(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO99/51748 (51) Int.Cl. C12N 15/31 ( ) C07K 14/35 ( ) C07K 19/00 ( ) A61K 39/04 ( ) C12P 21/02 ( ) (54) Immunogenny polipeptyd, kodujący go polinukleotyd, polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu, zawierająca immunogenny polipeptyd kompozycja farmaceutyczna, zawierający polinukleotyd wektor ekspresyjny, kompozycja szczepionki oraz komórka gospodarza (30) Pierwszeństwo: , US, 09/056, , US, 09/223,040 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/01 (73) Uprawniony z patentu: CORIXA CORPORATION, Wilmington, US (72) Twórca(y) wynalazku: YASIR A. SKEIKY, Seattle, US MARK ALDERSON, Bainbridge Island, US ANTONIO CAMPOS-NETO, Bainbridge Island, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunogenny polipeptyd, kodujący go polinukleotyd, polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu, zawierająca immunogenny polipeptyd kompozycja farmaceutyczna, zawierający polinukleotyd wektor ekspresyjny, kompozycja szczepionki oraz komórka gospodarza. Niniejszy wynalazek znajduje przykładowo zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom wywoływanym Mycobacterium tuberculosis. Gruźlica jest przewlekłą chorobą zapalną, wywoływaną zakażeniem M. tuberculosis. Jest ona jedną z najistotniejszych chorób występujących zarówno w krajach rozwijających się jak i stanowi coraz większy problem w rozwiniętych regionach świata. Co rocznie stwierdza się wystąpienie około 8 milionów nowych przypadków oraz 3 miliony zgonów z powodu gruźlicy. Jakkolwiek zakażenie może przez dłuższy czas pozostawać nierozpoznane to zazwyczaj choroba daje objawy ostrego zapalenia płuc, z gorączką i kaszlem bez odkrztuszania. W przypadku braku leczenia dochodzi zwykle do poważnych powikłań i zgonu. O ile, gruźlicę można na ogół zwalczać długotrwałą antybiotykoterapią, to leczenie takie jest niewystarczające do zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby. U osób zakażonych mogą przez pewien czas nie występować jakiekolwiek objawy, a tym samym mogą one potencjalnie zakażać kolejne osoby. Ponadto, mimo że stosowanie się do zaleceń lekarskich ma kluczowe znaczenie, trudno jest nadzorować zachowanie pacjentów. Niektórzy chorzy nie kończą całego cyklu leczenia, co może prowadzić do nieskuteczności takiego leczenia i rozwoju lekooporności. Dla kontrolowania rozprzestrzeniania się gruźlicy istotne znaczenie mają skuteczne szczepienia i trafne wczesne rozpoznanie choroby. Obecnie najskuteczniejszą metodą wywoływania ochronnej odporności jest szczepienie żywymi drobnoustrojami. Najczęstszym stosowanym w tym celu szczepem Mycobacterium jest Bacillus Calmette-Guerin (BCG), awirulentny szczep M. bovis. Jednakże bezpieczeństwo i skuteczność BCG budzą wątpliwości i w niektórych krajach, na przykład w Stanach Zjednoczonych, populacji ogólnej nie poddaje się szczepieniom tym szczepem. Gruźlicę rozpoznaje się zwykle na podstawie testu skórnego, polegającego na śródskórnym podaniu tuberkuliny PPD (oczyszczonej pochodnej białkowej). Swoiste dla antygenu reakcje limfocytów T wywołują wystąpienie po godzinach od wstrzyknięcia mierzalnego stwardnienia w miejscu wstrzyknięcia, co wskazuje na ekspozycję na antygeny Mycobacterium. W przypadku tego testu problemem jest jednak jego czułość i swoistość. Dodatkowo nie jest możliwym odróżnienie osób szczepionych BCG od osób zakażonych. O ile, jak wykazano, głównymi efektorami odporności na M. tuberculosis są makrofagi, to głównymi induktorami tej odporności są limfocyty T. Dowodem kluczowej roli limfocytów T w ochronie przed zakażeniem M. tuberculosis jest częste występowanie M. tuberculosis u chorych z zespołem nabytego braku odporności (AIDS), związane ze zmniejszeniem liczby limfocytów T CD4 + spowodowanym zakażeniem ludzkim wirusem nabytego braku odporności (HIV). Wykazano, że reagujące na Mycobacterium limfocyty T CD4 + są silnymi induktorami interferonu gamma (IFN-γ), który z kolei, jak wykazano, wyzwala działanie makrofagów przeciwko Mycobacterium u myszy. Chociaż rola IFN-γ u ludzi jest mniej oczywista, badania wykazały, że 1,25-dihydroksywitarnina D3, sama lub w połączeniu z IFN-γ lub czynnikiem martwicy nowotworu-alfa, aktywuje ludzkie makrofagi do hamowania zakażenia M. tuberculosis. Ponadto wiadomo, że IFN-γ pobudza ludzkie makrofagi do wytwarzania 1,25- -dihydroksywitaminy D3. Podobnie wykazano, że interleukina-12 (IL-12) odgrywa istotną rolę w pobudzaniu oporności na zakażenie M. tuberculosis. Przegląd immunologii zakażenia M. tuberculosis można znaleźć w Chan i Kaufmann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, red. Bloom, ASM Press, Waszyngton, D.C. W związku z tym wciąż istnieje potrzeba opracowania ulepszonych szczepionek i ulepszonych sposobów rozpoznawania, zapobiegania i leczenia gruźlicy. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunogenny polipeptyd zawierający, korzystnie składający się z sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 24, przy czym ta sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową delecję, addycję i/lub substytucję. Zgodnie z korzystną postacią wykonania przedmiotem wynalazku jest immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, korzystniej składający się z sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 24. Przedmiotem wykonania jest również immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowa zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16 albo zgodną z resztami 9 do 596

3 PL B1 3 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję. Immunogenny polipeptyd według wynalazku korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasową, korzystniej zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami aminokwasów 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16. Zgodnie z inną postacią wykonania wynalazku immunogenny polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16 albo zgodnej z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym sekwencja ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję, korzystnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasową, jeszcze korzystniej immunogenny polipeptyd według wynalazku składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16 albo zgodnej z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24. Zgodnie z kolejnym aspektem przedmiotem niniejszego wynalazku jest polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogenny polipeptyd według wynalazku. Wynalazek dotyczy również polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową zgodną z SEK NR ID: 15 albo z SEK NR ID: 23 lub sekwencją kodującą ten sam produkt genowy, korzystnie polinukleotydu składającego się z sekwencji nukleotydowej zgodnej z SEK NR ID: 15 albo z SEK NR ID: 23 lub z sekwencją kodującą ten sam produkt genowy, najkorzystniej składającego się z sekwencji nukleotydowej zgodnej z SEK NR ID: 15 albo z SEK NR ID: 23. Przedmiotem wynalazku jest także polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 16, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na DPV, MTI i MTCC2 w teście proliferacji komórek T lub teście wytwarzania interferonu gamma, przy czym korzystnie polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugim nukleotydem, który jest komplementarny do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 16, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na DPV, MTI i MTCC2 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma. Zgodnie z innym aspektem wykonania przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma, przy czym korzystnie polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej reszty 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub wytwarzania interferonu gamma. Korzystnie polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej reszty 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub wytwarzania interferonu gamma. Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku. Korzystnie, polipeptyd ten jest w fuzji z drugim polipeptydem heterologicznym.

