Western Blot. Praktyczny poradnik.

Transkrypt

1 Western Blot. Praktyczny poradnik. Western Blot jest techniką powszechnie stosowaną w biologii molekularnej w różnych laboratoriach na całym świecie. W przeciwieństwie do hybrydyzacji Southern i Northern, które służą identyfikacji odpowiednio DNA i RNA, Western Blot pozwala na jakościowe wykrycie konkretnego białka z bardzo kompleksowej mieszaniny białek izolowanych z ekstraktu komórkowego. Jak przebiega WB? Hybrydyzacja Western Blot, określana także jako immunoblotting, obejmuje trzy etapy. W pierwszej kolejności zdenaturowane białka rozdziela się na podstawie ich mas przy wykorzystaniu elektroforezy na żelu poliakrylamidowym. Następnie, białka są przenoszone na membranę (nitrocelulozową lub PVDF) na drodze elektrotransferu, aż w końcu następuje identyfikacja konkretnego białka poprzez inkubację membrany przeciwciałami pierwszo- i drugorzędowymi (immunodetekcja). Elektroforeza Rozdział białek podczas elektroforezy następuje na żelu składającym się z dwóch części: żelu zagęszczającego (górna warstwa) i żelu rozdzielającego (dolna warstwa). Próbki białka, uprzednio przygotowane w buforze o niskim przewodnictwie (ang. loading buffer), są aplikowane do studzienek żelu zagęszczającego. Zagęszczanie białek odbywa się w wyniku obustronnego kontaktu z buforami o wysokim przewodnictwie i następuje ono na granicy z żelem rozdzielającym [1].

2 Żele poliakrylamidowe używane w elektroforezie są polimerami akrylamidu i bisakrylamidu. Od proporcji i od ilości tego ostatniego składnika zależy usieciowanie żelu. Polimeryzacja katalizowana jest przez wolne rodniki, których źródłem jest nadsiarczan amonu (ang. ammonium persulfate, APS), a ich uwalnianie przyspiesza dodanie N,N,N -Tetramethylethylenediaminy (TEMED). Stężenie żelu poliakrylamidowego decyduje o rozdziale białek i jest ono odwrotnie proporcjonalnie do wielkości białka: im większe białko chcemy oznaczyć, tym mniejsze stężenie żelu powinno być wykonane. Elektrotransfer Elektrotransfer to przeniesienie rozdzielonych białek na membranę. Bardzo ważne jest ułożenie w odpowiedniej kolejności elementów tzw. kanapki, aby zapewnić prawidłowy transfer. Ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatniej elektrody i zostają zatrzymane na membranie umieszczonej między żelem a anodą. W ten sposób białka w formie prążków znajdujących się na różnych poziomach są przeniesione na membranę i dają lustrzany obraz rozdzielonych w żelu polipeptydów [1]. Tutaj warto podać kilka informacji na temat membran. Istnieją dwa typy membran powszechnie stosowanych w Western Blot: nitrocelulozowa i poliwinylidenowa (ang. polyvinylidene fluoride, PVDF). Różnią się one zasadniczo. Membrana nitrocelulozowa cechuje się wysokim powinowactwem do białek. Jest ona jednak bardzo krucha w strukturze, a hybrydyzację na niej można wykonać tylko jeden raz. Z kolei membrana PVDF odznacza się bardzo dobrymi właściwościami mechanicznymi, jest bardziej wytrzymała, a hybrydyzację na niej można wykonać wielokrotnie. W przypadku membran PVDF bardzo istotne jest płukanie membrany przy technice Western Blot, aby ograniczyć sygnał tła [2]. Immunodetekcja Jednym z jej typów immunodetekcji jest inkubacja dwoma rodzajami przeciwciał: pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Pomiędzy tymi inkubacjami przeprowadza się etapy płukania membrany w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Przeciwciała pierwszorzędowe bezpośrednio reagują z antygenem (czyli białkiem, które chcemy wykryć). Z kolei przeciwciała drugorzędowe zazwyczaj są znakowane, radioaktywnie albo przyłączonym enzymem np. peroksydazy chrzanowej (ang. horseradish peroxidase, HRP). Membranę pokrywa się

