 6,248,516 B1). W jednym z przykładów wykonania, przeciwciało jednodomenowe składa się z wszystkich fragmentów domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała. 8. Warianty przeciwciał [0170] W niektórych przykładach wykonania, analizowane są opisane w niniejszym opisie modyfikacje sekwencji aminokwasowej. Na przykład, może być pożądane zwiększenie powinowactwa wiązania i/lub innych własności biologicznych przeciwciała. Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała mogą być sporządzone poprzez wprowadzenie właściwych zmian w sekwencji, nukleotydowej kodującej przeciwciało lub poprzez syntezę peptydu. Takie modyfikacje obejmują, na przykład, delecje z i/lub insercje do i/lub substytucje reszt w obrębie sekwencji aminokwasowych przeciwciała. Jakakolwiek kombinacja delecji, insercji oraz substytucji może dawać ostateczną strukturę, pod warunkiem, że końcowy konstrukt posiada pożądane cechy. Zmiany aminokwasowe mogą być wprowadzone w obrębie sekwencji aminokwasowej przeciwciała, w chwili tworzenia tej sekwencji. [0171] Przydatną metodą identyfikacji niektórych reszt lub regionów, będących preferowanymi miejscami lokalizacji mutagenezy nazywano mutagenezą przeszukiwania alaninami jak opisali Cunningham oraz Wells (1989) Science, 244: W niniejszym opisie, identyfikuje się reszty lub grupy reszt docelowych (np. naładowane reszty takie jak Arg, Asp, His, Lys oraz Glu) i są one zastępowane obojętnymi lub ujemnie naładowanymi aminokwasami (np. alaniną czy polialaniną) w celu wpływania na oddziaływanie aminokwasów z antygenem. Te lokalizacje aminokwasów, wykazujące wrażliwość funkcjonalną na substytucję, są bliżej charakteryzowane poprzez wprowadzenie dalszych lub innych wariantów przy lub do miejsc substytucji. Tak więc, podczas gdy miejsce wprowadzania wariacji sekwencji aminokwasowej jest z góry ustalone, charakter mutacji per se nie wymaga ustalenia. Na przykład, w celu zanalizowania działania mutacji w danym miejscu, prowadzi się przeszukiwanie alaninami lub mutagenezę losową w docelowym kodonie lub w regionie, a ulegające ekspresji immunoglobuliny przeszukuje się pod kątem pożądanej aktywności. [0172] Insercje sekwencji aminokwasowych obejmują fuzje na końcu aminowym i/lub końcu karboksylowym, w przedziale długości od jednej reszty do polipeptydów zawierających sto lub więcej reszt, jak również insercje wewnątrzsekwencyjne pojedynczych lub wieloaminokwasowych reszt. Przykłady insercji końcowych obejmują przeciwciało z resztami metionylowymi na końcu N. Inne warianty insercyjne cząsteczki przeciwciała obejmują fuzje N- lub C-końca przeciwciała do enzymu (np. ADEPT) lub polipeptydu, które wydłużają okres półtrwania przeciwciała w osoczu. [0173] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało według wynalazku podlega zmianom w celu zwiększenia lub obniżenia zakresu glikozylacji przeciwciała. Glikozylacja polipeptydów jest zwykle N-glikozylacją lub O-glikozylacją. N-glikozylacja odnosi się do przyłączenia wyodrębnionej części cząsteczki węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginy. Sekwencja trójpeptydowa asparagina-x-seryna oraz asparagina-x-treonina, gdzie

49 X jest dowolnym aminokwasem, z wyjątkiem proliny, są sekwencjami rozpoznawczymi dla enzymatycznego przyłączenia wyodrębnionej części cząsteczki węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Tak więc, obecność jednej z takich sekwencji trójpeptydowych w polipeptydzie tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. O-glikozylacja odnosi się do przyłączenia jednego z cukrów N-acetylogalaktozaminy, galaktozy lub ksylozy do hydroksyaminokwasu, najczęściej seryny lub treoniny, chociaż 5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna może być również wykorzystana. [0174] Addycję lub delecję miejsc glikozylacji przeciwciała można w dogodny sposób wykonać poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, że tworzona jest lub usuwana jedna lub więcej powyżej opisanych sekwencji trójpeptydowych (dla miejsc N-glikozylacji). Zmiana może być także wykonana poprzez addycję, delecję lub substytucję jednej lub większej liczby reszt serynowych lub treoninowych w obrębie sekwencji oryginalnego przeciwciała (dla miejsc O-glikozylacji). [0175] W przypadku, gdy przeciwciało zawiera region Fc, można zmieniać węglowodan przyłączony do niego. Na przykład, przeciwciała o dojrzałej strukturze węglowodanowej, które są pozbawione fukozy przyłączonej do regionu Fc przeciwciała, opisano w amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr 2003/ (Presta, L.). Patrz także US 2004/ (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Przeciwciała z przeciętą na dwie części N-acetyloglukozaminą (GlcNAc) w węglowodanie przyłączonym do regionu Fc przeciwciała, są opisane w WO 2003/011878, Jean-Mairet i in. oraz w patencie amerykańskim nr 6,602,684, Umana i in. Przeciwciała z co najmniej jedną resztą galaktozy w obrębie oligasacharydu przyłączonego do regionu Fc przeciwciała są opisane w WO 1997/30087, Patel i in. Zobacz także WO 1998/58964 (Raju, S.) oraz WO 1999/22764 (Raju, S.) dotyczące przeciwciał ze zmienionym połączeniem węglowodanu z regionem Fc. Zobacz także US 2005/ (Umana i in.) dotyczący cząsteczek wiążących antygen, o zmodyfikowanej glikozylacji. [0176] W niektórych przykładach wykonania, wariant glikozylacji obejmuje region Fc, gdzie struktura węglowodanu, przyłączonego do regionu Fc, jest pozbawiona fukozy. Takie warianty wykazują ulepszoną funkcję ADCC. Opcjonalnie, region Fc zawiera dodatkowo jedną lub więcej substytucji aminokwasowych, w celu dalszej poprawy ADCC, na przykład, podstawienia w pozycjach 298, 333 i/lub 334 regionu Fc (numeracja reszt Eu). Przykłady publikacji związanych z przeciwciałami pozbawionymi fukozy lub defukozylowanymi obejmują: US 2003/ ; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/ ; US 2002/ ; US 2004/ ; US 2004/ ; US 2004/ ; US 2004/ ; US 2004/ ; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki i in., J. Mol. Biol. 336: (2004); Yamane- Ohnuki i in., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Przykłady linii komórkowych, produkujących defukozylowane przeciwciała, obejmują: komórki Lec13 CHO, pozbawione zdolności do fukozylacji białka (Ripka i in., Arch. Biochem. Biophys. 249: (1986); amerykańskie zgłoszenie patentowe US 2003/ A1, Presta, L; oraz WO 2004/ A1, Adams i in., szczególnie w przykładzie 11), nokautowane linie komórkowe, takie jak gen alfa-1,6-

50 fukozylotransferazy, FUT8, nokautowane komórki CHO (Yamane-Ohnuki i in., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). [0177] Innym rodzajem wariantu jest wariant podstawienia aminokwasu. Te warianty mają co najmniej jedną resztę aminokwasową zastąpioną inną resztą aminokwasową w cząsteczce przeciwciała. Miejsca, będące przedmiotem zainteresowania z punktu widzenia mutagenezy substytucyjnej obejmują regiony hiperzmienne, ale rozważane są także zmiany FR. Substytucje konserwatywne są przedstawione w tabeli 1, pod nagłówkiem preferowane substytucje. Jeśli takie substytucje skutkują pożądaną zmianą aktywności biologicznej, wtedy może zostać wprowadzonych więcej istotnych zmian, nazywanych przykładowymi substytucjami w tabeli 1 lub jak opisano poniżej, w odniesieniu do klas aminokwasów, i może dojść do przeszukiwania powstałych produktów. TABELA 1 Oryginalna reszta Przykładowe substytucje Preferowane substytucje Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucyna Leu Leu (L) Norleucyna; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucyna Leu

51 [0178] Istotne modyfikacje właściwości biologicznych przeciwciał osiąga się poprzez selekcję substytucji, które różnią się znacząco, jeśli chodzi o wpływ na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w obszarze substytucji, na przykład jako harmonijka lub konformacja helikalna, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) rozmiaru łańcucha bocznego. Aminokwasy mogą być zgrupowane według podobieństwa własności ich łańcuchów bocznych (w A. L. Lehninger, w Biochemistry, wydanie drugie, str , Worth Publishers, Nowy Jork (1975)): (1) niepolarne: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polarne bez ładunku: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) kwasowe: Asp (D), Glu (E) (4) zasadowe: Lys (K), Arg (R), His (H) [0179] Zamiennie, naturalnie występujące reszty mogą być podzielone na grupy, w oparciu o typowe właściwości łańcuchów bocznych: (1) hydrofobowe: Norleucyna, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) obojętne hydrofilowe: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kwasowe: Asp, Glu; (4) zasadowe: His, Lys, Arg; (5) reszty wpływające na orientację łańcucha: Gly, Pro; (6) aromatyczne: Trp, Tyr, Phe. [0180] Substytucje niekonserwatywne będą wymagały wymiany członka jednej klasy na członka innej klasy. Tak podstawione reszty mogą być także wprowadzone do miejsc substytucji konserwatywnej lub do pozostałych(nie-zachowawczych) miejsc [0181] Jeden z rodzajów wariantów podstawienia obejmuje podstawienie jednej lub większej liczby reszt regionów hiperzmiennych macierzystego przeciwciała (np. przeciwciała ludzkiego lub humanizowanego). Ogólnie, wynikający(-e) wariant(y) wybrane celem dalszego opracowania, będą miały zmodyfikowane (np. ulepszone) właściwości biologiczne w porównaniu z przeciwciałem macierzystym, z którego zostały wytworzone. Wygodny sposób generowania takich wariantów podstawień obejmuje dojrzewanie powinowactwa z użyciem prezentacji fagowej. Pokrótce, niektóre miejsca regionów hiperzmiennych (np. 6-7 miejsc) mutuje się w celu wytworzenia wszystkich możliwych substytucji aminokwasowych w każdym miejscu. Wygenerowane w ten sposób przeciwciała są eksponowane na cząstkach faga włókienkowego jako fuzje przynajmniej do części fagowego białka płaszcza (np. produkt genu III M13) upakowanego w każdej cząstce. Warianty po prezentacji fagowej są następnie poddawane przeszukiwaniu pod kątem ich właściwości biologicznych (np. powinowactwa wiązania). W celu określenia ewentualnych miejsc regionów hiperzmiennych do modyfikacji, może być przeprowadzona mutageneza przeszukiwania (np. przeszukiwania alaninami) w celu zidentyfikowania reszt regionów hiperzmiennych, uczestniczących w znaczącym stopniu w wiązaniu antygenu. Zamiennie lub dodatkowo, korzystne może być zanalizowanie struktury krystalicznej kompleksu antygenprzeciwciało celem określenia punktów styku pomiędzy przeciwciałem a antygenem. Takie reszty kontaktowe oraz reszty sąsiadujące są ewentualnymi potencjalnymi miejscami

52 substytucji, zgodnej z technikami znanymi w dziedzinie, włączając te opracowane w niniejszym opisie. Kiedy takie warianty zostaną wytworzone, panel wariantów jest poddawany przeszukiwaniu z użyciem technik znanych w dziedzinie, włączając te opisane w niniejszym opisie, a w kolejnych próbach mogą być wyselekcjonowane do dalszego opracowywania przeciwciała o lepszych właściwościach. [0182] Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące warianty sekwencji aminokwasowych przeciwciała są otrzymywane za pomocą szeregu sposobów znanych w dziedzinie. Te sposoby obejmują, bez ograniczania się do, izolację ze źródeł naturalnych (w przypadku występujących naturalnie wariantów sekwencji aminokwasowych) lub otrzymywanie za pomocą mutagenezy sterowanej oligonukleotydami (lub mutagenezy ukierunkowanej), mutagenezy PCR oraz mutagenezy kasetowej wcześniej przygotowanej wariantowej lub niewariantowej wersji przeciwciała. [0183] Pożądane może być wprowadzenie jednej lub większej liczby modyfikacji aminokwasowych w regionie Fc przeciwciał wynalazku, generując tym samym wariant regionu Fc. Wariant regionu Fc może zawierać sekwencje ludzkiego regionu Fc (np. ludzkie regiony Fc IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4), zawierające modyfikację aminokwasową (np. substytucję) w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasowych, włączając cysteinę zawiasową. [0184] Zgodnie z niniejszym opisem i technikami znanymi w dziedzinie, uważa się, że w niektórych przykładach wykonania, przeciwciało według wynalazku może zawierać jedną lub więcej zmian w porównaniu z odpowiednikiem dzikiego typu przeciwciała, np. w regionie Fc. Te przeciwciała miałyby jednak zasadniczo zachować takie same cechy, wymagane dla przydatności terapeutycznej w porównaniu z odpowiednikami dzikiego typu. Na przykład, uważa się, że można dokonać pewnych zmian w regionie Fc, które spowodowałyby zmiany wiązania C1q (albo zwiększenie albo obniżenie) i/lub zmiany cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC), jak opisano np. w WO99/ Zobacz także Duncan & Winter Nature 322: (1988); patent amerykański nr 5,648,260; patent amerykański nr 5,624,821 oraz WO94/29351 dotyczący innych przykładów wariantów regionu Fc. WO00/42072 (Presta) oraz WO 2004/ (Lowman) opisują warianty przeciwciała ze zwiększonym lub obniżonym wiązaniem do FcRs. Zawartość tych publikacji patentowych jest specyficznie włączona do niniejszego opisu przez odniesienie. Zobacz także Shields i in., J. Biol. Chem. 9(2): (2001). Przeciwciała o wydłużonym okresie półtrwania oraz lepszym wiązaniu do noworodkowego receptora Fc (FcRn), który jest odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer i in., J. Immunol.117: 587 (1976) oraz Kim i in., J. Immunol. 24:249 (1994)), są opisane w US2005/ A1 (Hinton i in.). Przeciwciała te zawierają regiony Fc z jedną lub większą liczbą substytucji, które poprawiają wiązanie regionu Fc do FcRs. Warianty polipeptydów ze zmienionymi sekwencjami aminokwasowymi regionu Fc oraz zwiększoną lub zmniejszoną zdolnością wiązania C1q są opisane w patencie amerykańskim nr 6,194,551B1, WO99/ Zawartość tych publikacji patentowych jest specyficznie włączona do niniejszego opisu przez odniesienie. Patrz także Idusogie i in. J. Immunol. 164: (2000).

53 [0185] W jednym z aspektów, wynalazek dostarcza przeciwciała zawierające modyfikacje w interfejsie polipeptydów Fc, obejmujące region Fc, w którym modyfikacje ułatwiają i/lub promują heterodimeryzację. Te modyfikacje obejmują wprowadzenie wypukłości do pierwszego polipeptydu Fc oraz zagłębienia do drugiego polipeptydu Fc, przy czym wypukłości są pozycjonowane w przestrzeni tak, aby promować kompleksowanie pierwszego i drugiego polipeptydu Fc. Sposoby generowania przeciwciał z tymi modyfikacjami są znane w dziedzinie, jak np. opisano w patencie amerykańskim nr 5,731, Pochodne przeciwciał [0186] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być dodatkowo zmodyfikowane tak, że będą zawierały dodatkowe ugrupowania niebiałkowe, które są znane w danej dziedzinie i łatwo dostępne. Korzystnie, ugrupowania odpowiednie do derywatyzacji przeciwciała są polimerami rozpuszczalnymi w wodzie. Nieograniczone przykłady polipeptydów rozpuszczalnych w wodzie obejmują, bez ograniczania się do: glikol polietylenowy (PEG), kopolimery glikol etylenowy/glikol propylenowy, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etylen/bezwodnik maleinowy, poliaminokwasy (albo homopolimery albo losowe kopolimery) oraz dekstran lub glikol poli(n-winylopirolidono)polietylenowy, homopolimery glikolu polipropylenowego, kopolimery tlenek polipropylenu/tlenek etylenu, poliole polioksyetylowane (np. glicerol), alkohol poliwinylowy oraz ich mieszaniny. Aldehyd propionowy glikolu polietylenowego może przynieść korzyści w produkcji ze względu na trwałość w wodzie. Polimer może mieć dowolną masę cząsteczkową, może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Liczba polimerów połączonych z przeciwciałem może być różna i jeśli więcej niż jeden polimer jest związany, mogą to być takie same lub różne cząsteczki, Ogólnie, liczba i/lub rodzaj polimerów użytych do derywatyzacji może być określana w oparciu o przesłanki obejmujące, ale nie ograniczające się do szczególnych właściwości lub funkcji przeciwciał, mających podlegać ulepszeniu, albo tego, czy pochodne przeciwciał mają być użyte w terapii w określonych warunkach, itd. [0187] W innym przykładzie wykonania wynalazku, dostarcza się koniugaty przeciwciała i ugrupowań niebiałkowych, które mogą być selektywnie ogrzewane poprzez ekspozycję na promieniowanie. W jednym przykładzie wykonania, ugrupowaniem niebiałkowym jest nanosonda węglowa (Kam i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: (2005). Promieniowanie może być o dowolnej długości fali i obejmuje, bez ograniczania się do, długości fali, które nie szkodzą zwykłym komórkom, ale które podgrzewają ugrupowania niebiałkowe do temperatury, w której komórki położone najbliżej w stosunku do kompleksu przeciwciało-ugrupowanie niebiałkowe, są zabijane, B. Niektóre sposoby sporządzania przeciwciał 1. Niektóre sposoby oparte o hybrydoma [0188] Przeciwciała monoklonalne anty-tat226 według wynalazku mogą być sporządzone z użyciem metody hybrydoma, opisanej po raz pierwszy przez Kohlera i in., Nature, 256: 495 (1975) lub mogą być sporządzone za pomocą sposobów rekombinowanego DNA (patent amerykański nr 4,816,567).

54 [0189] W metodzie hybrydoma, myszy lub inne przeznaczone tego celu zwierzęta gospodarze, takie jak chomiki, są immunizowane w celu zaktywizowania limfocytów, które produkują lub są zdolne do produkcji przeciwciał, które będą się wiązać specyficznie do białka używanego do immunizacji. Powstawanie przeciwciał przeciwko TAT226 na ogół osiąga się u zwierząt za pomocą licznych iniekcji, podskórnie (sc) lub dootrzewnowo (ip) TAT226 oraz adiuwanta. TAT226 mogą być przygotowane za pomocą metod dobrze znanych w dziedzinie, spośród których niektóre zostały opisane w niniejszym opisie. Na przykład, TAT226 może być produkowane drogą rekombinacji. W jednym z przykładów wykonania, zwierzęta są immunizowane pochodną TAT226, zawierającą zewnątrzkomórkowe fragmenty TAT226, sprzężone z fragmentem Fc łańcucha ciężkiego immunoglobuliny. W jednym przykładzie wykonania, zwierzęta są immunizowane za pomocą białka fuzyjnego TAT226- IgG1. W jednym przykładzie wykonania, zwierzęta są immunizowane za pomocą immunogennych pochodnych TAT226 w roztworze dikrynomykolanu trehalozy (TDM) z monofosforylolipidem A (MPL) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT), a roztwór jest wstrzykiwany śródskórnie w licznych miejscach. Dwa tygodnie później zwierzętom podaje się dawkę przypominającą. Siedem do czternastu dni później, zwierzęta są skrwawiane, a w surowicy oznacza się miano przeciwciał antytat226. Zwierzętom podaje się dawki przypominające aż do uzyskania poziomu plateau miana produkowanych przeciwciał. [0190] Zamiennie, limfocyty mogą być immunizowane in vitro. Limfocyty są następnie sprzęgane z komórkami szpiczaka za pomocą odpowiedniego czynnika sprzęgającego, jak glikol polietylenowy, tworząc komórki hybrydoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str (Academic Press, 1986)). [0191] Przygotowane w ten sposób komórki hybrydoma są wysiewane i rosną w odpowiedniej pożywce hodowlanej, np. w pożywce zawierającej jedną lub więcej substancji hamujących wzrost lub przeżycie niesprzężonych, macierzystych komórek szpiczaka. Na przykład, jeśli macierzyste komórki szpiczaka są pozbawione enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HGPRT lub HPRT), pożywka hodowlana dla hybrydoma będzie zazwyczaj zawierała hipoksantynę, aminopterynę, tymidynę (pożywka HAT), z substancjami zapobiegającymi wzrostowi komórek z niedoborem HGPRT. [0192] W niektórych przykładach wykonania, komórki szpiczaka są tymi, które skutecznie podlegają fuzji, wspierają stabilny wysoki poziom produkcji przeciwciał przez wyselekcjonowane komórki produkujące przeciwciała oraz są wrażliwe na pożywkę taką, jak pożywka HAT. Przykładowe komórki szpiczaka obejmują, bez ograniczania się do, mysie linie szpiczaka, takie jak te pochodzące z guzów mysich MOPC-21 oraz MPC-11, dostępne z Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA oraz komórki SP-2 lub X63Ag8-653 dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Linie komórkowe ludzkiego szpiczaka oraz mysio-ludzkiego heteroszpiczaka zostały również opisane pod kątem produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i in., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str (Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1987)).

55 [0193] Pożywka hodowlana, w której rosną komórki hybrydoma, jest testowana pod kątem produkcji przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się do TAT226. Korzystnie, specyficzność wiązania przeciwciał monoklonalnych, produkowanych przez komórki hybrydoma, jest określona przez immunoprecypitację lub przez test wiązania in vitro, taki jak test radioimmunologiczny (RIA) lub test immunoenzymatyczny (ELISA). Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego może być określone, na przykład przez analizę Scatcharda według Munsona i in., Anal. Biochem., 107: 220 (1980). [0194] Po identyfikacji komórek hybrydoma, które produkują przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony można poddać subklonowaniu poprzez ograniczenie procedur rozcieńczania i hodować standardowymi metodami (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice str (Academic Press, 1986)). Odpowiednie pożywki hodowlane do tego celu, obejmują, na przykład pożywki D-MEM lub RPMI W dodatku, komórki hybrydoma mogą rosnąć in vivo jako guzy wysiękowe u zwierząt. Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony są odpowiednio oddzielane z pożywki hodowlanej, płynów guza wysiękowego lub surowicy poprzez tradycyjne procedury oczyszczania immunoglobulin, takie, jak na przykład sefaroza-białko A, chromatografia hydroksyapatytowa, elektroforeza żelowa, dializa oraz chromatografia powinowactwa. 2. Niektóre sposoby przeszukiwania bibliotek [0195] Przeciwciała anty-tat226 według wynalazku mogą być wyprodukowane za pomocą bibliotek kombinatorycznych w celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał z pożądaną aktywnością lub aktywnościami. Na przykład, znany jest w dziedzinie szereg sposobów generowania bibliotek fagowych oraz przeszukiwania takich bibliotek pod kątem przeciwciał posiadających pożądane parametry wiązania. Takie sposoby są ogólnie opisane w Hoogenboom i in. (2001) w Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O Brien i in.; Human Press, Totowa, NJ) a niektóre przykłady wykonania w Lee i in. (2004) J. Mol. Biol. 340: [0196] W zasadzie, klony przeciwciał syntetycznych są selekcjonowane na drodze przeszukiwania bibliotek fagowych, zawierających fagi, które eksponują różne fragmenty regionu zmiennego (Fv) przeciwciała poddanych fuzji do fagowego białka płaszcza. Takie biblioteki fagowe są przemieszczane drogą chromatografii powinowactwa przeciw żądanemu antygenowi. Klony wykazujące ekspresję fragmentów Fv, zdolnych do wiązania się z pożądanymi antygenami, są adsorbowane do antygenu i w ten sposób separowane od niewiążących klonów biblioteki. Klony wiążące są następnie wymywane z antygenu i mogą być następnie wzbogacone poprzez dodatkowe cykle adsorpcji/elucji antygenu. Którekolwiek z przeciwciał anty-tat226 według wynalazku może być otrzymane poprzez zaprojektowanie procedury przeszukiwania dla odpowiedniego antygenu celem wyselekcjonowania klonu faga, będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie skonstruowanie pełnej długości klonu przeciwciała anty-tat226, z użyciem sekwencji Fv z klonu faga, będącego przedmiotem zainteresowania oraz odpowiednich sekwencji regionu stałego (Fc), co opisał Kabat i in. w Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie V, NIH Publication , Bethesda MD (1991), tomy 1-3.

