(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/40 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 38/17 ( ) A61K 39/00 ( ) A61K 31/7088 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Leczenie stanów związanych z demielinizacją (30) Pierwszeństwo: US P US P US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/17 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/03 (73) Uprawniony z patentu: Biogen Idec MA Inc., Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 SHA MI, Belmont, US R. BLAKE PEPINSKY, Arlington, US JOHN MCCOY, Reading, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Tło wynalazku Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy dziedzin neurobiologii, neurologii i farmakologii. W szczególności, dotyczy to antagonistów Sp35 stosowanych w metodach leczenia stwardnienia rozsianego, jak określono w zastrzeżeniach. Stan techniki [0002] Wiele chorób układu nerwowego jest związanych z demielinizacją i dysmielinizacją, w tym między innymi stwardnienie rozsiane (SM), postępująca leukoencefalopatia wieloogniskowa (PML), zapalenia mózgu i rdzenia (EPL), mielinoliza środkowa mostu (CPM), zwyrodnienie Wallera i niektóre choroby dziedziczne, takie jak adrenoleukodystrofia, choroby Alexandra i choroba Pelizaeusa-Merzbachera (PMZ). Spośród tych chorób, najbardziej rozpowszechnioną jest SM, na którą cierpi 2,5 mln ludzi na całym świecie. [0003] SM zazwyczaj początkowo ma przebieg zaostrzająco-zwalniający pod względem neurologicznym, po którym następuje faza przewlekła wzrostu uszkodzeń neurologicznych. SM jest związane ze zniszczeniem mieliny, oligodendrocytów oraz aksonów w miejscach przewlekłych zmian chorobowych. Demielinizacja obserwowana w przypadku SM nie zawsze ma charakter stały i udokumentowane zostały przypadki remielinizacji we wczesnych stadiach choroby. Remielinizacja neuronów wymaga obecności oligodendrocytów. [0004] W przypadku SM dostępne są różne metody leczenia modyfikujące przebieg choroby, w tym wykorzystujące kortykosteroidy i leki immunomodulujące, takie jak interferon beta. Ponadto, ze względu na zasadniczą rolę oligodendrocytów i mielinizacji w SM, podjęto starania w celu opracowania terapii mających na celu zwiększenie liczby oligodendrocytów lub stymulację mielinizacji. Zob. np. Cohen i wsp., Patent amerykański nr ; Chang i wsp., N. Engl. J. Med. 346: (2002). Pozostaje jednak pilna potrzeba opracowania dodatkowych sposobów leczenia SM. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO A2, opublikowanym w dniu 7 października 2004 r. ujawniono antagonisty Sp35 przeznaczone do stosowania w leczeniu chorób, zaburzeń i urazów neurologicznych przez zwiększanie przeżywalności neuronów. Krótki opis wynalazku [0005] Niniejszy wynalazek jest oparty na odkryciu, że Sp35 (Sp35 występuje w literaturze również pod nazwami LINGO-1 oraz LRRN6) jest wyrażany w oligodendrocytach i ujemnie reguluje różnicowanie się i przeżywalność oligodendrocytów, jak i mielinizację aksonów. Ponadto, niektóre z antagonistów Sp35 stymulują przeżywalność, proliferację i różnicowanie się oligodendrocytów oraz mielinizację neuronów. W oparciu o te odkrycia, wynalazek dostarcza metody in vitro, wspomagającej stymulację różnicowania się lub przeżywalności oligodendrocytów, metody polegającej na kontaktowaniu oligodendrocytów wyrażających Sp35 ze skuteczną ilością zestawu składników zawierającego antagonistę Sp35 (LINGO-1) z grupy obejmującej: 1

3 (i) rozpuszczalny polipeptyd Sp35 pozbawiony domeny transbłonowej Sp35 oraz domeny cytoplazmatycznej Sp35; (ii) przeciwciało Sp35 lub jego fragment wiążący antygen, (iii) polinukleotyd antagonisty Sp35 wybrany z grupy obejmującej: (a) polinukleotyd antysensowny, (b) rybozym, (c) mały interferujący RNA (sirna) i (d) RNA o strukturze spinki do włosów (shrna) oraz (iv) połączenie dwóch lub więcej wspomnianych antagonistów Sp35. Niniejszy wynalazek określa również antagonistę Sp35 (LINGO-1), wybranego z grupy obejmującej: (i) rozpuszczalny polipeptyd Sp35 pozbawiony domeny transbłonowej Sp35 oraz domeny cytoplazmatycznej Sp35; (ii) przeciwciało Sp35 lub jego fragment wiążący antygen, (iii) polinukleotyd antagonisty Sp35 wybrany z grupy obejmującej: (a) polinukleotyd antysensowny, (b) rybozym, (c) mały interferujący RNA (sirna) i (d) RNA o strukturze spinki do włosów (shrna) oraz (iv) połączenie dwóch lub więcej wspomnianych antagonistów Sp35; do wykorzystania w metodzie leczenia stwardnienia rozsianego u ssaków poprzez stymulację różnicowania się lub przeżywalności oligodendrocytów wyrażających Sp35. [0006] Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 obejmują polipeptydy zawierające (i) domenę powtórzeń bogatych w leucynę (LRR) Sp35, (ii) zasadowy obszar C-terminalny w stosunku do domeny LRR Sp35, oraz (iii) domenę immunoglobuliny (Ig) Sp35. W niektórych przykładach wykonania, rozpuszczalny polipeptyd Sp35 jest pozbawiony domeny Ig Sp35, domeny LRR Sp35, domeny transbłonowej oraz domeny cytoplazmatycznej. W niektórych przykładach wykonania, rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera domenę LRR Sp35, a jest pozbawiony domeny Ig Sp35, obszaru zasadowego Sp35, domeny transbłonowej oraz domeny cytoplazmatycznej. W niektórych przykładach wykonania, rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera aminokwasy sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. [0007] W niektórych przykładach wykonania, przewiduje się podanie antagonisty Sp35 zastrzykiem w bolusie lub jako infuzję chroniczną. W niektórych przykładach wykonania, przewiduje się podanie rozpuszczalnego polipeptydu Sp35 bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego. W niektórych przykładach wykonania, przewiduje się podanie rozpuszczalnego polipeptydu Sp35 bezpośrednio w miejsce przewlekłych zmian chorobowych spowodowanego przez SM. [0008] W niektórych przykładach wykonania, antagonistą Sp35 jest polipeptyd fuzyjny zawierający część nienależącą do Sp35. W niektórych przykładach wykonania, część nienależąca do Sp35 jest wybierana z grupy obejmującej ugrupowanie przeciwciał Ig, ugrupowanie albuminy surowiczej, ugrupowanie ukierunkowujące, ugrupowanie raportujące oraz ugrupowanie ułatwiające oczyszczanie. W niektórych przykładach wykonania, ugrupowanie przeciwciał Ig stanowi ugrupowanie zawiasu oraz Fc. 2

4 [0009] W niektórych przykładach wykonania, polipeptydy i przeciwciała użyte według niniejszego wynalazku są sprzężone z polimerem. W niektórych przykładach wykonania, polimer jest wybierany z grupy obejmującej glikol polialkilenowy, polimer cukru i polipeptyd. W niektórych przykładach wykonania, glikolem polialkilenowym jest glikol polietylenowy (PEG). W niektórych przykładach wykonania, polipeptydy i przeciwciała użyte według niniejszego wynalazku są sprzężone z polimerami 1, 2, 3 i 4. W niektórych przykładach wykonania, całkowita masa cząsteczkowa polimerów wynosi od 5000 Da do Da. Wynalazek został określony w załączonym zbiorze zastrzeżeń. Krótki opis rysunków [0010] Rysunek 1 przedstawia sekwencję nukleotydową pełnej długości cdna ludzkiego Sp35 (Numer identyfikacyjny sekwencji: 1). [0011] Rysunek 2 przedstawia sekwencję aminokwasową pełnej długości ludzkiego polipeptydu Sp35 (Numer identyfikacyjny sekwencji: 2). [0012] Rysunek 3 przedstawia sekwencję nukleotydową sekwencji kodującej pełnej długości mysiego polipeptydu Sp35 (Numer identyfikacyjny sekwencji: 3). [0013] Rysunek 4 przedstawia sekwencję aminokwasową pełnej długości mysiego polipeptydu Sp35 (Numer identyfikacyjny sekwencji: 4). [0014] Rysunek 5 - Sp5 (LINGO-1) jest wyrażone w oligodendrocytach. Analiza RT-PCR ekspresji LINGO-1 mrna w kulturach neuronalnych P13 CG (p13cgn), oligodendrocytów i astrocytów. Ekspresja GAPDH była analizowana z tych samych próbek, co w przypadku kontroli wewnętrznej. [0015] Rysunki 6A i 6B - (A) Analiza RT-PCR ekspresji SP5 (LINGO-1) mrna w oligodendrocytach zainfekowanych RNAi oraz w kontrolnych próbkach niezainfekowanych. β-aktynę zastosowano jako wzorzec wewnętrzny. (B) Kwantyfikacja dojrzałych oligodendrocytów w kulturach poddanych działaniu RNAi. [0016] Rysunek 7 - Ekspresja Sp35 (LINGO-1) mrna w oligodendrocytach na różnych etapach rozwoju. Oligodendrocyty były indukowane w celu wywołania dyferencjacji, a kwantyfikacja Sp35 została przeprowadzona za pomocą analizy RT-PCR. Dane zostały znormalizowane do poziomów GAPDH, stanowiących wewnętrzną kontrolę. Wczesne progenitory oligodendrocytów (A2B5 + ) oraz oligodendrocyty przedmielinizacyjne (O4 + ) wykazywały równoważne poziomy mrna Sp35, ale poziom Sp35 mrna w dojrzałych oligodendrocytach (MBP+) był ponad dwukrotnie wyższy. [0017] Rysunek 8 - Zależne od dawki różnicowanie oligodendrocytów po zastosowaniu egzogennego LINGO-1-Fc w porównaniu z zastosowaniem kontrolnego polipeptydu Fc. Dane te zostały ujęte ilościowo poprzez zliczenie dojrzałych oligodendrocytów (zidentyfikowanych przez obecność warstw mieliny) jako wielkości procentowej wszystkich oligodendrocytów 04+. W każdej próbce liczono około 800 komórek. [0018] Rysunek 9 - Antagonisty LINGO-1 (Sp5) regulują RhoA oraz Fyn. (A) Ilość RhoA-GTP w oligodendrocytach po zastosowaniu LINGO-1-Fc, jak zidentyfikowane za pomocą metody Western blot. (B) Ekspresja 3