4 4 PL B1 Wynalazek dostarcza ponadto kompozycji farmaceutycznej do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis zawierającej immunogenny polipeptyd według wynalazku albo polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku. Zgodnie z kolejnym korzystnym aspektem wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis zawierającej polinukleotyd według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor ekspresyjny, korzystnie wektor wirusowy, zawierający polinukleotyd według wynalazku. Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji szczepionki, zawierającej immunogenny polipeptyd według wynalazku albo polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku i adiuwant. Wynalazek dostarcza ponadto kompozycji szczepionki zawierającej polinukleotyd według wynalazku i adiuwant. Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub w zapobieganiu zakażeniom M. Tuberculosis. Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku jest również polinukleotyd według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub w zapobieganiu zakażeniom M. Tuberculosis. Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu według wynalazku, w którym prowadzi się rekombinowaną ekspresję polinukleotydu według wynalazku. Zgodnie z kolejnym aspektem wynalazek dotyczy izolowanej komórki gospodarza, w której zachodzi rekombinacyjna ekspresja polipeptydu według wynalazku. Niniejszy wynalazek opiera się w części na spostrzeżeniu, że polinukleotydy, które zawierają od dwóch do pięciu sekwencji kodujących M. tuberculosis, wytwarzają rekombinacyjne białka fuzyjne, które zachowują immunogenność i antygenowość ich poszczególnych składowych. Te opisane niniejszym białka fuzyjne według wynalazku indukują zarówno reakcje limfocytów T, jak i limfocytów B, co można potwierdzić poprzez proliferację limfocytów T, wytwarzanie cytokin i wytwarzanie przeciwciał. Ponadto jako immunogen stosowano in vivo białko fuzyjne z adiuwantami w celu wywołania zarówno komórkowej, jak i humoralnej odporności na M. tuberculosis. Ponadto wytwarzano konstrukt białka fuzyjnego do stosowania w wytwarzaniu szczepionki z adiuwantem do uzyskania długotrwałej ochrony zwierząt przed rozwojem gruźlicy. Białko fuzyjne było immunogenem skuteczniejszym, niż mieszanina poszczególnych jego składników białkowych. Izolowane lub oczyszczone polipeptydy M. tuberculosis stosuje się powszechnie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do podawania pacjentowi w celu zapobiegania i/lub leczenia zakażenia M. tuberculosis. Immunogenność białka fuzyjnego można zwiększyć dodając adiuwant. Izolowane lub oczyszczone polinukleotydy stosuje się natomiast do wytwarzania rekombinacyjnych antygenów polipeptydu fuzyjnego in vitro. Polinukleotydy można także podawać pacjentowi bezpośrednio jako szczepionki DNA w celu wywołania ekspresji antygenu w organizmie pacjenta, i w wyniku tego wywołania reakcji immunologicznej przeciwko M. tuberculosis. Polipeptydy te można również stosować do testów in vitro do wykrywania przeciwciał humoralnych lub odporności komórkowej przeciwko M. tuberculosis w celu rozpoznawania zakażenia lub obserwacji postępu choroby. Ponadto polipeptydy można stosować jako środek diagnostyczny in vitro w postaci śródskórnego testu skórnego. Zamiast tego polipeptydy, można stosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał przeciwko M. tuberculosis w organizmie zwierzęcia (innego niż człowiek). Przeciwciała można stosować do wykrywania docelowych antygenów in vivo i in vitro. 4. Niniejszy wynalazek zilustrowano w opisanych poniżej przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym Fig. 1A i 1B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 1) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 2) białka trifuzyjnego Ra12-TbH9-Ra35 (oznaczonego jako Mtb32A) Fig. 2: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 3) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 4) białka trifuzyjnego Erdl4-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb39A) Fig. 3A-3D: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 5) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 6) białka trifuzyjnego TbRa3-38kD-Tb38-1 Fig. 4A-4D: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 7) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 8) białka bifuzyjnego TbH9-Tb38-1 Fig. 5A-5J: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 9) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 10) białka tetrafuzyjnego TbRa3-38kD-Tb38-1DPEP (oznaczonego jako TbF-2)

5 PL B1 5 Fig. 6A i 6B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 11) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 12) białka pentafuzyjnego Erdl4-DPV-MTI-MSL-MTCC2 (oznaczonego jako Mtb88f) Fig. 7A i 7B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 13) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 14) białka tetrafuzyjnego Erdl4-DPV-MTI-MSL (oznaczonego jako Mtb46f) Fig. 8A i 8B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 15) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 16) białka tetrafuzyjnego DPV-MTI-MSL-MTCC2 (oznaczonego jako Mtb71f) Fig. 9A i 9B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 17) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 18) białka trifuzyjnego DPV-MTI-MSL (oznaczonego jako Mtb31f) Fig. 10A i 10B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 19) i sekwencja aminokwasowa (SEK NR ID: 20) białka trifuzyjnego TbH9-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb61f) Fig. 11A i 11B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 21) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 22) białka trifuzyjnego Erdl4-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb36f) Fig. 12A i 12B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 23) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 24) białka bifuzyjnego TbH9-Ra35 (oznaczonego jako Mtb59f) Fig. 13A i 13B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 25) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 