56 [0197] W niektórych przykładach wykonania domena przeciwciała wiążąca antygen jest formowana z dwóch regionów zmiennych (V) po około 110 aminokwasów, jednym z lekkiego łańcucha (VL) oraz jednym z ciężkiego łańcucha (VH), oboma prezentującymi trzy hiperzmienne pętle (HVRs) lub regiony determinujące komplementarność (CDRy). Domeny zmienne mogą być wyeksponowane funkcjonalnie na fagu, albo jako fragmenty jednołańcuchowe Fv (scfv), w których VH oraz VL są związane kowalencyjnie poprzez krótki, elastyczny peptyd lub jako fragmenty Fab, w których każdy jest poddany fuzji do domeny stałej i oddziałuje niekowalencyjnie, jak opisano w Winter i in., Ann. Rev. Immunol., 12: (1994). Jak użyto w niniejszym opisie, scfv kodujące klony fagowe oraz Fab kodujące klony fagowe są wspólnie określane jako klony fagowe Fv lub klony Fv. [0198] Zestaw genów VH oraz VL może być klonowany osobno przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) oraz zrekombinowany losowo w bibliotekach fagowych, które następnie mogą być przeszukiwane pod kątem klonów wiążących antygen, jak opisano w Winter i in., Ann. Rev. Immunol., 12: (1994). Biblioteki ze źródeł immunizowanych dostarczają przeciwciała o wysokim powinowactwie do immunogenu, bez konieczności budowania komórek hybrydoma. Zamiennie, może być sklonowany zestaw bez uprzedniej immunizacji ( naiwny ), celem dostarczenia pojedynczego źródła ludzkich przeciwciał dla szerokiego zakres antygenów oraz auto-antygenów bez jakiejkolwiek immunizacji, jak opisano przez Griffiths i współpracowników, EMBO J, 12: (1993). W końcu, naiwne biblioteki mogą być także wytworzone syntetycznie poprzez klonowanie segmentów nierearanżowanego genu V z komórek macierzystych, z zastosowaniem starterów PCR zawierających losowe sekwencje do kodowania wysoce zmiennych regionów CDR3 i w celu dopełnienia rearanżacji in vitro, jak opisał Hoogenboom oraz Winter, J. Mol. Biol., 227: (1992). [0199] W niektórych przykładach wykonania, fag włókienkowy jest używany do eksponowania fragmentów poprzez fuzję do mniejszego białka płaszcza piii. Fragmenty przeciwciał mogą być eksponowane jako pojedynczołańcuchowe fragmenty Fv, w których domeny VH oraz VL są połączone na tym samym łańcuchu polipeptydowym za pomocą elastycznej przekładki polipeptydowej, np. jak opisał Marks i in., J. Mol. Biol., 222: (1991) lub jako fragmenty Fab, w których jeden łańcuch jest poddany fuzji do piii, a drugi jest wydzielany do przestrzeni peryplazmatycznej komórki gospodarza bakteryjnego, gdzie złożona w całość struktura Fab-białko płaszcza, staje się widoczna na powierzchni faga poprzez eksponowanie kilku białek płaszcza typu dzikiego, jak opisał np. Hoogenboom i in., Nucl. Acids Res., 19: (1991). [0200] Ogólnie kwasy nukleinowe kodujące fragmenty genów przeciwciał są otrzymywane z komórek immunologicznych zebranych od ludzi lub zwierząt. Jeśli pożądana jest biblioteka tendencyjna na korzyść klonów anty-tat226, przeprowadza się u danego osobnika immunizację TAT226, w celu wygenerowania odpowiedzi ze strony przeciwciał, a komórki śledziony i/lub krążące komórki B lub inne limfocyty krwi obwodowej (PBL) zbiera się, w celu utworzenia biblioteki. W preferowanym przykładzie wykonania, bibliotekę fragmentów genów ludzkich przeciwciał, tendencyjną na korzyść klonów anty-tat226, uzyskuje się poprzez generowanie odpowiedzi przeciwciała anty-tat226 u myszy transgenicznych,

57 obciążonych szeregiem funkcjonalnych genów ludzkiej immunoglobuliny (i pozbawionych układu wewnętrznej produkcji funkcjonalnych przeciwciał), tak, że immunizacja TAT226 podnosi produkcję komórek B wytwarzających ludzkie przeciwciała przeciwko TAT226. Generowanie myszy transgenicznych, produkujących ludzkie przeciwciała, jest opisane poniżej. [0201] Dodatkowe wzbogacenie reaktywnej pod kątem anty-tat226 populacji komórek może być osiągnięte za pomocą odpowiedniej procedury przeszukiwania, w celu wyizolowania komórek B, wykazujących ekspresję przeciwciała TAT226 wiążącego się specyficznie do błony, np. poprzez separację komórek wykorzystującą chromatografię powinowactwa TAT226 lub adsorpcję komórek do TAT226 znakowanego fluorochromem, a następnie cytometrię przepływową, metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS). [0202] Zamiennie, użycie komórek śledziony i/lub komórek B lub innych PBL od immunizowanych dawców zapewnia lepszą reprezentację możliwego zestawu przeciwciał, a także pozwala na konstrukcję biblioteki przeciwciał z wykorzystaniem gatunków zwierzęcych (ludzkiego lub innych), w których TAT226 nie jest antygenowe. Dla bibliotek inkorporujących in vitro konstrukty genów przeciwciał, komórki macierzyste są zbierane od danego osobnika, w celu dostarczenia kwasów nukleinowych kodujących nierearanżowane segmenty genów przeciwciała. Komórki immunologiczne, będące przedmiotem zainteresowania, mogą być dostarczone przez różne gatunki zwierząt, takich jak człowiek, mysz, szczur, zajęczaki, psy, koty, świnie, bydło, konie oraz gatunki ptasie itd. [0203] Kwasy nukleinowe kodujące zmienne segmenty genów przeciwciała (włączając segmenty VH oraz VL) są odzyskiwane z komórek, będących przedmiotem zainteresowania oraz amplifikowane. W przypadku rearanżacji bibliotek genów VH oraz VL, pożądane DNA może być uzyskane za pomocą izolacji genomowego DNA lub mrna z limfocytów, a następnie łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) ze starterami pasującymi do końców 5 oraz 3 rearanżowanych genów VH oraz VL, jak opisano w Orlandi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: (1989), tym samym tworząc różne zestawów genów V do ekspresji. Geny V mogą być amplifikowane z cdna oraz genomowego DNA, ze starterami antysensownymi na końcu 5 eksonu kodującego dojrzałą domeną V oraz starterami sensownymi, opartymi o segment J, jak opisał Orlandi i in. (1989) oraz Ward i in., Nature, 341: (1989). Jakkolwiek, do amplifikacji z cdna, startery antysensowne mogą być oparte o ekson wiodący, jak opisano w Jones i in. Biotechnol., 9: (1991), a startery sensowne znajdować się w obrębie regionu stałego, jak opisano w Sastry i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: (1989). W celu zmaksymalizowania komplementarności, można zastosować startery degenerowane, jak opisano w Orlandi i in. (1989) lub Sastry i in. (1989). W niektórych przykładach wykonania, zróżnicowanie bibliotek jest maksymalizowane za pomocą starterów PCR, nacelowanych na każdą rodzinę genu V, w celu amplifikacji wszystkich dostępnych aranżacji VH oraz VL, obecnych w próbkach kwasów nukleinowych immunocytów, np. jak opisano w metodzie Marksa i in. J. Mol. Biol., 222: (1991) lub jak opisano w metodzie Orum i in., Nucleic Acids Res., 21: (1993). Celem klonowania zamplifikowanych DNA do wektorów ekspresyjnych, można

58 wprowadzić rzadkie miejsca restrykcyjne do wnętrza starterów PCR, jako znacznik na jednym końcu, jak opisano przez Orlandi i in. (1989) lub poprzez dalszą amplifikację PCR ze znakowanymi starterami, jak opisano przez Clackson i in., Nature, 352: (1991). [0204] Zestawy rearanżowanych syntetycznie genów V mogą pochodzić z in vitro, z segmentów genu V. Większość segmentów VH ludzkich genów zostało sklonowanych oraz zsekwencjonowanych (opisano przez Tomlinson i in., J. Mol. Biol., 227: (1992)), oraz mapowanych (opisano w Matsuda i in., Nature Genet., 3: (1993); te sklonowane segmenty (włączając główne konformacje pętli H1 oraz H2) mogą być zastosowane do wytwarzania różnych zestawów genów VH, ze starterami PCR kodującymi pętle H3 różnych sekwencji oraz długości, jak opisał Hoogenboom oraz Winter, J. Mol. Biol., 227: (1992). Zestawy VH mogą być także stworzone z całej różnorodności sekwencji skoncentrowanych w długiej pętli H3 pojedynczej długości, jak opisał Barbas i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: (1992). Ludzkie segmenty Vκ oraz Vλ zostały sklonowane oraz zsekwencjonowane (opisano przez Williams oraz Winter, Eur. J. Immunol., 23: (1993)) i mogą być wykorzystane do tworzenia zestawów syntetycznych łańcuchów lekkich. Po amplifikacji DNA kodującego gen V, segmenty genu V mogą być rearanżowane in vitro zgodnie z metodami Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: (1992). [0205] Zestawy fragmentów przeciwciał mogą być budowane poprzez kombinacje na kilka sposobów zestawu genów VH oraz VL. Każdy zestaw może być utworzony w innych wektorach, a wektory mogą być rekombinowane in vitro, np. jak opisano w Hogrefe i in. Gene, 128: (1993) lub in vivo poprzez infekcje kombinatoryczne, np. system loxp, opisany przez Waterhouse i in., Nucl. Acids Res., 21: (1993). Podejście poprzez rekombinację in vivo wykorzystuje dwułańcuchową naturę fragmentów Fab, w celu pokonania ograniczenia rozmiaru biblioteki, narzuconego przez efektywność transformacji E. coli. Naiwne zestawy VH oraz VL są klonowane osobno, jeden do fagemidu, a drugi do wektora fagowego. Dwie biblioteki są następnie łączone poprzez infekcję fagową bakterii zakażonej fagemidem tak, że każda komórka zawiera inna kombinację a rozmiar biblioteki jest ograniczony tylko liczbą komórek obecnych (około klonów). Obydwa wektory zawierają in vivo sygnały rekombinacji tak, że geny VH oraz VL są rekombinowane na pojedynczym replikonie oraz wspólnie pakowane do wirionów fagowych. Te olbrzymie biblioteki dostarczają ogromną liczbę różnych przeciwciał o wysokim powinowactwie (K d -1 około 10-8 M). [0206] Zamiennie, zestawy mogą być klonowane sekwencyjnie do tego samego wektora, jak np. opisano w Barbas i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: (1991) lub łączone poprzez PCR, a następnie klonowane, jak opisano np. w Clackson i in., Nature, 352: (1991). Technikę łączenia poprzez PCR można także wykorzystywać w celu połączenia DNA VH oraz VL z DNA kodującym giętkie polipeptydy łącznikowe, w celu utworzenia zestawów pojedynczołańcuchowych Fv(scFv). W jeszcze innej technice, montaż wewnątrzkomórkowy PCR jest stosowany do łączenia genów VH oraz VL w limfocytach za pomocą PCR, a następnie klonowania zestawu połączonych genów, jak opisał Embleton i in., Nucl. Acids Res., 20: (1992).

59 [0207] Przeciwciała produkowane przez naiwne biblioteki (naturalne lub syntetyczne) mogą posiadać umiarkowane powinowactwo (K d -1 od około 10 6 do 10 7 M -1 ), ale dojrzewanie powinowactwa może być także naśladowane in vitro poprzez konstruowanie i ponowną selekcję z wtórnych bibliotek, jak opisano przez Winter i in. (1994). Na przykład, mutacje mogą być wprowadzane in vitro w sposób losowy poprzez zastosowanie podatnej na błędy polimerazy (opisano przez Leung i in., Technique, 1: (1989)) w metodzie Hawkins i in., J. Mol. Biol., 226: (1992) lub w metodzie Gram i in. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: (1992). Ponadto, dojrzewanie powinowactwa można prowadzić przez losowe mutowanie jednego lub większej liczby CDRów, np. za pomocą PCR ze starterami niosącymi losowe sekwencje obejmujące CDRy będące przedmiotem zainteresowania, w wyselekcjonowanych pojedynczych klonach Fv oraz przeszukując celem znalezienia klonów o wyższym powinowactwie. WO (opublikowany 14 marca 1996) opisuje sposób indukcji metagenezy w regionie determinującym komplementarność łańcucha lekkiego immunoglobuliny, w celu stworzenia biblioteki genów łańcucha lekkiego. Inne skuteczne podejście polega na rekombinacji domen VH lub VL wyselekcjonowanych za pomocą prezentacji fagowej z zestawami naturalnie występujących wariantów domeny V, otrzymanych od nieimmunizowanych dawców oraz poddanych przeszukiwaniu celem uzyskania wyższego powinowactwa w kilku turach przebudowy łańcucha, jak opisano przez Marks i in., Biotechnol., 10: (1992). Ta technika umożliwia produkcję przeciwciał oraz fragmentów przeciwciał o powinowactwie około 10-9 lub mniej. [0208] Przeszukiwanie bibliotek można prowadzić za pomocą różnych technik, znanych w dziedzinie. Na przykład TAT226 może być zastosowane do pokrycia studzienek płytki adsorpcyjnej, eksprymowane na komórkach gospodarza umieszczonych na płytkach adsorpcyjnych lub zastosowane w sortowaniu komórek lub też koniugowane z biotyną w celu wychwytywania kulek pokrywanych streptawidyną lub użyte w dowolnej innej metodzie uwidaczniania bibliotek fagowych. [0209] Próbki bibliotek fagowych są kontaktowane z unieruchomionym TAT226, w warunkach odpowiednich dla wiązania przynajmniej części cząstek faga do adsorbenta. Normalnie, warunki, w tym ph, siłę jonową, temperaturę i tym podobne, ustala się tak, aby naśladować warunki fizjologiczne. Fagi związane do fazy stałej przemywa się i poddaje elucji kwasem, jak opisał np. Barbas i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: (1991) lub zasadą, jak opisał np. Marks i in., J. Mol. Biol., 222: (1991) lub antygenem kompetycyjnym TAT226, jak np. w procedurze podobnej do metody współzawodnictwa antygenowego, Clackson i in., Nature, 352: (1991). Fagi mogą być wzbogacone krotnie w pojedynczej rundzie selekcji. Ponadto, wzbogacone fagi mogą rosnąć w hodowlach bakteryjnych i być poddawane dalszym turom selekcji. [0210] Skuteczność selekcji zależy od wielu czynników, włączając kinetykę dysocjacji podczas odpłukiwania oraz to, czy wiele fragmentów przeciwciała na pojedynczym fagu może jednocześnie oddziaływać z antygenem. Przeciwciała z szybką kinetyką dysocjacji (i słabymi powinowactwami wiązania) mogą być zachowane poprzez zastosowanie krótkich płukań, prezentację fagów multiwalentnych oraz wysoką gęstość pokrywania antygenem w fazie stałej. Wysoka gęstość nie tylko stabilizuje fagi podczas oddziaływań

60 multiwalentnych, ale faworyzuje ponowne związanie faga, który uległ dysocjacji. Selekcja przeciwciał z powolną kinetyką dysocjacji (i dobrym powinowactwem wiązania) może być promowana poprzez zastosowanie długich płukań i prezentację faga monowalentnego, jak opisał Bass i in., Proteins, 8: (1990) oraz w WO 92/09690, oraz niską gęstość pokrywania antygenem, jak opisał Marks i in., Biotechnol., 10: (1992). [0211] Możliwa jest selekcja pomiędzy przeciwciałami fagowymi o różnych powinowactwach, nawet w przypadku niewielkich różnic powinowactwa do TAT226. Jakkolwiek, losowe mutacje wybranego przeciwciała (jak np. przeprowadzono w niektórych technikach dojrzewania powinowactwa), może prowadzić do powstania wielu mutantów, bardziej wiążących się do antygenu i kilku z wyższym powinowactwem. Ograniczając TAT226, można wyeliminować konkurencję rzadkich fagów o wysokim powinowactwie. W celu zachowania wszystkich mutantów o wyższym powinowactwie, fagi mogą być inkubowane z nadmiarem biotynylowanego TAT226, ale z biotynylowanym TAT226 w stężeniu o niższej molarności niż docelowe powinowactwo molowe stałe dla TAT226. Fagi o wysokim powinowactwie wiązania mogą być następnie wychwytywane przez kulki paramagnetyczne pokrywane streptawidyną. Takie zrównoważone wychwytywanie pozwala na wyselekcjonowanie przeciwciał według ich powinowactwa wiązania, z czułością, która pozwala na izolację klonów mutantów o zaledwie dwukrotnie większym powinowactwie, z dużego nadmiaru fagów o mniejszym powinowactwie. Warunki zastosowane podczas płukania fagów związanych z fazą stałą również mogą być modulowane w celu różnicowania ze względu na kinetykę dysocjacji. [0212] Klony anty-tat226 mogą być selekcjonowane w oparciu o aktywność. W niektórych przykładach wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-tat226, które wiążą się do żywych komórek, wykazujących naturalną ekspresję TAT226. W jednym przykładzie wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-tat226, które blokują wiązanie pomiędzy ligandem TAT226 a TAT226, ale nie blokują wiązania pomiędzy ligandem TAT226 a drugim białkiem. Klony Fv odpowiadające takim przeciwciałom antytat226, mogą zostać wyselekcjonowane poprzez (1) izolowanie klonów anty-tat226 z biblioteki fagów, jak opisano powyżej oraz opcjonalnie amplifikowanie wyizolowanej populacji klonów fagowych poprzez wzrost populacji w odpowiednim gospodarzu bakteryjnym; (2) selekcjonowanie TAT226 oraz drugiego białka, przeciwko którym pożądana jest odpowiednio aktywność blokująca i nieblokująca; (3) adsorbowanie klonów fagowych anty-tat226 na unieruchomionym TAT226; (4) używanie nadmiaru drugiego białka w celu elucji niepożądanych klonów, które rozpoznają determinanty wiążące TAT226, które nakładają się lub są wspólne z determinantami wiążącymi drugiego białka oraz (5) elucję klonów, które pozostają zadsorbowane po etapie (4). Opcjonalnie, klony z pożądanymi własnościami blokującymi/nieblokującymi mogą być następnie wzbogacone poprzez powtórzenie raz lub więcej razy procedur selekcji, opisanych w niniejszym opisie. [0213] DNA kodujące przeciwciała monoklonalne, pochodzące z komórek hybrydoma lub fagów prezentujących klony Fv według wynalazku jest łatwo izolowany i sekwencjonowany za pomocą konwencjonalnych procedur (np. stosując startery oligonukleotydowe zaprojektowane specjalnie do amplifikacji regionów, będących przedmiotem zainteresowania,

61 kodujących łańcuchy ciężkie oraz lekkie z komórek hybrydoma lub na matrycy fagowego DNA). Po wyizolowaniu, DNA może być wprowadzany do wektorów ekspresyjnych, które są następnie transfekowane do komórek gospodarza takich, jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), czy komórki szpiczaka, które poza tym nie wytwarzają białka immunoglobuliny, w celu uzyskania syntezy pożądanych przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe na temat rekombinowanej ekspresji DNA kodującego przeciwciała u bakterii obejmują Skerraal i in., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) oraz Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992). [0214] DNA kodujący klony Fv według wynalazku może być łączony ze znanymi sekwencjami DNA, kodującymi stałe regiony łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego (np. odpowiednie sekwencje DNA mogą być uzyskane z Kabat i in., supra) w celu utworzenia klonów kodujących całą lub część długości łańcuchów ciężkich i/lub lekkich. Należy zauważyć, że regiony stałe jakiegokolwiek izotypu mogą być użyte do tego celu, włączając regiony stałe IgG, IgM, IgA, IgD oraz IgE, a te stałe regiony mogą być uzyskane z jakiegokolwiek gatunku, ludzkiego lub zwierzęcego. Klon Fv uzyskany z domeny zmiennej DNA jednego gatunku zwierzęcia (takiego jak człowiek) jest następnie poddawany fuzji do regionu stałego DNA innego gatunku zwierzęcego, w celu utworzenia sekwencji kodujących(-ej) hybrydy, pełnej długości łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego mieści się w definicji chimeryczny oraz hybrydowe przeciwciało, jak użyto w niniejszym opisie. W niektórych przykładach wykonania, klon Fv, pochodzący z ludzkiego zmiennego DNA, jest poddawany fuzji do regionu stałego ludzkiego DNA w celu utworzenia sekwencji kodujących(-ej) dla pełnej lub częściowej długości ludzkich łańcuchów ciężkich i/lub lekkich. [0215] DNA kodujący przeciwciało anty-tat226, pochodzące z komórek hybrydoma według wynalazku, może również zostać zmodyfikowany, na przykład poprzez substytucję sekwencji kodującej dla domen stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz łańcucha lekkiego, w miejsce homologicznej sekwencji mysiej pochodzącej z klonu komórek hybrydoma (np. jak w metodzie Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: (1984)). DNA kodujący przeciwciała lub fragmenty, pochodzące z komórek hybrydoma lub klonów Fv, może być następnie modyfikowany poprzez wiązanie kowalencyjne do immunoglobuliny, kodującej sekwencję całości lub części sekwencji kodujących polipeptydy nieimmunoglobulinowe. W ten sposób otrzymuje się przeciwciała chimeryczne lub hybrydowe mające specyficzność wiązania klonu Fv lub przeciwciał według wynalazku, pochodzących z klonów hybrydoma. 3. Wektory, komórki gospodarza oraz metody rekombinacji [0216] Do produkcji rekombinantów przeciwciał według wynalazku, izolowany jest kodujący je kwas nukleinowy, i podlega on insercji do replikowalnego wektora do dalszego klonowania (amplifikacji DNA) lub do ekspresji. DNA kodujące przeciwciało jest łatwo izolowane i sekwencjonowane za pomocą konwencjonalnych metod (np. poprzez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania się do genów kodujących ciężkie oraz lekkie łańcuchy przeciwciała). Dostępnych jest wiele wektorów. Wybór wektora zależy po części od komórek gospodarza, które mają być użyte. Ogólnie, komórki gospodarza

62 są albo pochodzenia prokariotycznego albo eukariotycznego (ogólnie ssaczego). Należy zauważyć, że do tego celu mogą być użyte stałe regony jakiegokolwiek izotypu, włączając regiony stałe IgG, IgM, IgA, IgD oraz IgE oraz, że takie regiony stałe można uzyskać z jakiegokolwiek gatunku, ludzkiego lub zwierzęcego. a) Generowanie przeciwciał z wykorzystaniem komórek prokariotycznych: (1) Konstrukcja wektora [0217] Sekwencje polinukleotydowe kodujące komponenty polipeptydów przeciwciała według wynalazku mogą być uzyskane za pomocą standardowych technik rekombinacji. Żądane sekwencje polinukleotydowe mogą być izolowane i poddane sekwencjonowaniu z komórek produkujących przeciwciała, takich jak komórki hybrydoma. Zamiennie, polinukleotydy mogą być syntetyzowane za pomocą syntezatora nukleotydów lub techniki PCR. Po otrzymaniu, sekwencje kodujące polinukleotydy, są wprowadzane do rekombinowanych wektorów, zdolnych do replikacji oraz ekspresji heterologicznych polinukleotydów u gospodarzy prokariotycznych. Wiele wektorów, które są dostępne i znane w danej dziedzinie, może być używanych do celów niniejszego wynalazku. Wybór odpowiedniego wektora będzie głównie zależeć od rozmiaru kwasów nukleinowych, które mają podlegać insercji do wektora, a zwłaszcza od komórek gospodarza, mających podlegać transformacji wektorem. Każdy wektor zawiera różne komponenty, zależnie od swej funkcji (amplifikacja lub ekspresja polinukleotydów heterologicznych albo obie) oraz jego kompatybilności z poszczególnymi komórkami gospodarza, w których rezyduje. Komponenty wektora ogólnie obejmują, bez ograniczania się do: miejsce inicjacji replikacji, selekcyjny gen markerowy, promotor, miejsce wiązania rybosomu (RBS), sekwencję sygnałową, insert heterologicznego kwasu nukleinowego oraz sekwencję terminacji transkrypcji. [0218] Ogólnie, wektory plazmidowe zawierające replikon oraz sekwencje kontrolne, pochodzące od gatunków kompatybilnych z komórkami gospodarza są stosowane w połączeniu z tymi gospodarzami. Wektor zwykle ma miejsce replikacji, jak również sekwencję markerowe, które są zdolne do dostarczenia selekcji fenotypowej w transformowanych komórkach. Na przykład, E. coli podlega zwykle transformacji za pomocą pbr322, plazmidu pochodzącego z gatunku E. coli. pbr322 zawiera geny kodujące oporność na ampicylinę (Amp) oraz tetracyklinę (Tet) i tym samym zapewnia łatwy sposób identyfikacji transformowanych komórek. pbr322, jego pochodne lub inne plazmidy mikrobiologiczne lub bakteriofagowe mogą także zawierać albo podlegać modyfikacji w celu posiadania promotorów, które mogą być użyte przez organizmy mikrobiologiczne do ekspresji białek endogennych. Przykłady pochodnych pbr322, użytych do ekspresji poszczególnych przeciwciał są opisane w szczegółach przez Carter i in., w patencie amerykańskim nr 5,648,237. [0219] Dodatkowo, wektory fagowe zawierające replikon oraz sekwencje kontrolne, które są kompatybilne z mikroorganizmem gospodarza, mogą być użyte jako wektory transformujące w połączeniu z tymi gospodarzami. Na przykład, bakteriofag, taki jak λgem.tm.-11, może być użyty do sporządzania rekombinowanego wektora, które może być użyty do transformacji podatnych komórek gospodarza, takich jak E. coli LE392.

63 [0220] Wektor ekspresyjny według wynalazku, może zawierać dwie lub więcej par promotorcistron, kodujących każdy z komponentów polipeptydowych. Promotor jest niepodlegającą translacji sekwencją regulatorową, zlokalizowaną powyżej (5') cistronu, który moduluje jego ekspresję. Promotory prokariotyczne zwykle dzielą się na dwie klasy, indukowalne oraz konstytutywne. Promotor indukowalny to promotor, który inicjuje podwyższony poziom transkrypcji cistronu, znajdującego się pod jego kontrolą, w odpowiedzi na zmiany warunków hodowli, np. obecność lub brak składnika odżywczego lub zmianę temperatury. [0221] Znana jest wielka liczba promotorów rozpoznanych przez różnorodne potencjalne komórki gospodarza. Wyselekcjonowany promotor może być połączony czynnościowo z cistronem DNA kodującym ciężki lub lekki łańcuch poprzez usunięcie promotora ze źródłowego DNA, poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi oraz wprowadzenie izolowanej sekwencji promotorowej do wektora według wynalazku. Można użyć zarówno natywną sekwencję promotora, jak i wiele heterologicznych promotorów do bezpośredniej amplifikacji i/lub ekspresji genów docelowych. W niektórych przykładach wykonania, stosowane są heterologiczne promotory, ponieważ one ogólnie pozwalają na lepszą transkrypcję oraz wyższą wydajność genów docelowych, podlegających ekspresji w porównaniu z promotorami natywnych polipeptydów docelowych. [0222] Promotory odpowiednie do użycia w gospodarzach prokariotycznych obejmują promotor PhoA, układy promotorów β-galaktamazy oraz laktozy, układ promotorowy tryptofanu (trp) oraz promotory hybrydowe, takie jak promotory tac lub trc. Jakkolwiek, inne promotory, które są funkcjonalne u bakterii (jak inne znane promotory bakteryjne lub fagowe) są również odpowiednie. Ich sekwencje nukleotydowe zostały opublikowane, tym samym umożliwiając specjalistom dokonanie funkcjonalnej ligacji do cistronu, kodującego docelowe łańcuchy lekkie oraz ciężkie (Siebenlist i in. (1980) Cell 20: 269) za pomocą łączników lub adapterów w celu dostarczenia każdego wymaganego miejsca restrykcyjnego. [0223] W jednym z aspektów wynalazku, każdy cistron wewnątrz rekombinowanego wektora zawiera komponent wydzielniczej sekwencji sygnałowej, która steruje translokacją eksprymowanego polipeptydu przez błonę. Ogólnie, sekwencja sygnałowa może być komponentem wektora lub może być częścią DNA polipeptydu docelowego, który jest wprowadzony do wektora. Sekwencja sygnałowa wybrana do celu niniejszego wynalazku powinna być taką, która jest rozpoznawana oraz obrabiana (tj. cięta przez peptydazę sygnałową) przez komórki gospodarza. Dla prokariotycznych komórek gospodarza, które nie rozpoznają ani nie obrabiają natywnej sekwencji sygnałowej polipeptydów hetrologicznych, sekwencja sygnałowa jest zastąpiona poprzez prokariotyczną sekwencję sygnałową wyselekcjonowaną, na przykład, z grupy składającej się z liderów fosfatazy alkalicznej, penicylinazy, Ipp lub termostabilnej enterotoksyny (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA oraz MBP. W jednym z przykładów wykonania wynalazku, sekwencje sygnałowe użyte w obu cistronach systemu ekspresyjnego są sekwencjami sygnałowymi STII lub ich wariantami. [0224] W innym aspekcie, produkcja immunoglobulin zgodnie z wynalazkiem, może mieć miejsce w cytoplazmie komórek gospodarza, a zatem nie wymaga obecności wydzielniczych sekwencji sygnałowych w każdym cistronie. W tym ujęciu, dochodzi do ekspresji łańcuchów lekkich oraz ciężkich immunoglobulin oraz fałdowania i składania w celu utworzenia