5 Fyn oraz fosforylacja (pfyn) w oligodendrocytach zakażonych lentiwirusem zawierającym FL-LINGO-1, DN- LINGO-1 lub plazmidy kontrolne, jak zidentyfikowane za pomocą metody Western blot. [0019] Rysunek 10A Antagonisty LINGO-1 wzmacniają mielinizację aksonów przez oligodendrocyty. Analiza ilościowa mielinizacji kokultur poddanych działaniu LINGO-1-Fc (10 µg/ml) przez okres 2 tygodni. Dla każdej próbki liczono dziesięć pól barwionych na obecność MBP +. [0020] Rysunek 10B - Badanie Western blot 4-tygodniowych kokultur poddanych działaniu egzogennego LINGO-1-Fc i polipeptydu z kontrolnym fragmentem Fc, wykorzystując przeciwciała przeciw zasadowemu białku mieliny (anty-mbp) w celu wykrycia obecności białka MBP. [0021] Rysunki 10C i 10D - Elektronomikroskopowa analiza kokultur poddanych działaniu LINGO-1-Fc (C) lub kontrolnego fragmentu Fc (D) przez okres 4 tygodni. Wskazana została struktura przewężenia Ranviera. Pasek skali 1,5 µm. [0022] Rysunki 10E i 10F - Mielinizacja w kokulturach zakażonych FL-LINGO-1, DN-LINGO-1 i lentiwirusem kontrolnym przez dwa tygodnie. Ilość komórek MBP + została określona metodą immunofluorescencyjną (E). Wyniki badań Western blot kultur zakażonych FL-LINGO-1, DN-LINGO-1 i lentiwirusem kontrolnym, analizowane pod kątem MBP oraz LINGO-1 z wykorzystaniem przeciwciała przeciw znacznikowi hemaglutyniny (F). [0023] Rysunek 10G - Mielinizacja w kokulturach, w których jedynie komórki zwoju korzeni grzbietowych nerwów rdzeniowych (zakażenie DRG) lub oligodendrocyty (zakażenie oligodendrocytów) lub obydwa rodzaje (podwójne zakażenie) zostały zakażone FL-LINGO-1, DN-LINGO-1 lub lentiwirusem kontrolowanym. [0024] Rysunki 11A i 11B - Mikroskopia elektronowa przedstawiająca (A) wizualną i (B) ilościowa analizę zmielinizowanych włókien aksonów w rdzeniu kręgowym myszy P1 pozbawionych genu LINGO-1 oraz typu dzikiego. Analizą objęto cztery rdzenie kręgowe; dla każdej próbki liczono zmielinizowane włókna aksonów z dziesięciu pól. Przedstawione dane stanowią średnie wartości z wszystkich pomiarów. [0025] Rysunek 12 - Myszy poddanej działaniu kupryzonu wstrzyknięto chirurgicznie zgodnie z opisem Sp5- Fc (LINGO-1-Fc) lub polipeptyd kontrolny. U zwierząt poddanych leczeniu Sp35-Fc odnotowano wzrost przeżywalności dojrzałych oligodendrocytów (na podstawie barwienia przeciwciał przeciw CC1). [0026] Rysunek 13 - Test na proliferację i apoptozę (oznaczenie TUNEL) różnicowanych komórek PC12 18 godzin po wycofaniu NGF, leczonych za pomocą Sp35-Fc (LINGO-1-Fc) lub kontroli. Wśród komórek poddanych leczeniu za pomocą Sp5-Fc było mniej komórek ulegających apoptozie. [0027] Rysunek 14 - Apoptoza w zróżnicowanych komórkach PC12 pozbawionych wsparcia troficznego 18 godzin po wycofaniu NGF z pożywki hodowlanej, leczonych Sp35-Fc (LINGO-1), inhibitorem kaspazy zvad lub polipeptydem kontrolnym. Komórki poddane leczeniu za pomocą polipeptydu kontrolnego cechowały się największą śmiertelnością. 4

6 [0028] Rysunek 15 - Wyniki badania Western blot kokultur leczonych egzogennym LINGO- 1-Ig-Fc, zmutowanym LINGO-1-Ig-Fc (arginina w pozycji 456 została zastąpiona histydyną), LINGO-1-Fc i polipeptydem z kontrolnym fragmentem Fc, przy wykorzystaniu przeciwciał przeciw zasadowemu białku mieliny (anty-mbp) w celu wykrycia obecności białka MBP. [0029] Rysunek 16 - Badanie Western blot czterech kokultur leczonych za pomocą cyklicznych peptydów egzogennego LINGO-1-Ig oraz cyklicznych peptydów zmutowanego LINGO-1-Ig, jak opisano w przykładzie 6, przy wykorzystaniu przeciwciał przeciw zasadowemu białku mieliny (anty-mbp) w celu wykrycia obecności białka MBP. Szczegółowy opis wynalazku Definicje [0030] O ile nie zdefiniowano inaczej, wszelkie określenia techniczne i naukowe stosowane w niniejszym opisie mają znaczenie ogólnie przyjęte w dziedzinie, do której należy niniejszy opis. W przypadku konfliktu, treść niniejszego zgłoszenia, wraz z definicjami, ma charakter wiążący. O ile z kontekstu nie wynika inaczej, terminy stosowane w liczbie pojedynczej obejmują terminy w liczbie mnogiej, a terminy w liczbie mnogiej obejmują terminy w liczbie pojedynczej. [0031] Chociaż metody i materiały podobne lub równoważne do tych określonych w niniejszym ujawnieniu mogą być stosowane w praktyce lub przy testowaniu niniejszego ujawnienia, odpowiednie materiały i metody zostały opisane poniżej. Przedstawione materiały, sposoby i przykłady mają wyłącznie charakter ilustracyjny i nie są wyczerpujące. Inne cechy i zalety ujawnienia zostaną przedstawione w szczegółowym opisie oraz w zastrzeżeniach patentowych. [0032] W celu sprecyzowania niniejszego ujawnienia, stosuje się następujące określenia i definicje. [0033] Należy zauważyć, że termin "jednostka" może odnosić się do więcej niż jednej jednostki; na przykład, określenie "cząsteczka immunoglobuliny" należy rozumieć jako jedną lub więcej cząsteczek immunoglobuliny. Jako takie, określenia "jeden lub więcej" i "co najmniej jeden" mogą być stosowane zamiennie. [0034] W niniejszym opisie i zastrzeżeniach, określenie "obejmować" lub jego odmiany, takie jak "obejmuje" lub "obejmujący" wskazują na uwzględnienie pewnej sprecyzowanej całości lub grupy całości, lecz nie na wykluczenie jakiejkolwiek innej całości lub grupy całości. [0035] W niniejszym opisie "terapeutycznie skuteczna ilość" oznacza ilość, skuteczną pod względem zastosowanej dawki i niezbędnego okresu czasu, do uzyskania żądanego skutku terapeutycznego. Skutkiem terapeutycznym może być np. zmniejszenie objawów, zwiększenie przeżywalności, zwiększona mobilność itp. Skutkiem terapeutycznym nie musi być "wyleczenie". [0036] W niniejszym opisie "zapobiegawczo skuteczna ilość" oznacza ilość skuteczną, pod względem zastosowanej dawki i niezbędnego okresu czasu, do uzyskania żądanego zapobiegawczego skutku. Zazwyczaj, 5

7 ponieważ dawki zapobiegawcze stosuje się u pacjentów przed lub we wczesnym stadium choroby, zapobiegawczo skuteczna ilość będzie mniejsza niż w ilość skuteczna terapeutycznie. [0037] W niniejszym opisie, "polinukleotyd" może zawierać sekwencję nukleotydową pełnej długości sekwencji cdna, w tym nieulegające translacji sekwencje 5' i 3', sekwencje kodujące, jak również fragmenty, epitopy, domeny i warianty sekwencji kwasu nukleinowego. Polinukleotyd może składać się z dowolnych polirybonukleotydów lub polideoksyrybonukleotydów, które mogą mieć formę niezmodyfikowanego RNA lub DNA, bądź zmodyfikowanego RNA lub DNA. Na przykład polinukleotydy mogą składać się z jedno- i dwuniciowego DNA, DNA zawierającego pomieszane regiony jedno- i dwuniciowe, jedno- i dwuniciowego RNA, RNA zawierającego pomieszane regiony jedno- i dwuniciowe, cząsteczek hybrydowych zawierających DNA i RNA, które mogą być albo jednoniciowe lub znacznie częściej dwuniciowe lub zawierają pomieszane regiony jedno- i dwuniciowe. Ponadto, polinukleotydy mogą być zbudowane z regionów trójniciowych zawierających RNA lub DNA lub zarówno RNA jak i DNA. Polinukleotydy mogą zawierać również jedną lub więcej zmodyfikowanych zasad lub szkielety DNA lub RNA zmodyfikowane dla zapewnienia stabilność lub z innych powodów. "Zmodyfikowane" zasady obejmują, na przykład, zasady zawierające grupę tritylową oraz nietypowe zasady, takie jak inozyna. DNA i RNA można poddać różnym modyfikacjom, w związku z czym "polinukleotyd" obejmuje formy zmodyfikowane chemicznie, enzymatycznie lub metabolicznie. [0038] W niniejszym ujawnieniu, polipeptyd może składać się z aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi lub zmodyfikowanymi wiązaniami peptydowymi tj. izosterami peptydów i mogą zawierać aminokwasy inne niż te z grupy 20 aminokwasów kodowanych przez geny (np. aminokwasy niewystępujące w środowisku naturalnym). Polipeptydy określone w niniejszym ujawnieniu mogą być modyfikowane zarówno w procesach naturalnych, takich jak modyfikacje posttranslacyjne, lub techniki modyfikacji chemicznych, które są dobrze znane w tej dziedzinie techniki. Takie modyfikacje są gruntownie opisane w podstawowych tekstach oraz w bardziej szczegółowych monografiach, jak również w obszernej literatury naukowej. Modyfikacje mogą występować w dowolnym miejscu polipeptydu, w tym w szkielecie peptydowym, łańcuchach bocznych lub w końcach aminowych lub karboksylowych. Należy zdawać sobie sprawę, że tego samego typu modyfikacje mogą występować w tym samym lub w różnym stopniu w różnych miejscach danego polipeptydu. Ponadto, dany polipeptyd może zawierać wiele typów modyfikacji. Polipeptydy mogą być rozgałęzione, na przykład, w wyniku ubikwitynacji, a także mogą być cykliczne, z rozgałęzieniami lub bez. Cykliczne, rozgałęzione lub rozgałęzione i cykliczne polipeptydy mogą być wynikiem naturalnych procesów posttranslacyjnych lub mogą być wytwarzane w drodze syntezy. Procesy modyfikacyjne obejmują: acetylację, acylację, ADP-rybozylację, amidowanie, kowalencyjne przyłączenie flawin, kowalencyjne przyłączenie ugrupowania hemowego, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu lub pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu lub pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie, cyklizację, tworzenie mostków dwusiarczkowych, demetylację, tworzenie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, tworzenie cysteiny, tworzenie piroglutaminianu, formylowanie, gamma-karboksylację, glikozylację, tworzenie kotwic GPI, hydroksylację, jodowanie, metylację, mirystylację, utlenianie, pegylację, przetwarzania proteolityczne, fosforylację, prenylację, racemizację, selenizację, siarczanowanie, przyłączenie aminokwasów za pośrednictwem transportującego RNA do białek, w procesach takich jak arginylacja i ubikwitynacja. (Zob. np. Proteins - Structure And Molecular Properties, Wyd. II, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nowy Jork 6