26) białka bifuzyjnego Ra12-DPPD (oznaczonego jako Mtb24) Fig. 14A-14F: przedstawia reakcje proliferacyjne limfocytów T sześciu osobników PPD+ po stymulacji dwoma białkami fuzyjnymi i ich oddzielnymi składnikami Fig. 15A-15F: przedstawia wytwarzanie IFN-γ w organizmach sześciu osobników PPD+ po stymulacji dwoma białkami fuzyjnymi i ich oddzielnymi składnikami Fig. 16A-16F: przedstawia proliferację limfocytów T myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem Fig. 17: przedstawia wytwarzanie IFN-γ myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem Fig. 13: przedstawia wytwarzanie IL-4 myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem Fig. 19A-19F: przedstawia stężenie przeciwciał w surowicy myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem Fig. 20A-20C: przedstawia przeżycie świnek morskich po ekspozycji na M. tuberculosis w aerozolu. Przed ekspozycją na bakterie u świnek morskich zastosowano jako immunogen białka fuzyjne Mtb32A i Mtb39A, w kompozycji z adiuwantem SBASlc (20A), SBAS2 (20B) lub SBAS7 (20C). Kontrolą dodatnią jest BCG. Fig. 21A i 21B: przedstawia stymulację proliferacji i wytwarzania IFN-γ w TbH9-swoistych limfocytach T przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1. Fig. 22A i 22B: przedstawia stymulację proliferacji i wytwarzania IFN-γ w Tb38-1-swoistych limfocytach T przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1. Fig. 23A i 23B: przedstawia stymulację proliferacji i wytwarzania IFN-γ w limfocytach T, dla których uprzednio wykazano reakcję zarówno na antygen TbH-9, jak i Tb38-1, przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1. Przedmiotem niniejszego wynalazku są immunogeniczne polipeptydy, które stanowią antygeny użyteczne w leczeniu i zapobieganiu gruźlicy, polinukleotydy kodujące takie antygeny i sposoby ich zastosowania. Antygeny te są polipeptydami fuzyjnymi antygenów M. tuberculosis i jego odmian. Bardziej szczegółowo, antygeny te zawierają co najmniej dwa polipeptydy M. tuberculosis, które uległy fuzji do większej cząsteczki polipeptydu fuzyjnego. Mogą one ponadto zawierać inne składniki, przeznaczone do zwiększenia immunogenności antygenów lub do ulepszenia tych antygenów w innych aspektach, na przykład izolacja antygenów poprzez dodanie przedłużenia z reszt histydynowych na jednym z końców antygenu. Antygeny swoiste dla M. tuberculosis Antygeny swoiste dla M. tuberculosis przedstawiono na Fig. 1A-13B, włączając homologi i odmiany tych antygenów. Antygeny te można modyfikować poprzez na przykład dodanie łącznikowych sekwencji peptydowych, jak to opisano poniżej. Te peptydy łącznikowe można włączać między jeden lub więcej polipeptydów, tworzących każde z białek fuzyjnych przedstawionych na Fig. 1A-13S. Innymi antygenami są antygeny opisane na Fig. 1A-13B, połączone ze znanym antygenem M. tuberculosis, takim jak uprzednio opisywany antygen 38 kd (SEK NR ID: 27) (Andersen i Hansen, 1989, Infect. Immun. 57: ; Genbank nr nabycia M30046).

6 6 PL B1 Testy immunogenności Antygeny i ich immunogenne części, mają zdolność do wywoływania reakcji immunogennej. Bardziej szczegółowo, antygeny mają zdolność do wywoływania proliferacji i/lub wytwarzania cytokin (to znaczy wytwarzania interferonu γ i/lub interleukiny 12) w limfocytach T, komórkach NK, limfocytach B i/lub makrofagach, pochodzących od osobnika odpornego na M. tuberculosis. Dobór typu komórki do zastosowania w ocenie reakcji immunogennej będzie zależał od badanej reakcji. Na przykład wytwarzanie interleukiny 12 najłatwiej ocenia się z zastosowaniem preparatów zawierających limfocyty B i/lub makrofagi. Osobnik odporny na M. tuberculosis jest to taki osobnik, którego uważa się za opornego na rozwój gruźlicy poprzez to, że doszło u niego do skutecznej reakcji limfocytów T przeciwko M. tuberculosis (to znaczy, jest on w zasadzie wolny od objawów choroby). Osobniki takie można zidentyfikować w oparciu o silnie dodatni (to znaczy, stwardnienie o średnicy powyżej 10 mm) wynik testu skórnego na białka gruźlicy (PPD) i brak jakichkolwiek przedmiotowych i podmiotowych objawów gruźlicy. Limfocyty T, komórki NK, limfocyty B i makrofagi pochodzące od osobnika odpornego na M. tuberculosis można wytwarzać sposobami znanymi specjalistom. Na przykład można stosować preparat PBMC (to znaczy, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej) bez dalszego rozdzielania komórek składowych. PBMC można na ogół wytworzyć na przykład stosując odwirowanie gęstości poprzez FICOLL" (Winthrop Laboratories, NY). Limfocyty T do testów można również oczyszczać bezpośrednio z PBMC. Zamiast tego można stosować wzbogaconą linię komórkową limfocytów T przeciwko białkom Mycobacterium, lub klony limfocytów T reaktywne na poszczególne białka Mycobacterium. Takie klony limfocytów T można wytwarzać na przykład poprzez hodowlę PBMC od osobników odpornych na M. tuberculosis z białkami Mycobacterium przez czas 2-4 tygodni. Umożliwia to ekspansję jedynie limfocytów T swoistych przeciwko białkom Mycobacterium, co powoduje powstanie linii złożonej wyłącznie z takich komórek. Komórki te można następnie klonować i badać z poszczególnymi białkami, stosując sposoby znane specjalistom w celu dokładniejszego zdefiniowania swoistości poszczególnych limfocytów T. Ogólnie, antygeny, które wypadają dodatnio w testach na proliferację i/lub wytwarzanie cytokin (to znaczy wytwarzanie interferonu γ i/lub interleukiny 12), wykonanych z zastosowaniem limfocytów T, komórek NK, limfocytów B i/lub makrofagów pochodzących od osobników odpornych na M. tuberculosis, uważa się za immunogenne. Testy takie można przeprowadzić na przykład stosując przykładowe opisane poniżej procedury. Immunogenne części takich antygenów można zidentyfikować stosując podobne testy, i mogą one być obecne w polipeptydach opisanych poniżej. Zdolność polipeptydu (na przykład immunogenicznego antygenu, lub jego części lub innej odmiany) do wywoływania proliferacji komórek, ocenia się poprzez zetknięcie komórek (na przykład komórek T i/lub komórek NK) z