64 funkcjonalnych immunoglobulin w cytoplazmie. Niektóre szczepy gospodarza (np. szczepy E. coli trxb) zapewniają w cytoplazmie warunki, które sprzyjają formowaniu mostków dwusiarczkowych, umożliwiając tym samym prawidłowe fałdowanie i składanie eksprymowanych podjednostek białkowych. Proba oraz Pluckthun Gene, 159: 203 (1995). [0225] Przeciwciała według wynalazku mogą być także produkowane z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego, w którym stosunek ilościowy komponentów polipeptydowych, podlegających ekspresji, może być modulowany w celu zmaksymalizowania wydajności wydzielanych oraz prawidłowo składanych przeciwciał. Taka modulacja odbywa się przynajmniej w części przez jednoczesne modulowanie intensywności translacji komponentów polipeptydowych. [0226] Jedna z technik modulacji intensywności translacji została przedstawiona przez Simmons i in., w patencie amerykańskim nr 5,840,523. Wykorzystuje ona warianty regionu inicjacji translacji (TIR) w obrębie cistronu. Dla danego TIR, mogą być stworzone szeregi aminokwasowe lub warianty sekwencji kwasów nukleinowych, o różnej intensywności translacji, zapewniając tym samym wygodny sposób dostosowywania tego czynnika dla pożądanego poziomu ekspresji specyficznego łańcucha. Warianty TIR mogą być generowane poprzez konwencjonalne techniki mutagenezy, co skutkuje zmianami w kodonach, które mogą zmieniać sekwencje aminokwasowe. W niektórych przykładach wykonania, zmiany w sekwencjach nukleotydowych są ciche. Zmiany w obrębie TIR mogą obejmować, np., zmiany w liczbie lub odstępach sekwencji Shine-Dalgarno, wraz ze zmianami w sekwencji sygnałowej. Jedną z metod generowania zmutowanych sekwencji sygnałowych jest generowanie banku kodonów na początku sekwencji kodujących, które nie zmieniają sekwencji aminokwasowej sekwencji sygnałowej (tj. zmiany są ciche). To może być dokonane poprzez zmianę nukleotydu w trzeciej pozycji w każdym kodonie; dodatkowo, kilka aminokwasów, jak leucyna, seryna oraz arginina mają więcej pozycji pierwszych i drugich, co może czynić tworzenie banku bardziej złożonym. Ta metoda mutagenezy została opisana w szczegółach przez Yansura i in. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4: [0227] W jednym z przykładów wykonania, zestaw wektorów jest generowany z różnym zakresem sił dla każdego cistronu. Ten ograniczony zestaw zapewnia porównanie poziomów ekspresji każdego łańcucha, jak również wydajności produktów żądanego przeciwciała dla różnych kombinacji intensywności TIR. Intensywności TIR mogą być określone poprzez określenie ilościowe poziomu ekspresji odnośnego genu, jak opisano w szczegółach przez Simmons i in., w patencie amerykańskim nr 5,840,523. W oparciu o porównanie intensywności translacji, poszczególne żądane TIR są selekcjonowane w celu poddania kombinacji w konstruktach wektorów ekspresyjnych według wynalazku. [0228] Komórki gospodarza prokariotycznego, odpowiednie do ekspresji przeciwciał według wynalazku, obejmują Archaebacteria oraz Eubacteria, organizmy gram-dodatnie i gramujemne. Przykłady przydatnych bakterii obejmują Escherichia (np. E. coli), Bacilli (np. B. subtilis), gatunki Enterobacteria, Pseudomonas (np. P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, czy Paracoccus. W jednym z przykładów wykonania, zostały użyte komórki gram-ujemne. W jednym z

65 przykładów wykonania, zostały użyte komórki E. coli jako gospodarze według wynalazku. Przykłady szczepów E. coli obejmują szczep W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, tom 2 (Waszyngton, D.C.: American Society for Microbiology (1987), str ; ATCC Deposit No. 27,325) oraz ich pochodne, obejmujące szczep 33D3 o genotypie W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacl8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degp41 kanr (patent amerykański nr 5,639,635). Inne szczepy i ich pochodne, takie jak E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliλ 1776 (ATCC 31,537) oraz E. coli RV308 (ATCC 31,608) są również odpowiednie. Przykłady te są bardziej ilustratywne niż ograniczające. Metody konstruowania pochodnych którejkolwiek z wyżej wspomnianych bakterii, mających określone genotypy, są znane w dziedzinie oraz opisane np. przez Bass i in., Proteins, 8: (1990). Ogólnie koniecznym jest wyselekcjonowanie odpowiedniej bakterii, biorąc pod uwagę replikacyjność replikonu w komórkach bakterii. Na przykład gatunki E. coli, Serratia, czy Salmonella mogą być odpowiednio użyte jako gospodarze, gdy dobrze znane plazmidy, takie jak pbr322, pbr325, pacyc177, czy pkn410 są używane do zapewnienia replikonu. Zwykle komórki gospodarza powinny wydzielać minimalne objętości enzymów proteolitycznych, a dodatkowe inhibitory proteaz mogą być korzystnie wbudowane do hodowli komórkowych. (2) Produkcja przeciwciał [0229] Komórki gospodarza podlegają transformacji opisanymi wyżej wektorami ekspresyjnymi i są hodowane w pożywkach z tradycyjnymi składnikami odżywczymi, zmodyfikowanymi odpowiednio w celu indukcji promotorów, selekcjonowania transformantów lub amplifikacji genów kodujących żądane sekwencje. [0230] Transformacja oznacza wprowadzenie DNA do gospodarzy prokariotycznych w taki sposób, ze DNA jest replikowalne albo jako element pozachromosomalny lub na drodze integracji do chromosomu. W zależności od zastosowanych komórek gospodarza, transformacja jest prowadzona z wykorzystaniem technik standardowych, odpowiednich dla takich komórek. Traktowanie wapniem, z użyciem chlorku wapnia, jest ogólnie stosowane w przypadku komórek bakteryjnych, zawierających znaczną barierę ścian komórkowych. Inna metoda wykorzystuje do transformacji glikol polietylenowy/dmso. Jeszcze inną stosowaną metodą jest elektroporacja. [0231] Komórki prokariotyczne, używane do produkcji polipeptydów według wynalazku, rosną w pożywkach znanych w danej dziedzinie i odpowiednich dla hodowli komórkowych wybranych komórek gospodarza. Przykłady odpowiednich pożywek obejmują bulion Lurii (LB) plus niezbędne uzupełniające składniki odżywcze. W niektórych przykładach wykonania, pożywki zawierają także czynnik selekcyjny, wybrany w oparciu o budowę wektora ekspresyjnego, by w selektywny sposób umożliwić wzrost komórek prokariotycznych, zawierających wektor ekspresyjny. Na przykład, ampicylina jest dodawana do pożywki w celu umożliwienia wzrostu komórek, wykazujących ekspresję genu oporności na ampicylinę. [0232] Jakiekolwiek niezbędne suplementy, z wyjątkiem węgla, azotu oraz źródeł fosforanu nieorganicznego mogą także zostać włączone w odpowiednich stężeniach, wprowadzone pojedynczo lub w mieszaninie z innym suplementem czy pożywką, taką jak kompleksowe

66 źródło azotu. Opcjonalnie, pożywka hodowlana może zawierać jeden lub więcej czynników redukujących, wybranych z grupy składającej się z glutationu, cysteiny, cystaminy, tioglikolanu, ditioerytritolu oraz ditiotreitolu. [0233] Komórki gospodarza prokariotycznego są hodowane w odpowiednich temperaturach. W niektórych przykładach wykonania, dla wzrostu E. coli, temperatury wzrostu wahają się od około 20 C do około 39 C; od około 25 C do około 37 C lub około 30 C. ph pożywki może być w zakresie od około 5 do około 9, głównie w zależności od organizmu gospodarza, W niektórych przykładach wykonania, dla E. coli ph jest od około 6,8 do około 7,4 lub około 7,0. [0234] Jeśli w wektorze ekspresyjnym według wynalazku użyto promotor indukowalny, ekspresja białka jest indukowana w warunkach odpowiednich dla aktywacji promotora. W jednym aspekcie wynalazku, promotory PhoA są wykorzystane do kontrolowania transkrypcji polipeptydów. Zgodnie z tym, transformowane komórki gospodarza są hodowane w pożywce ograniczającej fosforan, celem indukcji. W niektórych przykładach wykonania, pożywką ograniczającą fosforany jest pożywka C. R. A. P. (patrz na przykład Simmonsi in., J. Immunol. Methods (2002), 263: ). Mogą być wykorzystane liczne inne induktory, zgodnie z używanym konstruktem wektora, jak to jest znane w dziedzinie. [0235] W jednym przykładzie wykonania, eksprymowane polipeptydy według niniejszego wynalazku, są wydzielane do i odzyskiwane z peryplazmy komórek gospodarza. Odzyskanie białka zwykle wiąże się z rozerwaniem mikroorganizmu, na ogół za pomocą takich środków jak szok osmotyczny, sonikacja lub liza. Po rozerwaniu komórek, szczątki komórek lub całe komórki mogą być usuwane za pomocą wirowania lub filtracji. Białka mogą być następnie oczyszczane, na przykład za pomocą jonowymiennej chromatografii powinowactwa. Zamiennie, białka mogą być przenoszone do pożywki hodowlanej i w niej izolowane. Komórki mogą być usuwane z hodowli, a nadsącz znad hodowli podlega filtrowaniu i zagęszczeniu w celu dalszego oczyszczania produkowanych białek. Polipeptydy ulegające ekspresji, mogą być następnie izolowane oraz identyfikowane z użyciem znanych powszechnie metod, takich jak poliakrylamidowa elektroforeza żelowa (PAGE) oraz hybrydyzacja typu Western. [0236] W jednym aspekcie wynalazku, produkcja przeciwciała jest prowadzona w dużych ilościach poprzez proces fermentacji. Do produkcji białek rekombinowanych dostępne są różne procedury fermentacji wsadowej z uzupełnianiem, prowadzone na dużą skalę. Fermentacje na dużą skalę mają co najmniej 1000 litrów pojemności, a w niektórych przykładach wykonania, około 1000 do litrów objętości. Te fermentory wykorzystują mieszadła wirowe w celu dystrybucji tlenu oraz składników odżywczych, zwłaszcza glukozy (preferowane źródło węgla/energii). Fermentacje na małą skalę dotyczą zwykle fermentacji w fermentorach nieprzekraczających około 100 litrów wydajności objętościowej i mogą mieścić się w zakresie od 1 litra do około 100 litrów. [0237] W procesie fermentacji, indukcja ekspresji białka zwykle jest zapoczątkowywana po tym, jak komórki wzrastały w odpowiednich warunkach do żądanej gęstości, np. OD550 około , na którym to etapie komórki znajdują się we wczesnej fazie stacjonarnej. Mogą być zastosowane liczne induktory, zgodnie z zastosowanymi konstruktami

67 wektorowymi, jak to jest znane w dziedzinie oraz opisane powyżej. Komórki mogą wzrastać przez krótsze okresy czasu przed indukcją. Komórki są zwykle poddawane indukcji przez około godzin, jakkolwiek można zastosować dłuższe lub krótsze czasy indukcji. [0238] W celu poprawy wydajności produkcji oraz jakości polipeptydów według wynalazku, można modyfikować różne warunki fermentacji. Na przykład, w celu poprawy prawidłowego składania oraz fałdowania wydzielanych polipeptydów przeciwciał, mogą być zastosowane dodatkowe wektory nadeksprymujące białka opiekuńcze, takie jak białka Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i/lub DsbG) lub FkpA (cis,transizomeraza peptydylopropylu, z aktywnością białka opiekuńczego) w celu kotransformacji komórek gospodarza prokariotycznego. Wykazano, że białka opiekuńcze ułatwiają prawidłowe fałdowanie oraz sprzyjają rozpuszczalności białek heterologicznych, produkowanych w komórkach gospodarza bakteryjnego (Chen i in. (1999) J. Biol. Chem. 274: ; Georgiou i in., patent amerykański nr 6,083,715; Georgiou i in.; patent amerykański nr 6,027,888; Bothmann oraz Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: ; Ramm oraz Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: ; Arie i in. (2001) Mol. Microbiol. 39: [0239] W celu zminimalizowania proteolizy eksprymowanych białek heterologicznych, (szczególnie tych, które są wrażliwe na proteolizę), w niniejszym wynalazku mogą być użyte niektóre szczepy gospodarzy, z wadliwą produkcją enzymów proteolitycznych. Na przykład, szczepy komórek gospodarza mogą być modyfikowane w celu wywołania mutacji genetycznych(-ej) w genach kodujących znane proteazy bakteryjne, jak proteza III, OmpT, DegP, Tsp, proteaza I, proteza Mi, proteaza V, proteaza VI oraz ich kombinacje. Dostępne są pewne szczepy E. coli, wadliwe pod względem produkcji proteaz, opisane np. przez Joly i in. (1998), supra; Georgiou i in., patent amerykański nr 5,264,365; Georgiou i in., patent amerykański nr 5,508,192; Hara i in., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996). [0240] W jednym przykładzie wykonania wynalazku, szczepy E. coli z wadliwą produkcją enzymów proteolitycznych, transformowane plazmidami wykazującymi nadekspresję jednego lub kilku białek opiekuńczych, są wykorzystane jako komórki gospodarza w systemie ekspresji według wynalazku. (3) Oczyszczanie przeciwciał [0241] W jednym przykładzie wykonania, białko przeciwciała produkowanego według niniejszego opisu, jest następnie oczyszczane w celu uzyskania preparatów, które są zasadniczo jednorodne, do dalszego zastosowania i prób. Mogą być wdrożone standardowe, znane w dziedzinie, metody oczyszczania białka. Następujące procedury są przykładami odpowiednich procedur oczyszczania: frakcjonowanie na kolumnach do immunopowinowactwa lub jonowymiennych, precypitacja etanolem, HPLC w układzie faz odwróconych, chromatografia na krzemionce lub na żywicy kationowymiennej, takiej jak DEAE, chromatoogniskowanie, SDS-PAGE, precypitacja siarczanem amonu, filtracja żelowa, z wykorzystaniem np. SEPHADEX G-75. [0242] W jednym z aspektów, do oczyszczania za pomocą immunopowinowactwa produktów przeciwciał wynalazku jest wykorzystywane Białko A unieruchomione na fazie stałej. Białko A jest białkiem ściany komórkowej, o masie 41 kd, ze Staphylococcus aureas, wiążącym się z wysokim powinowactwem do regionów Fc przeciwciała. Lindmark i in. (1983) J. Immunol.

68 Meth. 62:1-13. Faza stała, na której unieruchomione jest białko A, może być kolumną, posiadającą powierzchnię szklaną lub krzemionkową lub kolumną szklaną z porami szkła o kontrolowanej wielkości lub kolumną z kwasu krzemowego. W niektórych zastosowaniach, kolumna jest pokryta reagentem, takim jak glicerol, w celu ewentualnego zapobiegania przyczepianiu się niespecyficznych zanieczyszczeń. [0243] W pierwszym etapie oczyszczania, preparat pochodzący z hodowli komórkowej, jak opisano powyżej, może być nakładany na białko A unieruchomione na fazie stałej, w celu umożliwienia specyficznego wiązania przeciwciała, będącego przedmiotem zainteresowania, do białka A. Faza stała będzie przemywana w celu usunięcia zanieczyszczeń, wiążących się niespecyficznie do fazy stałej. W końcu przeciwciało, będące przedmiotem zainteresowania, jest odzyskiwane z fazy stałej poprzez elucję. b) Generowanie przeciwciał z użyciem komórek gospodarza eukariotycznego [0244] Wektor do zastosowania w komórkach gospodarza eukariotycznego ogólnie zawiera jeden lub więcej następujących nieograniczających komponentów: sekwencja sygnałowa, miejsce inicjacji replikacji, jeden lub więcej genów markerowych, element wzmacniający, promotor, sekwencja terminacji transkrypcji. (1) Komponent sekwencji sygnałowej [0245] Wektor do zastosowania w komórce gospodarza eukariotycznego może także zawierać sekwencję sygnałową lub inne polipeptydy posiadające miejsca specyficznego cięcia na końcu N dojrzałego białka lub polipeptydu, będącego przedmiotem zainteresowania. Wybrana heterologiczna sekwencja sygnałowa może być taką, która będzie rozpoznana i poddana obróbce (tj. cięta przez peptydazę sygnałową) przez komórkę gospodarza. Przy ekspresji w komórce ssaczej, dostępne są ssacze sekwencje sygnałowe, jak również wirusowe lidery wydzielania, na przykład sygnał z Herpes simplex (wirusa opryszczki) gd. DNA dla takiego regionu prekursorowego podlega ligacji w ramce odczytu do DNA kodującego przeciwciało. (2) Miejsce inicjacji replikacji [0246] Ogólnie, komponent miejsca inicjacji replikacji nie jest konieczny dla ssaczych wektorów ekspresyjnych. Na przykład, miejsce inicjacji replikacji SV40 może być zwykle użyte tylko dlatego, że zawiera wczesny promotor. (3) Selekcja komponentu genu [0247] Wektory ekspresyjne oraz do klonowania mogą zawierać gen selekcyjny, określany również jako marker selekcyjny. Typowy wybór genów kodujących białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, neomycynę, metotreksat czy tetracyklinę, (b) uzupełniają braki auksotroficzne, w stosownych przypadkach lub (c) dostarczają substancje odżywcze niedostępne ze złożonych pożywek. [0248] Jeden z przykładów schematu selekcji wykorzystuje lek do zatrzymania wzrostu komórki gospodarza. Te komórki, które uległy pomyślnej transformacji heterologicznym genem, produkują białko nadające oporność na lek i w ten sposób mogą przetrwać reżim selekcji. Przykłady takich selekcji dominujących opierają się na lekach: neomycynie, kwasie mykofenolowym oraz higromycynie. [0249] Inne przykłady odpowiednich markerów selekcyjnych dla komórek ssaczych to takie, które umożliwiają identyfikację komórek kompetentnych (zdolnych) do przyjęcia kwasu

69 nukleinowego przeciwciała, jak DHFR, kinaza tymidynowa, metalotioneina I i II, geny metalotionein preferencyjnie od naczelnych, deaminaza adenozyny, dekarboksylaza ornityny itd. [0250] Na przykład, w niektórych przykładach wykonania, komórki poddane transformacji z genem selekcji DHFR są najpierw identyfikowane poprzez hodowanie wszystkich transformantów w pożywce hodowlanej, zawierającej metotreksat (Mtx), będący antagonistą kompetycyjnym DHFR. W niektórych przykładach wykonania, odpowiednią komórką gospodarza, gdy stosuje się DHFR dzikiego typu jest linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), pozbawiona aktywności DHFR (np. ATCC CRL-9096). [0251] Zamiennie, komórki gospodarza (szczególnie gospodarza dzikiego typu, zawierające endogenny DHFR), transformowane lub kotransformowane sekwencjami DNA kodującymi przeciwciało, białkiem DHFR dzikiego typu oraz innym markerem selekcyjnym, takim jak 3'-fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH), mogą być selekcjonowane na podstawie wzrostu komórkowego w pożywce zawierającej czynnik selekcji dla markera selekcyjnego, taki jak antybiotyk aminoglikozydowy, np. kanamycynę, neomycynę czy G418. Patrz patent amerykański nr 4,965,199. (4) Komponent promotora [0252] Wektory ekspresyjne i do klonowania często zawierają promotor, który jest rozpoznawany przez organizm gospodarza i jest funkcjonalnie związany z kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd, będący przedmiotem zainteresowania (np. przeciwciało). Znane są sekwencje promotora dla eukariontów. Na przykład, praktycznie wszystkie geny eukariotyczne mają region bogaty w AT, zlokalizowany w przybliżeniu 25 do 30 zasad w górę od miejsca, w którym rozpoczyna się transkrypcja. Inną sekwencją, znajdywaną 70 do 80 zasad w górę od miejsca startu transkrypcji wielu genów, jest region CNCAAT, gdzie N może być dowolnym nukleotydem. Na końcu 3' większości genów eukariotycznych znajduje się sekwencja AATAAA, która może być sygnałem dla addycji ogona poli-a do końca 3' kodującej sekwencji. W niektórych przykładach wykonania, którakolwiek z lub wszystkie te sekwencje mogą być odpowiednio wprowadzone do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych. [0253] Transkrypcja z wektorów w ssaczych komórkach gospodarza jest kontrolowana, na przykład przez promotory uzyskane z genomów wirusów takich, jak wirus polioma, wirus ptasiej ospy, adenowirus (taki jak Adenowirus 2), bydlęcy wirus brodawczaka, ptasi wirus mięsaka, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby typu B, wirus Simian 40 (SV40), z heterologicznych promotorów ssaczych, np. promotora aktyny lub promotora immunoglobuliny, z promotorów szoku cieplnego, pod warunkiem, ze takie promotory są kompatybilne z systemami komórek gospodarza. [0254] Wczesne oraz późne promotory wirusów SV40 są otrzymywane w dogodny sposób jako fragment restrykcyjny SV40, które również zawiera wirusowe miejsce inicjacji replikacji SV40. Bezpośredni wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa jest dogodnie otrzymywany jako fragment restrykcyjny HindIII E. System ekspresji DNA w ssaczych komórkach gospodarza, stosujący jako wektor bydlęcy wirus brodawczaka, jest opisany w

70 patencie amerykańskim nr 4,419,446. Modyfikację tego systemu opisano w patencie amerykańskim nr 4,601,978. Zobacz także Reyes i in., Nature 297: (1982), opisujący ekspresję cdna ludzkiego β-interferonu w komórkach mysich pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej z wirusa opryszczki Herpes simplex. Zamiennie, długie powtórzenia końcowe wirusa mięsaka Rousa, mogą być użyte jako promotor. (5) Komponent elementu wzmacniającego [0255] Transkrypcja DNA kodującego przeciwciało niniejszego wynalazku przez wyższe eukarionty, jest często podwyższana poprzez włączenie sekwencji wzmacniającej do wektora. Znanych jest teraz wiele sekwencji wzmacniających z genów ssaczych (globina, elastaza, albumina, α-fetoproteina oraz insulina). Typowo, jakkolwiek, stosuje się wzmacniacze (enhancery) z wirusa komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują enhancer SV40 z późnej strony miejsca inicjacji replikacji ( par zasad), enhancer wczesnego promotora cytomegalowirusa, enhancer polioma z późnej strony miejsca inicjacji replikacji oraz enhancery adenowirusowe. Zobacz także Yaniv, Nature 297: (1982), opisujące elementy enhancerowe do aktywacji promotorów eukariontów. Enhancer może być włączony do wektora w pozycji 5' lub 3' wobec sekwencji kodującej polipeptyd przeciwciała, ale jest zwykle zlokalizowany po stronie 5' od promotora. (6) Komponenty terminacji transkrypcji [0256] Wektory ekspresyjne, użyte w komórkach gospodarza eukariotycznego, mogą także zawierać sekwencje niezbędne do terminacji transkrypcji oraz do stabilizacji mrna. Takie sekwencje są powszechnie dostępne na końcach 5' oraz, rzadko 3', niepodlegających translacji regionów eukariotycznych lub wirusowych DNA lub cdna. Regiony te zawierają segmenty nukleotydów, transkrybowanych jako fragmenty poliadenylowane w niepodlegających translacji częściach mrna kodującego przeciwciało. Jednym przydatnym komponentem terminacji transkrypcji jest region poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu. Patrz WO 94/11026 oraz wektor ekspresyjny, ujawnione w niniejszym opisie. (7) Selekcja oraz transformacja komórek gospodarza [0257] Komórki gospodarza, odpowiednie do klonowania lub ekspresji DNA w wektorach, obejmują w niniejszym opisie komórki wyższych eukariontów, włączając komórki kręgowców. Propagacja komórek kręgowców w hodowlach (hodowlach tkankowych) stała się rutynową procedurą. Przykładami przydatnych linii komórek ssaczych są linia nerki małp CV1, transformowana przez SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia ludzkich komórek embrionalnych nerki (293 lub komórki 293 subklonowane w celu wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i in., J. Gen Virol. 36: 59 (11977)); komórki nerki młodych chomików (BHK, ATCC CCL 10); komórki jajnika chomika chińskiego/-dhfr (CHO, Urlaub i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mysie komórki Sertoliego (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: (1980)); komórki nerki małp (CV1 ATCC CCL 70); komórki nerki afrykańskiej małpy zielonej (VERO-76, ATCC CRL-1587); komórki ludzkiego raka szyjki macicy (HELA, ATCC CCL 2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuca (W138, ATCC

71 CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); mysie komórki guza sutka (MMT , ATCC CCL51); komórki TRI (Mather i in., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: (1982)); komórki MRC 5; komórki FS4 oraz ludzka linia komórek raka wątroby (Hep G2). [0258] Komórki gospodarza są transformowane opisanymi powyżej wektorami ekspresyjnymi lub do klonowania, do produkcji przeciwciał oraz hodowane w pożywkach z tradycyjnymi składnikami odżywczymi, odpowiednio modyfikowanych w celu indukowania promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów kodujących żądane sekwencje. (8) Hodowanie komórek gospodarza [0259] Komórki gospodarza, użyte do produkcji przeciwciał według niniejszego wynalazku, mogą być hodowane w różnych pożywkach. Komercyjnie dostępne pożywki takie, jak Ham s F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) oraz Dulbecco s Modified Eagle s Medium ((DMEM), Sigma) są odpowiednie do hodowania komórek gospodarza. Dodatkowo którakolwiek z pożywek opisanych przez Ham i in., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes i in., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patenty amerykańskie o numerach 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655 lub 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195 lub patent amerykański złożony ponownie 30,985, może być zastosowana jako pożywka do hodowli komórek gospodarza. Którakolwiek z tych pożywek może być wzbogacona, jeśli to konieczne, hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostu (takimi jak insulina, transferyna czy epidermalny czynnik wzrostu), solami (takimi jak chlorek sodu, wapnia, magnezu oraz fosforan), buforami (jak HEPES), nukleotydami (jak adenozyna oraz tymidyna), antybiotykami (jak GENTAMYCIN ), mikroelementami (zdefiniowanymi jako związki nieorganiczne często obecne w końcowych stężeniach w zakresie mikromolowym) oraz glukozą lub równoważnymi źródłami energii. Jakiekolwiek inne suplementy mogą także być włączone w odpowiednich stężeniach, znanych specjalistom w danej dziedzinie. Warunki hodowli, takie jak temperatura, ph i tym podobne, są tymi stosowanymi wcześniej w odniesieniu do komórek gospodarza, wyselekcjonowanych w celu ekspresji, i będą oczywiste dla specjalistów. (9) Oczyszczanie przeciwciała [0260] Podczas korzystania z technik rekombinacji, przeciwciało może być produkowane wewnątrzkomórkowo lub bezpośrednio wydzielane do pożywki. Jeśli przeciwciało jest produkowane wewnątrzkomórkowo, w pierwszym etapie, zanieczyszczenia nierozpuszczone, albo komórek gospodarza albo uległych lizie fragmentów, mogą być usunięte np. poprzez wirowanie lub ultrafiltrację. Kiedy przeciwciało jest wydzielane do pożywki, nadsącza z takich systemów ekspresyjnych mogą być najpierw zagęszczone z użyciem dostępnych komercyjnie filtrów zagęszczających białko, np. urządzenia do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pellicon. Inhibitor proteazy jak PMSF, może być włączony podczas którejkolwiek z powyższych czynności w celu zahamowania proteolizy, a antybiotyki mogą być włączone w celu zapobiegania wzrostowi przypadkowych zanieczyszczeń. [0261] Kompozycja przeciwciał przygotowanych z komórek może być oczyszczana, na przykład, za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej, elektroforezy żelowej, dializy oraz