8 (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, red., Academic Press, Nowy Jork, str (1983); Seifter i wsp., Meth Enzymol 182: (1990); Rattan i wsp., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).) [0039] Terminy "fragment", "wariant", "pochodna" i "analog", w odniesieniu do antagonistów Sp35 w niniejszym ujawnieniu, obejmują wszelkie cząsteczki antagonistów, które zachowują co najmniej pewną zdolność hamowania aktywności Sp35. Opisane w niniejszym dokumencie antagonisty Sp35 mogą obejmować fragment, wariant lub cząsteczki pochodne bez ograniczeń, pod warunkiem, że antagonista Sp35 będzie nadal spełniał swoją funkcję. Ujawnione w niniejszym dokumencie rozpuszczalne polipeptydy Sp35 mogą obejmować fragmenty proteolityczne Sp35, fragmenty pochodzące z delecji, a w szczególności, fragmenty, które łatwiej docierają do miejsca działania po podaniu u zwierzęcia. Fragmenty polipeptydowe zawierają ponadto wszelkie części polipeptydu, które stanowią epitop antygenowy lub immunogenny natywnego polipeptydu, w tym epitopy liniowe, jak i trójwymiarowe. Ujawnione w niniejszym dokumencie rozpuszczalne polipeptydy Sp35 mogą obejmować obszary wariantu Sp35, w tym wyżej opisane fragmenty, jak również polipeptydy o sekwencjach aminokwasowych zmienionych w wyniku substytucji, delecji lub insercji aminokwasów. Niektóre warianty, takie jak wariant alleliczny, występują naturalnie. Przez określenie "wariant alleliczny" należy rozumieć inne formy genu zajmujące dany locus na chromosomie organizmu. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nowy Jork (1985). Nie występujące naturalnie warianty mogą być wytwarzane za pomocą znanych w tej dziedzinie technik mutagenezy. Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 mogą obejmować zachowawcze lub nie-zachowawcze substytucje, delecje lub insercje aminokwasów. Do ujawnionych w niniejszym dokumencie antagonistów Sp35 można zaliczyć również pochodne cząsteczek. Przykładowo, określane w niniejszym ujawnieniu rozpuszczalne polipeptydy Sp35 mogą obejmować regiony Sp35, które zostały zmienione tak, aby wykazywać dodatkowe cechy, które nie występują w natywnym polipeptydzie. Do przykładów należą białka fuzyjne oraz koniugaty białkowe. [0040] W niniejszym ujawnieniu "fragment polipeptydu" odnosi się do krótkiej sekwencji aminokwasów polipeptydu Sp35. Fragmenty białka mogą być "osobne" lub stanowić fragment większego polipeptydu, którego jest częścią lub obszarem. Reprezentatywne przykłady fragmentów polipeptydowych ujawnionych w niniejszym opisie obejmują na przykład, fragmenty o długości około 5 aminokwasów, około 10 aminokwasów, około 15 aminokwasów, około 20 aminokwasów, około 30 aminokwasów, około 40 aminokwasów, około 50 aminokwasów, około 60 aminokwasów, około 70 aminokwasów, około 80 aminokwasów, około 90 aminokwasów, około 100 aminokwasów. [0041] Przeciwciało lub immunoglobulina. W jednym przypadku, antagonistami Sp35 stosowanymi w metodach leczenia ujawnionych w niniejszym dokumencie są cząsteczki "przeciwciał" lub "immunoglobulin" lub ich immunospecyficzne fragmenty np. naturalnie występujące cząsteczki przeciwciał lub immunoglobulin lub syntetycznie uzyskane cząsteczki przeciwciał lub fragmenty wiążące antygen w sposób podobny jak cząsteczki przeciwciał. Terminy "przeciwciało" i "immunoglobulina" stosuje się w niniejszym opisie wymiennie. Przeciwciała lub immunoglobuliny zawierają przynajmniej domenę zmienną łańcucha ciężkiego, a zazwyczaj zawierają przynajmniej domeny zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego. Podstawowe struktury im- 7

9 munoglobulin w systemach kręgowców są stosunkowo dobrze zrozumiane. Zob. np. Harlow i wsp., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Wyd. II, 1988). [0042] Jak omówione zostanie bardziej szczegółowo w dalszej części tekstu, określenie "immunoglobulina" obejmuje pięć szerokich klas polipeptydów, które można wyróżnić biochemicznie. Wszystkie pięć klas wchodzi wyraźnie w zakres ujawnienia, przy czym poniższe omówienie będzie obejmowało głównie klasę IgG cząsteczek immunoglobulin. W odniesieniu do IgG, standardowa cząsteczka immunoglobuliny zawiera dwa identyczne lekkie łańcuchy polipeptydowe o masie cząsteczkowej około daltonów oraz dwa identyczne ciężkie łańcuchy polipeptydowe o masie cząsteczkowej Te cztery łańcuchy są zazwyczaj połączone wiązaniami dwusiarczkowymi w konfiguracji "Y", w której łańcuchy lekkie spinają łańcuchy ciężkie począwszy od rozwidlenia "Y" cząsteczki i dalej przechodzą przez region zmienny. [0043] Zarówno łańcuchy lekkie jak i ciężkie są podzielone na regiony o homologii strukturalnej i funkcjonalnej. Terminy "stała" i "zmienna" są stosowane funkcjonalnie. W związku z tym, należy zdawać sobie sprawę, że zmienne domeny zarówno części łańcuchów lekkich (V L ) jak i ciężkich (V H ) określają rozpoznanie i specyficzność antygenu. Odwrotnie, domeny stałe łańcucha lekkiego (C L ) i łańcucha ciężkiego (C H 1, C H 2 lub C H 3) nadają istotne właściwości biologiczne, takie jak wydzielanie, mobilność łożyskowa, wiązanie receptora Fc, wiązanie komplementu itp. Zgodnie z konwencją, numeracja domen regionu stałego rośnie wraz z tym, jak stają się one coraz bardziej dystalne od miejsca wiążącego antygen lub koniec aminowy przeciwciała. N- końcowa część jest regionem zmiennym, a C-końcowa część jest regionem stałym; domeny C H 3 i C L w rzeczywistości zawierają koniec karboksylowy odpowiednio łańcucha ciężkiego i lekkiego. [0044] Łańcuchy lekkie są klasyfikowane jako kappa lub lambda (κ, λ). Łańcuch ciężki każdej klasy może być wiązany zarówno przez łańcuch lekki kappa, jak i lambda. Ogólnie rzecz biorąc, łańcuchy lekkie i ciężkie wiążą się ze sobą nawzajem kowalencyjnie, a części "końcowe" obydwu łańcuchów ciężkich wiążą się ze sobą nawzajem za pomocą kowalencyjnych wiązań dwusiarczkowych lub wiązań niekowalencyjnych w przypadku, gdy immunoglobuliny są generowane przez hybrydomy, komórki B lub genetycznie zmodyfikowane komórki gospodarza. W łańcuchu ciężkim, sekwencje aminokwasowe biegną od N-końca na rozgałęzionych końcach konfiguracji Y do C-końca na dole każdego łańcucha. Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywistym jest, że ciężkie łańcuchy są klasyfikowane jako gamma, mu, alfa, delta lub epsilon, (γ, µ, α, δ, ε), a niektóre z nich posiadają podklasy (np. γ1-γ4). Charakter tego łańcuchu określa "klasę" przeciwciała np. IgG, IgM, IgA IgG lub IgE. Podklasy immunoglobulin (izotypy), np. IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1 itp., zostały dobrze scharakteryzowane i wiadome jest, że nadają one specjalizację funkcjonalną. Zmodyfikowane wersje każdej z tych klas i izotypów są łatwe do zidentyfikowania dla specjalisty w tej dziedzinie w świetle przedstawionego ujawnienia, a zatem wchodzą w zakres niniejszego ujawnienia. [0045] Jak wskazano powyżej, region zmienny umożliwia przeciwciału selektywne rozpoznanie i wiązanie epitopów antygenów. Oznacza to, że domena V L oraz domena V H przeciwciała łączą się tworząc region zmienny, definiującym trójwymiarowy fragment wiążący antygen. Ta czwartorzędowa struktura przeciwciała tworzy fragment wiążący antygen obecny na końcu każdego ramienia w konfiguracji Y. W szczególności, miejsce wiązania antygenu jest określone przez trzy dopełniające się regiony określające wiązanie (CDR) na każdym z łańcuchów V H i V L. W pewnych przypadkach, np. w niektórych cząsteczkach immunoglobulin po- 8

10 chodzących od wielbłądowatych lub opracowanych na podstawie immunoglobulin wielbłądowatych, kompletna cząsteczka immunoglobuliny może zawierać wyłącznie ciężkie łańcuchy, bez łańcuchów lekkich. Zob. np. Hamers-Casterman i wsp., Nature 363: (1993). [0046] W przeciwciałach występujących naturalnie, sześć "regionów determinujących dopasowanie" lub "CDR" występujących w każdej domenie wiążącej antygen ma formę krótkich nieciągłych sekwencji aminokwasów, które są pozycjonowane w taki sposób, aby utworzyć domenę wiążącą antygen, gdy przeciwciało przyjmuje swą trójwymiarową konfigurację w środowisku wodnym. Pozostała część aminokwasów w domenach wiążących antygen, zwana regionami "zrębowymi", wykazuje mniejszą zmienność międzycząsteczkową. Regiony zrębowe przyjmują głównie konformacje harmonijki β, a regiony CDR tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące część struktury harmonijki β. Tak więc, regiony zrębowe pełnią rolę rusztowania umożliwiającego umieszczenie regionów CDR w prawidłowym położeniu poprzez międzyłańcuchowe oddziaływania niekowalencyjne. Domena wiążąca antygen utworzona przez pozycjonowane regiony CDR określa powierzchnię komplementarną do epitopu na immunoreaktywnym antygenie. Ta komplementarna powierzchnia promuje wiązanie niekowalencyjne przeciwciała z jego epitopem pokrewnym. W aminokwasach zawierających odpowiednio regiony CDR i regiony zrębowe, osoba posiadająca podstawową wiedzę w dziedzinie łatwo zidentyfikuje region zmienny w danym łańcuchu ciężkim lub łańcuchu lekkim, ponieważ zostały one precyzyjnie określone, (zob. "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E. i wsp., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); oraz Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196: (1987). [0047] Jednakże, u wielbłądowatych, region zmienny łańcucha ciężkiego, zwany V H H, tworzy cały region CDR. Główne różnice między regionami zmiennymi V H H u wielbłądowatych, a wywodzącymi się od tradycyjnych przeciwciał (V H ) to między innymi (a) zawartość aminokwasów o większych właściwościach hydrofobowych na powierzchni styku lekkiego łańcucha V H w porównaniu do odpowiedniego regionu V H H; (b) dłuższy region CDR3 w V H H oraz (c) częste występowanie wiązań dwusiarczkowych pomiędzy regionami CDR1, a CDR3 w V H H. [0048] W jednym przypadku, ujawniona w niniejszym dokumencie cząsteczka wiążąca antygen zawiera co najmniej jeden region CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego cząsteczki przeciwciała. W innym przypadku, ujawniona w niniejszym dokumencie cząsteczka wiążąca antygen zawiera co najmniej dwa regiony CDR z jednej lub więcej cząsteczek przeciwciał. W innym przypadku, ujawniona w niniejszym dokumencie cząsteczka wiążąca antygen zawiera co najmniej trzy regiony CDR z jednej lub więcej cząsteczek przeciwciał. W innym przypadku, ujawniona w niniejszym dokumencie cząsteczka wiążąca antygen zawiera co najmniej cztery regiony CDR z jednej lub więcej cząsteczek przeciwciał. W innym przypadku, ujawniona w niniejszym dokumencie cząsteczka wiążąca antygen zawiera co najmniej pięć regionów CDR z jednej lub więcej cząsteczek przeciwciał. W innym przypadku, ujawniona w niniejszym dokumencie cząsteczka wiążąca antygen zawiera co najmniej sześć regionów CDR z jednej lub więcej cząsteczek przeciwciał. W dziedzinie znane są przykładowe cząsteczki przeciwciał zawierające co najmniej jeden z regionów CDR, które mogą być zawarte w przedmiotowych cząsteczkach wiążących antygen. Przykładowe cząsteczki zostały opisane w niniejszym dokumencie. 9