polipeptydem i pomiar proliferacji komórek. Na ogół ilość polipeptydu, wystarczająca do oceny około 10 5 komórek, wynosi od około 10 ng/ml do około 100 µg/ml, a korzystnie wynosi około 10 µg/ml. Inkubację polipeptydu z komórkami prowadzi się typowo w temperaturze 37 C przez około sześć dni. Po inkubacji z polipeptydem komórki bada się pod kątem reakcji proliferacyjnej, którą można oceniać sposobami znanymi specjalistom, na przykład poprzez eksponowanie komórek na impuls znakowanej radioaktywnie tymidyny i pomiar włączania znacznika do DNA komórek. Ogólnie, polipeptyd powodujący co najmniej trzykrotne zwiększenie proliferacji powyżej poziomu tła (to znaczy proliferacji obserwowanej dla komórek hodowanych bez polipeptydu) uważa się za zdolny do indukcji proliferacji. Zdolność polipeptydu do stymulowania wytwarzania interferonu γ i/lub interleukiny 12 można oceniać poprzez zetknięcie komórek z polipeptydem i pomiar poziomu interferonu γ lub interleukiny 12 wytwarzanej przez komórki. Ogólnie, ilość polipeptydu, wystarczająca do oceny około 10 5 komórek, wynosi od około 10 ng/ml do około 100 µg/ml, a korzystnie, wynosi około 10 µg/ml. Polipeptyd może być, lecz niekoniecznie, unieruchomiony na podłożu stałym, takim jak kulka lub ulegająca rozpadowi biologicznemu mikrosfera, takich jak opisane w patencie Stanów Zjednoczonych nr i Inkubację polipeptydu z komórkami typowo prowadzi się w temperaturze 37 C przez około sześć dni. Po inkubacji z polipeptydem, komórki bada się pod kątem interferonu γ i/lub interleukiny 12 (lub jednej lub więcej z jej podjednostek), które można oceniać sposobami znanymi specjalistom, takimi jak enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA), lub, w przypadku podjednostki P70 IL-12, test biologiczny, taki jak test z pomiarem proliferacji limfocytów T. Ogólnie polipeptyd powodujący wytwarzanie co najmniej 50 pg interferonu γ na ml nadsączu hodowli (zawierającego komórek na ml) uważa się za zdolny do stymulowania wytwarzania interferonu γ. Polipeptyd, który pobudza wytwarzanie co najmniej 10 pg/ml podjednostki P70 IL-12 i/lub co najmniej 100 pg/ml podjednostki P40 IL-12,

7 PL B1 7 na 10 s makrofagów lub limfocytów B (lub na 3x10 5 PBMC) uważa się za zdolny do pobudzania wytwarzania IL-12. Ogólnie, antygenami immunogennymi są te antygeny, które pobudzają proliferację i/lub wytwarzanie cytokin (to znaczy, interferonu γ i/lub interleukiny 12) w limfocytach T, komórkach NK, limfocytach B i/lub makrofagach, pochodzących od co najmniej około 25% osobników odpornych na M. tuberculosis. Wśród tych antygenów immunogennych, można wyróżnić polipeptydy o korzystnych właściwościach terapeutycznych w oparciu o wielkość reakcji w powyższych testach i w oparciu o odsetek osobników, dla których obserwuje się reakcję. Ponadto, antygeny o korzystnych właściwościach terapeutycznych nie będą pobudzały proliferacji ani wytwarzania cytokin in vitro w komórkach pochodzących od więcej niż 25% osobników nieodpornych na M. tuberculosis, co eliminuje reakcje nie spowodowane swoiście komórkami reagującymi na M. tuberculosis. Antygeny pobudzające reakcję w dużym odsetku preparatów limfocytów T, komórek NK, limfocytów B i/lub makrofagów od osobników odpornych na M. tuberculosis (z małą częstością reakcji w preparatach komórek od innych osobników) mają korzystne właściwości terapeutyczne. Antygeny o korzystnych właściwościach terapeutycznych można również zidentyfikować na podstawie ich zdolności do zmniejszania nasilenia zakażenia M. tuberculosis u zwierząt doświadczalnych przy podawaniu w postaci szczepionki. Korzystne preparaty szczepionki do zastosowania u zwierząt doświadczalnych opisano szczegółowo poniżej. Skuteczność można określić w oparciu o zdolność antygenu do zapewniania co najmniej około 50% zmniejszenia liczby bakterii i co najmniej około 40% zmniejszenia śmiertelności po zakażeniu doświadczalnym. Do korzystnych zwierząt doświadczalnych należą myszy, świnki morskie i Naczelne. Izolowanie sekwencji kodujących Przedmiotem niniejszego wynalazku są również cząsteczki kwasów nukleinowych, kodujące polipeptydy fuzyjne M. tuberculosis. W szczegółowych wykonaniach podanych jako przykładowe w poniższym przykładzie 6, zbudowano trzynaście fuzyjnych sekwencji kodujących M. tuberculosis. Każdą sekwencję nukleotydową, kodującą sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego można stosować do wytwarzania rekombinacyjnych cząsteczek, kierujących ekspresją sekwencji kodującej. Dla klonowania pełnej długości sekwencji kodujących lub odmian homologicznych dla wytworzenia polinukleotydów fuzyjnych, można stosować wyznakowane sondy DNA, wytworzone z dowolnej części sekwencji nukleotydowych lub ich komplementów według niniejszego wynalazku, do przeszukiwania biblioteki genomowej lub cdna, utworzonej z różnych szczepów M. tuberculosis, w celu zidentyfikowania sekwencji kodującej każdego składnika. Izolowanie sekwencji kodujących można przeprowadzić poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR), stosując dwie pule zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych, wytworzone na podstawie sekwencji kodujących. Wynalazek dotyczy izolowanych lub oczyszczonych polinukleotydów komplementarnych do sekwencji SEQ ID nr: 15 i 23, oraz polinukleotydów wybiórczo hybrydyzujących do takiej sekwencji komplementarnej. W korzystnym wykonaniu w łagodnych warunkach hybrydyzacji polinukleotyd według wynalazku koduje białko zachowujące immunogeniczność białek fuzyjnych o sekwencji SEQ ID nr: 16 i 24. Inne izolowane lub oczyszczone polinukleotydy, mogą być komplementarne do sekwencji nukleotydowych SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 i 25, oraz do polinukleotydów, które wybiórczo hybrydyzują do takich sekwencji komplementarnych. Zapewniono też polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji SEQ ID nr: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 i 25 lub jej sekwencji komplementarnej w łagodnych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22 i 26. Jako przykład łagodnych