3 substratem dla HRP, np. luminolem. Na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych zestawów z przygotowanym roztworami substratów. HRP katalizuje utlenienie luminolu w obecności nadtlenku wodoru. Luminol, który przeszedł w stan wzbudzenia, emituje promieniowanie świetlne. Obraz doświadczenia uzyskuje się poprzez ekspozycję membrany na kliszę, następnie ją wywołując [3]. Przejdźmy teraz do praktycznego i technicznego spojrzenia na procedurę Western Blot. SDS PAGE przygotowanie i elektroforeza 1. Przygotowanie aparatury i żeli Do przeprowadzenia elektroforezy SDS PAGE niezbędnym elementem są żele poliakrylamidowe. Jeżeli nie możemy sobie pozwolić na zakup gotowych żeli, musimy je własnoręcznie przygotować. Przy dobrej organizacji nie jest to jednak żmudna i czasochłonna praca. Poniżej przedstawiona jest lista wszystkich odczynników i buforów potrzebnych do elektroforezy SDS PAGE i elektrotransferu: 3x Gel Buffer (bufor do przygotowania żeli poliakrylamidowych, przechowywać w temperaturze 4 st.c): 3M Tris-HCl 0.3% SDS ph 8,45 Bufory do elektroforezy: a) Bufor anodowy: 0,2 M Tris ph 8,9 b) Bufor katodowy: 0,1 M Tris 0,1 M Tricine 0,1 % SDS ph 8,25

4 Bufor do elektrotransferu: 192 mm roztwór glicyny 25 mm Tris 20% metanol 2x bufor do przygotowania próbek białka: 100 mm Tris HCl ph 6,8 20% glicerol 5% SDS 0,02% błękit bromofenolowy (opcjonalnie 10% 2-merkaptoetanol) TBS-T (2 L) 40 ml 1M Tris ph ml 3 M NaCl 2 ml TWEEN 20 (0.1%) Zanim zaczniemy przygotowywać mieszaniny żeli, pierwszym krokiem jest przygotowanie całej aparatury zgodnie z wytycznymi producenta. Składamy kasetę żelową, umieszczamy w niej grzebień i zaznaczamy markerem miejsce ok cm poniżej końca ząbków grzebienia jest to górna granica żelu rozdzielającego. Przykładowa kaseta żelowa przedstawiona jest na Ryc. 1. Ryc. 1. Przykładowa kaseta żelowa. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Lilly_M, licencja: CC BY-SA 2.5 Aby przygotować wystarczającą ilość żelu, obliczamy objętość kasety żelowej (Objętość = szerokość x wysokość x głębokość). Przykładowo, objętość kasety wynosi 8.2 cm 3 (V = 6.8 cm x 8 cm x 0.15 cm) i z praktycznego punktu widzenia