11 [0049] Przeciwciała lub ich immunospecyficzne fragmenty przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, wielospecyficzne, ludzkie, humanizowane, prymatyzowane lub chimeryczne, przeciwciała jednołańcuchowe, fragmenty wiążące epitopy, np. Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, Fvs, jednołańcuchowe Fvs (scfv), przeciwciała jednołańcuchowe, Fvs (sdfv) połączone wiązaniami dwusiarczkowymi, fragmenty zawierające domenę V L lub V H, fragmenty wytwarzane przez biblioteki ekspresyjne Fab oraz przeciwciała antyidiotypowe (anty-id) (w tym np. przeciwciała anty-id przeciw opisywanym tu cząsteczkom wiążącym). Cząsteczki scfv są znane w dziedzinie i zostały opisane np. w opisie patentowym US Ujawnione w niniejszym dokumencie cząsteczki immunoglobulin lub przeciwciał mogą być dowolnego typu (np. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klasy (np. IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1 oraz IgA 2 ) lub podklasy cząsteczki immunoglobuliny. [0050] Fragmenty przeciwciał, w tym przeciwciał jednołańcuchowych, mogą zawierać osobne regiony zmienne lub połączone z całością lub częścią: regionu zawiasu, domen C H 1, C H 2, i C H 3. Niniejsze ujawnienie obejmuje również fragmenty wiążące antygen, zawierające dowolną kombinację regionu zmiennego z regionem zawiasowym, domenami C H 1, C H 2, i C H 3. Przeciwciała lub ich immunospecyficzne fragmenty stosowane w metodach diagnostycznych i terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą pochodzić od dowolnych zwierząt, w tym od ptaków i ssaków. Korzystnie, przeciwciała powinny pochodzić od człowieka, myszy, osła, królika, kozy, świnki morskiej, wielbłąda, lamy, konia lub kurczaka. W innym przypadku region zmienny może pochodzić od rybokształtnych (np. od rekinów). W niniejszym opisie, "ludzkie" przeciwciała obejmują przeciwciała zawierające sekwencję aminokwasową ludzkiej immunoglobuliny oraz obejmują przeciwciała wyizolowane z bibliotek ludzkich immunoglobulin lub zwierząt transgenicznych produkujących jedną lub więcej z ludzkich immunoglobulin i niewyrażających immunoglobulin endogennych, jak opisano poniżej oraz np. w opisie patentowym US przez Kucherlapati i wsp. [0051] W niniejszym opisie, termin "część łańcucha ciężkiego" obejmuje sekwencje aminokwasowe wywodzące się z łańcucha ciężkiego immunoglobuliny. Polipeptyd zawierający część łańcucha ciężkiego obejmuje co najmniej jedną z: domeny C H 1, domeny zawiasowej (np. górny, środkowy i/lub niższy region zawiasowy), domeny C H 2, domeny C H 3 lub jej wariantu bądź fragmentu. Na przykład, polipeptyd wiążący może zawierać łańcuch polipeptydowy zawierający domenę C H 1; łańcuch polipeptydowy zawierający domenę C H 1, przynajmniej część domeny zawiasowej i domenę C H 2; łańcuch polipeptydowy zawierający domenę C H 1 i domenę C H 3; łańcuch polipeptydowy zawierający domenę C H 1, przynajmniej część domeny zawiasowej i domenę C H 3 lub łańcuch polipeptydowy zawierający domenę C H 1, przynajmniej część domeny zawiasowej, domenę C H 2 i domeny C H 3. W innym przypadku, polipeptyd według niniejszego ujawnienia obejmuje łańcuch polipeptydowy zawierający domenę C H 3. Ponadto, polipeptyd wiążący może być pozbawiony co najmniej część domeny C H 2 (np. całości lub części domeny C H 2). Jak zaznaczono powyżej, dla specjalistów w tej dziedzinie zrozumiałym jest, że domeny te (np. części łańcuchów ciężkich) mogą zostać zmodyfikowane w taki sposób, że różnią się one pod względem sekwencji aminokwasów od cząsteczek naturalnie występujących immunoglobulin. [0052] W niektórych przeciwciałach lub fragmentach immunospecyficznych antagonistów Sp35 wykorzystywanych w opisywanych tu metodach leczenia, części łańcucha ciężkiego jednego łańcucha polipeptydowego 10

12 multimeru są identyczne jak części łańcucha ciężkiego w drugim łańcuchu polipeptydowym multimeru. Alternatywnie, części łańcucha ciężkiego zawierające monomery nie są identyczne. Na przykład, każdy monomer może zawierać inne docelowe miejsce wiązania, tworząc na przykład przeciwciało dwuspecyficzne. [0053] Części łańcucha ciężkiego polipeptydu wiążącego wykorzystywane w metodach diagnostycznych i leczniczych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą pochodzić z różnych cząsteczek immunoglobulin. Na przykład, część łańcucha ciężkiego polipeptydu może zawierać domenę C H 1 wywodzącą się z cząsteczki IgG 1 i regionu zawiasowego wywodzącego się z cząsteczki IgG 3. W innym przykładzie, część łańcucha ciężkiego może zawierać region zawiasowy wywodzący się częściowo z cząsteczki lgg 1, a częściowo z cząsteczki IgG 3. W innym przykładzie, część łańcucha ciężkiego może zawierać zawias chimeryczny wywodzący się częściowo z cząsteczki lgg 1, a częściowo z cząsteczki IgG 4. [0054] W niniejszym opisie, termin "część łańcucha lekkiego" obejmuje sekwencje aminokwasowe wywodzące się z łańcucha lekkiego immunoglobuliny. Korzystnie, część łańcucha lekkiego powinna zawierać co najmniej jedną z domen V L lub C L. [0055] Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego nienaturalny wariant polipeptydu wywodzącego się z immunoglobuliny (np. część łańcucha ciężkiego lub część łańcucha lekkiego immunoglobuliny) może być tworzona przez wprowadzenie co najmniej jednej substytucji, addycji lub delecji w sekwencji immunoglobuliny w taki sposób, że co najmniej jedna substytucja, addycja lub delecja aminokwasowa jest wprowadzana do zakodowanego białka. Mutacje można wprowadzać przy użyciu standardowych technik, takich jak mutageneza ukierunkowana lub mutageneza metodą PCR. Korzystnie, konserwatywne podstawienia aminokwasów winny być dokonywane w miejsce jednego lub więcej nieistotnych reszt aminokwasowych. [0056] Przeciwciała lub ich immunospecyficzne fragmenty wykorzystywane w ujawnionych tu metodach leczenia można opisać lub określić również pod względem ich powinowactwa wiązania polipeptydu niniejszego ujawnienia. Preferowane powinowactwa wiązania obejmują te ze stałą dysocjacji lub wartością Kd mniejszą niż 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x M, M, 5 x M, M, 5 x M, M, 5 x M, M, 5 x M, M, 5 x M lub M. [0057] Przeciwciała lub ich immunospecyficzne fragmenty wykorzystywane w ujawnionych tu metodach leczenia działają jako antagonisty Sp35, jak opisano w niniejszym dokumencie. Na przykład, przeciwciało może działać jak antagonista, blokując lub hamując aktywność tłumiącą polipeptydu Sp35. [0058] W niniejszym opisie, określenie "przeciwciało chimeryczne" będzie oznaczało każde przeciwciało, w którym region lub miejsce immunoreaktywne jest uzyskiwane lub otrzymywane z jednego gatunku, a region stały (który może być nienaruszony, częściowy lub zmieniony) uzyskuje się z drugiego gatunku. W korzystnych przypadkach, docelowy region wiążący lub miejsce jest pochodzenia nieludzkiego (np. od myszy i naczelnych), a region stały jest pochodzenia ludzkiego. 11

13 [0059] W niniejszym opisie, termin "przeciwciało inżynierowane" odnosi się do przeciwciała, w którym domena zmienna w łańcuchu ciężkim lub lekkim lub w obydwu została zmieniona przez co najmniej częściowe zastąpienie jednego lub więcej regionów CDR przeciwciała o znanej swoistości i, w razie potrzeby, przez częściowe zastąpienie regionu zrębowego i zmianę sekwencji. Chociaż regiony CDR mogą wywodzić się od przeciwciał tej samej klasy lub nawet podklasy, co przeciwciało, z którego pochodzą regiony zrębowe, przewiduje się, że regiony CDR będą pochodzić z przeciwciała innej klasy, a najlepiej z przeciwciała pochodzącego z innego gatunku. Przeciwciało inżynierowane, w którym jeden lub więcej regionów CDR "dawców" pochodzących z nieludzkiego przeciwciała o znanej swoistości zostaje wszczepiony w region zrębowy ludzkiego łańcucha ciężkiego lub lekkiego jest określane w niniejszym dokumencie jako "przeciwciało humanizowane". Nie ma potrzeby zastępowania wszystkich regionów CDR kompletnymi regionami CDR z regionu zmiennego dawcy, aby przenieść zdolność wiązania antygenu pomiędzy domenami zmiennymi. Może być tylko konieczne przeniesienie tylko tych reszt, które są niezbędne w celu utrzymania aktywności docelowego miejsca wiązania. Biorąc pod uwagę wyjaśnienia zawarte w np. opisach patentowych nr US , , i , specjaliści w tej dziedzinie techniki będą w stanie, poprzez przeprowadzenie rutynowych eksperymentów lub metodą prób i błędów uzyskać funkcjonalne przeciwciała inżynierowane lub humanizowane. [0060] W niniejszym opisie, określenia "złączony", "zlany" lub "fuzja" są stosowane wymiennie. Określenia te odnoszą się do łączenia ze sobą dwóch kolejnych elementów lub części, w jakikolwiek sposób w tym w drodze koniugacji chemicznej lub rekombinacji. "Fuzja in-frame" odnosi się do łączenia dwóch lub więcej otwartych ramek odczytu (ORF) w celu utworzenia ciągłej dłuższej ramki ORF, w sposób pozwalający zachować prawidłowość ramki odczytu oryginalnej ramki ORF. Stąd, powstałe rekombinowane białko fuzyjne stanowi pojedyncze białko zawierające co najmniej dwa segmenty, które odpowiadają polipeptydom zakodowanym przez oryginalne ramki ORF (które to segmenty nie są normalnie połączone w ten sposób w naturze). Chociaż ramka odczytu zachowuje ciągłość we wszystkich połączonych segmentach, segmenty mogą być fizycznie lub przestrzennie oddzielone, na przykład, poprzez sekwencję łącznika in-frame. [0061] W kontekście polipeptydów, "sekwencja liniowa" lub "sekwencja" to kolejność aminokwasów w polipeptydzie w kierunku od końca aminowego do końca karboksylowego, w którym sąsiadujące ze sobą w sekwencji reszty są przyległe w strukturze pierwszorzędowej polipeptydu. [0062] Stosowane, w niniejszym opisie określenie "ekspresja" odnosi się do procesu, w którym gen tworzy związek biochemiczny np. RNA lub polipeptyd. Proces ten obejmuje wszelkie manifestacje funkcjonalnej obecności genu w komórce, w tym, lecz niewyłącznie, zachowaną ale obniżoną ekspresję genów jak i ekspresję przejściową oraz ekspresję stabilną. Obejmuje on bez ograniczeń transkrypcję genu dającą RNA matrycowy (mrna), RNA transportujący (trna), RNA o strukturze spinki do włosów (shrna), małe interferujące RNA (sirna) lub inne rodzaje RNA i translacje takiego mrna dające polipeptyd(y). Jeśli pożądany produkt końcowy jest związkiem biochemicznym, ekspresja obejmuje utworzenie tego związku biochemicznego oraz wszelkich jego prekursorów. [0063] Określenia "obiekt", "osobnik", "zwierzę", "pacjent" lub "ssak" oznaczają dowolny obiekt, a w szczególności ssaka będącego przedmiotem diagnozy, prognozy lub leczenia. Ssaki obejmują między innymi lu- 12