72 chromatografii powinowactwa, z chromatografią powinowactwa jako dogodną techniką. Przydatność białka A jako liganda powinowactwa zależy od gatunku oraz izotypu domeny Fc immunoglobuliny obecnej w przeciwciałach. Białko A może być użyte do oczyszczania przeciwciał, które są oparte na ludzkich łańcuchach ciężkich γ1, γ2 lub γ4 (Lindmark i in., J. Immunol. Methods 62: 1-13 (1983)). Białko G jest rekomendowane do wszystkich mysich izotypów oraz ludzkich γ3 (Guss i in., EMBO J. 5: (1986)). Macierzą, do której przyłączony jest ligand powinowactwa, może być agaroza, ale dostępne są także inne macierze. Stabilne mechanicznie macierze, jak pory szklane o kontrolowanej wielkości lub poli(styrenodiwinylo)benzen pozwalają na szybszy przepływ i krótsze czasy obróbki, niż te, które można osiągnąć z agarozą. Kiedy przeciwciało zawiera domenę CH3, do oczyszczania jest przydatna żywica Bakerbond ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Inne techniki oczyszczania białka, takie jak frakcjonowanie na kolumnach jonowymiennych, precypitacja etanolem, HPLC w układzie faz odwróconych, chromatografia na krzemionce, chromatografia na heparynie SEPHAROSE, chromatografia na żywicy aniono- lub kationowymiennej (jak kolumna z kwasem poliasparaginowym), chromatoogniskowanie, SDS-PAGE oraz precypitacja siarczanem amonu, są również dostępne w zależności od przeciwciała, które ma być odzyskane. [0262] Po każdym wstępnym procesie oczyszczania, mieszanina zawierająca przeciwciało, będące przedmiotem zainteresowania, oraz zanieczyszczenia, może być poddana dalszemu oczyszczaniu, na przykład poprzez chromatografię oddziaływań hydrofobowych w niskim ph z użyciem buforu do elucji w ph pomiędzy 2,5-4,5, korzystnie prowadzaną w niskich stężeniach soli (np. od około 0-0,25 M soli). [0263] Ogólnie, różne metodologie przygotowania przeciwciał do użytku w badaniach, do testowania oraz użytku klinicznego, są dobrze ugruntowane w dziedzinie, zgodnie z metodologiami opisanymi powyżej i/lub jak uznano przez specjalistów, za odpowiednie dla danego przeciwciała, będącego przedmiotem zainteresowania. C. Immuokoniugaty [0264] Wynalazek dostarcza także immunokoniugaty (zamiennie określane jako koniugaty lek-przeciwciało lub ADC ), zawierające jakiekolwiek z przeciwciał anty-tat226 według wynalazku, sprzężone z jednym lub większą liczbą czynników cytotoksycznych, takich jak czynnik chemoterapeutyczny, lek, czynnik hamowania wzrostu, toksyna (np. enzymatycznie aktywna toksyna pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, czy też jej fragmenty) lub izotop promieniotwórczy (radiokoniugat). [0265] Immunokoniugaty mogą być wykorzystane do miejscowego dostarczenia czynników cytotoksycznych, leków, które zabijają lub hamują wzrost lub proliferację komórek guza, w leczeniu nowotworów (Syrigos i Epenetos (1999) Anticancer Research 19: ; Niculescu-Duvaz i Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: ; patent amerykański nr 4,975,278). Immunokoniugaty umożliwiają celowane dostarczanie ugrupowań leku do guza oraz ich wewnątrzkomórkową akumulację w nim, tam gdzie systemowe podawanie leków niesprzężonych mogłoby skutkować niedopuszczalnymi poziomami toksyczności dla

73 komórek prawidłowych, jak również komórek guza, który ma być wyeliminowany (Baldwin i in., Lancet (15 marca 1986) str ; Thorpe (1985) Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review w Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications (A Pinchera i in.) str Zarówno przeciwciała monoklonalne jak i poliklonalne zostały opisane jako użyteczne w tych strategiach (Rowland i in., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87)). Leki stosowane w tych metodach obejmują daunomycynę, doksorubicynę, metotreksat oraz windezynę (Rowland i in., (1986) supra). Toksyny stosowane w koniugatach przeciwciało-toksyna obejmują toksyny bakteryjne, jak toksyna błonicy, toksyny roślinne jak rycyna, toksyny małocząsteczkowe jak geldanamycyna (Mandler i in. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): ; Mandler i in. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: ; Mandler i in. (2002) Bioconjugate Chem. 13: ), majtanzynoidy (EP ; Liu i in., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: ) oraz kalicheamycynę (Lode i in. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman i in. (1993) Cancer Res. 53: ). Toksyny mogą wywierać ich efekty cytotoksyczne poprzez mechanizmy obejmujące wiązanie tubuliny, wiązanie DNA lub inhibicję topoizomerazy. Niektóre leki cytotoksyczne wydają się być nieaktywne lub mniej aktywne, kiedy są sprzężone z dużymi przeciwciałami lub białkami receptorów ligandów. [0266] ZEVALIN (tiuksetan ibrytumomabu, Biogen/Idec) jest koniugatem przeciwciałoizotop promieniotwórczy, złożonym z mysiego przeciwciała monoklonalnego IgG1 kappa, skierowanego przeciwko antygenowi CD20 znajdowanemu na powierzchni prawidłowych oraz nowotworowych limfocytów B i izotopu promieniotwórczego 111In lub 90Y związanego łącznikiem-chelatorem tiomocznika (Wiseman i in. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman i in. (2002) Blood 99 (12): ; Witzig i in. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): ; Witzig i in. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15): ). Chociaż ZEVALIN wykazuje aktywność przeciwko komórkom B chłoniaka nieziarniczego (NHL), podawanie skutkuje ciężką i przewlekłą cytopenią u większości pacjentów. MYLOTARG (ozogamycyna gemtuzumabu, Wyeth Pharmaceuticals) koniugat przeciwciało-lek, złożony z przeciwciała hu CD33 połączonego z kalicheamycyną, został zatwierdzony w 2000 roku do leczenia ostrej białaczki szpikowej, poprzez iniekcje (Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686; US Patent Nos ; ; ; ; ; ; ; ). Kantuzumab, mertanzyna (Immunogen, Inc.), koniugat przeciwciało-lek, złożony z przeciwciała huc242 połączonego poprzez mostek dwusiarczkowy SPP z ugrupowaniem majtazynoidowym leku, DM1, wszedł do II fazy badań klinicznych w leczeniu nowotworów, które wykazują ekspresję CanAg, takich jak nowotwór jelita grubego, trzustki, żołądka i inne. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), koniugat przeciwciałolek, złożony z przeciwciała monoklonalnego przeciwko błonowemu antygenowi specyficznemu dla stercza (PSMA), związanego z ugrupowaniem majtazynoidowym leku, DM1, jest w trakcie opracowywania do potencjalnego leczenia guzów stercza. Peptydy aurystatynowe, aurystatyna, E (AE) oraz monometylaurystatyna (MMAE), syntetyczne analogi dolastatyny, zostały sprzężone z chimerycznymi przeciwciałami monoklonalnymi cbr96 (specyficznymi dla Lewis Y na nowotworach ) oraz cac10 (specyficznymi dla CD30

74 nowotworów przerzutowych krwi) (Doronina i in. (2003) Nature Biotechnol. 21(7): ) i są w trakcie badań nad zastosowaniem w leczeniu. [0267] W niektórych przykładach wykonania, immunokoniugat zawiera przeciwciało anty- TAT226 oraz czynnik chemoterapeutyczny lub inną toksynę. Czynniki chemoterapeutyczne użyteczne w generowaniu immunokoniugatów, są opisane w niniejszym opisie (przykłady powyżej). Toksyny aktywne enzymatycznie oraz ich fragmenty również mogą być zastosowane jak opisano w niniejszym opisie. [0268] W niektórych przykładach wykonania, immunokoniugat zawiera przeciwciało anty- TAT226 oraz jedną lub większą liczbę niskocząsteczek toksyn, włączając, ale nie ograniczając się do, niskocząsteczkowych leków, takich jak kalicheamycyna, majtanzynoid, dolastatyna, aurystatyna, trichotecen i CC1065 oraz pochodne tych leków, posiadające aktywność cytotoksyczną. Przykłady takich immunokoniugatów są omówione bardziej szczegółowo poniżej. 1. Przykładowe immunokoniugaty [0269] Immunokoniugat (lub koniugat przeciwciało-lek ( ADC )) według wynalazku może być o wzorze I, poniżej, w którym przeciwciało anty-tat226 jest sprzężone (tj. połączone kowalencyjnie) z jedną lub większą liczbą wyodrębnionych części cząsteczki leku (D) przez opcjonalny łącznik (L). Ab-(L-D)p I W związku z tym, przeciwciało anty-tat226 może być sprzężone z lekiem albo bezpośrednio albo poprzez łącznik. We wzorze I, p oznacza średnią liczbę ugrupowań leku na przeciwciało, która może się wahać, np. od około 1 do około 20 ugrupowań leku na przeciwciało, a w niektórych przykładach wykonania, od 1 do około 8 ugrupowań na przeciwciało. a) Przykładowe łączniki [0270] Łącznik może zawierać jeden lub więcej komponentów łącznika. Przykładowe komponenty łącznika obejmują 6-maleimidokaproil ( MC ), maleimidopropanoil ( MP ), walino-cytrulinę ( Val-Cit lub VC ), alanino-fenylaloalaninę ( Ala-Phe ), p-aminobenzyloksykarbonyl ( PAB ), 4-(2-pirydylotio)pentanian N-sukcynoimidylu ( SPP ), 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan N-sukcynoimidylu ( SMCC ) oraz (4-jodoacetylo)aminobenzoesan N-sukcynimidylu ( SIAB ). W stanie techniki znane są różne łączniki, z których niektóre omówiono poniżej. [0271] Łącznik może być łącznikiem rozszczepialnym, ułatwiającym uwalnianie leku w komórce. Na przykład, mogą być zastosowane: łącznik nietrwały w środowisku kwasowym (np. hydrazon), łącznik wrażliwy na proteazy (peptydazo-wrażliwy), łącznik fotolabilny, łącznik dimetylowy lub łącznik zawierający dwusiarczek (Chari i in., Cancer Research 52: (1992); patent amerykański nr 5,208,020).

75 [0272] W niektórych przykładach wykonania, komponent łącznika może zawierać podjednostkę rozciągliwą, która łączy przeciwciało z komponentem innego łącznika lub z wyodrębnioną częścią cząsteczki leku. Przykładowe podjednostki rozciągliwe są pokazane poniżej (przy czym linia falista wskazuje miejsce kowalencyjnego przyłączenia do przeciwciała): [0273] W niektórych przykładach wykonania, komponent łącznika może zawierać jednostkę aminokwasową. W jednym takim przykładzie wykonania, jednostka aminokwasowa pozwala

76 na rozszczepienie łącznika przez proteazę, ułatwiając w ten sposób uwalnianie leku z immunokoniugatu, po ekspozycji na proteazy wewnątrzkomórkowe, takie jak enzymy lizosomalne. Patrz np. Doronina i in. (2003) Nat. Biotechnol. 21: Przykładowe jednostki aminokwasowe obejmują, bez ograniczania się do: dipeptyd, tripeptyd, tetrapeptyd oraz pentapeptyd. Przykładowe dipeptydy obejmują: walino-cytrulinę (VC lub Val-Cit), alanino-fenyloalaninę (AF lub Ala-Phe); fenyloalanino-lizynę (FK lub Phe-Lys) lub N-metylo-walino-cytrulinę (Met-Val-Cit). Przykładowe tripeptydy obejmują: glicyno-walinocytrulinę (Gly-Val-Cit) oraz glicyno-glicyno-glicynę (Gly-Gly-Gly). Podjednostki aminokwasowe mogą zawierać reszty aminokwasowe, występujące naturalnie, jak również pomniejsze aminokwasy oraz analogi aminokwasów, niewystępujące naturalnie, takie jak cytrulina. Jednostki aminokwasowe mogą być zaprojektowane oraz zoptymalizowane ze względu na selektywność wobec rozkładu enzymatycznego przez poszczególne enzymy, np. proteazy związane z nowotworem, katepsynę B, C i D czy proteazę plazminy. [0274] W niektórych przykładach wykonania, komponent łącznika może zawierać podjednostkę odstępu, która łączy przeciwciało z ugrupowaniem leku albo bezpośrednio albo poprzez jednostkę rozciągliwą i/lub jednostkę aminokwasową. Jednostka łącznikowa może być autodestruktywna lub nie-autodestruktywna. Jednostka łącznikowa nie-autodestruktywna jest taką, w której część lub cała jednostka łącznikowa pozostaje związana z ugrupowaniem leku po rozkładzie enzymatycznym (np. proteolitycznym) ADC. Przykłady jednostek łącznikowych nie-autodestruktywnych obejmują, bez ograniczania się do: glicynową podjednostkę łącznikową oraz glicyno-glicynową jednostkę łącznikową. Analizowane są również inne kombinacje łącznikowych peptydów, wrażliwych na rozszczepienie enzymatyczne, specyficzne dla sekwencji. Na przykład, rozkład enzymatyczny ADC, zawierającego glicyno-glicynową jednostkę łącznikową, przez proteazę związaną z komórkami guza będzie skutkować uwalnianiem glicyno-glicynowego ugrupowania leku od pozostałej części ADC. W jednym takim przykładzie wykonania, glicyno-glicynowe ugrupowanie leku jest następnie poddawane odrębnemu etapowi hydrolizy w komórce guza, uwalniając w ten sposób glicyno-glicynową jednostkę łącznikową z ugrupowania leku. [0275] Autodestruktywna jednostka łącznikowa pozwala na uwalnianie ugrupowania leku bez etapu hydrolizy. W niektórych przykładach wykonania łącznikowa jednostka zawiera jednostkę p-aminobenzylową. W jednym takim przykładzie wykonania, alkohol p-aminobenzylowy jest przyłączony do jednostki aminokwasowej poprzez wiązanie amidowe, a pomiędzy alkoholem benzylowym a czynnikiem cytotoksycznym jest karbaminian, metylokarbaminian lub węglan. Patrz np. Hamann i in. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: W jednym przykładzie wykonania, jednostką odstępu jest p-aminobenzyloksykarbonyl (PAB). W niektórych przykładach wykonania, część fenylenowa jednostki p-aminobenzylu jest podstawiona Qm, gdzie Q oznacza -C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 alkil), -halogen, -nitro lub -cyjano; a m oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4. Przykłady autodestruktywnych jednostek łącznikowych obejmują dodatkowo, bez ograniczania się do: związki aromatyczne, które są elektronowo podobne do alkoholu p-aminobenzylowego (patrz np. US 2005/ A1), takie jak pochodne aminoimidazolo- 5-metanolu (Hay i in. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) oraz orto czy para

77 aminobenzyloacetale. Można wykorzystywać odstępy, które podlegają cyklizacji po hydrolizie wiązania amidowego, takie jak podstawione i niepodstawione amidy kwasu 4-aminomasłowego (Rodrigues i in., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); odpowiednio podstawione układy pierścieniowe bicyklo[2.2.1] oraz bicyklo[2.2.2] (Storm i in., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815) oraz amidy kwasu 2-aminofenylopropionowego (Amsberry i in., J. Org. Chem., 1990, 55; 5867). Usuwanie leków zawierających aminy, które są podstawione w pozycji α glicyny (Kingsbury i in., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) także są przykładami autodestruktywnych łączników przydatnych w ADC. [0276] W jednym przykładzie wykonania, jednostka łącznikowa oznacza rozgałęzioną jednostkę bis(hydroksymetylo)styrenu, która może być wykorzystana do wbudowywania i uwalniania licznych leków, jak pokazano poniżej: cięcie enzymatyczne 2 leki przy czym Q oznacza -C 1 -C 8 alkil, -O-(C 1 -C 8 alkil), -halogen, -nitro czy -cyjano; a m oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4; n oznacza 0 lub 1, a p oznacza zakresy od 1 do około 20. [0277] Łącznik może zawierać jeden lub więcej z powyższych komponenów łączników. W niektórych przykładach wykonania, łącznik jest jak pokazano w nawiasach w następującym wzorze II: w którym A jest jednostka rozciągliwą, oraz a jest liczbą całkowitą od 0 do 1; W oznacza jednostkę aminokwasową, a w jest liczbą całkowitą od 0 do 12; Y oznacza jednostkę odstępu, a y wynosi 0, 1 lub 2; a Ab, D i p są jak zdefiniowano powyżej we wzorze I. Przykładowe zastosowania takich łączników są opisane w patencie amerykańskim A1, który jest wyraźnie włączony do niniejszego opisu przez odniesienie. [0278] Przykładowe komponenty łączników oraz ich kombinacje są pokazane poniżej, w kontekście ADC ze wzoru II:

78 Val Cit lub VC [0279] Komponenty łączników, włączając jednostki: rozciągliwą, odstępu oraz jednostki aminokwasowe, mogą być syntetyzowane za pomocą metod znanych w dziedzinie tak, jak opisano w US A1. b) Przykładowe ugrupowania leku (1) Majtanzyna oraz majtanzynoidy

79 [0280] W niektórych przykładach wykonania, immunokoniugat zawiera przeciwciało według wynalazku sprzężone z jedną lub większą liczbą cząsteczek majtanzynoidów. Majtanzynoidy są inhibitorami mitotycznymi, które działają poprzez hamowanie polimeryzacji tubulin. Majtanzyna została po raz pierwszy wyizolowana ze wschodnioafrykańskiego krzewu Maytenus serrata (patent amerykański nr ). Następnie odkryto, że niektóre mikroorganizmy również wytwarzają majtanzynoidy, jak majtanzynol oraz estry C-3 majtanzynolu (patent amerykański nr 4,151,042). Syntetyczny majtanzynol oraz jego pochodne i analogi są przedstawione, np., w patentach amerykańskich nr 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663 oraz 4,371,533. [0281] Ugrupowania majtanzynoidowe leków są atrakcyjnymi ugrupowaniami lekowymi w koniugatach przeciwciało-lek, ponieważ są: (i) stosunkowo dostępne do otrzymania poprzez fermentację lub modyfikację chemiczną lub derywatyzację produktów fermentacji, (ii) przydatne do tworzenia pochodnych z grupami funkcyjnymi odpowiednimi do sprzęgania z przeciwciałami poprzez łączniki nie-dwusiarczkowe, (iii) trwałe w osoczu oraz (iv) skuteczne przeciwko licznym liniom komórek nowotworowych. [0282] Związki majtanzyny odpowiednie do zastosowania jako leki z ugrupowaniami majtanzynowymi są dobrze znane w danej dziedzinie i mogą być izolowane ze źródeł naturalnych zgodnie ze znanymi metodami lub produkowane z użyciem technik inżynierii genetycznej (patrz Yu i in. (2002) PNAS 99: ). Majtanzynol oraz analogi majtanzynolu mogą być także otrzymywane syntetycznie zgodnie ze znanymi metodami. [0283] Przykładowe ugrupowania majtanzynoidowe leków obejmują te mające zmodyfikowane pierścienie aromatyczne, takie jak C-19-dechloro (patent amerykański nr ) (sporządzone na drodze redukcji wodorku litowo-glinowego ansamytocyny P2); C-20-hydroksy (lub C-20-demetyl) +/-C-19-dechloro (patenty amerykańskielo oraz ) (sporządzone przez demetylację z użyciem Streptomyces lub Actinomyces, czy odchlorowywanie z użyciem LAH) oraz C-20-demetoksy, C-20-acyloksy (-OCOR), +/-dechloro (patent amerykański nr 4,294,757) (sporządzone przez acylowanie z użyciem chlorków acylu) oraz te mające modyfikacje w innych pozycjach. [0284] Przykładowe ugrupowania majtanzynoidowe leków obejmują także te mające modyfikacje takie, jak: C-9-SH (patent amerykański nr ) (sporządzone w reakcji majtanzynolu z H 2 S lub P 2 S 5 ); C-14-alkoksymetylo(demetoksy/CH 2 OR) (US ); C-14-hydroksymetyl lub acyloksymetyl (CH 2 OH lub CH 2 OAc) (patent amerykański nr ) (sporządzone z Nocardia); C-15-hydroksy/acyloksy (US ) (sporządzone drogą konwersji majtanzynolu przez Streptomyces); C-15-metoksy (patenty amerykańskie nr oraz ) (wyizolowano z Trewia nudlflora); C-18-N-demetyl (patenty amerykańskie nr oraz ) (sporządzony drogą demetylacji majtanzynolu przez Streptomyces) oraz 4,5-deoksy (US ) (sporządzone drogą redukcji trójchlorku tytanu/lah majtanzynolu).

80 [0285] Przykładowe wykonania reszt majtanzynoidowych leków obejmują: DM1; DM3 oraz DM4, mające struktury:

81 przy czym linie falowane wskazują połączenia kowalencyjne atomu siarki leku z łącznikiem (L) koniugatu przeciwciało-lek. Opisano HERCEPTIN (trastuzumab) połączony przez SMCC do DM1 (WO 2005/037992; US 2005/ A1). [0286] Inne przykładowe koniugaty przeciwciało-lek mają następujące struktury oraz skróty (w których Ab jest przeciwciałem, a p wynosi od 1 do około 8):

82 [0287] Przykładowe koniugaty przeciwciało-lek, gdzie DM1 jest połączony przez łącznik BMPEO z grupą tiolową przeciwciała, mają następującą strukturę oraz skróty:

83 w których Ab oznacza przeciwciało; n wynosi 0, 1 lub 2, a p wynosi 1, 2, 3 lub 4. [0288] Immunokoniugaty zawierające majtanzynoidy, metody ich otrzymywania oraz ich zastosowanie terapeutyczne przedstawiono np. w patentach amerykańskich nr 5,208,020, 5,416,064, US 2005/ A1 oraz w patencie europejskim EP B1, których ujawnienia są wyraźnie włączone do niniejszego opisu przez odniesienie. Liu i in. Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: (1996) opisuje immunokoniugaty zawierające majtanzynoid oznaczony jako DM1, połączony z przeciwciałem monoklonalnym C242, skierowanym przeciwko ludzkiemu rakowi okrężnicy i odbytnicy. Odkryto, że koniugat jest wysoce cytotoksyczny w stosunku do hodowanych komórek raka okrężnicy i odbytnicy, oraz że wykazuje aktywność przeciwnowotworową w testach wzrostu guza in vivo oraz in vitro. Chari i in. Cancer Research 52: (1992) opisują immunokoniugaty, w których majtanzynoid został sprzężony poprzez łącznik dwusiarczkowy z mysim przeciwciałem A7 wiążącym się do antygenu linii komórek ludzkiego raka jelita grubego albo do innego mysiego przeciwciała monoklonalnego TA.1, które wiąże onkogen HER-2/neu. Cytotoksyczność koniugatu TA.1-majtanzynonoid badano in vivo oraz in vitro na liniach komórkowych SK-BR-3 ludzkiego raka piersi, który wykazuje ekspresję antygenów powierzchniowych 3 x 10 5 HER-2 na komórkę. Koniugat leku osiąga stopień cytotoksyczności podobny do wolnego leku majtanzynoidowego, który może być podwyższony poprzez zwiększenie liczby cząsteczek majtanzynoidów na cząsteczkę przeciwciała. Koniugat maytanzynoidowy A7 wykazuje niską cytotoksyczność ogólnoustrojową u myszy. [0289] Koniugaty przeciwciało-majtanzynoid są otrzymywane przez łączenie chemiczne przeciwciała do cząsteczki majtanzynoidu, bez znacznego zmniejszenia aktywności biologicznej ani przeciwciała, ani cząsteczki majtanzynoidu. Patrz np. patent amerykański nr 5,208,020 (ujawnienie którego jest wyraźnie włączone do niniejszego opisu poprzez odniesienie). Średnio 3-4 cząsteczki majtanzynoidowe sprzężone na cząsteczkę przeciwciała wykazały skuteczność we wzmacnianiu cytoksyczności komórek docelowych, bez negatywnego wpływu na funkcję lub rozpuszczalność przeciwciała, chociaż należało się

84 spodziewać, że nawet jedna cząsteczka toksyny na przeciwciało będzie zwiększać cytotoksyczność w porównaniu z zastosowaniem niesprzężonego przeciwciała. Majtanzynoidy są dobrze znane w dziedzinie i mogą być syntetyzowane za pomocą znanych technik lub izolowane z naturalnych źródeł. Odpowiednie majtazynoidy są ujawniane, na przykład, w patencie amerykańskim nr 5,208,020 oraz innych patentowych i nieopatentowych publikacjach, do których są odniesienia powyżej. Preferowanymi majtanzynoidami są majtanzynol oraz analogi majtanzynolu, zmodyfikowane w pierścieniu aromatycznym lub innych pozycjach cząsteczki majtazynolu, jak liczne estry majtazynolu. [0290] Znanych jest wiele grup łącznikowych do wytwarzania koniugatów przeciwciałomajtazynoid, włączając np., te ujawnione w patencie nr lub patencie EP B1; Chari i in., Cancer Research 52: (1992) oraz US 2005/ A1, ujawnienie których jest wyraźnie włączone do niniejszego opisu przez odniesienie. Koniugaty przeciwciało-majtanzynoid zawierające komponent łącznika SMCC mogą być sporządzone jak ujawniono w US 2005/ A1, Antibody-drug conjugates and Methods. Łączniki zawierają grupy dwusiarczkowe, grupy tioeterowe, grupy wrażliwe na działanie kwasu, światła, peptydaz czy esteraz, jak ujawniono w wykazanych powyżej patentach. W niniejszym opisie opisane są dodatkowe łączniki oraz podane są ich przykłady. [0291] Koniugaty przeciwciała oraz majtazynoidu mogą być sporządzone z użyciem licznych czynników sprzęgających białka bifunkcjonalne, jak propionian N-sukcynoimidylo- 3-(2-pirydyloditiolowy) (SPDP), sukcynoimidylo-4-n-maleimidometylo)cykloheksano-1- karboksylan (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcjonalne pochodne imidoestrów (jak chlorowodorek dimetyloadypimidatu), aktywne estry (jak suberan disukcynoimidylowy), aldehydy (jak glutaraldehyd), związki bis-azydowe, jak bis-(pazydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bisdiazoniowe (jak bis-(p-diazoniumbenzoilo)- etylenodiamina, diizocyjaniany (jak tolueno-2,6-diizocyjanian) oraz bis-aktywne związki fluoru (jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). W niektórych przykładach wykonania, związkiem sprzęgającym jest N-suckynoimidylo-3-(2-pirydyloditiopropionian (SPDP) (Carlsson i in., Biochem. J. 173: (1978)) lub N-sukcynoimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanian (SPP) w celu zapewnienia połączenia dwusiarczkowego. [0292] Łącznik może być połączony z cząsteczką majtanzynoidu w różnych pozyjach, zależnie od rodzaju połączenia. Na przykład, wiązanie estrowe może być utworzone z wykorzystaniem konwencjonalnych technik sprzęgania, poprzez reakcję z grupą hydroksylową. Reakcja może zajść w pozycji C-3, posiadającej grupę hydroksylową, pozycji C-14 modyfikowanej hydroksymetylem, pozycji C-15 modyfikowanej grupą hydroksylową oraz pozycji C-20, posiadającej grupę hydroksylową. W jednym przykładzie wykonania, wiązanie jest utworzone w pozycji C-3 majtanzynolu lub analogu majtanzynolu. (1) Aurystatyny oraz dolastatyny [0293] W niektórych przykładach wykonania, immunokoniugat zawiera przeciwciało według wynalazku sprzężone z dolastatyną lub peptydowym analogiem lub pochodną dolastatyny, np. aurystatyną (patenty amerykańskie nr ; ). Wykazano, że