5 potrzeba w tym przypadku 6-7 ml żelu rozdzielającego, jednak lepiej przygotować mały zapas np. 10 ml dla jednego żelu. Stężenia akrylamidu w żelach różnią się w zależności od wykonywanego rozdziału. Stężenie akrylamidu w żelu zagęszczającym (ang. stacking gel) waha się zazwyczaj pomiędzy 4-5%, podczas gdy w żelu rozdzielającym (ang. separating gel) jego stężenie różni się w zależności od masy cząsteczkowej danego białka. Odpowiednie stężenia dla obydwóch żeli dla białka o znanej masie cząsteczkowej, które poddajemy elektroforezie, można znaleźć na stronach różnych producentów. Poniżej przedstawiony skład można użyć do przygotowania kilku żeli (około 3) do rozdziału białek, o masie cząsteczkowej w przedziale kda. Tabela 1. Skład żelu zagęszczającego i rozdzielającego dla elektroforezy białek o masie cząsteczkowej kda. Źródło: własne Żele przygotowujemy pod wyciągiem, ponieważ niespolimeryzowany akrylamid jest neurotoksyczny. Odpowiednio wcześnie organizujemy wszystkie potrzebne narzędzia i odczynniki. W 50 ml probówkach typu Falcon mieszamy wszystkie składniki żelu rozdzielającego, pamiętając o tym, że TEMED dodajemy na sam koniec, gdyż inicjuje on polimeryzację żelu. Tak przygotowany roztwór przenosimy pipetą do kasety żelowej do wcześniej zaznaczonej linii cm (wcześniej wyjmujemy grzebyk). Nałożony żel rozdzielający pokrywamy cienką warstwą n-butanolu (około 500 µl) i upewniamy się, że jest on równomiernie rozmieszczony na górnej linii żelu. Pozostawiamy tak przygotowany żel na minut, aby spolimeryzował. Proces ten możemy także obserwować na pozostałościach roztworu w 50 ml tubce Falcon. Poliakrylamid (który uległ polimeryzacji) nie jest już silnie neurotoksyczny. Gdy żel rozdzielający ulegnie polimeryzacji, usuwamy n-butanol z powierzchni żelu, a jego nadmiar osuszamy delikatnie bibułą. Następnie przygotowujemy żel zagęszczający poprzez zmieszanie komponentów z APS, dodając na koniec TEMED. Nakładamy pipetą mieszaninę, szybko umieszczając grzebień pomiędzy

6 krawędzie płytek szklanych w ten sposób, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Pozostawiamy żel do polimeryzacji. Warto pamiętać, że jeżeli planujemy przeprowadzenie dużej ilości elektroforez w krótkim czasie, można za jednym razem przygotować więcej żeli i przechować je kasetach żelowych z umieszczonym grzebykiem, owinięte w nasączony w buforze katodowym kawałek ręcznika papierowego w temperaturze 4 stc. 2. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym W przypadku, gdy elektroforezę przeprowadzamy tego samego dnia, ostrożnie wyjmujemy grzebień z żelu i przemywamy studzienki wodą destylowaną. Przygotowaną kasetę z żelem umieszczamy w module i mocujemy za pomocą uszczelek do ramki mocującej. Następnie cały moduł umieszczamy wewnątrz zbiornika elektroforezy. Górną komorę wypełniamy buforem katodowym do krawędzi górnej, upewniając się, że cały żel jest zanurzony w buforze. Dolną komorę wypełniamy buforem anodowym. Przykładowy dobrze zmontowany moduł do elektroforezy jest przedstawiony na Ryc. 2. Ryc. 2. Zmontowany moduł do elektroforezy. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Jean-Eitenne Poirrier, licencja: CC BY-SA 2.0 Następnie zamykamy pokrywą zbiornik i podłączamy do zasilacza. Przy żelach własnoręcznie wylewanych ważne jest przeprowadzenie tzw. pre-run w celu usunięcia zanieczyszczeń z żelu. Proces Pre-run przeprowadzamy przez 20 minut przy napięciu V podczas przygotowywania próbek na rozdział. Oznaką dobrze zmontowanej aparatury do elektroforezy i poprawnie działającego systemu jest pojawienie się piany przy górnej krawędzi żelu. Ryc. 3 poniżej przedstawia przykładowy zestaw do elektroforezy na żelu poliakrylamidowym.