14 dzi, zwierzęta udomowione, zwierzęta hodowlane, zwierzęta w zoo, zwierzęta, zwierzęta sportowe, zwierzęta domowe takie jak psy, koty, świnki morskie, króliki, szczury, myszy, konie, bydło, krowy; naczelne, takie jak małpy, orangutany i szympansy; psowate takie jak psy i wilki; kotowate takie jak koty, lwy, tygrysy; koniowate takie jak konie, osły i zebry; zwierzęta rzeźne takie jak krowy, świnie i owce; zwierzęta kopytne takie jak jelenie i żyrafy; gryzonie takie jak myszy, szczury, chomiki i świnki morskie itp. W niektórych przypadkach ssakiem jest człowiek. [0064] Termin "Interferencja RNA" lub "RNAi" odnosi się do wyciszania lub zmniejszenia ekspresji genów przez sirna. Jest to specyficzny dla sekwencji proces posttranskrypcyjnego wyciszania genów u zwierząt i roślin, zapoczątkowany przez sirna, który jest homologiczny w swoim regionie dupleksu do sekwencji wyciszanego genu. Gen ten może być endogenny lub egzogenny w stosunku do organizmu, obecny i zintegrowany w chromosomie lub w wektorze z transfekcji, który nie jest zintegrowany z genomem. Ekspresja genu jest w całości lub częściowo blokowana. Można uznać, że RNAi blokuje działanie docelowego RNA, natomiast działanie docelowego RNA może być całkowita lub częściowe. Sp35 (LINGO-1/LRRN6) [0065] Niniejsze ujawnienie opiera się na odkryciu, że antagonisty Sp35 zwiększają liczbę oligodendrocytów poprzez stymulowanie ich przeżywalności, proliferacji i różnicowania się. Ponadto, wynalazcy odkryli, że antagonisty Sp35 wzmacniają mielinizację neuronów. Bez chęci ograniczania się przez teorię, wydaje się, że stymulacja mielinizacji wynikająca z aktywności antagonistów Sp35 jest niezależna od oddziaływania na proliferację oligodendrocytów. [0066] Naturalnie występujące ludzkie białko Sp35 jest specyficznym dla układu nerwowego białkiem glikozylowanym składającym się z 614 aminokwasów (Rys. 1, Numer identyfikacyjny sekwencji: 2). Ludzki polipeptyd Sp35 zawiera domenę LRR składają się 14 powtórzeń bogatych w leucynę (w tym końców N i C), domeny Ig, regionu transbłonowego i domeny cytoplazmatycznej (Rys. 2). Domena cytoplazmatyczna zawiera kanoniczne miejsce fosforylacji tyrozyny. Ponadto, naturalnie występujące białko Sp35 zawiera sekwencję sygnałową, krótki zasadowy region pomiędzy LRRCT a domeną Ig, oraz region transbłonowy pomiędzy domeną Ig a domeną cytoplazmatyczną (Rys. 2). Ludzki gen Sp35 zawiera alternatywne kodony startu translacji, w związku z czym sześć dodatkowych aminokwasów (MQVSKR, Numer identyfikacyjny sekwencji: 5) może być obecne lub nie na N-końcu sekwencji sygnałowej Sp35. Tabela 1 przedstawia domeny Sp35 i inne regiony, wymienione w kolejności reszt aminokwasowych, w oparciu o sekwencję na Rys. 1. Tabela 1 Domena lub region Reszta początkowa Reszta końcowa Sekwencja sygnałowa 1 33 lub 35 LRRNT 34 lub LRR LRR

15 LRR LRR LRR LRR LRR LRR LRR LRR LRR LRR LRRCT lub 416 Zasadowa 415 lub Ig Sekwencja łącząca Transbłonowa Cytoplazmatyczna [0067] Dystrybucja w tkankach i ekspresja rozwojowa Sp35 zostały zbadane u ludzi i szczurów. Biologia Sp35 została zbadana w eksperymentalnym modelu zwierzęcym ( szczurze). Ekspresja Sp35 u szczurów jest zlokalizowana w neuronach układu nerwowego i oligodendrocytach mózgu, jak ustalono za pomocą badania Northern blot i barwienia immunohistochemicznego. Poziom ekspresji mrna Sp35 u szczura jest regulowany rozwojowo, osiągając wartość szczytową wkrótce po urodzeniu tj. około w pierwszym dniu po urodzeniu. W modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego szczura przez przecięcie, poziom Sp35 jest regulowany w górę w miejscu uszkodzenia, jak określono za pomocą metody RT-PCR. Ponadto wykazano, że Sp35 wchodzi w interakcję z receptorem Nogo66 (receptor Nogo). Zob np. międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/US2004/ Jednakże receptor Nogo-1 nie jest wyrażany na oligodendrocytach i jakikolwiek wpływ Sp35 na biologię oligodendrocytów wymaga szlaku niezależnego od receptora Nogo. Zastosowanie antagonistów Sp35 w medycynie [0068] W jednym z przedstawianych w niniejszym ujawnieniu przypadków prezentowane są metody leczenia choroby, zaburzenia lub urazu związanego z dysmielinizacją lub demielinizacją np. stwardnienia rozsianego u zwierząt cierpiących na tę chorobę, przy czym metoda ta obejmuje, zasadniczo polega lub polega na podaniu zwierzęciu skutecznej ilości antagonisty Sp35 wybranego z grupy obejmującej: rozpuszczalny polipeptyd Sp35, przeciwciało przeciw Sp35 oraz polinukleotyd antagonisty Sp35. [0069] Ponadto, ujawnienie skierowane jest na metodę stymulacji mielinizacji neuronów u ssaków, obejmującą, zasadniczo polegającą lub polegającą na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty Sp35, wybranego z grupy obejmującej: rozpuszczalny polipeptyd Sp35, przeciwciało przeciw Sp35 oraz polinukleotyd antagonisty Sp35. 14

16 [0070] W innym z przedstawianych w niniejszym ujawnieniu przypadków prezentowane są metody leczenia choroby, zaburzenia lub urazu związanego ze śmiercią lub brakiem różnicowania się oligodendrocytów np. stwardnienia rozsianego, choroby Pelizaeusa-Merzbachera lub leukodystrofii globoidalnej (choroby Krabbego), u zwierząt cierpiących na tę chorobę, przy czym metoda ta obejmuje, zasadniczo polega lub polega na podaniu zwierzęciu skutecznej ilości antagonisty Sp35 wybranego z grupy obejmującej: rozpuszczalny polipeptyd Sp35, przeciwciało Sp35 oraz polinukleotyd antagonisty Sp35. [0071] W innym z przedstawianych w niniejszym ujawnieniu przypadków prezentowana jest metoda stymulacji proliferacji, różnicowania i przeżywalności oligodendrocytów u ssaków obejmującą, zasadniczo polegającą lub polegającą na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty Sp35, wybranego z grupy obejmującej: rozpuszczalny polipeptyd Sp35, przeciwciało przeciw Sp35 oraz polinukleotyd antagonisty Sp35. [0072] Antagonista Sp35 np. rozpuszczalny polipeptyd Sp35, przeciwciało przeciw Sp35 lub polinukleotyd antagonisty Sp35, przewidziany do wykorzystania w opisywanych metodach leczenia, może być spreparowany i stosowany jako środek leczniczy, który zatrzymuje, zmniejsza, zapobiega lub hamuje zdolność Sp35 do negatywnego regulowania mielinizacji neuronów przez oligodendrocyty. Dodatkowo, antagonista Sp35 przewidziany do wykorzystania w ujawnionych tu metodach leczenia, może być wytwarzany i stosowany jako środek leczniczy, który zatrzymuje, zmniejsza, zapobiega lub hamuje zdolność Sp35 do negatywnego regulowania różnicowania, proliferacji i przeżywalności oligodendrocytów. [0073] W kolejnych przykładach zawartych w niniejszym ujawnieniu prezentowana jest metoda stymulacji proliferacji lub przeżywalności oligodendrocytów w celu leczenia choroby, zaburzenia lub urazu związanego ze zniszczeniem oligodendrocytów lub mieliny, polegająca na podaniu ssakowi, w miejscu lub w pobliżu miejsca dotkniętego chorobą, zaburzeniem lub uszkodzeniem, w ilości wystarczającej do zmniejszania zahamowania wydłużeń aksonów i stymulacji mielinizacji. [0074] W sposobach prezentowanych w niniejszym ujawnieniu, antagonistę Sp35 można podawać poprzez bezpośrednie podanie pacjentowi rozpuszczalnego polipeptydu Sp35, przeciwciała przeciw Sp35 lub polinukleotydu antagonisty Sp35. Alternatywnie, antagonistę Sp35 można podawać za pomocą wektora ekspresji, który produkuje danego antagonistę Sp35. W niektórych przypadkach niniejszego ujawnienia antagonista Sp35 jest podawany w ramach metody leczenia, która obejmuje: (1) transformację lub transfekcję przeszczepialnej komórki gospodarza kwasem nukleinowym np. wektorem wyrażającym antagonistę Sp35 oraz (2) wszczepianie transformowanej komórki gospodarza ssakowi w miejscu dotkniętym chorobą, zaburzeniem lub uszkodzeniem. Przykładowo, transformowana komórka gospodarza może zostać wszczepiona w miejscu przewlekłych zmian chorobowych spowodowanych przez SM. W niektórych przypadkach przedstawionych w niniejszym ujawnieniu, przeszczepialna komórka gospodarza jest usuwana ze ssaka, przenoszona do tymczasowej hodowli, transformowana lub poddawana transfekcji za pomocą kwasu nukleinowego kodującego antagonistę Sp35 i wszczepiana z powrotem u tego samego ssaka, z którego została usunięta. Komórka może, ale nie musi być usunięta w tym samym miejscu, w którym jest wszczepiany. Takie przypadki, niekiedy określane jako terapia genowa ex vivo, mogą zapewnić ciągłe źródło antagonisty Sp35, zlokalizowanego w miejscu działania, przez ograniczony okres czasu. 15

17 [0075] Choroby lub zaburzenia, które można leczyć lub łagodzić z zastosowaniem metody przedstawionej w niniejszym ujawnieniu obejmują choroby, zaburzenia lub urazy związane z dysmielinizacją lub demielinizacją neuronów u ssaków. W szczególności, chorób i zaburzeń, w których mielina otaczająca neuron jest nieobecna, niepełna, nieprawidłowo wytworzona lub w stanie ulegającym pogorszeniu. Do chorób takich zalicza się miedzy innymi stwardnienie rozsiane (SM), w tym jego formę rzutowo-remisyjną, wtórnie postępującą i postępującą; postępująca leukoencefalopatia wieloogniskowa (PML), zapalenie mózgu i rdzenia (EPL), mielinoliza środkowa mostu (CPM), adrenoleukodystrofia, choroba Alexandra, choroba Pelizaeusa-Merzbachera (PMZ), leukodystrofia globoidalna (chorobę Krabbego), zwyrodnienie Wallera, zapalenie nerwu wzrokowego oraz poprzeczne zapalenie rdzenia. [0076] Choroby lub zaburzenia, które można leczyć lub łagodzić z zastosowaniem metody przedstawionej w niniejszym ujawnieniu obejmują choroby, zaburzenia lub urazy odnoszące się do śmierci lub braku różnicowania się lub proliferacji oligodendrocytów. Do chorób takich zalicza się miedzy innymi stwardnienie rozsiane (SM); postępującą leukoencefalopatię wieloogniskową (PML), zapalenia mózgu i rdzenia (EPL), mielinolizę środkową mostu (CPM), adrenoleukodystrofię, chorobę Alexandra, chorobę Pelizaeusa-Merzbachera (PMZ), leukodystrofię globoidalną (chorobę Krabbego) oraz zwyrodnienie Wallera. [0077] Choroby lub zaburzenia, które można leczyć lub łagodzić z zastosowaniem metody przedstawionej w niniejszym ujawnieniu obejmują choroby lub zaburzenia neurodegeneracyjne. Do chorób takich zalicza się między innymi stwardnienie zanikowe boczne, chorobę Huntingtona, chorobę Alzheimera oraz chorobę Parkinsona. [0078] Do przykładów innych chorób, zaburzeń lub urazów, które można leczyć lub łagodzić z zastosowaniem metod niniejszego ujawnienia zalicza się między innymi: uszkodzenia rdzenia kręgowego, przewlekłą mielopatię lub radikulopatię, urazowe uszkodzenie mózgu, choroby nerwów ruchowych, aksonalne uszkodzenia rozdzierające, stłuczenia, paraliż, uszkodzenia popromienne lub inne neurologiczne powikłania chemioterapii, udar, powiększenie zatok, średnią i dużą niedrożność naczyń, leukoarajozę, ostrą niedokrwienną neuropatię nerwu wzrokowego, niedobory witaminy E (zespół izolowanego niedoboru, AR, zespół Bassena- Kornzweiga), B12, B6 (pirydoksyna-pellagra), tiaminy, kwasu foliowego, niedobór kwasu nikotynowego, zespół Marchiafavy-Bignamiego, leukodystrofię metachromatyczną, neuralgię nerwu trójdzielnego, porażenie Bella lub uszkodzenia nerwów, które wymagają regeneracji aksonów, remielinizacji lub stymulacji różnicowania, proliferacji i różnicowania oligodendrocytów. Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 [0079] Do ujawnionych w niniejszym dokumencie antagonistów Sp35 można zaliczyć te polipeptydy, które blokują, hamują lub zakłócają biologiczną funkcję naturalnie występującego Sp35. W szczególności, przedstawiane w niniejszym ujawnieniu rozpuszczalne polipeptydy Sp35 obejmują fragmenty, warianty, lub pochodne rozpuszczalnego polipeptydu Sp35. W Tabeli 1 powyżej opisano różne domeny polipeptydu Sp35. Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 są pozbawione domen wewnątrzkomórkowych i transbłonowych polipeptydu Sp35. Na przykład, niektóre rozpuszczalne polipeptydy Sp35 są pozbawione aminokwasów , które zawierają domenę transbłonową Sp35 i/lub aminokwasów , które zawierają domenę we- 16