85 dolastatyny oraz aurystatyny zaburzają dynamikę mikrotubul, hydrolizę GTP oraz podziały komórkowe i jądra (Woyke i in. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): ) oraz wykazują aktywność przeciwnowotworową (patent amerykański nr ) i aktywność przeciwgrzybiczą (Pettit i in. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: ). Ugrupowania leków dolastatyny czy aurystatyny mogą być połączone do przeciwciała poprzez koniec N (aminowy) lub koniec C (karboksylowy) peptydowego ugrupowania leku (WO 02/088172). [0294] Przykładowe wykonania aurystatyny obejmują połączone z N-końcem wyodrębnione części cząsteczki leku monometyloaurystatyn D E i D F, ujawnione przez Senter i in., Proceedings of the American Association for Cancer Research, tom 45, streszczenie numer 623, wydany 28 marca, 2004, ujawnienie których jest wyraźnie w całości włączone do niniejszego opisu poprzez odniesienie. [0295] Wyodrębnione peptydowe części cząsteczki leku mogą być wybrane ze wzorów D E oraz D F poniżej: w których linia falowana D E oraz D F wskazuje miejsca połączeń kowalencyjnych do przeciwciała lub komponentu łącznikowego-przeciwciała, gdzie niezależnie dla każdej pozycji: R 2 jest wybrany spośród H oraz C 1 -C 8 alkilu; R 3 jest wybrany spośród H, C 1 -C 8 alkilu, C 3 -C 8 karbocyklu, arylu, C 1 -C 8 alkilo-arylu, C 1 -C 8 alkilo-(c 3 -C 8 karbocyklu), C 3 -C 8 heterocyklu oraz C 1 -C 8 alkilo-(c 3 -C 8 heterocyklu); R 4 jest wybrany spośród H, C 1 -C 8 alkilu, C 3 -C 8 karbocyklu, arylu, C 1 -C 8 alkilo-arylu, C 1 -C 8 alkilo-(c 3 -C 8 karbocyklu), C 3 -C 8 heterocyklu oraz C 1 -C 8 alkilo-(c 3 -C 8 heterocyklu); R 5 jest wybrany spośród H oraz metylu;

86 a R 4 i R 5 wspólnie tworzą pierścień karbocykliczny o wzorze -(CR a R b ) n - w którym R a oraz R b są niezależnie wybrane spośród H, C 1 -C 8 alkilu oraz C 3 -C 8 karbocyklu, a n jest wybrany spośród 2, 3, 4, 5 oraz 6; R 6 jest wybrany spośród H oraz C 1 -C 8 alkilu; R 7 jest wybrany spośród H, C 1 -C 8 alkilu, C 3 -C 8 karbocyklu, arylu, C 1 -C 8 alkilo-arylu, C 1 -C 8 alkilo-(c 3 -C 8 karbocyklu), C 3 -C 8 heterocyklu oraz C 1 -C 8 alkilo-(c 3 -C 8 heterocyklu); każdy R 8 jest niezależnie wybrany spośród H, OH, C 1 -C 8 alkilu, C 3 -C 8 karbocyklu oraz O-(C 1 -C 8 alkilu); R 9 jest wybrany spośród H oraz C 1 -C 8 alkilu; R 10 jest wybrany spośród arylu lub C 3 -C 8 heterocyklu; Z oznacza O, S, NH lub NR 12, przy czym R 12 oznacza C 1 -C 8 alkil; R 11 jest wybrany spośród H, C 1 -C 20 alkilu, arylu, C 3 -C 8 heterocyklu, -(R 13 O) m -R 14 lub -(R 13 O) m -CH(R 15 ) 2; m oznacza liczbę całkowitą od ; R 13 oznacza C 2 -C 8 alkil; R 14 oznacza H lub C 1 -C 8 alkil; każde wystąpienie R 15 oznacza niezależnie H, COOH, -(CH 2 ) n -N(R 16 ) 2, -(CH 2 ) n -SO 3 H lub -(CH 2 ) n -SO 3 -C 1 -C 8 alkil; każde wystąpienie R 16 oznacza niezależnie H, C 1 -C 8 alkil lub -(CH 2 ) n -COOH; jest wybrany spośród -C(R 8 ) 2 -C(R 8 ) 2 -arylu, -C(R 8 ) 2 -C(R 8 ) 2 -(C 3 -C 8 heterocyklu) oraz -C(R 9 ) 2 -C(R 9 ) 2 -(C 3 -C 9 karbocyklu), a R 18 n oznacza liczbę całkowitą z zakresu od 0 do 6. [0296] W jednym przykładzie wykonania R 3, R 4 oraz R 7 oznaczają niezależnie izopropyl lub sec-butyl, a R 5 oznacza -H lub metyl. W przykładowym wykonaniu, R 3 oraz R 4 oznaczają (każdy z nich) izopropyl, R 5 oznacza -H, a R 7 oznacza sec-butyl. [0297] W jeszcze innym przykładzie wykonania R 2 oraz R 6 są (każdy z nich) metylami, a R 9 oznacza -H. [0298] W jeszcze innym przykładzie wykonania, każde występienie R 8 oznacza -OCH 3. [0299] W przykładowym wykonaniu, R 3 oraz R 4 są (każdy z nich) izopropylami, R 2 oraz R 6 są (każdy z nich) metylami, R 5 oznacza -H, R 7 oznacza sec-butyl, każde wystąpienie R 8 oznacza -OCH 3, a R 9 oznacza -H. [0300] W jednym przykładzie wykonania, Z oznacza -O- lub -NH-. [0301] W jednym przykładzie wykonania, R 10 oznacza aryl. [0302] W przykładowym wykonaniu, R 10 oznacza fenyl.

87 [0303] W przykładowym wykonaniu, kiedy Z oznacza -O-, R 11 oznacza -H, metyl lub t-butyl. [0304] W jednym przykładzie wykonania, kiedy Z oznacza -NH, R 11 oznacza -CH(R 15 ) 2, przy czym R 15 oznacza -(CH 2 ) n -N(R 16 ) 2, a R 16 oznacza -C 1 -C 8 alkil lub -(CH 2 ) n -COOH. [0305] W kolejnym przykładzie wykonania wynalazku, kiedy Z oznacza -NH, R 11 oznacza -CH(R 15 ) 2, przy czym R 15 oznacza -(CH 2 ) n -SO 3 H. [0306] Przykładowym wykonaniem aurystatyny o wzorze D E jest MMAE, przy czym linia falowana wskazuje połączenie kowalencyjne z łącznikiem (L) koniugatu przeciwciało-lek: [0307] Przykładowym wykonaniem aurystatyny o wzorze D F jest MMAF, przy czym linia falowana wskazuje połączenie kowalencyjne z łącznikiem (L) koniugatu przeciwciało-lek (patrz US 2005/ oraz Doronina i in. (2006) Bioconjugate Chem. 17: ): [0308] Inne wyodrębnione części cząsteczki leku obejmują następujące pochodne MMAF, przy czym linia falowana wskazuje połączenie kowalencyjne z łącznikiem (L) koniugatu przeciwciało-lek:

88 - 87 -

89 oraz

90 [0309] W jednym aspekcie, grupy hydrofilowe obejmujące, bez ograniczania się do, estry glikolu trietylenowego (TEG), jak pokazano powyżej, mogą być przyłączone do wyodrębnionych części cząsteczki leku przy R 11. Bez wiązania się z jakąkolwiek konkretną teorią, grupy hydroksylowe pomagają w internalizacji oraz zapobieganiu aglomeracji wyodrębnionych części cząsteczki leku. [0310] Przykładowe wykonania ADC o wzorze I, obejmujące aurystatynę/dolastatynę lub ich pochodne są opisane w US A1 oraz Doronina i in. (2006) Bioconjugate Chem. 17: , ujawnienie których jest wyraźnie włączone do niniejszego opisu poprzez odniesienie. Przykładowe wykonania ADC o wzorze I, obejmujące MMAE lub MMAF oraz różne komponenty łącznika, mają następujące struktury oraz skróty (przy czym Ab oznacza przeciwciało, p wynosi 1 do około 8, Val-Cit jest dipeptydem walino-cytruliny, a S oznacza atom siarki:

91 [0311] Przykładowe wykonania ADC o wzorze I, obejmujące MMAF oraz rożne komponenty łącznika dodatkowo zawierają Ab-MC-PAB-MMAF oraz Ab-PAB-MMAF. Co ciekawe, wykazano, że immunokoniugaty zawierające MMAF przyłączone do przeciwciała poprzez łącznik, który nie jest rozszczepialny proteolitycznie, posiadają aktywność porównywalną do immunokoniugatów zawierających MMAF, przyłączony do przeciwciała poprzez łącznik rozszczepialny proteolitycznie. Patrz Doronina i in. (2006) Bioconjugate Chem. 17: W takich przypadkach, wydaje się, że uwalnianie leku jest skutkiem degradacji przeciwciała w komórce. Id. [0312] Zazwyczaj, wyodrębnione części cząsteczek leku opartego na peptydach mogą być otrzymywane poprzez tworzenie wiązania peptydowego pomiędzy dwoma lub większą liczbą aminokwasów i/lub fragmentów peptydów. Takie wiązania peptydowe mogą być tworzone, na przykład, zgodnie ze sposobem syntezy w fazie płynnej (patrz E. Schröder oraz K. Lübke, The Peptides, tom 1, str , 1965, Academic Press), który jest dobrze znany w dziedzinie chemii peptydów.wyodrębnione części cząsteczki leku aurystatyny/dolastatyny mogą być otrzymywane zgodnie ze sposobami: US A1; patent amerykański nr ; patent amerykański nr ; Pettit i in. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: ; Pettit i in. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: ; Pettit, G.R. i in.,

92 Synthesis, 1996, ; Pettit i in. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: oraz Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): [0313] W szczególności, wyodrębnione części cząsteczki leku aurystatyny/dolastatyny o wzorze D F, jak MMAF oraz pochodne, mogą być otrzymywane za pomocą sposobów opisanych w US A1 oraz Doronina i in. (2006) Bioconjugate Chem. 17: Wyodrębnione części cząsteczki leku aurystatyny/dolastatyny o wzorze D E, jak MMAE oraz pochodne, mogą być otrzymywane za pomocą sposobów opisanych w Doronina i in. (2003) Nat. Biotech. 21: Wyodrębnione części cząsteczek lek-łącznik MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PABMMA oraz MC-vc-PAB-MMAE mogą być syntetyzowane konwencjonalnie za pomocą rutynowych metod, jak np. opisane przez Doronina i in. (2003) Nat. Biotech. 21: oraz w amerykańskim zgłoszeniu patentowym 2005/ A1, a następnie sprzęgane z przeciwciałem, będącym przedmiotem zainteresowania. (3) Kalicheamycyna [0314] W innych przykładach wykonania, immunokoniugat zawiera przeciwciało według wynalazku sprzężone z jedną lub większą liczbą cząsteczek kalicheamycyny. Rodzina antybiotyków kalicheamycynowych jest zdolna do generowania pęknięć dwuniciowego DNA, w stężeniach niższych od pikomolowych. W celu otrzymania koniugatów rodziny kalicheamycyn, patrz patenty amerykańskie o numerach 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877, 296 (wszystkie dla American Cyanamid Company). Analogi strukturalne kalicheaminy, które można stosować, obejmują, bez ograniczania się do: γ 1 I, α 2 I, α 3 I, N-acetylo-γ 1 I, PSAG oraz θ I 1 (Hinman i in., Cancer Research 53: (1993), Lode i in., Cancer Research 58: (1998) oraz wyżej wspomniane amerykańskie patenty dla American Cyanamid). Innym lekiem przeciwnowotworowym, z którym może być sprzężone przeciwciało jest QFA, który jest antyfolianem. Zarówno kalicheamycyna jak i QFA mają wewnątrzkomórkowe miejsca działania i nie przechodzą łatwo przez błonę plazmatyczną. Dlatego wychwyt komórkowy tych czynników przez internalizację za pośrednictwem przeciwciała, znacznie zwiększa ich działanie cytotoksyczne. c) Inne czynniki cytotoksyczne [0315] Inne czynniki przeciwnowotworowe, które mogą być sprzężone z przeciwciałami według wynalazku, obejmują BCNU, streptozocynę, winkrystynę oraz 5-fluorouracyl, rodzinę czynników znanych pod wspólną nazwą kompleks LL-E33288, opisany w patentach amerykańskich nr 5,053,394, 5,770,710, jak również esperamycyny (patent amerykański nr 5,877,296). [0316] Toksyny aktywne enzymatycznie oraz ich fragmenty, które mogą być zastosowane, obejmują łańcuch błonicy A, niewiążące aktywne fragmenty toksyny błonicy, łańcuch egzotoksyny A (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch rycyny A, łańcuch abryny A, łańcuch inodekcyny A, alfa-sarcynę, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolaca americana (PAPI, PAPII oraz PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcynę, krotynę,

93 inhibitor Sapaonaria officinalis, geloninę, mitogelinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę oraz trichoteceny. Patrz na przykład WO 93/21232, opublikowane 28 października [0317] Niniejszy wynalazek następnie analizuje immunokoniugat utworzony pomiędzy przeciwciałem a związkiem o aktywności nukleolitycznej (np. rybonukleaza lub endonukleaza DNA, jak deoksyrybonukleaza; DNaza). [0318] W niektórych przykładach wykonania, immunokoniugat może zawierać wysoce promieniotwórczy atom. Różne izotopy radioaktywne są dostępne do produkcji przeciwciał sprzężonych z promieniotwórczym izotopem. Przykłady obejmują At 211, I 131, I 125, Y 90, Re 186, Re 188, Sm 153, Bi 212, P 32, Pb 212 oraz promieniotwórcze izotopy Lu. Kiedy immunokoniugat jest używany do detekcji, może zawierać atom promieniotwórczy do badań scyntygraficznych, np. tc 99m lub I 123 lub znacznik spinowy do obrazowania jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) (znany także jako obrazowanie rezonansu magnetycznego mri), taki jak jod-123, jod- 131, ind-111, fluor-19, węgiel-13, azot-15, tlen-17, gadolin, mangan lub żelazo. [0319] Radio- lub inne znaczniki mogą być wbudowywane do immunokonigatów za pomocą znanych sposobów. Na przykład, peptyd może być biosyntetyzowany lub syntetyzowany poprzez syntezę chemiczną aminokwasów, z użyciem odpowiednich prekursorów aminokwasów, włączając, na przykład fluor-19 w miejsce wodoru. Znaczniki takie jak tc 99m lub I 123, Re 186, Re 188 oraz In 111, mogą być przyłączone poprzez resztę cysteiny w peptydzie. Itr-90 może być przyłączony poprzez resztę lizyny, Można zastosować metodę IODOGEN (Fraker i in. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: do inkorporacji jodu-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989) opisuje w szczegółach inne sposoby. [0320] W niektórych przykładach wykonania, immunokoniugat może zawierać przeciwciało anty-tat226 według wynalazku, sprzężone z enzymem aktywującym prolek, który przekształca prolek (np. peptydowy czynnik chemoterapeutyczny, patrz WO 81/01145) w aktywny lek, taki jak lek przeciwnowotworowy. Takie immunikoniugaty są przydatne w kierowanej przeciwciałem enzymatycznej terapii prolekowej ( ADEPT ). Enzymy, które mogą być sprzężone z przeciwciałem anty-tat226 według wynalazku obejmują, bez ograniczania się do, fosfatazy alkaliczne, które są przydatne do przekształcania proleków zawierających fosforan w wolne leki; arylosulfatazy, które są przydatne do przekształcania proleków zawierających siarczany w wolne leki, deaminazę cytozyny, która jest przydatna do przekształcania nietoksycznej 5-fluorocytozyny w lek przeciwnowotworowy, 5-fluorouracyl; proteazy, takie jak proteaza Serratia, termolizynę, subtylizynę, karboksypeptydazy oraz katepsyny (jak katepsyna B i L), które są przydatne do przekształcania proleków zawierających peptyd w wolne leki; D-alanylokarboksypeptydazy, które są przydatne do przekształcania proleków zawierających podstawniki D-aminokwasowe; enzymy rozkładające węglowodany, takie jak β-galaktozydaza oraz neuraminidaza, które są przydatne do przekształcania proleków glikozylowanych w wolne leki; β-laktamaza, która jest przydatna do przekształcania leków derywatyzowanych β-laktamami w wolne leki, a także amidazy penicyliny, takie jak amidaza penicyliny V oraz amidaza penicyliny G, które są

94 przydatne do przekształcania leków, których azoty aminowe derywatyzowano grupami fenoksyacetylowymi lub fenyloacetylowymi, odpowiednio, w wolne leki. Enzymy mogą być związane kowalencyjnie z przeciwciałami anty-tat226 według wynalazku, za pomocą dobrze znanych w dziedzinie technik rekombinacyjnych DNA. Patrz np. Neuberger i in., Nature 312: (1984). d) Wysycenie lekiem [0321] Wysycenie lekiem jest wyrażone przez p, średnią liczbę wyodrębnionych części cząsteczki leku na przeciwciało w cząsteczce o wzorze I. Wysycenie lekiem może mieścić się w zakresie od 1 do 20 wyodrębnionych części cząsteczki leku (D) na przeciwciało. ADC o wzorze I obejmują zbiory przeciwciał sprzężonych z szeregiem wyodrębnionych części cząsteczek leku, w ilości od 1 do 20. Średnią wyodrębnionych części cząsteczek leku na przeciwciało w preparatach ADC z reakcji sprzęgania można scharakteryzować za pomocą konwencjonalnych sposobów, takich jak spektroskopia mas, test ELISA oraz HPLC. Można również określić ilościowy rozkład ADC w zakresie p. W niektórych przypadkach, rozdział, oczyszczanie oraz charakterystykę jednorodnych ADC, gdzie p jest pewną wartością z ADC z innymi obciążeniami lekiem, można osiagnąć za pomocą sposobów takich, jak HPLC w układzie faz odwróconych lub elektroforeza. [0322] Dla niektórych koniugatów przeciwciało-lek, p może być ograniczone przez liczbę miejsc przyłączenia na powierzchni przeciwciała. Na przykład, gdzie miejscem przyłączenia jest grupa tiolowa cysteiny, jak w przykładowych zastosowaniach powyżej, przeciwciało może posiadać tylko jedną lub kilka grup tiolowych cysteiny lub możę posiadać tylko jedną lub kilka wystarczająco reaktywnych grup tiolowych grup tiolowych, przez które może być przyłączony łącznik. W niektórych przykładach wykonania, wyższe wysycenie lekiem niektórych koniugatów przeciwciało-lek, np. p > 5, może powodować agregację, nierozpuszczalność, toksyczność lub utratę przepuszczalności komórkowej. W niektórych przykładach wykonania, wysycenie lekiem dla ADC według wynalazku wynosi od 1 do około 8; od około 2 do około 6 lub od około 3 do około 5. Rzeczywiście, dla niektórych ADC wykazano, że optymalny stosunek wyodrębnionych części cząsteczki leku na przeciwciało może być mniejszy niż 8 i może wynosić około 2 do około 5. Patrz US A1. [0323] W niektórych przykładach wykonania, mniej niż teoretyczne maksimum ugrupowań leku podlega sprzężeniu z przeciwciałem podczas reakcji sprzęgania. Przeciwciało może zawierać, na przykład reszty lizyny, które nie reagują z produktem pośrednim łącznik-lek czy reagentem łącznika, jak omówiono poniżej. Ogólnie, przeciwciała nie zawierają wielu wolnych i reaktywnych grup tiolowych cystein, które mogą zostać przyłączone do wyodrębnionych części cząsteczki leku; w rzeczywistosci większość ugrupowań tiolowych cysteiny w obrębie przeciwciała ma postać mostków dwusiarczkowych. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało można redukować czynnikiem redukującym, jak ditiotreitol (DTT) lub trikarbonyloetylofosfina (TCEP), w warunkach częściowo lub w pełni redukujących, w celu wygenerowania reaktywnych grup tiolowych cysteiny. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało jest poddane warunkom denaturującym w celu odsłonienia reaktywnych grup nukleofilowych takich, jak lizyna czy cysteina.

95 [0324] Wysycenie (stosunek lek/przeciwciało) ADC może być kontrolowane na różne sposoby, np. poprzez: (i) ograniczenie nadmiaru molowego produktu pośredniego lek-łącznik lub reagentu łącznika w stosunku do przeciwciała, (ii) ograniczenie czasu reakcji sprzęgania lub temperatury oraz (iii) częściowe lub limitujące warunki redukcyjne dla modyfikacji grup tiolowych cysteiny. [0325] Zrozumiałym jest, że gdy więcej niż jedna grupa nukleofilowa reaguje z produktem pośrednim lek-łącznik lub reagentem lącznika, a następnie z reagentem wyodrębnionych części cząsteczki leku, wtedy uzyskiwany produkt jest mieszaniną związków ADC z dystrybucją jednego lub większej liczby ugrupowań leku przyłączonych do przeciwciała. Średnia liczba cząsteczek leku na przeciwciało można obliczyć z mieszaniny za pomocą podwójnego testu ELISA z przeciwciałami, specyficznego wobec przeciwciała oraz specyficznego wobec leku. Pojedyncze cząsteczki ADC mogą być identyfikowane w mieszaninie za pomocą spektroskopii mas oraz rozdziału HPLC, np. chromatografię interakcji hydrofobowych (patrz np. Hamblett, K.J i in. Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-cd30 antibody-drug conjugate Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, marca, 2004, Proceedings of the AACR, tom 45, marzec 2004; Alley, S.C i in. Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting marca, 2004, Proceedings of the AACR, tom 45, marzec 2004). W niektórych przykladach wykonania, jednorodne ADC z pojedynczą wartością obciążenia, mogą być izolowane z mieszaniny sprzęganych związków za pomocą elektroforezy lub chromatografii. e) Niektóre sposoby otrzymywania immunokoniugatów [0326] ADC o wzorze I można otrzymywać kilkoma sposobami, wykorzystującymi reakcje chemii organicznej, warunki oraz reagenty znane specjalistom w dziedzinie, włączając: (1) reakcję grupy nukleofilowej przeciwciała z dwuwartościowym reagentem łącznika w celu utworzenia Ab-L poprzez wiązanie kowalencyjne, z następującą reakcją z wyodrębnioną częścią cząsteczki D leku oraz (2) reakcję grupy nukleofilowej wyodrębnionej części cząsteczki leku z dwuwartościowym reagentem łącznika w celu utworzenia D-L poprzez wiązanie kowalencyjne, z następującą reakcją z grupą nukleofilową przeciwciała. Przykładowe sposoby otrzymywania ADC o wzorze I drugą metodą są opisane w US A1, który jest wyraźnie włączony do niniejszego opisu poprzez odniesienie. [0327] Grupy nukleofilowe przeciwciała obejmują, bez ograniczania się do: (i) N-końcowe grupy aminowe, (ii) grupy aminowe łańcucha bocznego, np. lizyny, (iii) grupy tiolowe łańcucha bocznego, np. cysteiny oraz (iv) grupy hydroksylowe cukrów lub grupy aminowe, gdy przeciwciało jest glikozyowane. Grupy aminowe, tiolowe oraz grupy hydroksylowe cukrów są nukleofilowe i zdolne do reagowania w celu utworzenia wiązań kowalencyjnych z grupami elektrofilowymi na wyodrębnionych częściach cząsteczek łącznika oraz z reagentami łącznika obejmującymi: (i) aktywne estry takie jak estry NHS, estry HOSt, halogenomrówczany oraz halogenki kwasowe; (ii) halogenki alkilowe i benzylowe takie jak halogenoacetamidy; (iii) aldehydy, ketony, grupy karboksylowe oraz maleimidowe. Niektóre

96 przeciwciała posiadają międzyłańcuchowe podlegające redukcji ugrupowania dwusiarczkowe, np. mostki cysteinowe. Przeciwciała można ureaktywnić w kierunku sprzęgania z reagentami łącznika poprzez traktowanie czynnikiem redukcyjnym, takim jak DTT (ditiotreitol) lub (TCEP) trikarbonyloetylofosfina tak, że przeciwciało ulega całkowitej lub częściowej redukcji. Każdy mostek cysteinowy może więc, teoretycznie, utworzyć dwa reaktywne nukleofile tiolowe. Dodatkowe grupy nukleofilowe mogą być wprowadzone do przeciwciała poprzez modyfikację reszt lizyny, np. poprzez reakcję reszt lizyny z 2-iminotiolanem (odczynnikiem Trauta), co prowadzi do przekształcenia grup aminowych do grup tiolowych. Reaktywne grupy tiolowe mogą być wprowadzone do przeciwciała poprzez wprowadzenie jednej, dwóch, trzech, czterech lub większej liczby reszt cysteiny (np. poprzez sporządzenie wariantów przeciwciała zawierających jedną lub więcej nie-natywnych reszt aminokwasowych cysteiny). [0328] Koniugaty przeciwciało-lek, będące przedmiotem wynalazku, mogą być również wytworzone poprzez reakcję pomiędzy grupą elektrofilową przeciwciała, taką jak aldehydowa lub ketonowa grupa karbonylowa z grupą nukleofilową reagenta łącznika lub leku. Przydatne grupy nukleofilowe na reagencie łącznika obejmują, bez ograniczania się do: grupy hydrazydowe, oksymowe, aminowe, hydrazynowe, tiosemikarbazonowe, karboksylohydrazynowe oraz arylohydrazydowe. W jednym z przykładów wykonania, przeciwciało podlega modyfikacji w celu wprowadzenia ugrupowań elektrofilowych, zdolnych do reagowania z podstawnikami nukleofilowymi reagenta łącznika leku. W innym przykładzie wykonania, cukry przeciwciał glikozylowanych mogą być utleniane, np. nadjodanowymi odczynnikami utleniającymi, w celu utworzenia grup aldehydowych lub ketonowych, które mogą reagować z grupami aminowymi reagentów łącznika lub ugrupowań leku. Powstające w ten sposób grupy iminowe zasad Schiffa mogą tworzyć trwałe wiązania lub mogą podlegać redukcji, np. odczynnikami borowodorkowymi, w celu utworzenia trwałych wiązań aminowych. W jednym z przykładów wykonania, reakcja fragmentu węglowodanowego glikozylowanego przeciwciała albo z oksydazą galaktozy albo z metanadjodanem sodu może skutkować utworzeniem w obrębie przeciwciała grup karbonylowych (aldehydowych oraz ketonowych), które mogą reagować z odpowiednimi grupami leku (Hermanson, Bioconjugate Techniques). W innym przykładzie wykonania, przeciwciała zawierające N-końcowe reszty seryny lub treoniny mogą reagować z metanadjodanem sodu, co skutkuje powstaniem aldehydu w miejscu pierwszego aminokwasu (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: ; US 5,362,852). Aldehyd taki może być wykorzystany w reakcji z wyodrębnioną częścią cząsteczki leku lub nukleofilem łącznika. [0329] Grupy nukleofilowe wyodrębnionej części cząsteczki leku obejmują, bez ograniczania się do: grupy aminowe, tiolowe, hydroksylowe, hydrazydowe, oksymowe, hydrazynowe, tiosemikarbazonowe, karboksylohydrazynowe oraz arylohydrazydowe, zdolne do reakcji z utworzeniem wiązań kowalencyjnych z grupami elektrofilowymi na ugrupowaniach łącznika oraz reagentach łącznikowych, obejmujących: (i) aktywne estry, takie jak estry NHS, estry HOBt, halogenomrówczany oraz halogenki kwasowe;