7 Ryc. 3. SDS PAGE. Źródło: FLICKR, autor: Jean-Eitenne Poirrier, licencja: CC BY- SA 2.0 Równocześnie z pre-run przygotowujemy próbki białka, których stężenie oznaczyliśmy wcześniej np. metodą Bradforda. Odpowiednią obliczoną ilość próbki mieszamy z 2x buforem do próbek (ang. loading buffer) i inkubujemy przez 5 minut w temperaturze 95 stc w celu denaturacji białka. Następnie odpowiednią ilość próbki nanosimy do poszczególnych studzienek. Pamiętamy także o zaaplikowaniu 5 µl markera. Elektroforezę przeprowadzamy w następujących warunkach. Przy napięciu 80 V załadowane próbki zagęszczają się, następnie przy wyższym napięciu V następuje ich rozdział. Elektroforezę prowadzimy do momentu, gdy linia wędrujących w żelu prążków znajdzie się przy dolnej krawędzi żelu. Po zakończeniu elektroforezy bufor katodowy zlewamy, natomiast bufor anodowy możemy użyć do następnej elektroforezy. Kasetę żelową wyjmujemy ostrożnie z modułu, następnie rozdzielamy za pomocą szpatułki płytki, pomiędzy którymi znajduje się żel. Skalpelem lub żyletką odcinamy żel zagęszczający i tak przygotowany żel umieszczamy w buforze do elektrotransferu. Transfer półsuchy W trakcie prowadzenia elektroforezy przygotowujemy wszystkie potrzebne czynniki do transferu rozdzielonych białek na membranę. Wycinamy membranę PVDF w rozmiarze odpowiadającym żelowi rozdzielającemu i aktywujemy ją (zmniejszamy jej hydrofobowość) w 100% metanolu przez 10 sekund, następnie obmywając membranę 5 minut w wodzie MQ i przenosząc do buforu do elektrotransferu (ang. Western buffer). W ten sam sposób traktujemy złożone po 3 bibuły Whatmann.

8 Składamy kanapkę w kasecie do elektrotransferu w następującej kolejności: 3 x nasączone bibuły Whatmann aktywowana membrana PVDF żel nasączony także buforem do elektrotransferu 3 x nasączone bibuły Whatmann. Przedstawiona poniżej Ryc. 4 przedstawia schemat układania kanapki do Western Blot. Ryc. 4. Elektrotransfer. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Bensaccount, licencja: CC-BY-SA 3.0 Praktyczna rada: Dla ułatwienia orientacji membrany i żelu odcinamy żyletką mały górny lewy róg na membranie i żelu. Upewniamy się także, czy żadne pęcherzyki powietrza nie dostały się pomiędzy warstwy. Poprzez delikatne rolowanie na powierzchni kanapki probówką typu Falcon możemy zapewnić dokładne przyleganie poszczególnych warstw. Następnie, nakładamy górną pokrywę kasety Western Blot i przeprowadzamy elektrotransfer przez 1 h i 10 minut. Natężenie potrzebnego prądu obliczamy z następującego wzoru: I = S x 1,1 x N [ma] N ilość membran jaką poddajemy Western Blot S powierzchnia membrany. Napięcie ustawiamy w granicach V. O sukcesie przeprowadzonego elektrotransferu upewniamy się, jeżeli zaobserwujemy przeniesiony marker na membranę.

9 Przykładowa kaseta do Western Blot przedstawiona jest na Ryc. 5. Ryc. 5. Kaseta do elektrotransferu. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Lilly_M, licencja: CC BY-SA 3.0 W trakcie trwania elektrotransferu przygotowujemy roztwór blokujący: 4% mleka odtłuszczonego w proszku, 1% BSA w 100 ml roztworu TBS-T. Po wykonanym elektrotransferze membranę zanurzamy w przygotowanym roztworze blokującym i pozostawiamy w temperaturze 4 stc przez noc na wolnym kołysaniu. Roztwór ten ma na celu zablokować niespecyficzne wiązania. Immunodetekcja Inkubacja membrany przeciwciałami pierwszorzędowymi Wykonujemy odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w TBS-T, zgodnie z zaleceniami producenta. Rozcieńczenia zazwyczaj wahają się w granicach 1:500 1:5000. Dla przykładu przeciwciała anty-cd4 zgodnie ze wskazówkami powinny być rozcieńczone 1:500. W związku z tym, 8 µl z próbki przeciwciał rozcieńczamy w 4 ml TBS-T. Jest to wystarczająca objętość na inkubację przeciwciałami pierwszorzędowymi. Praktycznym sposobem na inkubację jest umieszczenie membrany w 50 ml probówce typu Falcon (do wewnątrz stroną, na której znajdują się białka) tak, aby strony membrany na siebie się nie nakładały. Następnie układamy 50 ml probówkę poziomo na urządzeniu rotującym, tak aby zapewnić równomiernie rozłożenie roztworu z przeciwciałami na całą membranę. Inkubację prowadzimy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukanie membrany. Membranę płuczemy w TBS-T w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Proces