18 wnątrzkomórkową Sp35. Ponadto, pewne rozpuszczalne polipeptydy Sp35 zawierają domeny LRR, domenę Ig, region zasadowy i/lub całą domenę zewnątrzkomórkową (odpowiadającą aminokwasom od 34 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2) polipeptydu Sp35. Specjalista w tej dziedzinie zda sobie sprawę z tego, że cała domena zewnątrzkomórkowa Sp35 może zawierać więcej lub mniej aminokwasów na C-końcu lub N-końcu domeny zewnątrzkomórkowej polipeptydu. Jako takie, rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 41 do 525 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 40 do 526 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 39 do 527 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 38 do 528 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 37 do 529 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 530 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 35 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 46 do 520 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 45 do 521 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 44 do 522 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 43 do 523 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; oraz 42 do 524 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. Do antagonistów polipeptydu Sp35 można zaliczyć dowolną kombinację domen opisanych w Tabeli 1. [0080] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 1 do 33 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 35 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 66 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 90 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 114 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 138 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 162 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 186 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 210 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 234 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 258 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 282 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 306 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 330 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 363 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 419 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz 494 do 551 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0081] Inne rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 1 do 33 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 35 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 551 se- 17

19 kwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 1 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz 1 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0082] Jeszcze inne rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 34 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz 34 do 551 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0083] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 34 do 530 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 533 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 534 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 535 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 536 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 537 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 538 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 539 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 30 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 31 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 32 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 33 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 35 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 30 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 31 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 32 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 33 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 34 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 35 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz 36 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0084] Jeszcze inne rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 36 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 416 sekwencji o 18

20 numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz 36 do 551 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0085] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 36 do 530 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 533 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 534 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 535 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 536 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 537 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 36 do 538 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; oraz 36 do 539 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0086] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35, ich fragmenty, warianty lub pochodne obejmują polipeptydy zawierające domenę Ig Sp35. Na przykład: polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów: 417 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 495 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 496 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 497 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 498 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 499 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 500 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 492 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 491 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 412 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 413 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 414 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 415 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 416 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 411 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 410 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 410 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 411 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 412 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 413 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 414 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 415 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 416 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 417 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz 418 do 494 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. [0087] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z peptydów domeny Ig Sp35 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. W szczególności, polipeptydów zawierających, składających się zasadniczo lub składających się z następujących sekwencji polipeptydowych: ITX 1 X 2 X 3 (numer identyfikacyjny sekwencji: 6), ACX 1 X 2 X 3 (numer identyfikacyjny sekwencji: 7), VCX 1 X 2 X 3 (numer identyfikacyjny sekwencji: 8) oraz SPX 1 X 2 X 3 (numer identyfikacyjny sekwencji: 9), gdzie X 1 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę, X 2 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę a X 3 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę. Na przykład, peptydy antagonistyczne do domeny Ig Sp35 zawierają, składają się zasadniczo lub składają się z następujących sekwencji polipeptydowych: SPRKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 10), SPRKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: 11), SPRKR (Numer identyfikacyjny sekwencji: 12), SPKKH (Numer iden- 19

21 tyfikacyjny sekwencji: 13), SPHKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 14), SPRRH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 15), SPRHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 16), SPRRR (Numer identyfikacyjny sekwencji: 17), SPHHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 18) SPKKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: 19), LSPRKH (Numer identyfikacyjny sekwencji:61), LSPRKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), LSPRKR (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), LSPKKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), LSPHKH (Numer identyfikacyjny sekwencji:_), LSPRRH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), LSPRHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), LSPRRR (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), LSPHHH Numer identyfikacyjny sekwencji: _) LSPKKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPRKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPRKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPRKR (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPKKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPHKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPRRH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPRHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPRRR (Numer identyfikacyjny sekwencji: _), WLSPHHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: _) WLSPKKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: _). Te rozpuszczalne polipeptydy Sp35 zawierają pętlę zasadową RKH (aminokwasy : arginina, lizyna, histydyna) w domenie Ig Sp35. Ten zasadowy tripeptyd jest uznawany za istotny dla wiązania rozpuszczalnego polipeptydu antagonisty Sp35 z natywnym polipeptydem Sp35. Do innych rozpuszczalnych peptydów Sp35, które zawierają tripeptyd zasadowy należą peptydy: ITPKRR (Numer identyfikacyjny sekwencji: 20), ACHHK (Numer identyfikacyjny sekwencji: 21) oraz VCHHK (Numer identyfikacyjny sekwencji: 22). [0088] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z peptydów domeny Ig Sp35 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. W szczególności, peptyd zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z następujących sekwencji polipeptydowych: X 4 X 5 RKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 23), X 4 X 5 RRR (Numer identyfikacyjny sekwencji: 24), X 4 X 5 KKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: 25), X 4 X 5 HHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 26), X 4 X 5 RKK (Numer identyfikacyjny sekwencji: 27), X 4 X 5 RKR (Numer identyfikacyjny sekwencji: 28), X 4 X 5 KKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 29), X 4 X 5 HKH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 30), X 4 X 5 RRH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 31) oraz X 4 X 5 RHH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 32), gdzie X 4 stanowi dowolny aminokwas i X 5 stanowi dowolny aminokwas. [0089] W innych przykładach, rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z peptydów domeny Ig Sp35 lub fragmentów, wariantów bądź pochodnych takich polipeptydów. W szczególności, polipeptydów zawierających, składających się zasadniczo lub składających się z następujących sekwencji polipeptydowych: ITX 6 X 7 X 8 (numer identyfikacyjny sekwencji: 68), ACX 6 X 7 X 8 (numer identyfikacyjny sekwencji: 69), VCX 6 X 7 X 8 (numer identyfikacyjny sekwencji: 70) oraz SPX 6 X 7 X 8 (numer identyfikacyjny sekwencji: 71), gdzie X 6 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę, X 7 oznacza dowolny aminokwas, a X 8 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę. Na przykład, peptydy antagonistyczne do domeny Ig Sp35 zawierają, składają się zasadniczo lub składają się z następującej sekwencji polipeptydowej: SPRLH (Numer identyfikacyjny sekwencji: 72). 20

22 [0090] W innych przedstawianych w niniejszym ujawnieniu przypadków, rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z peptydów zawierających aminokwasy w domenie Ig Sp35 lub ich pochodne, gdzie aminokwas 452 stanowi tryptofan lub fenyloalaninę. [0091] Dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z peptydów domeny zasadowej Sp35. W szczególności, peptydy zawierające, składające się zasadniczo lub składające się z następujących sekwencji polipeptydowych: RRARIRDRK (numer identyfikacyjny sekwencji: 33), KKVKVKEKR (numer identyfikacyjny sekwencji: 34), RRLRLRDRK (numer identyfikacyjny sekwencji: 35), RRGRGRDRK (numer identyfikacyjny sekwencji: 36) oraz RRIRARDRK (numer identyfikacyjny sekwencji: 37). [0092] Różne przykładowe rozpuszczalne polipeptydy Sp35, a także materiały i metody uzyskiwania tych cząsteczek na potrzeby niniejszego ujawnienia zostały opisane poniżej i/lub można je znaleźć np. w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US2004/ [0093] Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia mogą być cykliczne. Cyklizacja rozpuszczalnych polipeptydów Sp35 zmniejsza swobodę konformacji peptydów liniowych i daje rezultat w postaci cząsteczek o bardziej ograniczonej strukturze. W obecnej dziedzinie techniki znanych jest wiele metod cyklizacji peptydów. Na przykład cyklizacja metodą "od łańcucha głównego do łańcucha głównego" poprzez utworzenie wiązania amidowego pomiędzy resztami aminokwasowymi N-końca i C-końca peptydu. Cyklizacja metodą "od łańcucha głównego do łańcucha głównego" obejmuje tworzenie mostków dwusiarczkowych pomiędzy dwoma resztami aminokwasów ω-tio (np. cysteiny, homocysteiny). Niektóre rozpuszczalne peptydy Sp35 według niniejszego ujawnienia obejmują modyfikacje N-końca i C-końca peptydu tworzące cykliczny polipeptyd Sp35. Modyfikacje takie obejmują między innymi reszty cysteinowe, reszty cysteiny acetylowanej, reszty cysteinowe z ugrupowaniem NH 2 oraz biotynę. Inne metody cyklizacji peptydów zostały opisane w Li i Roller. Curr. Top. Med. Chem. 3: (2002). [0094] Cykliczne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi C 1 LSPX 9 X 10 X 11 C 2 (numer identyfikacyjny sekwencji:_), gdzie X 1 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę, X 2 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę, X 3 oznacza lizynę, argininę, histydynę, glutaminę lub asparaginę, C 1 posiada opcjonalnie przyłączone ugrupowanie stymulujące cyklizację (np. grupę acetylową lub biotynę) i C 2 posiada opcjonalnie przyłączone ugrupowanie stymulujące cyklizację (np. ugrupowanie NH 2 ). [0095] Opisane w niniejszym dokumencie rozpuszczalne polipeptydy Sp35 mogą zawierać różne zmiany, takie jak substytucje, insercje lub delecje. Do przykładów substytucji zalicza się między innymi następujące substytucje: walina w pozycji 6 polipeptydu Sp35 o numerze identyfikacyjnym sekwencji 2 na metioninę; seryna w pozycji 294 polipeptydu Sp35 o numerze identyfikacyjnym sekwencji 2 na glicynę; waliny 348 polipeptydu Sp35 o numerze identyfikacyjnym sekwencji 2 na alaninę; arginina w pozycji 419 polipeptydu Sp35 21