97 (ii) halogenki alkilowe oraz benzylowe, takie jak halogenoacetamidy; (iii) aldehydy, ketony, grupy karboksylowe oraz maleimidowe. [0330] Do związków, będących przedmiotem wynalazku, zalicza się intensywnie rozważane, bez ograniczania się do, ADC, otrzymane z zastosowaniem następujących odczynników sieciująccyh: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-emcs, sulfo-gmbs, sulfo-kmus, sulfo-mbs, sulfo-siab, sulfo-smcc oraz sulfo-smpb i SVSB (4-winylosulfonobenzoesan sukcynoimidylu), które są dostępne komercyjnie (np. z Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U. S. A; patrz str , Applications Handbook Catalog. [0331] Immunokoniugaty zawierające przeciwciało oraz czynnik cytotoksyczny mogą być utworzone z wykorzystaniem wielu dwufunkcyjnych czynników sprzęgających białka, takich jak 3-(2-pirydyloditio)propionian N-sukcynoimidylu (SPDP), cykloheksano-1-karboksylan 4-N-maleimidometylo)sukcynoimidylu (SMCC), iminotiolan (IT), dwufunkcyjne pochodne imidoestrów (takie jak chlorowodorek adypoimidanu dimetylu), aktywne estry (takie jak suberynian disukcynoimidylu), aldehydy (takie jak aldehyd glutarowy), związki bis-azydowe (takie jak bis(p-azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bisdiazoniowe (takie jak bis-(pdiazoniobenzoilo)etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak tolueno-2,6-diizocyjanian) oraz związki z dwoma aktywnymi atomami fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na przykład, immunotoksynę rycynową można otrzymać w sposób opisany przez Vitetta i in., Science 238: 1098 (1987). Znakowany izotopem węgla C-14 kwas 1-izotiocyjanatobenzylo-3- metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DTPA), jest przykładowym czynnikiem chelatującym, służącym do sprzęgania radionukleotydu z przeciwciałem. Patrz WO94/ [0332] Zamiennie, białko fuzyjne, zawierające przeciwciało oraz czynnik cytotoksyczny, może być sporządzone na przykład za pomocą technik rekombinacyjnych lub syntezy peptydowej. Cząsteczka rekombinowanego DNA może zawierać regiony kodujące przeciwciało oraz fragmenty cytotoksyczne koniugatu albo znajdujące się obok siebie albo oddzielone regionem kodującym peptyd łącznikowy, który nie niszczy pożądanych właściwosci koniugatu. [0333] W jeszcze innym przykładzie wykonania, przeciwciało może być sprzężone z receptorem (takim jak streptawidyna) w celu zastosowania do wstępnego nakierowywania na guz, przy czym koniugat przeciwciało-receptor jest podawany pacjentowi, po czym niezwiązane przeciwciało jest usuwane z krążenia za pomocą czynnika oczyszczającego, a następnie podawany jest ligand (np. awidyna), sprzężony z czynnikiem cytotoksycznym (np. radionukleotydem). D. Formulacje farmaceutyczne [0334] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza formulacje farmaceutyczne, zawierające co najmniej jedno przeciwciało anty-tat226, będące przedmiotem wynalazku i/lub co najmniej jeden jego immunokoniugat. W niektórych przykładach wykonania, formulacja farmaceutyczna zawiera 1) przeciwciało anty-tat226 i/lub jego immunokoniugat oraz 2) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W niektórych przykładach wykonania, formulacja

98 farmaceutyczna zawiera 1) przeciwciało anty-tat226 i/lub jego immunokoniugat oraz opcjonalnie 2) co najmniej jeden dodatkowy czynnik terapeutyczny. Dodatkowe czynniki terapeutyczne obejmują, bez ograniczania się do, te, które opisano poniżej w sekcji E.2. [0335] Formulacje farmaceutyczne, zawierające przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, są przygotowywane do przechowywania poprzez zmieszanie przeciwciała lub immunokoniugatu, mających pożądany stopień czystości, z opcjonalnymi, fizjologicznie dopuszczalnymi, nośnikami, rozczynnikami lub stabilizatorami (Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, Osol, A. (red.), (1980)), pod postacią roztworów wodnych lub w formie liofilizowanej czy w postaci innych formulacji suchych. Dopuszczalne nośniki, rozczynniki lub stabilizatory, są nietoksyczne dla biorców w zastosowanych dawkach oraz stężeniach i obejmują bufory takie, jak bufor fosforanowy, cytrynianowy, histydynę i inne kwasy organiczne; przeciwutleniacze, w tym kwas askorbinowy i metioninę, środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, chlorek heksametoniowy, chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetoniowy); fenol, alkohol butylowy lub benzylowy; alkiloparabeny takie, jak metylo- lub propyloparaben, katechol, rezorcynol, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol); niskocząsteczkowe (mniej niż 10 reszt) polipeptydy; białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny, polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon, aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, włączając glukozę, mannozę lub dekstryny; środki chelatujące takie, jak EDTA; cukry takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; przeciwjony tworzące sole, takie jak sód; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne takie, jak TWEEN, PLURONICS czy glikol polietylenowy (PEG). Formulacje farmaceutyczne do podawania in vivo są sterylne. Jest to łatwe do wykonania za pomocą filtracji przez sterylne membrany filtracyjne. [0336] Składniki czynne mogą również być zamknięte w mikrokapsułkach, sporządzonych, na przykład, za pomocą technik koacerwacji lub poprzez polimeryzację międzyfazową, na przykład, odpowiednio, w mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych oraz z polimetakrylanu metylu, w koloidalnych układach dostarczania leku (np. w liposomach, mikrosferach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach oraz nanokapsułkach) lub w makroemulsjach. Techniki te ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 16., red. Osol, A. (1980). [0337] Można sporządzić preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce stałych polimerów hydrofobowych, zawierające przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, przy czym matryce te występują w postaci uformowanych wyrobów, np. błon lub mikrokapsułek. Przykłady matryc do przedłużonego uwalniania obejmują poliestry, hydrożele (np. polimetakrylan 2-hydroksyetylu lub alkohol poliwinylowy), polilaktydy (patent amerykański nr 3,773,919), kopolimery kwasu L-glutaminowego oraz γ-l-glutaminianu etylu, niedegradowalnego octanu etylenowinylowego, degradowalnych kopolimerów kwasu mlekowego-kwasu glikolowego, jak

99 np. LUPRON DEPOT (wstrzykiwalne mikrosfery, złożone z kopolimeru kwasu mlekowego-kwasu glikolowego oraz octanu leuprolidu) oraz kwas poli-d-(-)-3- hydroksymasłowy. Podczas gdy polimery, takie jak octan etyleno-winylowy czy kopolimer kwasu mlekowego-kwasu glikolowego umożliwiają uwalnianie cząsteczek przez ponad 100 dni, niektóre hydrożele uwalniają białka przez krótsze okresy czasu. Gdy kapsułkowane przeciwciała lub immunokoniugaty pozostają w organizmie przez długi okres czasu, mogą ulegać denaturacji lub agregacji w wyniku ekspozycji na wilgoć w temperaturze 37 C, co prowadzi do utraty aktywności biologicznej oraz możliwych zmian immunogenności. Mogą być opracowane racjonalne strategie stabilizacji przeciwciał, w zależności od zaangażowanego mechanizmu. Na przykład, jeśli odkryto, że mechanizm agregacji polega na tworzeniu międzycząsteczkowych wiązań S-S poprzez wymianę tiol-dwusiarczek, można osiągnąć trwałość poprzez modyfikację reszt sulfhydrylowych, liofilizację z roztworów kwasowych, kontrolowanie wilgotności, stosowanie odpowiednich dodatków oraz opracowywanie określonych kompozycji matrycy polimerowej. E. Sposoby stosowania przeciwciał anty-tat226 oraz immunokoniugatów 1. Sposoby diagnostyczne oraz metody detekcji [0338] Przeciwciała anty-tat226 oraz immunokoniugaty, będące przedmiotem wynalazku, są przydatne do wykrywania obecnosci TAT226 w próbkach biologicznych. Określenie wykrywanie, jak użyto w niniejszym opisie, obejmuje wykrywanie ilosciowe lub jakościowe. Próbka biologiczna może zawierać komórki lub tkanki, jak tkanki wymienione na Fig. 13. Takie tkanki mogą obejmować tkanki prawidłowe i/lub nowotworowe, które wykazują ekspresję TAT226 na wyższych poziomach w stosunku do innych tkanek, na przykład, tkanki jajnika, nerki, mózgu, śluzówki, nadnerczy, kości, płuc, skóry oraz tkanek miękkich. [0339] Przykładowe zaburzenia proliferacji komórek, które mogą być zdiagnozowane za pomocą przeciwciała, będącego przedmiotem wynalazku, obejmują, stany nowotworowe takie jak guzy, np. raki (guzy nabłonkowe), blastomy (guzy pochodzące z tkanek embrionalnych), a w niektórych przykładach wykonania, raka jajnika, raka macicy (włączając raka śluzówki macicy) oraz raka nerki, włączając nefroblastomy (np. guz Wilmsa). Rak jajnika, w szczególności, obejmuje różnorodną grupę guzów złosliwych, pochodzących z jajnika. Około 90% guzów złośliwych jajnika jest pochodzenia nabłonkowego; pozostałość stanowią guzy komórek rozrodczych oraz guzy podścieliska. Guzy nabłonkowe jajnika są sklasyfikowane w następujące podtypy histologiczne: surowicze gruczolakoraki (stanowiące około 50% nabłonkowych guzów jajnika), gruczolakoraki endometrioidalne (około 20%); śluzowe gruczolakoraki (około 10%); raki jasnokomórkowe (około 5-10%); guzy Brennera (guzy z komórek przejściowych) (stosunkowo rzadkie). Rokowania dla raka jajnika, który jest na szóstym miejscu wśród najczęściej występujacych raków u kobiet, jest zwykle złe, z piecioletnim okresem przeżycia, wahajacym się od 5-30%. Celem zapoznania się z pracami przeglądowymi na temat raka jajnika, patrz Fox i in. (2002) Pathology of epithelial ovarian cancer w Ovarian Cancer rozdz. 9 (Jacobs i in., Oxford University Press, Nowy Jork); Morin i in. (2001) Ovarian Cancer Encyclopedia Reference of Cancer, str (Schwab, pod

100 redakcją Springer-Verlag, Nowy Jork). Niniejszy wynalazek analizuje sposoby diagnozowania lub leczenia nabłonkowych guzów jajnika wszystkich opisanych powyżej podtypów, a w szczególnosci podtyp surowiczego gruczolakoraka. [0340] W niektórych przykładach wykonania, sposób diagnozowania lub wykrywania, jak te opisane powyżej, obejmuje wykrywanie wiązania przeciwciała anty-tat do TAT226, który ulega ekspresji na powierzchni komórki lub w preparacie uzyskanym z błon komórek, wykazujących ekspresję TAT226 na swojej powierzchni. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje kontakt komórki z przeciwciałem anty-tat226, w warunkach pozwalających na wiązanie przeciwciała anty-tat226 do TAT226 oraz wykrywanie, czy doszło do utworzenia kompleksu pomiędzy przeciwciałem anty-tat226 a TAT226 na powierzchni komórki. Przykładowym testem do wykrywania wiązania przeciwciała anty-tat226 do TAT226, który podlega ekspresji na powierzchni komórek, jest oznaczenie FACS, jak opisano w przykładzie D, poniżej. [0341] W celu detekcji wiązania przeciwciał anty-tat226 do TAT226, można zastosować pewne inne sposoby. Sposoby te obejmują, bez ograniczania się do, testy wiązania antygenprzeciwciało, które są dobrze znane w dziedzinie, takie jak hybrydyzacje typu Western, testy radioimmunologiczne, ELISA (test immunoenzymatyczny), kanapkowe testy immunologiczne, testy immunoprecypitacji, testy immunofluorescencyjne, testy immunologiczne białka A, immunohistochemia (IHC). [0342] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała anty-tat226 są znakowane. Znaczniki obejmują, bez ograniczania się do: znaczniki lub ugrupowania, które są wykrywane bezpośrednio (jak znaczniki fluorescencyjne, chromoforyczne, gęstości elektronowej, chemiluminescencyjne oraz promieniotwórcze), jak również ugrupowania, takie jak enzymy lub ligandy, które są wykrywane pośrednio, np. poprzez reakcję enzymatyczną lub oddziaływanie molekularne. Przykładowe znaczniki obejmują, bez ograniczania się do: izotopy promieniotwórcze 32 P, 14 C, 125 I, 3 H oraz 131 I, fluorofory, jak rzadkie chelaty ziemi lub fluoresceina i jej pochodne, rodamina i jej pochodne, dansyl, umbeliferon, lucyferazy, np. lucyferaza robaczka świętojańskiego oraz lucyferaza bakteryjna (patent amerykański nr 4,737,456), lucyferyna, 2,3-dihydroftalazynodiony, peroksydaza chrzanowa (HRP), fosfataza alkaliczna, β-galaktozydaza, glukoamylaza, lizozym, oksydazy sacharydów, np. oksydaza glukozy, oksydaza galaktozy oraz dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, oksydazy heterocykliczne jak urykaza oraz oksydaza ksantynowa, w połączeniu z enzymem, który wprowadza nadtlenek wodoru w celu utlenienia prekursorów barwnika, takiego jak HRP, laktoperoksydaza lub mikroperoksydaza, biotyna/awidyna, znaczniki spinowe, znaczniki bakteriofagowe, stabilne wolne rodniki i tym podobne. [0343] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała anty-tat226 są unieruchomione na nierozpuszczalnej matrycy. Unieruchomienie pociąga za sobą oddzielenie przeciwciała anty-tat226 od TAT226, które pozostaje wolne w roztworze. Zwykle jest to osiągane albo poprzez przekształcenie przeciwciała anty-tat226 do postaci nierozpuszczalnej, przed rozpoczęciem procedury testowej, jak poprzez adsorpcję na nierozpuszczalnej w wodzie matrycy lub powierzchni (Bennich i in., U.S. 3,720,760) lub

101 poprzez sprzęganie kowalencyjne (na przykład z zastosowaniem sieciowania glutaraldehydem) lub poprzez przekształcenie przeciwciała anty-tat226 do postaci nierozpuszczalnej po utworzeniu kompleksu pomiędzy przeciwciałem anty-tat226 a TAT226, np. poprzez immunoprecypitację. [0344] Każdy z powyższych przykładów wykonania do diagnostyki lub wykrywania może być prowadzony z zastosowaniem immunokoniugatu, będącego przedmiotem wynalazku, zamiast lub oprócz przeciwciała anty-tat Sposoby terapeutyczne [0345] Przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, mogą być zastosowane, na przykład w sposobach terapeutycznych in vivo oraz in vitro. [0346] Inhibowanie wzrostu komórek lub proliferacji oznacza obniżanie wzrostu komórek lub proliferacji o co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 100% oraz obejmuje indukcję śmierci komórkowej. W niektórych przykładach wykonania, komórka jest komórką guza. W niektórych przykładach wykonania, komórka jest komórką guza jajnika, komórką guza macicy, komórką guza mózgu lub komórką guza nerki. W niektórych przykładach wykonania, komórka jest komórką heteroprzeszczepu, np. jak wyszczególniono w niniejszym opisie. [0347] Przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, mogą być przeznaczone do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom proliferacyjnych komórek. W niektórych przykładach wykonania, zaburzenie proliferacji komórek jest związane ze wzrostem ekspresji i/lub aktywności TAT226. Na przykład, w niektórych przykładach wykonania, zaburzenie proliferacji komórek jest związane ze wzrostem ekspresji TAT226 na powierzchni komórki. W niektórych przykładach wykonania, zaburzenie proliferacji komórek jest guzem lub rakiem. Przykłady zaburzeń proliferacji komórek, które mają być leczone przeciwciałami lub immunokoniugatami, będącymi przedmiotem wynalazku, obejmują, bez ograniczania się do: stany nowotworowe takie jak guzy, ma przykład raki (nowotwory nabłonkowe) oraz blastomy (guzy pochodzące z tkanek embrionalnych), a w niektórych przykładach wykonania, raka jajnika, raka macicy (włączając rak śluzówki macicy), guzy mózgu (np. astrocytomy, obejmujące zaawansowane stadia 103 glejaków, określanych także jako glejaki wielopostaciowe) oraz raka nerki, włączając nefroblastomy (np. guz Wilmsa). [0348] Ujawnione są w niniejszym opisie sposoby leczenia zaburzeń proliferacyjnych komórek, obejmujące podawanie pacjentom skutecznych dawek przeciwciała anty-tat226 lub jego immunokoniugatów. W niektórych przykładach wykonania, sposób leczenia zaburzeń proliferacyjnych komórek obejmuje podawanie pacjentom skutecznych dawek formulacji farmaceutycznej, zawierającej przeciwciało anty-tat226 oraz, opcjonalnie, co najmniej jeden dodatkowy czynnik terapeutyczny, jak te dostarczone poniżej. W niektórych przykładach wykonania, sposób leczenia zaburzeń proliferacyjnych komórek obejmuje podawanie pacjentom skutecznych dawek formulacji farmaceutycznej, zawierającej

102 ) immunokoniugat zawierający przeciwciało anty-tat226 oraz czynnik cytotoksyczny oraz opcjonalnie 2) co najmniej jeden dodatkowy czynnik terapeutyczny, jak te dostarczone poniżej. [0349] W jednym aspekcie, przynajmniej niektóre przeciwciała lub immunokoniugaty, będące przedmiotem wynalazku, mogą wiązać TAT226 z gatunków innych niż człowiek. Stosownie do tego, przeciwciała lub immunokoniugaty według wynalazku, mogą być użyte do wiązania TAT226, np. w hodowlach komórkowych zawierających TAT226, u ludzi lub innych ssaków, mających TAT226, z którym przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, wchodzą w reakcje krzyżowe (np. szympans, pawian, małpa szerokonosa, małpa cynomolgus, rezus, świnia lub mysz). W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało anty-tat226 lub immunokoniugat mogą być użyte do inhibowania aktywności TAT226 poprzez kontakt przeciwciała lub immunokoniugatu z TAT226, tak że aktywność TAT226 zostaje zahamowana. W jednym przykładzie wykonania, TAT226 jest ludzkim TAT226. [0350] Przeciwciało anty-tat226 lub immunokoniugat, mogą być użyte w sposobie wiązania TAT226 u osobników cierpiących na zaburzenia związane z podwyższoną ekspresją i/lub aktywnością TAT226, sposób obejmuje podawanie osobnikom przeciwciała lub immunokoniugatu, tak że TAT226 u pacjentów zostaje związany. W jednym przykładzie wykonania, TAT226 jest ludzkim TAT226, a osobnicy są ludźmi. Zamiennie, osobnicy mogą być ssakami, wykazującymi ekspresję TAT226, do którego wiąże się przeciwciało anty-tat226. Jeszcze inni osobnicy mogą być ssakami, do których TAT226 został wprowadzony (np. poprzez podanie TAT226 lub poprzez ekspresję transgenu kodującego TAT226). [0351] Przeciwciało anty-tat226 lub immunokoniugat mogą być podane ludziom w celach terapeutycznych. Ponadto, przeciwciało anty-tat226 lub immunokoniugat mogą być podane ssakom, niebędącymi ludźmi, wykazującym ekspresję TAT226, z którymi przeciwciało wchodzi w reakcję krzyżową (np. naczelne, świnia, szczur lub mysz) do celów weterynaryjnych lub jako zwierzęcy model choroby ludzkiej. Jeśli chodzi o ten ostatni, takie modele zwierzęce mogą być przydatne do oceny skuteczności terapeutycznej przeciwciał lub immunokoniugatów, będących przedmiotem wynalazku (np. testowanie dawkowania oraz czasów podawania). [0352] Przeciwciała oraz immunokoniugaty, będące przedmiotem wynalazku, mogą być użyte pojedynczo lub w kombinacji z innymi związkami w terapii. Na przykład, przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, mogą być podane wspólnie z co najmniej jednym dodatkowym czynnikiem terapeutycznym i/lub adiuwantem. W niektórych przykładach wykonania, dodatkowy czynnik terapeutyczny jest czynnikiem cytotoksycznym, czynnikiem chemoterapeutycznym lub czynnikiem hamującym wzrost. W jednym z przykładów takiego zastosowania, czynnik chemoterapeutyczny jest czynnikiem lub kombinacją czynników, stosowanych w leczeniu raka jajnika, jak związki platyny (np. cisplatyna lub karboplatyna); taksan (np. paklitaksel lub docetaksel); topotekan; antracykliny (np. doksorubicyna (ADRIAMYCIN ) lub doksorubicyna liposomalna

103 (DOXIL )); gemcytabina; cyklofosfamid; winorelbina (NAWELBINE ); heksametylomelamina; ifosfamid oraz etopozyd. W innych przykładach takiego zastosowania, czynnik chemoterapeutyczny jest czynnikiem lub kombinacją czynników, stosowanych w leczeniu raka macicy lub śluzówki macicy, jak cisplatyna, karboplatyna, doksorubicyna, paklitaksel, metotreksat, fluorouracyl oraz medroksyprogesteron. W innych przykładach takiego zastosowania, czynnik chemoterapeutyczny jest czynnikiem lub kombinacją czynników, stosowanych w leczeniu guzów mózgu, jak nitrozomocznik (np. karmustyna lub lomustyna); czynnik cytotoksyczny (np. irinotekan lub temozolamid); czynnik przeciwangiogenny (np. talidomid, TNP-470, czynnik płytkowy 4, interferon oraz endostatyna); czynnik różnicujący (np. retinoidy, fenylomaślan, fenylooctan oraz anty-neoplastony); czynnik przeciwinwazyjny (np. inhibitory metaloproteinaz macierzy jak marimastat); modulatory transdukcji sygnału (np. tamoksyfen, briostatyna oraz O-6 benzyguanina); inhibitor topoizomerazy (np. irinotekan lub topotekan) oraz inhibitor czynnika wzrostu (np. inhibitor kinazy tyrozynowej). W innych przykładach takiego zastosowania, czynnik chemoterapeutyczny jest czynnikiem lub kombinacją czynników, stosowanych w leczeniu raka nerki (np. guza Wilmsa), jak winkrystyna, aktynomycyna D, adriamycyna, doksorubicyna, cyklofosfamid, ifosfamid, etopozyd oraz karboplatyna. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało będące przedmiotem wynalazku, może być w kombinacji z czynnikiem przeciwzapalnym i/lub antyseptycznym. [0353] Takie terapie skojarzone, odnotowane powyżej, obejmują skojarzone podawanie (gdzie dwa lub więcej czynników terapeutycznych jest wprowadzonych w ramach tej samej lub odrębnych formulacji) oraz podawanie odrębne, w przypadku którego podawanie przeciwciała lub immunokoniugatu według wynalazku, może nastąpić przed, jednocześnie lub po podaniu dodatkowego czynnika terapeutycznego i/lub adiuwanta. Przeciwciała oraz immunokoniugaty, będące przedmiotem wynalazku, mogą być także stosowane w kombinacji z radioterapią. [0354] Przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku (oraz jakikolwiek dodatkowy czynnik terapeutyczny lub adiuwant) mogą być podawane za pomocą któregokolwiek z odpowiednich sposobów, włączając podawanie pozajelitowe, podskórne, dootrzewnowe, do płuc i nosa oraz, w razie potrzeby, do leczenia miejscowego, podawania śróduszkodzeniowego. Infuzje pozajelitowe obejmują podawanie domięśniowe, dożylnie, wewnątrztętnicze, dootrzewnowe lub podskórne. Dodatkowo, przeciwciało lub immunokoniugat są odpowiednio podawane poprzez wlewy pulsacyjne, szczególnie w zmniejszających się dawkach przeciwciała lub immunokoniugatu. Dawkowanie może odbywać się dowolną odpowiednią drogą, np. poprzez wstrzyknięcia, jak wstrzyknięcia dożylne lub podskórne, częściowo w zależności od tego, czy podawanie jest krótkotrwałe czy przewlekłe. [0355] Kiedy cel do związania jest zlokalizowany w mózgu, niektóre przykłady wykonania wynalazku, zapewniają przeniesienie przeciwciała lub immunokoniugatu przez barierę krew-mózg. Istnieje kilka znanych w dziedzinie sposobów transportu cząsteczek przez barierę

104 krew-mózg, włączając, bez ograniczania się do, metody fizyczne, metody oparte na lipidach, metody oparte na komórkach macierzystych oraz metody oparte na receptorach lub kanałach. [0356] Metody fizyczne transportu przeciwciała lub immunokoniugatu przez barierę krew-mózg obejmują, bez ograniczania się do, całkowite obejście bariery krew-mózg lub poprzez tworzenie otworów w barierze krew mózg. Metody obejścia obejmują, bez ograniczania się do, bezpośrednie wstrzyknięcie do mózgu (patrz np. Papanastassiou i in., Gene Therapy 9: (2002)), śródmiąższową infuzję/dostarczanie za pomocą wzmocnienia konwekcyjnego (patrz np. Bobo i in., Proc. Nat Acad. Sci. USA 91: (1994)) oraz wszczepienie w mózgu urządzenia do podawania (patrz np. Gill i in., Nature Med. 9: (2003) oraz Gliadel Wafers, Guildford Pharmaceutical). Sposoby tworzenia otworów w barierze krew-mózg obejmują, nie ograniczając się do: USG (patrz np. amerykańska publikacja patentowa nr 2002/ ), ciśnienie osmotyczne (np. poprzez podawanie hipertonicznego mannitolu ((Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation tomy 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilizację poprzez np. bradykininę lub permeabilizator A-7 (patrz np. patenty amerykańskie nr 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206 oraz 5,686,416) oraz transfekcję neuronów, które rozciągają się po obu stronach bariery krew-mózg, wektorami zawierającymi geny kodujące przeciwciało (patrz np. amerykańska publikacja patentowa nr 2003/ ). [0357] Oparte na lipidach metody transportu przeciwciała lub immunokoniugatu przez barierę krew mózg, obejmują, bez ograniczania się do, enkapsulację przeciwciała lub immunokoniugatu w liposomach, sprzężonych z fragmentami wiążącymi przeciwciało, które wiążą się do receptorów w śródbłonku naczyniowym bariery krew-mózg (patrz np. amerykańskie zgłoszenie patentowe nr ) oraz powlekanie przeciwciała lub immunokoniugatu cząstkami lipoproten o niskiej gęstości (patrz np. amerykańskie zgłoszenie patentowe nr ) lub apolipoproteiną E (patrz np. amerykańskie zgłoszenie patentowe nr ). [0358] Oparte na komórkach macierzystych metody transportu przeciwciała lub immunokoniugatu przez barierę krew-mózg, obejmują inżynierowanie genetyczne neuronalnych komórek progenitorowych (NPCs) w celu ekspresji przeciwciała lub immukoniugatu, będących przedmiotem zainteresowania, a następnie wszczepianie komórek macierzystych do mózgu osobników mających podlegać leczeniu. Patrz Behrstock i in. (2005) Gene Ther., 15 grudnia 2005 zaawansowana publikacja internetowa (donosząca, że poddane inżynerii genetycznej NPC, w celu ekspresji czynnika neutroficznego GDNF, redukowały objawy choroby Parkinsona, kiedy wszczepiano je do mózgów modelowych gryzoni oraz naczelnych). [0359] Oparte na receptorach oraz kanałach sposoby transportu przeciwciała lub immunokoniugatu przez barierę krew-mózg, obejmują, bez ograniczania się do, stosowanie blokerów glukokortykoidów w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg (patrz np. amerykańskie zgłoszenia patentowe o numerach 2002/ , 2003/ oraz 2005/ ); aktywację kanałów potasowych (patrz np. amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 2005/ ) inhibowanie transporterów ABC leku (patrz np. amerykańskie