warunków hybrydyzacji można podać następujące warunki: (zob. także Shilo i Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: ): filtry zawierające DNA poddaje się obróbce wstępnej przez 6 godzin w temperaturze 40 C w roztworze zawierającym 35% formamidu, 5X SSC, 50 mm Tris-HCl (ph 7,5), 5 mm EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA i 500 µg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Hybrydyzację prowadzi się z zastosowaniem tego samego roztworu z następującymi modyfikacjami: stosuje się 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 µg/ml DNA spermy łososiowej, 10% (masa/obj.) siarczanu dekstranu i 5-20 X 10 s cpm sondy wyznakowanej 32 P. Filtry inkubuje się w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez h w temperaturze 40 C, a następnie płucze przez 1,5 godziny w temperaturze 55 C w roztworze zawierającym 2xSSC, 25 mm Tris-HCl (ph 7,4), 5 mm EDTA i 0,1% SDS. Roztwór płuczący zastępuje się świeżym roztworem i inkubuje przez dodatkowe półtorej godziny w temperaturze 60 C. Filtry osusza się bibułą i eksponuje na autoradiografię. Jeżeli jest to konieczne, filtry płucze się po raz trzeci w temperaturze C i ponownie

8 8 PL B1 eksponuje na film. Inne warunki łagodnej hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki (na przykład takie, jak stosowane do hybrydyzacji międzygatunkowej). W innym korzystnym wykonaniu dostarcza się polinukleotyd, hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 15 albo 23, lub jej sekwencji komplementarnej w surowych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEK NR ID: 16 i 23. Można także zapewnić polinukleotyd, hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 i 25 lub jej sekwencji komplementarnych w surowych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22 i 26. Surowe warunki hybrydyzacji są następujące. Wstępną hybrydyzację filtrów, zawierających DNA, prowadzi się od 8 godzin do czasu przez noc w temperaturze 65 C w buforze złożonym z 6X SSC, 50 mm Tris-HCl (ph 7,5), 1 mm EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 µml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Filtry hybrydyzuje się przez 48 godzin w temperaturze 65 C w mieszaninie hybrydyzacji wstępnej, zawierającej 100 µg/ml denaturowanego DMA spermy łososiowej i 5-20 X 10 5 cpm sondy wyznakowanej 32 P. Płukania filtrów dokonuje się w temperaturze 37 C przez 1 godz. w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll i 0,01% BSA. Następnie prowadzi się płukanie w 0,1 X SSC w temperaturze 50 C przez 45 minut przed autoradiografią. Inne surowe warunki hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki. W innym korzystnym wykonaniu zapewnia się polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 15 albo 23 lub do jej sekwencji komplementarnej w średnich warunkach hybrydyzacji i kodujący białko zachowujące immunogenność białka fuzyjnego o SEK NR ID: 16 albo 24. Można też zapewnić polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 lub 25 lub do jej sekwencji komplementarnej w średnich warunkach hybrydyzacji i kodujący białko zachowujące immunogenność białka fuzyjnego o SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22 i 26. Przykładowe średnie warunki hybrydyzacji są następujące: filtry zawierające DNA poddaje się obróbce wstępnej przez 6 godz. w temperaturze 55 C w roztworze zawierającym 6 X SSC, 5X roztwór Denhardta, 0,5% SDS i 100 µg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Hybrydyzację prowadzi się w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez godz. w temperaturze 55 C i następnie płucze dwukrotnie przez 30 minut w temperaturze 60 C w roztworze zawierającym 1 X SSC i 0,1% SDS. Filtry osusza się bibułą i eksponuje na autoradiografię. Inne średnie warunki hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki. Płukanie filtrów prowadzi się w temperaturze 37 C przez 1 godz. w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,1% SDS. Polipeptydy kodowane przez sekwencje kodujące Zgodnie z niniejszym wynalazkiem polinukleotyd według niniejszego wynalazku, kodujący białko fuzyjne, jego fragmenty lub funkcjonalne odpowiedniki można stosować do wytwarzania cząsteczek rekombinacyjnych kwasów nukleinowych, kierujących ekspresją białka fuzyjnego, jego fragmentów lub funkcjonalnych odpowiedników w odpowiednich komórkach-gospodarzach. Produkty polipeptydu fuzyjnego kodowane przez takie polinukleotydy można modyfikować poprzez molekularną manipulację sekwencji kodującej. Z uwagi na nieodłączną degenerację kodu genetycznego w praktyce niniejszego wynalazku można stosować inne sekwencje DNA, kodujące w zasadzie tę samą lub funkcjonalnie równoważną sekwencję aminokwasową do ekspresji polipeptydów fuzyjnych. Do takich sekwencji DNA należą sekwencje zdolne do hybrydyzacji do sekwencji kodujących lub ich komplementów, opisanych w niniejszym wynalazku, w łagodnych, średnich lub surowych warunkach hybrydyzacji opisanych powyżej. Do modyfikacji sekwencji nukleotydowych, które można stosować według niniejszego wynalazku, należą delecję, addycję lub substytucje różnych reszt nukleotydowych, powodujące powstanie sekwencji kodujących ten sam lub funkcjonalnie równoważny produkt genowy. Sam produkt genowy może zawierać delecję, addycję lub substytucje reszt aminokwasowych, powodujące nieme zmiany, dając w ten sposób funkcjonalnie równoważny epitop antygenowy. Takich konserwatywnych substytucji aminokwasów można dokonywać w oparciu o podobieństwo polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilności i/lub amfipatycznej natury danych reszt. Na przykład do aminokwasów o ładunku ujemnym należą kwas asparaginowy i glutaminowy; do aminokwasów o ładunku dodatnim należą lizyna, histydyna i arginina; do aminokwasów o nienaładowanych polarnych grupach początkowych o podobnej hydrofilności należą glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina i tyrozyna, a do aminokwasów o niepolarnych grupach początkowych należą alanina, walina, izoleucyna, leucyna, fenyloalanina, prolina, metionina i tryptofan.