23 na histydynę; arginina w pozycji 456 na kwas glutaminowy oraz histydyna w pozycji 458 o numerze identyfikacyjnym sekwencji 2 na walinę. [0096] Odpowiednie fragmenty rozpuszczalnych polipeptydów Sp35 co najmniej w 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95% identyczne z polipeptydami o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 2, opisanymi w niniejszym dokumencie, są również brane pod uwagę. [0097] Jak wiadomo w tej dziedzinie "identyczność sekwencji" dwóch polipeptydów określa się przez porównanie sekwencji aminokwasów jednego polipeptydu z sekwencją w drugim polipeptydzie. Omawiane w niniejszym dokumencie podobieństwo danego polipeptydu na poziomie co najmniej około 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95% do innego polipeptydu można określić za pomocą znanych w dziedzinie metod i programów takich jak między innymi program BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 8 dla systemu Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT wykorzystuje algorytm lokalnej homologii Smitha i Watermana, Advances in Applied Mathematics 2: (1981), aby odnaleźć najlepszy segment homologii pomiędzy dwiema sekwencjami. Stosując BESTFIT lub inny program służący do dopasowywania sekwencji, w celu określenia, czy dana sekwencja jest, na przykład, w 95% identyczna z sekwencją odniesienia według niniejszego ujawnienia, ustala się oczywiście takie parametry, aby procent identyczności był obliczany dla całkowitej długości sekwencji polipeptydu odniesienia oraz aby dopuszczalne były przerwy w homologii na poziomie do 5% całkowitej ilości aminokwasów w sekwencji odniesienia. [0098] Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia mogą zawierać dowolną kombinację dwóch lub więcej rozpuszczalnych polipeptydów Sp35. Przeciwciała lub ich immunospecyficzne fragmenty [0099] Antagonisty Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują również przeciwciała specyficzne przeciw Sp35 lub fragmenty, warianty bądź pochodne wiążące antygen, które mają działania antagonistyczne wobec Sp35. Na przykład, wiązanie pewnych przeciwciał Sp35 z Sp35, wyrażone na oligodendrocytach, blokuje hamowanie wzrostu lub różnicowania się oligodendrocytów lub blokuje demielinizacją lub dysmielininację neuronów OUN. [0100] Niektóre antagonistyczne przeciwciała przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego opisu wiążą się specyficznie lub korzystnie z określonym fragmentem lub domeną polipeptydu Sp35. Takie fragmenty polipeptydu Sp35 obejmują między innymi polipeptyd Sp35 zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów 34 do 532; 34 do 417, 34 do 425, 34 do 493, 66 do 532, 66 do 417 (domena LRR), 66 do 426, 66 do 493, 66 do 532, 417 do 532, 417 do 425 (region zasadowy Sp35), 417 do 424 (region zasadowy Sp35), 417 do 493, 417 do 532, 419 do 493 (region Ig Sp35) lub 425 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub wariantu polipeptydu Sp35 co najmniej w 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95% podobnym do aminokwasów 34 do 532; 34 do 417, 34 do 425, 34 do 493, 66 do 532, 66 do 417, 66 do 426, 66 do 493, 66 do 532, 417 do 532, 417 do 425 (region zasadowy Sp35), 417 do 493, 417 do 532, 419 do 493 (region Ig Sp35) lub 425 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. 22

24 [0101] Dodatkowe fragmenty peptydu Sp35, z którymi wiążą się pewne przeciwciała specyficzne dla Sp35 lub ich fragmenty, warianty lub pochodne wiążące antygen według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi fragmenty zawierające, składające się zasadniczo lub składające się z jednego lub więcej powtórzeń bogatych w leucynę (LRR) w Sp35. Takie fragmenty, obejmują, na przykład, fragmenty zawierające, składające się zasadniczo lub składające się z aminokwasów 66 do 89, 66 do 113, 66 do 137, 90 do 113, 114 do 137, 138 do 161, 162 do 185, 186 do 209, 210 do 233, 234 do 257, 258 do 281, 282 do 305, 306 do 329 lub 330 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. Odpowiednie fragmenty wariantu polipeptydu Sp35 co najmniej w 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95% identyczne z aminokwasami z 66 do 89, 66 do 113, 90 do 113, 114 do 137, 138 do 161, 162 do 185, 186 do 209, 210 do 233, 234 do 257, 258 do 281, 282 do 305, 306 do 329 lub 330 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, są również brane pod rozwagę. [0102] Dodatkowe fragmenty peptydu Sp35, z którymi wiążą się pewne przeciwciała lub ich wiążące antygen fragmenty, warianty lub pochodne według niniejszego ujawnienia obejmują między innymi fragmenty zawierające, składające się zasadniczo lub składające się z jednego lub więcej bogatych w cysteinę powtórzeń flankujących region LRR w Sp35. Takie fragmenty, obejmują, na przykład, fragment zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów 34 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (Nkońcowy region flankujący LRR (LRRNT)) lub fragment zawierający, składający się zasadniczo lub składający się z aminokwasów 363 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (C-końcowy region flankujący LRR (LRRCT)). Odpowiednie fragmenty wariantu polipeptydu Sp35 co najmniej w 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95% identycznego z aminokwasami 34 do 64 i 363 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, są również brane pod rozwagę. [0103] W innych przypadkach, niniejsze ujawnienie obejmuje przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodną, które specyficznie lub korzystnie wiążą się z co najmniej jednym epitopem Sp35, który to epitop zawiera, składa się zasadniczo lub składa się z co najmniej czterech do pięciu aminokwasów sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, co najmniej siedmiu, co najmniej dziewięciu lub pomiędzy co najmniej około 15 do około 30 aminokwasów z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. Opisane aminokwasy danego epitopu z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, mogą lecz nie muszą być przyległe lub liniowe. W niektórych przypadkach, co najmniej jeden epitop Sp35 zawiera, zasadniczo składa się lub składa się z nieliniowego epitopu utworzonego przez domenę zewnątrzkomórkową Sp35 w postaci wyrażonej na powierzchni komórki lub jako rozpuszczalny fragment np. w fuzji z regionem Fc IgG. Tak więc, w niektórych przypadkach, ten co najmniej jeden epitop Sp35 zawiera, zasadniczo składa się lub składa się z co najmniej 4, co najmniej 5, co najmniej 6, co najmniej 7, co najmniej 8, co najmniej 9, co najmniej 10, co najmniej 15, co najmniej 20, co najmniej 25, od około 15 do około 30, lub co najmniej 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 lub 100 sąsiadujących lub niesąsiadujących aminokwasów z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, gdzie aminokwasy niesąsiadujące tworzą epitop w procesie zwijania białka. [0104] W innych przypadkach, niniejsze ujawnienie obejmuje przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodną, które specyficznie lub korzystnie wiążą się z co najmniej jednym epitopem Sp35, który to epitop zawiera, składa się zasadniczo lub składa się z co najmniej jednego, dwóch, trzech, czterech, pięciu, sześciu lub więcej sąsiadujących ze sobą lub niesąsiadujących aminokwasów z sekwencji o 23

25 numerze identyfikacyjnym: 2, jak opisano powyżej, oraz dodatkowego ugrupowania modyfikującego białko np. przyłączone ugrupowanie węglowodanowe może sprawiać, że przeciwciało Sp35 wiąże się z wyższym powinowactwem ze zmodyfikowanym białkiem docelowym niż z niemodyfikowaną wersją tego białka. Alternatywnie, przeciwciało Sp35 nie wiąże się w ogóle z niezmodyfikowaną wersję białka docelowego. [0105] W niektórych przypadkach, przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodna według ujawnienia, która wiąże się specyficznie z co najmniej jednym epitopem Sp35 lub wyżej opisanym fragmentem lub wariantem tj. wiąże się z tym epitopem łatwiej niż z epitopem nieskojarzonym lub losowym; wiąże się chętniej z co najmniej jednym epitopem Sp35 lub wyżej opisanym fragmentem lub wariantem tj. wiąże się z takim epitopem łatwiej niż z epitopem skojarzonym, podobnym, homologicznym lub analogicznym; kompetytywnie hamuje wiązanie przeciwciała referencyjnego, które samo wiąże się specyficznie lub korzystnie z określonym epitopem Sp35 lub opisanym wyżej fragmentem lub wariantem, lub wiąże się z co najmniej jednym epitopem Sp35 lub opisanym wyżej fragmentem lub wariantem z powinowactwem charakteryzującym się stałą dysocjacji K D niższą niż około 5 x 10-2 M, około 10-2 M, około 5 x 10-3 M, około 10-3 M, około 5 x 10-4 M, około 10-4 M, około 5 x 10-5 M, około 10-5 M, około 5 x 10-6 M, około 10-6 M, około 5 x 10-7 M, około 10-7 M, około 5 x 10-8 M, około 10-8 M, około 5 x 10-9 M, około 10-9 M, około 5 x M, około M, około 5 x M, około M, około 5 x M, około M, około 5 x M, około M, około 5 x M, około M, około 5 x M lub około M. W szczególnym aspekcie, przeciwciało lub jego fragment preferencyjnie wiąże się z polipeptydem Sp35 ludzkiego pochodzenia lub jego fragmentem w stosunku do polipeptydu Sp35 pochodzenia mysiego lub jego fragmentu. [0106] W kontekście stałych dysocjacji wiązania przeciwciała, określenie "około" pozwala utrzymać pewien stopień zróżnicowania, stanowiący nieodłączny element metod wykorzystywanych do pomiaru powinowactwa przeciwciał. Na przykład, w zależności od poziomu precyzji użytego urządzenia, standardowy błąd określany w oparciu o liczbę mierzonych próbek i błąd zaokrąglenia, określenie "około 10-2 M" może obejmować np. od około 0,05 M do 0,005 M. [0107] W szczególnych przypadkach, przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodna według niniejszego ujawnienia wiąże polipeptydy Sp35 lub ich fragmenty bądź warianty ze stałą dysocjacji (k(off)) mniejszej lub równej 5 X 10-2 s -1, 10-2 s -1, 5 X 10-3 s -1 lub 10-3 s -1. Alternatywnie, przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodna według niniejszego ujawnienia wiąże polipeptydy Sp35 lub ich fragmenty bądź warianty ze stałą dysocjacji (k(off)) mniejszej lub równej 5 X 10-4 s -1, 10-4 s -1, 5 X 10-5 s -1 lub 10-5 s -1, 5 X 10-6 s -1, 10-6 s -1, 5 X 10-7 s -1 lub 10-7 s -1. [0108] W innych przypadkach, przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodna według niniejszego ujawnienia wiąże polipeptydy Sp35 lub ich fragmenty bądź warianty przy stałej asocjacji (k(on) większej lub równej 10 3 M -1 s -1, 5 X 10 3 M -1 s -1, 10 4 M -1 s -1 lub 5 X 10 4 M -1 s -1. Alternatywnie, przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, wariant lub pochodna według niniejszego ujawnienia wiąże polipeptydy Sp35 lub ich fragmenty bądź warianty przy stałej asocjacji (k(on) większej lub równej 10 5 M -1 s -1, 5 X 10 5 M -1 s -1, 10 6 M -1 s -1 lub 5 X 10 6 M -1 s -1 lub 10 7 M -1 s

26 [0109] W jednym przypadku, antagonista Sp35 przewidziany do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia stanowi cząsteczkę przeciwciała lub jego immunospecyficzny fragment. O ile wyraźnie nie wskazano inaczej, stosowane w niniejszym dokumencie w odniesieniu do przeciwciała określenie "jego fragment" oznacza fragment immunospecyficzny tj. fragment swoisty dla antygenu. W jednym przypadku, ujawnione przeciwciało jest cząsteczkę wiążącą, polipeptydem wiążącym lub przeciwciałem o podwójnym działaniu np. przeciwciałem o podwójnym działaniu, miniciałem (minibody), przeciwciałem z usuniętą domeną lub białkiem fuzyjnym specyficznie wiążącym więcej niż jeden epitop np. więcej niż jeden antygen lub więcej niż jeden epitop w tym samym antygenie. W jednym przypadku, przeciwciało o podwójnym działaniu ma co najmniej jedną domenę wiążącą swoistą dla co najmniej jednego epitopu w Sp35. Przeciwciało o podwójnym działaniu może być przeciwciałem czterowartościowym posiadającym dwie docelowe domeny wiążące swoiste dla epitopu Sp35 oraz dwie docelowe domeny wiążące swoiste dla drugiego obiektu docelowego. Tak więc, czterowartościowe przeciwciało o podwójnym działaniu może być dwuwartościowe dla każdej specyficzności. [0110] W niektórych przypadkach, w niniejszym ujawnieniu założono podanie antagonisty przeciwciała Sp35 lub jego immunospecyficznego fragmentu, w którym co najmniej część jednego lub kilku domen stałego regionu została usunięta lub w inny sposób zmieniona tak, aby zapewnić żądane właściwości biochemiczne, takie jak osłabienie funkcji efektorowych, zdolności do niekowalencyjnej dimeryzacji, zwiększenie zdolności do koncentracji w miejscu nowotworu, skrócenie okresu półtrwania w surowicy lub wydłużenie okresu półtrwania w surowicy, w porównaniu z całym, niezmienionym przeciwciałem charakteryzującym się zbliżoną immunogennością. Na przykład, niektóre przeciwciała przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego opisu stanowią przeciwciała z usuniętą domeną zawierające łańcuch polipeptydowy podobny do łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, który jednak jest pozbawiony co najmniej części jednej lub wielu domen łańcucha ciężkiego. Na przykład, w niektórych przeciwciałach, usunięta będzie jedna cała domena regionu stałego zmodyfikowanego przeciwciała, na przykład, usunięta zostania całość lub część domeny C H 2. [0111] W niektórych przeciwciałach lub fragmentach immunospecyficznych antagonistów Sp35 do użycia w opisywanych tu metodach leczenia, fragment Fc może zostać zmutowany w celu osłabienia funkcji efektorowej przy zastosowaniu technik znanych w niniejszej dziedzinie. Na przykład, usunięcie lub inaktywacja (za pomocą mutacji punktowych lub innych metod) domeny regionu stałego może osłabić wiązanie receptora Fc w krążącym przeciwciele zmodyfikowanym, tym samym zwiększając koncentrację w miejscu występowania nowotworu. W innych przypadkach, modyfikacje regionu stałego zgodne z niniejszym opisem osłabiają wiązanie dopełniacza, tym samym skracając okres półtrwania w surowicy oraz zmniejszając nieswoistą asocjację sprzężonej cytotoksyny. Jeszcze inne modyfikacje regionu stałego mogą być stosowane w celu modyfikacji wiązań dwusiarczkowych lub ugrupowań oligosacharydów, które przyczyniają się do miejscowego zwiększenia koncentracji leku poprzez podniesienie specyficzności antygenowej lub elastyczności przeciwciała. Uzyskany profil fizjologiczny, biodostępność oraz inne efekty biochemiczne modyfikacji, takie jak lokalizacja do nowotworów, biodystrybucja oraz okres półtrwania w surowicy, można łatwo zmierzyć ilościowo przy zastosowaniu dobrze znanych technik immunologicznych, bez zbędnego eksperymentowania. 25