105 zgłoszenie patentowe nr 2003/ ), pokrywanie przeciwciał lub immunokoniugatów transferyną oraz modulowaniu aktywnosci jednego lub więcej receptorów transferyny (patrz np. amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 2003/ ), kationizowanie przeciwciał lub immunokoniugatów (patrz np. patent amerykański nr 5,004,697). [0360] Przeciwciała lub immunokoniugaty, będące przedmiotem wynalazku, będą poddawane formulacji, dawkowane oraz podawane w sposób zgodny z dobrą praktyką medyczną. Czynniki, do rozważenia w tym kontekście obejmują konkretne leczone zaburzenie, konkretny leczony gatunek ssaka, stan kliniczny danego pacjenta, przyczynę zaburzenia, miejsce podania czynnika, sposób podawania, harmonogram podawania oraz inne czynniki znane lekarzom praktykom. Przeciwciało lub immunokoniugat nie muszą być, ale opcjonalnie są formułowane z jednym lub większą liczbą czynników stosowanych obecnie w zapobieganiu lub leczeniu omawianego zaburzenia. Skuteczna ilość takich czynników zależy od ilości przeciwciała lub immunokoniugatu, obecnych w formulacji, rodzaju zaburzenia lub leczenia oraz innych omawianych powyżej czynników. Są one z reguły stosowane w tych samych dawkach oraz przy użyciu tych samych, opisanych w niniejszym opisie, dróg podania lub w od 1% do 99% dawkowań opisanych w niniejszym opisie, lub w jakichkolwiek dawkach czy przy użyciu jakichklowiek dróg podania, które zostały doświadczalnie/klinicznie uznane za odpowiednie do zastosowania. [0361] W celu zapobiegania lub leczenia choroby, odpowiednia dawka przeciwciała lub immunokoniugatu, będących przedmiotem wynalazku (użytych pojedynczo lub w skojarzeniu z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników terapeutycznych, takich jak czynniki chemioterapeutyczne), będzie zależała od rodzaju leczonej choroby, rodzaju przeciwciała lub immunokoniugatu, ciężkości oraz przebiegu choroby, od tego, czy przeciwciało lub immunokoniugat jest podawane w celach zapobiegawczych lub leczniczych, od wcześniejszych terapii, historii choroby pacjenta oraz odpowiedzi na przeciwciało lub immunokoniugat, według uznania lekarza prowadzącego. Przeciwciało lub immunokoniugat są w odpowiedni sposób podane pacjentowi, jednorazowo lub w serii terapii. W zależności od rodzaju i stopnia ciężkości choroby, około 1 µg/kg do 15 mg/kg (np. 0,1 mg/kg 10 mg/kg) przeciwciała lub koniugatu może być proponowaną początkową dawką do podania pacjentowi, czy to, na przykład, jednorazowo lub też w większej liczbie oddzielnych podań lub poprzez wlew ciągły. Jedna typowa dawka dzienna może wahać się w zakresie od około 1 µg/kg do 100 mg/kg lub więcej, w zależności od wyżej wymienionych czynników. W celu wielokrotnego podawania w okresie kilkudniowym lub dłuższym, w zależności od uwarunkowań, leczenie podtrzymuje się aż do wystąpienia pożądanego stłumienia objawów choroby. Jedno z przykładowych dawkowań przeciwciała lub immunokoniugatu będzie się wahać w zakresie od około 0,05 mg/kg do około 10 mg/kg. Tak więc, pacjentowi może zostać podana jedna lub więcej dawek w ilości około 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg lub 10 mg/kg (lub dowolne ich kombinacje). Takie dawki mogą być podawane sporadycznie, np. raz w tygodniu lub raz na trzy tygodnie (np. tak, że pacjent otrzymuje od około dwóch do około dwudziestu lub np. około sześciu dawek przeciwciała lub immunokoniugatu). Może być podana początkowa, wyższa dawka wysycająca z następującymi po niej niższymi dawkami. Przykładowy schemat dawkowania obejmuje podanie wstępnej dawki wysycającej,

106 wynoszącej około 4 mg/kg oraz następczych cotygodniowych dawek podtrzymujących, około 2 mg przeciwciała/kg. Jakkolwiek, inne schematy dawkowania mogą być również użyteczne. Postęp tej terapii może być łatwo monitorowany za pomocą konwencjonalnych technik i oznaczeń. 3. Oznaczenia [0362] Przeciwciała anty-tat226 oraz immunokoniugaty, będące przedmiotem wynalazku, mogą być charakteryzowane za pomocą różnych znanych w dziedzinie oznaczeń, ze względu na ich właściwosci fizyczne/chemiczne i/lub aktywności biologiczne. a) Oznaczenia aktywności [0363] W jednym aspekcie, dostarczane oznaczenia służą identyfikowaniu przeciwciał anty-tat226 lub ich immunokoniugatów, posiadających aktywność biologiczną. Aktywność biologiczna może obejmować, na przykład, zdolność do inhibowania wzrostu komórek lub proliferacji (np. aktywność zabijania komórek ) lub zdolność do indukowania śmierci komórkowej, włączając programowaną śmierć komórki (apoptozę). Dostarcza się także przeciwciała lub immunokoniugty o takiej aktywności biologicznej in vivo i/lub in vitro. [0364] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 lub jego immunokoniugat jest testowany pod kątem zdolności inhibowania wzrostu komórek lub proliferacji in vitro. Oznaczenia inhibicji wzrostu komórek lub proliferacji są dobrze znane w dziedzinie. Niektóre oznaczenia proliferacji komórek, wyszczególnione poprzez opisanie w oznaczeniach zabijania komórek w niniejszym opisie, mierzą żywotność komórek. Jednym z takich oznaczeń jest CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, który jest dostępny komercyjnie z Promega (Madison, WI). Oznaczenie to określa liczbę żywych komórek w hodowli, w oparciu o zliczanie ilościowe obecnego ATP, który jest wskaźnikiem aktywności metabolicznej komórek. Patrz Crouch i in. (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88, patent amerykański nr Oznaczenie może być przeprowadzone na płytkach 96- lub 384-studzienkowych, co predysponuje je do stosowania w wysokiej wydajności zautomatyzowanych badań przesiewowych. (HTS). Patrz Cree i in. (1995) AntiCancer Drugs 6: Procedura oznaczenia polega na dodaniu pojedynczego reagentu (CellTiter-Glo Reagent) bezpośrednio do hodowanych komórek. To skutkuje lizą komórek oraz wygenerowaniem syganału luminescencyjnego, będącego produktem reakcji lucyferazy. Sygnał luminescencyjny jest proporcjonalny do ilości obecnego ATP, co jest bezposrednio proporcjonalne do liczby żywych komórek, obecnych w hodowli. Dane mogą być zapisywane przez luminometr lub kamerę CCD. Wydajność luminescencji jest wyrażona jako względne jednostki światła (RLU). [0365] Innym oznaczeniem do proliferacji komórek jest test MTT, oznaczenie kolorymetryczne, które mierzy utlenienie bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5- difenylotetrazolium do formazanu, za pomocą reduktazy mitochondrialnej. Oznaczenie to, podobnie jak oznaczenie CellTiter-Glo, wskazuje liczbę aktywnych metabolicznie komórek, obecnych w hodowli komórkowej. Patrz np. Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65: oraz Zhang i in. (2005) Cancer Res. 65:

107 [0366] W jednym aspekcie, przeciwciało anty-tat226 jest testowane pod kątem jego zdolności do indukowania śmierci komórkowej in vitro. Oznaczenia indukcji śmierci komórkowej są dobrze znane w dziedzinie. W niektórych przykładach wykonania, takie oznaczenie mierzy, np. utratę integralności błony komórkowej, jak wskazano za pomocą pomiaru poboru jodku propidyny (PI), błękitu trypanu (patrz Moore i in. (1995) Cytotechnology, 17: 1-11) lub 7AAD. W przykładowych pomiarach poboru jodku propidyny (PI), komórki są hodowane w pożywce Dulbecco s Modified Eagle Medium (D-MEM): Ham s F-12 (50: 50), wzbogaconych 10% termicznie inaktywowaną FBS [bydlęcą surowicą płodową](hyclone) oraz 2 mm L-glutaminą. Tak więc, oznaczenie jest prowadzone pod nieobecność dopełniacza oraz efektorowych komórek odpornościowych. Komórki są wysiewane w gęstości 3 x 10 6 na szalkę w szalkach o średnicy 100 x 20 mm i pozwala im się na łączenie się przez noc. Pożywka jest usuwana oraz zastępowana świeżą, niewzbogaconą pożywką lub pożywką zawierającą różne stężenia przeciwciała lub immunokoniugatu. Komórki są inkubowane przez trzydniowy okres czasu. Po traktowaniu, szalki zarośnięte pojedynczą warstwą komórek przemywa się PBS, a komórki odrywane za pomocą trypsynizacji. Następnie komórki są wirowane przy prędkości 1200 rpm przez 5 minut, w temperaturze 5 C, osad zawiesza się ponownie w 3 ml zimnego buforu wiążącego Ca 2+ (10 mm Hepes, ph 7,4, 140 mm NaCl, 2,5 mm CaCl 2 ) i dzieli na porcje przy przenoszeniu do 35 mm, przykrytych filtrami, probówek (1 ml na probówkę, 3 probówki na grupę poddawaną leczeniu) w celu usunięcia grudek komórek. Następnie do probówek jest dodawany PI (10 μg/ml). Próbki są analizowane za pomocą cytometru przepływowego FACSCAN oraz oprogramowania FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). W ten sposób są identyfikowane przeciwciała lub immunokoniugaty, które indukują statystycznie istotne poziomy śmierci komórkowej, jak określono poprzez pobór PI. [0367] W jednym aspekcie, przeciwciało anty-tat226 lub jego immunokoniugat są testowane pod kątem ich zdolności do indukowania apoptozy (programowanej śmierci komórkowej) in vitro. Przykładowym oznaczeniem dla przeciwciał lub immunokoniuatów, które indukują apoptozę, jest test wiązania aneksyny. W przykładowym teście wiązania aneksyny komórki są hodowane oraz wysiewane na szalkach, jak opisano w poprzednim akapicie. Pożywka jest usuwana oraz zastępowana świeżą, niewzbogaconą lub pożywką zawierającą 0,001 do 10 μg/ml przeciwciała lub immunokoniugatu. Po upływie trzydniowego okresu inkubacji, zarośnięte pojedynczą warstwą komórek szalki są przemywane PBS, a komórki odrywane za pomocą trypsynizacji. Następnie komórki są wirowane, zawieszane w 3 ml zimnego buforu wiążącego Ca 2+ oraz dzielone na równe objętości do probówek, jak opisano w poprzednim akapicie. Następnie do probówek jest dodawana znakowana aneksyna (np. aneksyna V-FITC) (1μg/ml). Próbki są alizowane za pomocą cytometru przepływowego FACSCAN oraz oprogramowania FACSCONVERT CellQuest (BD Biosciences). W ten sposób są identyfikowane przeciwciała lub immunokoniugaty, które indukują statystycznie istotne poziomy wiązania aneksyny w stosunku do kontroli. Innym przykładowym oznaczeniem dla przeciwciał lub immunokoniugatów, które indukują apoptozę, jest kolorymetryczny pomiar (ELISA) histonowego DNA, do detekcji międzynukleosomalnej

108 degradacji genomowego DNA. Takie oznaczenie może być prowadzone za pomocą, np. Cell Death Detection ELISA kit (Roche, Palo Alto, CA). [0368] Komórki do stosowania w którymkolwiek z powyższych oznaczeń in vitro, obejmują komórki lub linie komórkowe, które wykazują naturalną ekspresję TAT226 lub te, które zostały poddane inzynierii po to, aby wykazywały ekspresję TAT226. Takie komórki obejmują komórki guza, które wykazują nadekspresję TAT226 w stosunku do komórek prawidłowych tego samego pochodzenia tkankowego. Takie komórki obejmują także linie komórkowe (włączając linie komórkowe guza), które wykazują ekspresję TAT226 oraz linie komórkowe, które nie wykazują naturalnej ekspresji TAT226, ale zostały poddane transfekcji kwasami nukleinowymi, kodującymi TAT226. Dostarczone w niniejszym opisie przykładowe linie komórkowe do zastosowania w powyższych oznaczeniach in vitro, obejmują linię komórek ludzkiego raka jajnika OVCAR3, która wykazuje ekspresję TAT226 oraz linę komórek ludzkiego raka jelita grubego HCT116, transfekowaną kwasami nukleinowymi, kodującymi TAT226. [0369] W jednym aspekcie, przeciwciało anty-tat226 lub jego immunokoniugat są testowane pod kątem ich zdolności do inhibicji wzrostu komórkowego lub proliferacji in vivo. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 lub jego immunokoniugat są testowane pod kątem ich zdolności do inhibicji wzrostu guza in vivo. Do takiego testowania mogą być użyte układy modelowe in vivo, takie jak modele heteroprzeszczepów. W przykładowym układzie heteroprzeszczepu, komórki ludzkiego guza są wprowadzone do odpowiedniego zwierzęcia (nie człowieka), z obniżoną odpornością, jak np. pozbawione grasicy nagie myszy ( nude ). Przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku, są podawane zwierzęciu. Mierzona jest zdolność przeciwciała lub immunokoniugatu do zahamowania lub zmniejszenia wzrostu guza. W niektórych przykładach wykonania powyższego układu heteroprzeszczepów, komórki guza ludzkiego są komórkami od ludzkiego pacjenta. Takie modele heteroprzeszczepów są dostępne komercyjnie z Oncotest GmbH (Frieberg, Niemcy). W niektórych przykładach wykonania, komórki guza ludzkiego są komórkami linii guza ludzkiego, jak wyszczególnione w niniejszym opisie komórki OVCAR3. W niektórych przykładach wykonania, komórki ludzkiego guza są wprowadzone do odpowiedniego zwierzęcia (nie człowieka), z obniżoną odpornością, poprzez iniekcję podskórną lub wszczepienie do odpowiedniego miejsca, jak tkanka tłuszczowa sutka. b) Oznaczenia wiązania oraz inne oznaczenia [0370] W jednym aspekcie, przeciwciało anty-tat226 jest testowane pod kątem aktywności wiązania antygenu. Na przykład, w niektórych przykładach wykonania, przeciwciało anty-tat226 jest testowane pod kątem zdolności wiązania TAT226, podlegająego ekspresji na powierzchni komórki. Oznaczenie FACS, jak to opisano w Przykładzie D, może być wykorzystane do takiego testowania. [0371] W jednym aspekcie, oznaczenie współzawodnictwa może być wykorzystane do identyfikacji przeciwciała monoklonalnego, które konkuruje z YWO.32, YWO.49,

109 YWO.49.B7, YWO.49.C9 YWO.49.H2 lub YWO.49.H6 o wiązanie z TAT226. W niektórych przykładach wykonania, takie współzawodniczące przeciwciało wiąże się do tego samego epitopu (np. epitopu liniowego lub konformacyjnego), który jest wiązany przez YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 lub YWO.49.H6. Przykładowe oznaczenia współzawodnictwa obejmują, bez ograniczania się do: rutynowe oznaczenia, takie jak te dostarczone przez Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, rozdz. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Szczegółowe przykładowe sposoby mapowania epitopu, do którego wiążą się przeciwciała, są dostarczone przez Morris (1996) Epitope Mapping Protocols w Methods in Molecular Biology, tom 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Mówi się, że dwa przeciwciała wiążą się do tego samego epitopu, jeśli każde z nich blokuje wiązanie drugiego w 50% lub więcej. [0372] W przykładowych oznaczeniach współzawodnictwa, unieruchomione TAT226 jest inkubowane w roztworze zawierającym pierwsze znakowane przeciwciało, które wiąże się do TAT226 (np. YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 lub YWO.49.H6) oraz drugie przeciwciało nieznakowane, które jest testowane pod kątem jego zdolności do współzawodnictwa z pierwszym przeciwciałem o wiązanie TAT226. Drugie przeciwciało może być obecne w nadsączu komórek hybrydoma. Jako kontrola, unieruchomione TAT226 jest inkubowane w roztworze zawierającym pierwsze znakowane przeciwciało, ale bez drugiego nieznakowanego przeciwciała. Po inkubacji w warunkach umożliwiających wiązanie pierwszego przeciwciała do TAT226, nadmiar niezwiązanego przeciwciała jest usuwany oraz mierzona jest ilość znacznika związanego z unieruchomionym TAT226. Jeśli ilość znacznika, związanego z unieruchomionym TAT226 jest znacząco zredukowana w próbce badanej w stosunku do próbki kontrolnej, oznacza to, że drugie przeciwciało współzawodniczy z pierwszym przeciwciałem o wiązanie do TAT226. W niektórych przykładach wykonania, unieruchomione TAT226 jest obecne na powierzchni komórki lub w preparacie blon komórkowych, otrzymanym z komórek wykazujących na swej powierzchni ekspresję TAT226. [0373] W jednym aspekcie, oczyszczone pprzeciwciała anty-tat226 mogą być dalej charakteryzowane za pomocą serii oznaczeń obejmujących, ale nieograniczających się do, sekwencjonowanie N-końca, analizę składu aminokwasowego, wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), spektrometrię masową, niedenaturującą chromatografię jonowymienną oraz trawienie papainą. [0374] W jednym przykładzie wykonania, wynalazek analizuje zmienione przeciwciało, które posiada niektóre, ale nie wszystkie, funkcje efektorowe, które czynią je pożądanym kandydatem dla wielu zastosowań, w których okres półtrwania przeciwciała in vivo jest ważny, ale niektóre funkcje efetorowe (jak dopełniacz oraz ADCC) nie są niezbędne lub są szkodliwe. W niektórych przykładach wykonania, aktywności Fc przeciwciała są mierzone w celu upenienia się, że zostały zachowane tylko pożądane właściwości. Można przeprowadzić pomiary cytotoksyczności in vitro i/lub in vivo w celu potwierdzenia redukcji/deplecji aktywności CDC i/lub ADCC. Na przykład, oznaczenie wiązania receptora Fc (FcR) może być przeprowadzone w celu potwierdzenia, że przeciwciało wykazuje brak

110 wiązania FcγR (stąd potencjalny brak aktywności ADCC), ale zachowuje zdolność wiązania FcRn. Komórki pierwotne do mediacji ADCC, komórki NK, wykazują jedynie ekspresję FcγRIII, podczas gdy monocyty wykazują ekspresję FcγRI, FcγRII and FcγRIII. Ekspresja FcR w komórkach hematolopoetycznych jest podsumowana w Tabeli 3 na stronie 464 Ravetch oraz Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: (1991). Przykład oznaczenia in vitro w celu oceny aktywności ADCC cząsteczki, będącej przedmiotem zainteresowania, jest opisany w patencie amerykańskim nr 5,500,362 lub 5,821,337. Komórki efektorowe, przydatne do takich oznaczeń, obejmują jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) oraz komórki NK. Zamiennie lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki, będącej przedmiotem zainteresowania, może być mierzona in vivo, np. w modelach zwierzęcych, jak te przedstawione przez Clynes i in., PNAS (USA) 95: (1998). Oznaczenia wiązania C1q mogą również być prowadzone celem potwierdzenia, że przeciwciało nie jest zdolne do wiązania C1q i stąd pozbawione jest aktywności CDC. W celu oznaczenia aktywacji dopełniacza, może być prowadzone oznaczenie CDC, jak np. opisano przez Gazzano-Santoro i in., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Wiązanie FcRn oraz klirens/okres półtrwania mogą być również mierzone z użyciem znanych w dziedzinie sposobów. F. Wyroby przemysłowe [0375] Dostarcza się ujawniony w niniejszym opisie wyrób przemysłowy, zawierający materiały przydatne do leczenia, zapobiegania i/lub diagnozowania zaburzeń opisanych powyżej. Wyrób przemysłowy zawiera pojemnik oraz etykietę lub ulotkę, umieszczone na pojemniku lub związane z pojemnikiem. Do odpowiednich pojemników zalicza się, na przykład, butelki, fiolki, strzykawki itd. Pojemniki mogą być zrobione z różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik. Pojemnik zawiera kompozycję, która sama lub w połączeniu z inną kompozycją, jest skuteczna w leczeniu, zapobieganiu i/lub diagnozowaniu stanu oraz może posiadać jałowy port dostępu (np. pojemnik może być workiem z roztworem do wlewów dożylnych lub fiolką z korkiem przebijanym przez igłę do wstrzyknięć podskórnych). Co najmniej jedną substancją czynną w kompozycji jest przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku. Etykieta lub ulotka, dołączone do opakowania, informują, że kompozycja stosowana jest w leczeniu wybranego stanu chorobowego. Ponadto, wyrób przemysłowy może zawierać (a) pierwszy pojemnik zawierający kompozycję, przy czym kompozycja zawiera przeciwciało lub immunokoniugat, będące przedmiotem wynalazku oraz (b) drugi pojemnik zawierający kompozycję, przy czym kompozycja zawiera uzupełniający czynnik cytotoksyczny lub inny czynnik terapeutyczny. Wyrób przemysłowy w tym przykładzie wykonania wynalazku może ponadto zawierać ulotkę, dołączoną do opakowania, wskazującą, że kompozycje mogą być zastosowane w leczeniu konkretnego schorzenia. Zamiennie lub dodatkowo, wyrób przemysłowy może ponadto zawierać drugi (lub trzeci) pojemnik zawierający dopuszczalny farmaceutycznie bufor, taki jak bakteriostatyczna woda do wstrzyknięć (BWFI), roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami, roztwór Ringera oraz roztwór dekstrozy. Wyrób może ponadto zawierać inne materiały pożądane z komercyjnego punktu widzenia czy z punktu widzenia użytkownika, włączając inne bufory, rozcieńczalniki, filtry, igły oraz strzykawki.

111 IV PRZYKŁADY [0376] Oto przykłady sposobów oraz kompozycji, będących przedmiotem wynalazku. Jest zrozumiałe, że mogą być wdrożone inne przykłady wykonania wynalazku, zgodne z ogólnym opisem powyżej. Pewne przykłady wykonania wynalazku dostarczono wyłącznie do celów porównawczych A. Analiza ekspresji genu TAT226 [0377] Ekspresję ludzkiego genu TAT226 analizowano z wykorzystaniem zastrzeżonej prawnie bazy danych, zawierajacej informacje na temat ekspresji genów (GeneExpress, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD). Analiza graficzna bazy danych GeneExpress została przeprowadzona za pomocą przeglądarki prolili mikromacierzy. Fig. 13 jest graficznym przedstawieniem ekspresji genu TAT226 w różnych tkankach, które są wymienione po lewej stronie. Skala w górnej części wykresu wskazuje poziomy ekspresji genu, w oparciu o intensywność sygnału hybrydyzacyjnego. Kropki pojawiają się powyżej oraz poniżej linii, przylegających do każdej z wymienionych tkanek. Kropki, znajdujące się powyżej linii, przedstawiają ekspresję genu w tkance prawidłowej, kropki pojawiające się poniżej linii przedstawiają ekspresję genu w guzie lub chorej tkance. Fig. 13 pokazuje trend w kierunku zwiększenia ekspresji genu TAT226 w guzie lub chorej tkance w stosunku do ich prawidłowych odpowiedników. W szczególności, TAT226 wykazuje znaczną nadekspresję w nowotworowych oraz zmienionych chorobowo jajnikach w stosunku do prawidłowego jajnika oraz w guzie Wilmsa w stosunku do prawidłowej nerki. Inne tkanki wykazujace nadekspresję w guzie lub zmienionej chorobowo tkance w stosunku do tkanki prawidłowej obejmują tkanki śluzówki macicy, nadnerczy, kości, płuca, skóry oraz tkanki miękkie. Dodatkowo, TAT226 ulega silnej ekspresji w prawidłowej tkance mózgu (jak węchomózgowie, hipokamp, zwoje podstawy mózgu) oraz w tkance guza mózgu lub zmienionej chorobowo tkance mózgowej, jak glejaki. [0378] Bazę danych GeneExpress wykorzystywano także do analizy ekspresji ludzkiego genu TAT226 w prawidłowych jajnikach; prawidłowych jajowodach; jasnokomórkowym raku jajnika, podtypach śluzowym oraz surowiczym torbielakogruczolakoraka, przerzutującym raku jajnika oraz innych rodzajach raka jajnika. Wyniki są przedstawione graficznie na Fig. 14, z wykazanem poszczególnych typów tkanek poniżej wykresu. Skala na osi γ wykresu wskazuje poziomy ekspresji genu oparte o o intensywność sygnału hybrydyzacyjnego. Surowiczy torbielakogruczolakorak oraz przerzutujący rak jajnika wykazywały silną nadekspresję TAT226 w stosunku do prawidłowego jajnika. Podtypy jansnokomórkowy oraz śluzowy wykazywały ekspresję porównywalną z prawidłowym jajnikiem. Prawidłowe jajowody także wykazywały znaczną ekspresję TAT226. Warto zauważyć, ze surowiczy podtyp raka jajnika jest bardzo podobny histologicznie do nabłonka jajowodów, a zarówno jajnik, jak i jajowody pochodzą z tego samego listka zarodkowego. Patrz Fox i in. (2002) Pathology of epithelial ovarian cancer w Ovarian Cancer rozdz. 9 (Jacobs i in., eds., Oxford University Press, Nowy Jork).