10 ten prowadzimy 5 razy przez 5 minut upewniając się, aby za każdym razem cała membrana była zanurzona w roztworze. Inkubacja przeciwciałami drugorzędowymi Prowadzimy ją w ten sam sposób jak w przypadku inkubacji przeciwciałami pierwszorzędowymi. Rozcieńczenie przeciwciał w tym wypadku jest zazwyczaj wyższe, np. 1: (rozcieńczenie wykonujemy zgodnie ze wskazówkami producenta.) Płukanie membrany Pięciokrotnie płuczemy membranę w roztworze TBS-T. Ostatnie płukanie wykonujemy w roztworze TBS bez Tween, aby wypłukać i usunąć detergent. Nałożenie czynnika detekcji Po drugim płukaniu membranę lekko osuszamy z nadmiaru TBS poprzez dotknięcie jednego jej końca o papierowy ręcznik, który wsiąknie nadmiar buforu. Następnie pokrywamy membranę czynnikiem detekcji, który wiąże się z drugorzędowymi przeciwciałami. Nakładamy reagent równomiernie pipetą na powierzchnię membrany i inkubujemy przez 1 minutę. Usuwamy nadmiar substratu i umieszczamy membranę w kasecie X ray. Membrana jest dodatkowo zabezpieczona, tj. włożona w zwykłą folię biurową. Białka do detekcji znajdują się po wierzchniej stronie. Przed wystawieniem membrany na ekspozycję, upewniamy się, że w pomieszczeniu, gdzie będziemy wywoływać film jest ciemno, a jedynym dozwolonym światłem jest światło czerwone. Następnie umieszczamy jeden film na powierzchni folii, zamykamy X ray kasetę i poddajemy ekspozycji w różnym czasie. Ekspozycja może trwać, np. 10 sec, 1 min 10 minut, ale czasem potrzeba i paru godzin [4]. Interpretacja wyniku. Przykładowy wynik Western Blot przedstawiony jest na Ryc. 6.

11 Ryc. 6. Przykładowy wynik Western Blot. Pierwszy rząd z lewej strony reprezentuje marker ze zdefiniowanymi rozmiarami białka, które miało być zidentyfikowane. Na górnej rycinie obserwujemy wyraźnie zarysowane prążki pochodzące od białka beta-actin o masie cząsteczkowej 42 kda. Na dolnej rycinie zostało zidentyfikowane białko PCP4 o masie cząsteczkowej 7.6 kda. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Herizora, licencja: CC BY-SA 3.0 Western Blot jest techniką popularną w biologii molekularnej. Ze względu na swoją czułość i jednoznaczność wyniku jest jedną z najczęściej wybieranych przez naukowców metod. Pomimo faktu, iż trwa ona aż dwa dni, to przy optymalizacji testu oraz doborze odpowiednich przeciwciał mamy pewność, że otrzymamy wyniki wysokiej jakości. Piśmiennictwo: 1. Opiela J. Analiza ekspresji genów na poziomie białek przy użyciu techniki western-blot. Wiadomości Zootechniczne, 2006; R. XLIV; 1: Mahmood T., Yang P-C. Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. N Am J Med Sci, 2012; 4(9): Kurien B., Scofield R. Western blotting. Methods; 2006; 38: Doświadczenia własne. Data publikacji: r.