9 PL B1 9 Sekwencje nukleotydowe według niniejszego wynalazku można wytwarzać w celu zmiany sekwencji kodującej białka fuzyjnego w wielu celach, włączając w to, jednak bez ograniczenia, zmiany powodujące modyfikację obróbki i ekspresji produktu genowego. Na przykład można wprowadzać mutacje sposobami znanymi ze stanu techniki, takimi jak mutageneza ukierunkowana na miejsce, w celu wprowadzenia nowych miejsc restrykcyjnych, w celu zmiany wzorca glikozylacji, fosforylacji itd. W innym wykonaniu niniejszego wynalazku można syntetyzować sekwencję kodującą białka fuzyjnego, w całości lub w części, znanymi sposobami chemicznymi opisanymi, na przykład, przez Caruthers i wsp., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: ; Crea i Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10) 2331; Matteucci i Caruthers, 1980, Tetrahedron Letter 21:719 i Chow i Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9 (12): Zamiast tego, sam polipeptyd można wytwarzać stosując sposoby chemiczne w celu wytworzenia w całości lub w części sekwencji aminokwasowej. Na przykład peptydy można syntetyzować technikami fazy stałej, odcinać z żywicy i oczyszczać poprzez preparacyjną wysokowydajną chromatografię cieczową. (Zob. Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., str ). Skład syntetycznych polipeptydów można potwierdzać poprzez analizę aminokwasów lub sekwencjonowanie (na przykład sposób degradacji Edmana, zob. 5 Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., str ). Ponadto sekwencję kodującą, białka fuzyjne można poddawać mutacji in vitro lub in vivo w celu stworzenia i/lub usunięcia sekwencji translacyjnych, inicjacyjnych i/lub terminacyjnych, lub w celu stworzenia odmian w regionach kodujących i/lub stworzenia nowych restrykcyjnych miejsc endonukleazowych lub zniszczenia miejsc uprzednio istniejących w celu ułatwienia dalszych modyfikacji in vitro. Można stosować dowolną technikę mutagenezy znaną ze stanu techniki, włączając w to, jednak bez ograniczenia, mutagenezę chemiczną, ukierunkowaną na miejsce mutagenezę in vitro (Hutchinson, C. i wsp., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), zastosowanie łączników TAB (Pharmacia) i tym podobne. Ważne jest, aby manipulacje nie zniszczyły immunogenności polipeptydów fuzyjnych. Ponadto, jako substytucje lub addycję do sekwencji można wprowadzać nieklasyczne aminokwasy lub chemiczne analogi aminokwasów. Do aminokwasów nieklasycznych należą, jednak bez ograniczenia, D-izomery pospolitych aminokwasów, kwas α-aminobutyrowy, 4-aminobutyrowy, Aby, 2-aminobutyrowy, γ-abu, ε-ahx, 6-aminoheksanoesowy, Aib, 2-aminobutyrowy, 2-aminopropionowy, ornityna, norleucyna, norwalina, hydroksyprolina, sarkozyna, cytrulina, kwas cysteinowy, t-butyloglicyna, t-butyloalanina, fenyloglicyna, cykloheksyloalanina, β-alanina, kwasy fluoroaminowe, tworzone aminokwasy, takie jak β-metyloaminokwasy, Cα-metyloaminokwasy, Nα-metyloaminokwasy i ogólnie analogi aminokwasów. Ponadto aminokwas może być D (prawoskrętny) lub L (lewoskrętny). W swoistym wykonaniu sekwencje kodujące każdego antygenu w białku fuzyjnym są połączone na swych końcach aminowych lub karboksylowych poprzez wiązanie peptydowe w dowolnej kolejności. Zamiast tego można stosować peptydową sekwencję łącznikową do oddzielania poszczególnych polipeptydów, tworzących polipeptyd fuzyjny, o odległość wystarczającą do zapewnienia, że każdy polipeptyd składa się w strukturę drugo- i trzeciorzędową, co maksymalizuje jego skuteczność antygenową w zapobieganiu i leczeniu gruźlicy. Taką peptydową sekwencję łącznikową włącza się do białka fuzyjnego z zastosowaniem standardowych sposobów znanych ze stanu techniki. Można dobierać korzystne peptydowe sekwencje łącznikowe w oparciu o następujące czynniki (1) ich zdolność do przyjęcia giętkiej rozciągniętej konformacji (2) ich niezdolność do przyjęcia struktury drugorzędowej, która mogłaby wchodzić w interakcje z epitopami funkcyjnymi na polipeptydzie pierwszym i drugim i (3) brak hydrofobowych lub naładowanych reszt, które mogłyby reagować z funkcyjnymi epitopami polipeptydu. Korzystne peptydowe sekwencje łącznikowe zawierają reszty Gly, Asn i Ser. W sekwencji łącznikowej można również stosować inne niemal obojętne aminokwasy, takie jak Thr i Ala. Do sekwencji aminokwasowych, które można korzystnie stosować jako łączniki, należą sekwencje opisane przez Maratea i wsp., Gene 40:39-46, 1985; Murphy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: , 1986; patencie Stanów Zjednoczonych nr i patencie Stanów Zjednoczonych nr Sekwencja łącznikowa może mieć długość od 1 do około 50 aminokwasów. Sekwencje peptydowe nie są konieczne, gdy polipeptydy pierwszy i drugi mają okolice nieniezbędnych N-końcowych aminokwasów, które można stosować do oddzielenia domen funkcyjnych i zapobiegania interferencji sterycznej. Na przykład antygeny w białku fuzyjnym mogą być połączone poprzez giętki polilinker, taki jak Gly-Cys-Gly lub Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, powtórzony 1-3 razy (Bird i wsp., 1988, Science 242: ; Chaudhary i wsp., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: ). W jednym z wykonań takie białko wytwarza się poprzez rekombinacyjną ekspresję kwasu nukleinowego, kodującego białko. Taki produkt fuzyjny można wytwarzać poprzez ligację ze sobą odpo-

10 10 PL B1 wiednich sekwencji kwasów nukleinowych, kodujących pożądane sekwencje aminokwasowe sposobami znanymi ze stanu techniki, w odpowiedniej ramce kodującej, i ekspresję produktu sposobami znanymi ze stanu techniki. Zamiast tego produkt taki można wytwarzać technikami syntezy białek, na przykład poprzez zastosowanie syntetyzatora peptydów. Do polinukleotydu fuzyjnego można również dodawać sekwencje kodujące dla innych cząsteczek, takich jak cytokina lub adiuwant. Wytwarzanie białek fuzyjnych W celu wytworzenia białka fuzyjnego M. tuberculosis według niniejszego wynalazku sekwencję nukleotydową, kodującą białko, lub jej równoważnik funkcjonalny, wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to znaczy do wektora zawierającego elementy niezbędne do transkrypcji i translacji wprowadzonej sekwencji kodującej. Komórki-gospodarzy lub linie komórkowe, transfekowane lub transformowane rekombinacyjnymi wektorami ekspresji, można stosować w wielu celach. Należy do nich, jednak bez ograniczenia, produkcja białka fuzyjnego na dużą skalę. Do wytwarzania wektorów ekspresji, zawierających fuzyjną sekwencję kodującą i odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji/translacji, można stosować sposoby znane specjalistom. Do sposobów tych należą sposoby rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinacja/genetyczna rekombinacja in vivo. (Zob. na przykład sposoby opisane przez Sambrooka i wsp., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., i Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Można