112 B. Generacja przeciwciał anty-tat226 [0379] Przeciwciała przeciwko TAT226 zostały wygenerowane poprzez przeszukiwanie bibliotek prezentacji fagowej rekombinowanym białkiem fuzyjnym TAT226-His, zawierającym aminokwasy według SEQ ID NO: 75 oraz C-końcowy znacznik polihistydyny. Biblioteka prezentacji fagowej była syntetyczną biblioteką (Fab') 2 wygenerowaną za pomocą systemu Fab'-zip-fag. Patrz Lee i in. (2004) J. Immunol. Methods 284: Biblioteka składała się z biblioteki HVR łańcucha ciężkiego w sekwencji zrębowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humab4d5-8 (patrz Fig. 5A oraz 5B, drugi akceptor B, SEQ ID NO: 50, 51, 57, 35) oraz nieruchomego regionu zmiennego łańcucha lekkiego humab4d5-8, jak pokazano w SEQ ID NO: 26. Klony wyselekcjonowane za pomocą prezentacji faga zostały poddane przeszukiwaniu przeciwko TAT226-His za pomocą fagowej analizy ELISA (patrz np. Sidhu i in. (2004) J. Mol. Biol. 338: ). Do dalszych analiz wyselekcjonowano klony YWO.32 oraz YWO.49. [0380] W celu poprawy powinowactwa YWO.49, wygenerowano biblioteki prezentacji fagowej z tłem YWO.49, z HVR-H3 oraz HVR-L3 ukierunkowanymi na miękką randomizację, w których wyselekcjonowane reszty aminokwasowe w wyznaczonych HVR były stałe, podczas gdy inne zostały poddane mutagenezie. Wybrane klony poddano przeszukiwaniu za pomocą fagowej analizy ELISA. Wyselekcjonowano do dalszej analizy przeciwciała o dojrzałym powinowactwie, oznaczone YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6. Nukleotydy oraz kodowane sekwencje polipeptydowe regionów VH oraz VL YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 zostały określone jak pokazano na Fig. 9 oraz 10. Sekwencje HVR łańcucha ciężkiego oraz łańcucha lekkiego YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 są przedstawione na Fig Sekwencje konsensusowe HVR-H3 oraz HVR-L3 pochodzące z YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 są także pokazane na Fig. 4. YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 zostały przeformatowane jako pełnej długosci IgG poprzez przeszczep fragmentów Fab' na odpowiednie regiony stałe, za pomocą technik rekombinacji. Eksperymenty opisane dalej zostały przeprowadzone z zastosowaniem przeformatowanych przeciwciał. C. Charakteryzowanie powinowactwa wiazania do rekombinowanego antygenu [0381] Powinowactwo wiązania YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 do rekombinowanego antygenu zostało określone poprzez pomiar powierzchniowego rezonansu plazmonowego za pomocą systemu BIACORE 3000 (Biacore, Inc.,Piscataway, NJ). W skrócie, chipy biosensorowe karboksymetylowanego dekstranu (CMS, Biacore Inc.) zostały zaktywowane chlorowodorkiem N-etylo-N -(3- dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) oraz N-hydroksysukcynoimidem (NHS) zgodnie z zaleceniami dostawcy. Przeciwciało anty-tat226 rozcieńczono do 5μg/ml 10 mm octanem sodu, ph 4,8, przed iniekcją z natężeniem przepływu rzędu 5μl/minutę w celu osiagnięcia około 500 jednostek odpowiedzi (RU) sprzężonego przeciwciała. Następnie, wstrzykiwano 1 M etanoloaminę w celu zablokowania grup, które nie przereagowały. Do pomiaru

113 kinetycznego, wstrzykiwano dwukrotne seryjne rozcieńczenia TAT226-His (0,7 nm do 500 nm), w PBS z 0,05% TWEEN 20 w temperaturze 25 C, z natężeniem przepływu rzędu 25 μl/minutę. Współczynnik asocjacji (k on ) oraz współczynnik dysocjacji (k off ) obliczono za pomocą prostego modelu wiązania Langmuira jeden-na-jeden (oprogramowanie BIAevaluation wersja 3.2). Stała równowagi dysocjacji (K d ) została wyliczona jako stosunek k off /k on. Wyniki tego eksperymentu pokazano poniżej w tabeli 2: TABELA 2 Klon k on /10 5 K off /10-4 Kd (nm) YWO.49 0,074 3,49 47,16 YWO.49.B7 0,27 <0,05 <0,18 YWO.49.C9 1,53 <0,05 <0,03 YWO.49.H2 0,22 0,05 0,23 YWO.49.H6 1,86 0,09 0,05 D. Charakterystyka wiązania przeciwciała TAT226 do powierzchni komórki [0382] Badano zdolność przeciwciał anty-tat226 do wiązania TAT226, ulegającego ekspresji na powierzchni komórek linii ludzkiego raka jajnika, OVCAR3. W odniesieniu do komórek OVCAR 3, zastosowano cytometrię przepływową metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), w obecności lub pod nieobecność YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 lub YWO.49H6. W skrócie, oderwane od podłoża komórki inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem o stężeniu 5μg/ml, przez 1 godzinę na lodzie, płukano oraz inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem (anty-igg ludzkie sprzężone z fikoerytryną) przez 30 minut na lodzie. Przeprowadzono analizę FACS za pomocą cytometru przepływowego FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA). [0383] Wyniki analizy FACS dla YWO.49, YWO.49.H2 oraz YWO.H6 są przedstawione na Fig. 15. Piki po lewej stronie kazdego grafu przedstawiają wiązanie tła, tj. wiązanie wyłącznie drugorzędowego przeciwciała. Piki po prawej stronie grafu przedstawiają wiązanie wskazanego przeciwciała anty-tat226. YWO.49.B7 nie wiązał się znacząco do komórek OVAR3 w metodzie FACS, nawet, jeśli wiązał się z rekombinowanym antygenem z K d w zakresie K d obserwowanym dla YWO.49 oraz innych przeciwciał o dojrzałym powinowactwie (patrz wyniki analizy BIACOREO, tabela 2 powyzej). Wiązanie YWO.49.C9 było porównywalne z tym obserwowanym dla YWO.49.H2 oraz YWO.H6. E. Charakteryzowanie powinowactwa wiązania do antygenu powierzchni komórki [0384] Powinowactwo wiązania YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 dla TAT226, ulegającego ekspresji na powierzchni komórek OVCAR3 badano za pomocą testu współzawodnictwa. W skrócie, pozwalano na wiązanie znakowanego (jodowanego) YWO.49.H2 lub YWO.49.H6 do komórek OVCAR3 w obecnosci nieznakowanego przeciwciała. Powinowactwo wiązania

114 przeciwciał określano zgodnie z metodologią analizy Scatcharda, początkowo opisanej przez Munson i in., Anal. Biochem. 107: 220 (1980). Wyniki tego eksperymentu pokazano ponizej w Tabeli 3: TABELA 3 Klon Kd (nm) YWO.49.H2 0,348 YWO.49.H6 0,404 [0385] Kd YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 jest wyższa dla TAT226, ulegajacego ekspresji na powierzchni komórek OVCAR3 w porównaniu z rekombinowanym TAT226-His (porównaj Kd dla YWO.49.H2 oraz YWO.49.H w tabelach 2 oraz 3), co wskazuje na to, że YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 wiąże się z nieco większym powinowactwem do rekombinowanegotat226-his niż do TAT226, ulegającego ekspresji na powierzchni komórek OVCAR3. F. mrna TAT226 oraz ekspresja białka [0386] Analizowano ekspresję mrna TAT226 w komórkach OVCAR3 oraz w zestawie próbek pochodzących z komórek raka jajnika, za pomocą testu 5' nukleazy (TaqMan ) oraz ilosciowego PCR w czasie rzeczywistym. Próbki raka jajnika, określone HF #### na Fig. 16, były zamrożonymi skrawkami tkanki. RNA izolowano ze skrawków tkankowych, amplifikowano za pomocą zestawu Ambion s Message Amp II kit (Ambion, Austin, TX) oraz poddawano odwrotnej transkrypcji do cdna. cdna TAT226 amplifikowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w obecności nieulegającej wydłużaniu reporterowej sondy, specyficznej dla powielanego produktu. Określany był cykl progowy lub Ct (cykl, w którym sygnał generowany przez przecięcie sondy reporterowej, przekracza tło) i wykorzystywany do obliczenia wyjściowych poziomów mrna TAT226. Poziom mrna TAT226 w zestawie próbek pochodzących z raka jajnika, określano wzgledem poziomu mrna TAT226 w komórkach OVCAR3, jak pokazano na wykresie słupkowym na Fig. 16. [0387] Ekspresję białka TAT226 w komórkach OVCAR3 oraz w powyższym zestawie próbek pochodzących z raka jajnika, analizowano za pomocą immunohistochemii (IHC) jak nastepuje. Skrawki tkankowe próbek raka jajnika (zamrożone i zatopione w parafinie) utrwalano przez 5 minut w acetonie/etanolu. Skrawki przemywano w PBS, blokowano awidyną oraz biotyną (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), każdą przez 10 minut oraz ponownie przemywano PBS. Skrawki blokowano następnie 10% surowicą przez 20 minut i usuwano nadmiar surowicy. Następnie dodawano do skrawków pierwszorzędowe przeciwciało (YWO.49.H2 lubywo.49.h6) w stężeniu 10 μg/ml na 1 godzinę. Skrawki przemywano następnie PBS. Biotynylowane drugorzędowe anty-ludzkie przeciwciało dodawano do skrawków na 30 minut, a następnie skrawki przemywano PBS. Skrawki poddawano ekspozycji na reagent zestawu Vector ABC kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) na 30 minut, a następnie przemywano PBS. Skrawki poddawano następnie

115 ekspozycji na diaminobenzydynę (Pierce) przez 5 minut, a następnie płukano PBS. Następnie skrawki wybarwiano kontrastowano hematoksyliną Mayers, przykrywano szkiełkiem nakrywkowym oraz wizualizowano. IHC na komórkach OVCAR3 przeprowadzano na podstawie tego samego protokołu, za takim wyjątkiem, że komórki najpierw zbierano w postaci osadu, zamrażano, a następnie dzielono na porcje. Następnie poddawao skrawki powyższej procedurze. [0388] Wyniki są przedstawione jakościowo na Fig. 16, z kategoryzacją poziomów ekspresji jak -, +/- lub +. Ogólnie, występowała pełna korelacja pomiędzy poziomem ekspresji mrna TAT226 a ekspresją białka TAT226 na powierzchni komórek OVCAR3. Eksperymenty IHC potwierdziły także, że przeciwiała rozpoznają TAT226 na powierzchni komórek. Histologia każdej komórki z zestawu komórek nowotworowych jest także przedstawiona na Fig. 16, ze skrótem adenoca oznaczającym adenocarcinoma ( gruczolakorak ). G. Produkcja ADC anty-tat226 [0389] ADC anty-tat226 wytwarzano poprzez sprzęganie YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 z następujacymi wyodrębnionymi częściami cząsteczek lek-łącznik: MC-vc-PAB-MMAE; MC-vc-PAB-MMAF oraz MC-MMAF, które są przedstawione powyżejw Części III. C. 1.b.2. Przed sprzęganiem, przeciwciała poddawano częściowej redukcji TCEP, stosując standardowe sposoby, zgodne z metodologią opisaną w WO 2004/ A2. Częściowo zredukowane przeciwciała sprzęgano z powyższymi wyodrębnionymi częściami cząsteczek lek-łącznik za pomocą standardowych sposobów, zgodnych z metodologią opisaną w Doronina i in. (2003) Nat. Biotechnol. 21: oraz US 2005/ A1. W skrócie, częściowo zredukowane przeciwciała łączono z wyodrębnionymi częściami cząsteczek łącznik-lek w celu umożliwienia sprzęgania ugrupowań z resztami cysteiny. Reakcje sprzęgania wygaszano i oczyszczano ADC. Wysycenie leku określano za pomocą HPLC, jak następuje: ADC Wysycenie leku YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE 3,8 YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 4,7 YWO.49.H2-MC-MMAF 4,9 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE 4,4 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF 4,4 YWO.49.H6-MC-MMAF 4,1

116 H. Oznaczenia uśmiercania komórek [0390] Koniugaty przeciwciało-lek (ADC) testowano pod kątem zdolności do inhibowania proliferacji komórek wykazujących ekspresję TAT226 w następujących oznaczeniach uśmiercania komórek, in vitro oraz in vivo: 1. Oznaczenie uśmiercania komórek OVCAR3 in vitro [0391] ADC YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 testowano pod kątem ich zdolności do inhibowania prolieracji komórek OVCAR3. OVCAR3 wysiewano na płytki 96-studzienkowe w RPMI z 20% FBS. Komórki OVCAR3 przy gęstości 3000 komórek na studzienkę inkubowano z różnymi stężeniami ADC, jak pokazano na Fig. 17. Przeciwciało anty-muc16/ca125, sprzężone z MC-vc-PAB-MMAE stanowiło kontrolę pozytywną. MUC16/CA125 jest znanym antygenem raka jajnika. Patrz np. Yin i in. (2001) J. Biol. Chem. 276: Przeciwciało anty-il-8, sprzężone z MC-vc-PAB-MMAE, stanowiło kontrolę negatywną. Po pięciu dniach inkubacji, mierzono żywotność komórek za pomocą testu luminescencyjnego CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI), zgodnie z zaleceniami producenta. Skala na osi γ na Fig. 17 wskazuje względne jednostki światła, czy RLU, pochodzące z luminescencji lucyferazy, co jest miarą żywotności komórek. [0392] Fig. 17 pokazuje, że, podobnie do kontroli pozytywnej, YWO.49.H2-MC-vc-PAB- MMAF oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF, wykazywały aktywność uśmiercania komórek, szczególnie w stężeniach około 0,01 oraz 0,1 μg/ml. YWO.49.H2-MC-vc-PAB- MMAE oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE także posiadały aktywność uśmiercania komórek, ale w mniejszym stopniu niż w przypadku YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF. Wartość IC 50 dla YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF wynosiła około 0,005 nm, a wartość IC 50 dla YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE wynosiła około 0,2 nm. Wartość IC 50 dla wolnego MMAE wynosiła około 0,1 nm. YWO.49.H2-MC-MMAF oraz YWO.49.H6-MC-MMAF nie wykazały w tym oznaczeniu znaczącej aktywności uśmiercania komórek. Należy zauważyć, że w tym konkretnym systemie oznaczeń, przy wysokich stężeniach ADC, włączając kontrolę negatywną ADC, żywotność komórek spada znacząco ze względu na ogólne wysokie stężenie MMAE oraz MMAF. 2. Oznaczenie in vitro uśmiercania komórek z użyciem komórek transfekowanych HCT116 [0393] ADC YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 sprawdzano pod kątem zdolności do inhibowania proliferacji komórek HCT116, linii komórek raka jelita, które zostały poddane trwałej transfekcji kwasem nukleinowym, kodującym ludzkie TAT226. Komórki HCT116, niepoddane transfekcji są normalnie około 5-6 razy mniej wrażliwe na wolne (niesprzężone) MMAE niż komórki OVCAR3.

117 [0394] W skrócie, komórki HCT116 poddano transfekcji, jak następuje. Kwas nukleinowy kodujący znakowane epitopem ludzkie TAT226, skonstruowano w ssaczym wektorze ekspresyjnym pcdna3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Znacznik epitopu skałdał się z aminokwasów 1-53 glikoproteiny wirusa Herpes simplex typu 1 (znacznik gd ), która zastąpiła sekwencję sygnałową z aminokwasów 1-22 na N-końcu ludzkiego TAT226. Rekombinowany wektor został poddany transfekcji do komórek HCT116, z użyciem Lipofectamine200 (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta. Transfekowane komórki HCT116 hodowano w pożywce McCoya 5a, z 10% FBS oraz 0,4 mg/ml G418. Komórki wybarwiano za pomocą przeciwciał anty-gd oraz poddawano sortowaniu metodą FACS w celu wyselekcjonowania pojedynczych klonów, wykazujących ekspresję rekombinowanego białka fuzyjnego gd: ludzkie TAT226. Jeden z klonów, określony HCT116#9-4, został wybrany do dalszej analizy. [0395] W celu przeprowadzenia oznaczenia uśmiercania komórek, komórki HCT116#9-4 wysiewano na płytkach 96-studzienkowych w gęstości 1000 komórek na studzienkę i inkubowano z różnymi stężeniami ADC, jak pokazano na Fig. 18. Przeciwciało anty-gp120, sprzężone z MC-vc-PAB-MMAE, stanowiło kontrolę negatywną. Po 3 dnaich inkubacji mierzono żywotność komórek za pomocą testu luminescencyjnego CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI), zgodnie z instrukcja producenta. [0396] Fig. 18 pokazuje, że YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF oraz YWO.49.H6-MC-vc- PAB-MMAF wykazywały aktywność uśmiercania komórek, szczególnie dla stężenia 0,01μg/ml aż do najwyższych testowanych stężeń. Wartość IC 50 dla YWO.49.H2-MC-vc- PAB-MMAF oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF wynosiła około 0,005 nm, a wartość IC 50 dla wolnego MMAE wynosiła około 0,9 nm. YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE oraz YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE nie wykazały w tym oznaczeniu znaczącej aktywności uśmiercania komórek w stosunku do kontroli negatywnej. Istnienie różnicy pomiędzy aktywnością uśmiercania komórek dla YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE oraz YWO.49.H6- MC-vc-PAB-MMAE w porównaniu z testem aktywności uśmiercania komórek OVCAR3 (powyżej) można przypisać różnym czynnikom, np. gęstości komórek i/lub różnicom we wrażliwości na lek. [0397] Należy zauważyć, że dla kilku innych badanych linii komórkowych, wykazujących normalnie ekspresję mrna lub białka TAT226, ADC YWO.49.H2 oraz YWO.49.H6 nie wykazywały znaczącej aktywności uśmiercania komórek. Może to być spowodowane różnymi czynnikami, np. efektami komórkowo-specyficznymi (zależnymi od typu komórek), poziomami ekspresji TAT226 na powierzchni komórek i/lub rożnicami we wrażliwości na lek. 3. Oznaczenie in vivo, z użyciem przeszczepów HCT116#9-4 [0398] Zastosowano model heteroprzeszczepu in vivo, w celu sprawdzenia niesprzężonego oraz sprzężonego YWO.49.H6 pod kątem zdolności do inhibowania proliferacji komórek guza, wykazujących ekspresję TAT226, in vivo. Guzy wprowadzano pozbawionym grasicy nagim myszom szczepu nu-nu poprzez iniekcję podskórną około 5x10 6 komórek

118 HCT116#9-4, do części grzbietowo-bocznej. Pozwalano na wzrost guzów aż do osiągniącia średniej objętości guza 200 mm 3. Ten punkt czasowy określano jako dzień 0. Jak pokazano na Fig. 19, myszy otrzymywały dożylnie zastzryki wskazanych niesprzężonych przeciwciał lub ADC w dawce 3mg/kg w dniach 0, 7 oraz 16. Sprzężone oraz niesprzężone przeciwciała (Ab) przeciwko alergenowi ambrozji (inaczej krostawiec) służyły jako kontrole negatywne. Średnia objetość guza była mierzona w dniach 3, 7, 10, 16 oraz 21. Jak pokazano na Fig. 19, YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF wykazywał znaczącą aktywność uśmiercania komórek guza, jak mierzono na podstawie średniej objętości guza, w porównaniu z przeciwciałami Ab- MC-vc-PAB-MMAF przeciwko alergenowi ambrozji, w tym konkretnym modelu heteroprzeszczepu. YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE nie wykazywały znaczącej aktywności uśmiercania komórek guza, w porównaniu z przeciwciałami Ab-MC-vc-PAB-MMAF przeciwko alergenowi ambrozji, w tym konkretnym modelu heteroprzeszczepu. Jakkolwiek, ten model heteroprzeszczepu może nie odzwierciedlać aktywności uśmiercania komórek przez WO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE, obserwowanej in vitro, ze względu na różne czynniki, np. różnice we wrażliwości na lek lub poziomy ekspresji TAT226 na powierzchni komórek w mikrośrodowisku heteroprzeszczepu guza. 4. Inne modele heteroprzeszczepu [0399] Inne modele heteroprzeszczepu mogą być użyte do testowania niesprzężonych oraz sprzężonych przeciwciał anty-tat226, pod kątem zdolności do inhibowania proliferacji komórek guza, wykazujacych ekspresję TAT226, in vivo. Na przykład, modele heteroprzeszczepów dla guzów jajnika oraz mózgu, mogą być zapewnione ze źródeł publicznych, takich jak Oncotest GmbH (Frieberg, Niemcy) oraz Southern Research Institute (Birmingham, AL). Modele Oncotest były w szczególności opracowywane na drodze wzrostu guzów, pochodzacych od pacjentów, u myszy z niedoborem odporności szczepu nude. Heteroprzeszczepy, wykazujące ekspresję mrna TAT226 i/lub białka, mogą być przydatne do wykazania aktywności, in vivo, przeciwciał anty-tat226 w uśmiercaniu komórek. [0400] Sprzężone YWO.49.H6 testowano w modelu Oncotest OVXF1023 pod kątem zdolności do inhibowania proliferacji komórek guza jajnika, in vivo. Model Oncotest OVXF1023 pochodzi z przerzutującego, słabo zróżnicowanego, brodawczakowatego surowiczego gruczolakowatego raka jajnika, stadium M1. Myszy OVXF1023 traktowano ADC, wskazanymi na Fig. 20. Na Fig. 20, YWO.49.H6 jest określony jako H6 ; przeciwciało przeciwko alergenowi ambrozji (kontrola) jest określone jako RW, a łącznik MC-vc-PAB- jest określony skrótem vc. ADC podawano w dniach oraz w stężeniach, wskazanych na Fig. 20. Wyniki pokazane na Fig. 20 wskazują, że YWO.49.H6-MC-vc-PAB- MMAF oraz YWO.49.H6-MC-MMAF znacząco redukowały objetość guza, w stosunku do innych ADC. [0401] Powyższy eksperyment został powtórzony z OVXF1023 w podobnych warunkach, ale ze zmianami, jeżeli chodzi o dawki oraz kontrole ADC. W powtórzonym eksperymencie, myszy traktowano wyższymi dawkami (5 mg/kg) YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE oraz niższymi dawkami (5 mg/kg) YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF i YWO.49.H6-MC-MMAF. Wyniki pokazały, że ADC H6 (a w szczególności YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE)

119 wykazywały zredukowaną objetość guza w stosunku do odpowiedniej kontroli ADC (anty-gp120-mc-vc-pab-mmae w stężeniu 6,4 mg/kg; anty-gp120-mc-vc-pab-mmaf w stężeniu 7,2 mg/kg oraz anty-gp120-mc-mmaf w stężeniu 5,4 mg/kg), jakkolwiek różnica w skuteczności pomiędzy H6 ADC a odpowiadającą mu kontrolą nie były istotne statystycznie dla niektórych punktów danych (Dane niepokazane). Różnicę pomiędzy tymi wynikami, a wynikami uzyskanymi w pierwszym eksperymencie OVXF1023 można przypisać różnicom w dawkowaniu H6 ADC oraz obserwacji, ze kontrola ADC anty-gp120 wykazywała niespodziewaną aktywność w redukowaniu objętości guza. [0402] Ponadto, ADC H6 testowano także w innym modelu Oncotest, OVXF899, który pochodzi z umiarkowanie zróżnicowanego, brodawczakowatego surowiczego raka jajnika (guza pierwotnego). ADC H6 nie redukowały objętości guza w tym modelu (Dane niepokazane). Jakkolwiek, ten konkretny model Oncotest wykazywał niską ekspresję TAT226, co może odpowiadać za obserwowane wyniki. I. TioMAb [0403] Stworzono przeciwciała inżynierowane z cysteiną lub tiomab, w których wybrana reszta YWO.49.H6 została podstawiona cysteiną, w celu dostarczenia dodatkowego miejsca sprzęgania wyodrębnionej części cząsteczki łącznik-lek. W szczególności, substytucję A118C (numeracja EU) wykonano w łańcuchu ciężkim YWO.49.H6 lub substytucję V205C (numeracja Kabata) wykonano w łańcuchu lekkim YWO.49.H6. Uzyskane tiomab A118C zostało następnie sprzężone z MC-MMAF, a uzykane tiomab V205C zostało następnie sprzężone albo z MC-MMAF albo z MC-vc-PAB-MMAE. Wszystkie tiomab były zdolne do wiązania komórek OVCAR3, co potwierdzono poprzez analizę FACS (Dane niepokazane). Dorota Rzążewska Rzecznik patentowy

120 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało monoklonalne, które wiąże się do TAT226, przy czym przeciwciało zawiera (1) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (2) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; (3) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową, wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: 7-10; (4) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (5) HVR-L2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (6) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową, wyselekcjonowaną spośród SEQ ID NO: 15-18, przy czym rzeczone przeciwciało, które wiąże TAT226, ma stałą dysocjacji (K D ) 10 nm. 2. Przeciwciało monoklonalne, które wiąże się do TAT226, przy czym przeciwciało zawiera (a), (b), (c) lub (d): (a) (1) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (2) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; (3) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 7; (4) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (5) HVR-L2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (6) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 15 (b) (1) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (2) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; (3) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 8; (4) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (5) HVR-L2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (6) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową SEQ według ID NO: 16 (c) (1) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (2) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5;

121 (3) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 9; (4) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (5) HVR-L2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (6) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 17 (d) (1) HVR-H1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 4; (2) HVR-H2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 5; (3) HVR-H3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 10; (4) HVR-L1 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 12; (5) HVR-L2 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 13 oraz (6) HVR-L3 zawierające sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrzeżenia 2(c). 4. Przeciwciało według zastrzeżenia 2(d) 5. Przeciwciało według zastrzeżenia 2, zawierające ponadto co najmniej jedną sekwencję zrębową, wyselekcjonowaną z sekwencji konsensusowej VH podgrupy III oraz sekwencji konsensusowej VL podgrupy I. 6. Przeciwciało monoklonalne, które wiąże się do TAT226, przy czym przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi wyselekcjonowanymi spośród SEQ ID NO: oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi wyselekcjonowanymi spośród SEQ ID NO: oraz przy czym rzeczone przeciwciało, które wiąże TAT226, ma stałą dysocjacji (K D ) 10 nm. 7. Przeciwciało według zastrzeżenia 6, przy czym przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi wyselekcjonowanymi spośród SEQ ID NO: 24 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową według SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrzeżenia 7, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 24 a domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrzeżenia 6, przy czym przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową według SEQ ID NO: 25 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego, mającą co najmniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową według SEQ ID NO: 30.

122 Przeciwciało według zastrzeżenia 9, przy czym przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: 25 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasową według SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrzeżenia 1, 2 lub 6, przy czym przeciwciało jest fragmentem przeciwciała wyselekcjonowanym spośród fragmentów Fab, Fab -SH, Fv, scfv lub (Fab ) Przeciwciało według zastrzeżenia 1, 2 lub 6, przy czym przeciwciało jest humanizowane. 13. Przeciwciało według zastrzeżenia 1, 2 lub 6, przy czym przeciwciało jest ludzkie. 14. Immunokoniugat zawierający przeiwciało, które wiąże TAT226, jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 13, kowalencyjnie przyłączone do czynnika cytotoksycznego. 15. Immunokoniugat według zastrzeżenia 14, przy czym czynnik cytotoksyczny jest wyselekcjonowany spośród toksyny, czynnika chemoterapeutycznego, antybiotyku, izotopu promieniotwórczego oraz enzymu nukleolitycznego. 16. Immunokoniugat o wzorze Ab-(L-D)p, w którym: (a) Ab jest przeciwciałem monoklonalnym, jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 13; (b) L oznacza łącznik; (c) D oznacza lek o wzorze D E lub D F w którym R 2 i R 6 są obydwa metylami, R 3 i R 4 są obydwa izopropylami, R 5 oznacza -H lub metyl, R 7 oznacza sec-butyl, każdy R 8 jest niezależnie wyselekcjonowany spośród CH 3, O-CH 3, OH oraz H; R 9 oznacza H; R 10 oznacza aryl; Z oznacza -O- lub -NH-; R 11 oznacza H, C 1 -C 8 alkil lub -(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-CH 3 a R 18 oznacza -C(R 8 ) 2 -C(R 8 ) 2 -aryl, a (d) p waha się od 1 do około 8.

123 Immunokoniugat według zastrzeżenia 16, przy czym łacznik jest przyłączony do przeciwciała poprzez grupę tiolową przeciwciała. 18. Immunokoniugat według zastrzeżenia 16, przy czym lek jest wyselekcjonowany spośród MMAE oraz MMAF. 19. Immunokoniugat według zastrzeżenia 18, przy czym lek oznacza MMAE. 20. Immunokoniugat według zastrzeżenia 18, przy czym lek oznacza MMAF. 21. Immunokoniugat według zastrzeżenia 18, przy czym łącznik jest rozkładany przez proteazę. 22. Immunokoniugat według zastrzeżenia 21, przy czym łącznik zawiera dipeptyd Val-Cit. 23. Immunokoniugat według zastrzeżenia 21, przy czym łącznik zawiera jednostkę p-aminobenzylu. 24. Immunokoniugat według zastrzeżenia 21, przy czym łącznik zawiera 6-maleimidokaproil. 25. Immunokoniugat według zastrzeżenia 19, przy czym immunokoniugat ma wzór w którym S oznacza atom siarki, a p waha się od 2 do Immunokoniugat według zastrzeżenia 20, gdzie immunokoniugat ma wzór w którym S oznacza atom siarki, a p waha się od 2 do Kompozycja farmaceutyczna zawierająca immunokoniugat jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 14 do 26 do stosowania w leczeniu zaburzeń proliferacji komórkowej. 28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 27, przy czym zaburzenie proliferacji komórek jest wybrane spośród raka jajnika, raka macicy, guza mózgu oraz guza Wilmsa. 29. Zastosowanie immunokoniugatu jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 14 do 26 do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń proliferacji komórek. 30. Zastosowanie według zastrzeżenia 29, przy czym zaburzenie proliferacji komórek jest wybrane spośród raka jajnika, raka macicy, guza mózgu oraz guza Wilmsa.

124 Immunokoniugat według zastrzeżenia 29, w którym Ab jest przeciwciałem monoklonalnym jak określono w zastrzeżeniu 2(c) lub zastrzeżeniu Immunokoniugat według zastrzeżenia 25, w którym Ab jest przeciwciałem monoklonalnym jak określono w zastrzeżeniu 2(d) lub zastrzeżeniu Immunokoniugat według zastrzeżenia 26, w którym Ab jest przeciwciałem monoklonalnym jak określono w zastrzeżeniu 2(c) lub zastrzeżeniu Immunokoniugat według zastrzeżenia 26, w którym Ab jest przeciwciałem monoklonalnym jak określono w zastrzeżeniu 2(d) lub zastrzeżeniu 10. Dorota Rzążewska Rzecznik patentowy

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142