również wytwarzać chemicznie RNA zdolne do kodowania polipeptydu (red. Gait, 1984, Oligonucleoide Synthesis, IRL Press, Oxford). Systemy ekspresji W celu ekspresji sekwencji kodującej białko fuzyjne można stosować różne systemy gospodarzwektor ekspresji. Należą do nich, jednak bez ograniczenia, drobnoustroje, takie jak bakterie (na przykład E. coli, B. subtilis) transformowane rekombinacyjnym DNA bakteriofaga, wektory ekspresji DNA plazmidowego lub DNA kosmidowego, zawierające sekwencję kodującą, drożdże (na przykład Saccharomyces, Pichia), transformowane rekombinacyjnymi drożdżowymi wektorami ekspresji, zawierającymi sekwencję kodującą, systemy komórek owadów, zakażone rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresji (na przykład bakulowirus), zawierające sekwencję kodującą, systemy komórek roślinnych, zakażone rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (na przykład wirus mozaiki kalafiora - CaMV; wirus mozaiki tytoniowej - TMV) lub transformowane rekombinacyjnymi plazmidowymi wektorami ekspresji (na przykład plazmid Ti), zawierającymi sekwencję kodującą, lub systemy komórek ssaków (na przykład COS, CHO, BHK, komórki 293, 3T3). Elementy ekspresji tych systemów mają różną moc i właściwości. W zależności od stosowanego układu gospodarz/wektor, w wektorze ekspresji można stosować dowolny z wielu korzystnych elementów transkrypcji i translacji, włączając w to promotory konstytutywne i indukowalne. Na przykład przy klonowaniu w systemach bakteryjnych można stosować promotory indukowalne, takie jak pl bakteriofaga X, plac, ptrp, ptac (promotor hybrydowy ptrp-lac; promotor cytomegalowirusowy) i tym podobne; przy klonowaniu w roślinnych systemach komórkowych można stosować promotory pochodzące z genomu komórek roślinnych (na przykład promotory wstrząsu cieplnego, promotor małej podjednostki RUBISCO, promotor białka wiążącego chlorofil oc/β) lub z wirusów roślinnych (na przykład promotor 35S RNA CaMV; promotor białkowy powłoki TMV); przy klonowaniu w systemach komórek ssaków - promotory pochodzące z genomu komórek ssaków (na przykład promotor metalotioneinowy) lub z wirusów ssaków (na przykład późny promotor adenowirusowy, promotor wirusa krowianki 7.5K); przy wytwarzaniu linii komórkowych, zawierających liczne kopie antygenowej sekwencji kodującej można stosować, wektory oparte na SV-40, BPV i EBV z odpowiednim dobieralnym znacznikiem. Do ekspresji antygenów M. tuberculosis korzystne są systemy bakteryjne. Do zastosowania in vivo można wytwarzać bakterię, taką jak Bacillus Calmette-Guerin, w celu ekspresji polipeptydu fuzyjnego według niniejszego wynalazku na powierzchni komórki. Można korzystnie dobierać inne bakteryjne systemy ekspresji w zależności od zamierzonego zastosowania produktów po ekspresji. Na przykład, gdy ma być wytworzona duża ilość białka fuzyjnego do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, korzystne mogą być wektory kierujące ekspresją wysokiego poziomu produktów białka fuzyjnego, które łatwo jest oczyszczać. Do wektorów takich należą, bez ograniczenia, wektor ekspresyjny E. coli pur278 (Inouye i Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: ; Van Heeke i Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: ) i tym podobne. Można również stosować wektory pgex dla ekspresji obcych polipeptydów jako białek fuzyjnych z glutationo-s-transferazą (GST). Ogólnie takie

11 PL B1 11 białka fuzyjne są rozpuszczalne i można je łatwo oczyszczać z uległych lizie komórek poprzez adsorpcję na kulki glutationowo-agarozowe i następnie elucję w obecności wolnego glutationu. Wektory pgex wytwarza się tak, aby zawierały miejsca cięcia trombiny lub proteazy czynnika Xa, tak aby korzystny klonowany polipeptyd fuzyjny mógł być uwalniany z cząstki GST. Oczyszczanie białek Po uzyskaniu ekspresji białka rekombinacyjnego można je zidentyfikować poprzez testy oparte na fizycznych lub funkcjonalnych właściwościach produktu, włączając w to radioaktywne znakowanie produktu i następnie analizę poprzez elektroforezę żelową, test radioimmunologiczny, ELISA, testy biologiczne itd. Po zidentyfikowaniu kodowanego białka można je izolować i oczyszczać standardowymi sposobami, włączając w to chromatografię (na przykład chromatografię cieczową wysokosprawną, jonowymienną, powinowactwa i kolumny różnicującej wielkość), odwirowanie, różnicową rozpuszczalność lub dowolny inny standardowy sposób oczyszczania białek. Rzeczywiste warunki będą zależeć w części od czynników takich, jak ładunek netto, hydrofobowość, hydrofilność itd., i będą oczywiste dla specjalisty. Właściwości funkcjonalne można oceniać stosując dowolny korzystny test, taki jak wiązanie przeciwciał, indukcja proliferacji limfocytów T, pobudzenie wytwarzania cytokin, takich jak IL2, IL-4 i IFN-γ. Dla praktyki niniejszego wynalazku korzystne jest, aby każde białko fuzyjne było w co najmniej 80% oczyszczone od innych białek. Korzystniejsze jest, aby było oczyszczone w co najmniej 90%. Do podawania in vivo, korzystne jest, aby białka były oczyszczone w ponad 95%. Zastosowanie sekwencji kodującej białko fuzyjne Sekwencję kodującą białko fuzyjne według niniejszego wynalazku można stosować do kodowania produktu białkowego do zastosowania jako immunogen do indukowania i/lub wzmagania reakcji immunologicznej na M. tuberculosis. Ponadto taką sekwencję kodującą można poddać ligacji z sekwencją kodującą innej cząsteczki, takiej jak cytokina lub adiuwant. Takie polinukleotydy można stosować in vivo jako szczepionki DNA (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr , , ). W tym wykonaniu wynalazku polinukleotyd wykazuje ekspresję kodowanego przez siebie białka w organizmie biorcy w celu bezpośredniego pobudzenia reakcji immunologicznej. Polinukleotyd można wstrzykiwać nieuodpornionemu pacjentowi w celu zapoczątkowania reakcji immunologicznej na produkt kodowany przez ten polinukleotyd, lub podawać zakażonemu lub uodpornionemu pacjentowi w celu zwiększenia wtórnych reakcji immunologicznych. W korzystnym wykonaniu, kompozycja terapeutyczna zawiera sekwencję kodującą białko fuzyjne lub jej fragmenty, które są częścią wektora ekspresyjnego. W szczególności polinukleotyd taki zawiera promotor połączony w sposób umożliwiający działanie z regionem kodującym, przy czym promotor ten jest indukowalny lub konstytutywny, i ewentualnie swoisty tkankowo. W innym wykonaniu polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą otoczoną regionami sprzyjającymi rekombinacji homologicznej w pożądanym miejscu genomu, zapewniając w ten sposób wewnątrzchromosomalną ekspresję sekwencji kodującej (Roller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: ; Zijlstra i wsp. 1989, Nature 342: ). Podawanie kwasu nukleinowego pacjentowi może być bezpośrednie - w tym przypadku pacjenta eksponuje się bezpośrednio na kwas nukleinowy lub wektor zawierający kwas nukleinowy, lub pośrednie - w tym przypadku komórki transformuje się najpierw kwasem nukleinowym in vitro i następnie wszczepia pacjentowi. Te dwa sposoby znane są, odpowiednio, jako transfer genów in vivo i ex vivo. W swoistym wykonaniu kwas nukleinowy podaje się bezpośrednio in vivo, gdzie ulega ekspresji w celu wytworzenia kodowanego produktu-białka fuzyjnego. Można tego dokonać jednym z licznych sposobów znanych ze stanu techniki, na przykład poprzez wytworzenie go jako części odpowiedniego wektora ekspresyjnego kwasu nukleinowego i podanie go, tak aby stał się wewnątrzkomórkowy, na przykład poprzez zakażenie z zastosowaniem defektywnego lub atenuowanego wektora retrowirusowego lub innego wektora wirusowego (zob. patent Stanów Zjednoczonych nr ) lub poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie nagiego DNA, lub poprzez zastosowanie bombardowania mikrocząstkami (na przykład działo genowe; Bioloistic, Dupont) lub powlekanie lipidami lub receptorami powierzchni komórkowej lub czynnikami transfekującymi, zamknięcie w liposomach, mikrocząstkach lub mikrokapsułkach (patent Stanów Zjednoczonych nr , , i ) lub przez podawanie go w połączeniu z peptydem, o którym wiadomo, że wchodzi do jądra, poprzez podanie go w połączeniu z ligandem podlegającym endocytozie, której mediatorem jest receptor (zob. na przykład Wu i Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: ), który można stosować do typów komórek docelowych wykazujących swoistą ekspresję receptorów itp. W innym praktycznym wykonaniu można wytwarzać

12 12 PL B1 kompleks kwasu nukleinowego i ligandu, w którym ligand zawiera fuzogenny peptyd wirusowy do rozsadzania endosomów, co umożliwia uniknięcie lizosomalnego rozpadu kwasu nukleinowego. W jeszcze innym praktycznym wykonaniu kwas nukleinowy można ukierunkowywać in vivo na swoisty komórkowo wychwyt zwrotny i ekspresję, poprzez ukierunkowywanie swoistego receptora (zob. na przykład publikacje PCT WO 92/06180 z 16 kwietnia 1992; WO 92/22635 z 23 grudnia 1992; WO 92/20316 z 26 listopada 1992; WO 93/14188 z 22 lipca 1993 i WO 93/20221 z 14 października 1993). Zamiast tego kwas nukleinowy można wprowadzać wewnątrzkomórkowo i włączać do DNA komórki gospodarza w celu ekspresji przez rekombinację homologiczną (Roller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ; Zijlstra i wsp., Nature 342: ). W swoistym wykonaniu można stosować wektor wirusowy, taki jak wektor retrowirusowy (zob. Miller i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217: ). Wektory retrowirusowe zmodyfikowano w celu delecji sekwencji retrowirusowych, które nie są konieczne do pakowania genomu wirusowego i włączania do DNA komórki-gospodarza. Fuzyjną sekwencję kodującą klonuje się do wektora, co ułatwia podawanie kwasu nukleinowego biorcy. Więcej szczegółów na temat wektorów retrowirusowych można znaleźć w Boesen i wsp., 1994, Biotherapy 6: , gdzie opisano zastosowanie wektora retrowirusowego do podawania genu mdrl do hematopoetycznych komórek macierzystych w celu nadania komórkom macierzystym większej oporności na chemioterapię. Innymi pozycjami piśmiennictwa ilustrującymi zastosowanie wektorów retrowirusowych do terapii genowej są: Clowers i wsp., 1994, J. Clin. Invest. 93: ; Kiem i wsp., 1994, Blood 83: ; Salmons i Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: i Grossman i Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3: Innymi wektorami wirusowymi, które można stosować w terapii genowej, są adenowirusy. Adenowirusy są szczególnie atrakcyjnymi nośnikami do podawania genów na nabłonek dróg oddechowych. Adenowirusy w naturalnych warunkach zakażają nabłonek dróg oddechowych, gdzie wywołują chorobę o lekkim przebiegu. Innymi miejscami docelowymi opartych na adenowirusach systemów podawania są wątroba, ośrodkowy układ nerwowy, komórki śródbłonka i mięśnie. Adenowirusy mają tę zaletę, że są zdolne do zakażania komórek niedzielących się. Proponowano także zastosowanie do transferu genów in vivo wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (Walsh i wsp., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: ). Inna technika obejmuje przeniesienie struktury do komórek w hodowli tkankowej takimi sposobami, jak elektroporacja, lipofekcja, transfekcja, której mediatorem jest fosforan wapnia lub zakażenie wirusowe. Zwykle sposób transferu obejmuje transfer dobieralnego znacznika do komórek. Komórki umieszcza się następnie w warunkach selekcji w celu wyizolowania tych komórek, w których doszło do wychwytu i ekspresji transferowanego genu. Komórki te podaje się następnie pacjentowi. W tym wykonaniu kwas nukleinowy wprowadza się do komórki przed podaniem in vivo powstałej komórki rekombinacyjnej. Takiego wprowadzenia można dokonać dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, włączając w to, bez ograniczenia, transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, zakażenie wektorem wirusowym lub bakteriofagowym, zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego, fuzje komórkowe, chromosomalny transfer genu, mikrokomórkowy transfer genu, fuzję sferoplastu itp. Ze stanu techniki znane są liczne sposoby wprowadzania obcych genów do komórek (zob. na przykład Loeffler i Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: ; Cohen i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217: ; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) i można je stosować według niniejszego wynalazku. Polinukleotydy według niniejszego wynalazku można również stosować w rozpoznawaniu gruźlicy do wykrywania u pacjenta sekwencji polinukleotydowych swoistych dla M. tuberculosis. Takiego wykrywania można dokonywać na przykład poprzez izolowanie polinukleotydów z próbki biologicznej uzyskanej od pacjenta podejrzanego o zakażenie bakterią. Po izolowaniu polinukleotydów z próbki biologicznej umożliwia się hybrydyzację wyznakowanego polinukleotydu według niniejszego wynalazku, komplementarnego do jednego lub więcej polinukleotydów, do polinukleotydów w próbce biologicznej, stosując techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych znane specjalistom. Hybrydyzację taką można prowadzić na przykład w roztworze lub z zastosowaniem partnera hybrydyzacyjnego na stałym podłożu. Terapeutyczne i profilaktyczne zastosowanie białka fuzyjnego Oczyszczone lub częściowo oczyszczone białka fuzyjne lub ich fragmenty można wytwarzać jako szczepionki lub kompozycję terapeutyczną. Takie kompozycje mogą zawierać adiuwanty w celu wzmożenia reakcji immunologicznych. Ponadto białka takie można dalej zawieszać w emulsji olejowej w celu spowodowania wolniejszego uwalniania białek in vivo po wstrzyknięciu. Optymalny stosunek każdego składnika w preparacie można określać technikami znanymi specjalistom.