27 [0112] Zmodyfikowane formy przeciwciał lub ich immunospecyficznych fragmentów stosowanych w metodach diagnostycznych i terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą być utworzone z wykorzystaniem całych prekursorów lub przeciwciał macierzystych za pomocą technik znanych w tej dziedzinie techniki. Przykładowe metody zostały omówione bardziej szczegółowo w niniejszym dokumencie. [0113] W niektórych przypadkach zarówno zmienne jak i stałe regiony antagonistycznych przeciwciał Sp35 lub ich immunospecyficznych fragmentów przewidzianych do wykorzystania w ujawnionych tu metodach leczenia są w całości pochodzenia ludzkiego. W pełni ludzkie przeciwciała mogą być wytworzone przy użyciu technik znanych w tej dziedzinie nauki i opisanych w niniejszym dokumencie. Na przykład, w pełni ludzkie przeciwciała przeciw określonemu antygenowi mogą zostać wytworzone przez podanie antygenu zwierzęciu transgenicznemu, które zostało zmodyfikowane w celu wytwarzania takich przeciwciał w odpowiedzi na antygenową prowokację, ale których endogenne loci zostały unieczynnione. Przykładowe techniki stosowane do wytwarzania takich przeciwciał zostały opisane w amerykańskich opisach patentowych: ; ; Inne techniki znane są w dziedzinie. W pełni ludzkie przeciwciała mogą być również wytwarzane za pomocą różnych technik ekspresji, np. systemów ekspresji fagowej lub wirusowej, opisanych bardziej szczegółowo w innym miejscu niniejszego dokumentu. [0114] Przeciwciała antagonistyczne do Sp35 lub ich immunospecyficzne fragmenty stosowane w metodach diagnostycznych i terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą być wytwarzane za pomocą technik znanych w tej dziedzinie techniki. W niektórych przypadkach, cząsteczki przeciwciał lub ich fragmenty są "wytwarzane rekombinacyjnie" tj. są wytwarzane przy użyciu technologii rekombinowanego DNA. Przykładowe techniki wytwarzania cząsteczek przeciwciał lub ich fragmentów zostały omawiane bardziej szczegółowo w innym miejscu niniejszego dokumentu. [0115] Przeciwciała antagonistyczne do Sp35 lub ich immunospecyficzne fragmenty do stosowania w metodach terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie obejmują pochodne zmodyfikowane np. przez kowalencyjne przyłączenie dowolnego rodzaju cząsteczki do przeciwciała w taki sposób, żeby kowalencyjnie przyłączone cząsteczki nie blokowały specyficznego wiązania przeciwciała z jego pokrewnym epitopem. Dla przykładu, ale nie dla ograniczenia, pochodne przeciwciał obejmują przeciwciała, które zostały zmodyfikowane np. poprzez glikozylację, acetylację, pegylację, fosforylację, amidowanie, derywatyzację za pomocą znanych grup zabezpieczających/blokujących, rozkład proteolityczny, łączenie z ligandem komórkowym lub innym białkiem itp. Każdą z licznych modyfikacji chemicznych można przeprowadzić znanymi technikami, w tym między innymi w drodze określonego rozkładu chemicznego, acetylacji, formylowania, metabolicznej syntezy tunikamycyny itp. Dodatkowo, pochodna może zawierać jeden lub więcej z nieklasycznych aminokwasów. [0116] W preferowanych przypadkach przeciwciało antagonistyczne do Sp35 lub jego immunospecyficzny fragment, przewidziane do stosowania w ujawnionych tu metodach leczenia, nie wywołują szkodliwej reakcji immunologicznej u zwierząt, które mają być leczone, np. u człowieka. W jednym przypadku, przeciwciała antagonistyczne do Sp35 lub ich immunospecyficzne fragmenty przewidziane do stosowania w metodach leczenia ujawnionych w niniejszym dokumencie są modyfikowane w celu zmniejszenia ich immunogenności przy użyciu znanych w tej dziedzinie technik. Na przykład, przeciwciała mogą być humanizowane, prymaty- 26

28 zowane, deimmunizowane lub mogą być wytwarzane przeciwciała chimeryczne. Te rodzaje przeciwciał pochodzą od przeciwciał innych niż ludzkie, zazwyczaj od przeciwciał myszy lub naczelnych, które zachowują lub zasadniczo zachowują właściwości wiązania antygenu przeciwciała macierzystego, ale charakteryzują się mniejszą immunogennością u ludzi. Można to osiągnąć na różne sposoby, w tym (a) przez przeszczepienie całych domen zmiennych pochodzenia innego niż ludzkie w regiony stałe ludzkie w celu utworzenia przeciwciał chimerycznych; (b) przeszczepienie co najmniej części jednego lub więcej regionów determinujących dopasowanie (CDR) pochodzenia innego niż ludzkie w regiony zrębowe i stałe z zatrzymaniem lub bez reszt zrębowych lub (c) transplantację całych domen zmiennych pochodzenia innego niż ludzkie i "okrycie" ich odcinkiem podobnym do ludzkiego przez zastąpienie reszt na powierzchni. Takie sposoby zostały ujawnione w Morrison i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. 57: (1984); Morrison i wps., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239: (1988); Padlan, Molec. Immun. 28: (1991); Padlan, Molec. Immun. 31: (1994) oraz w amerykańskich opisach patentowych nr , , i [0117] W celu zmniejszenia immunogenności przeciwciała można stosować również deimmunizację. W niniejszym opisie, termin "deimmunizacja" obejmuje zmianę przeciwciała obejmującą modyfikację epitopów komórek T (zob. np. WO A1, WO A2). Na przykład, analizowane są sekwencje V H i V L przeciwciała startowego oraz "mapa" epitopów ludzkich komórek T każdego z regionów V wskazująca położenie epitopów w odniesieniu do regionów determinujących dopasowanie (CDR) oraz innych kluczowych reszt w sekwencji. Poszczególne epitopy komórek T z mapy epitopów komórek T są analizowane w celu identyfikacji podstawień alternatywnych aminokwasów, niosących niskie ryzyko zmiany aktywności końcowego przeciwciała. Zaprojektowany jest szereg alternatywnych sekwencji V H i V L zawierający kombinacje substytucji aminokwasów, a sekwencje te są następnie wprowadzone do szeregu polipeptydów wiążących np. przeciwciała antagonistyczne do Sp35 lub ich immunospecyficzne fragmenty, przewidziane do wykorzystania w ujawnionych tu metodach leczenia, które następnie są testowane pod kątem swych funkcji. Zazwyczaj, wytwarzanych i testowanych jest od 12 do 24 wariantów przeciwciał. Kompletne geny lekkiego i ciężkiego łańcucha, zawierające zmodyfikowaną regiony V i C pochodzenia ludzkiego, są następnie klonowane do wektorów ekspresyjnych, a powstałe plazmidy są wprowadzane do linii komórkowych w celu wytworzenia całego przeciwciała. Przeciwciała są następnie porównywane w odpowiednich testach biochemicznych i biologicznych i określany jest optymalny wariant. [0118] Przeciwciała antagonistyczne do Sp35 lub ich fragmenty przewidziane do stosowania w metodach ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą być wytwarzane dowolną metodą znaną w tej dziedzinie. Przeciwciała poliklonalne mogą być wytwarzane różnymi sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie techniki. Na przykład, immunospecyficzny fragment Sp35 można podawać różnym zwierzęcym gospodarzom, w tym między innymi królikom, myszom, szczurom itp., w celu wywołania wytwarzania surowicy zawierającej przeciwciała poliklonalne swoiste dla antygenu. W celu zwiększenia reakcji immunologicznej, stosowane mogą być różne adiuwanty, w zależności od gatunku gospodarza, w tym. między innymi, adiuwant Freunda (kompletny i niekompletny), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjaniny, dinitrofenol i poten- 27

29 cjalnie użyteczne ludzkie adiuwanty takie jak BCG (bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Takie substancje pomocnicze są również znane w technice. [0119] Przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowywane przy użyciu różnorodnych technik znanych w sztuce, włącznie z użyciem technologii hybrydomy, rekombinantu i ekspresji fagowej lub ich kombinacji. Na przykład, przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane z zastosowaniem technik hybrydomy, w tym znanych w tej dziedzinie techniki i rozpowszechnianych np. w Harlow i wsp., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Wyd. II, (1988); Hammerling i wsp. w: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas Elsevier, N.Y., (1981). Termin "przeciwciało monoklonalne" w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie nie ogranicza się do przeciwciał wytwarzanych przy zastosowaniu technologii hybrydomy. Termin "przeciwciało monoklonalne" odnosi się do przeciwciała, które uzyskuje się z pojedynczego klonu, w tym klonu eukarioty, prokarioty lub faga, a nie metody, którą jest produkowane. Stąd termin "przeciwciało monoklonalne" nie ogranicza się do przeciwciał wytwarzanych przy zastosowaniu technologii hybrydomy. Przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowywane przy użyciu różnorodnych technik znanych w sztuce, włącznie z użyciem technologii hybrydomy, rekombinantu i ekspresji fagowej. [0120] Przy zastosowaniu uznanych protokołów, w jednym z przykładów, poziom przeciwciał u ssaków jest wzbudzany przez zastosowanie wielokrotnych podskórnych lub dootrzewnowych iniekcji odpowiedniego antygenu (np. oczyszczonych antygenów Sp35 lub komórek, czy ekstraktów komórkowych, zawierających takie antygeny) i adiuwanta. Takie zaszczepienie wywołuje zazwyczaj reakcję immunologiczną, w ramach której aktywowane splenocyty lub limfocyty wytwarzają przeciwciała wchodzące w reakcje z antygenem. Podczas, gdy uzyskane przeciwciała można zebrać z surowicy zwierząt w celu przygotowania preparatów poliklonalnych, często wskazane jest wyizolowania pojedynczych limfocytów ze śledziony, węzłów chłonnych lub krwi obwodowej, w celu zapewnienia jednolitych preparatów przeciwciał monoklonalnych (MAb). Korzystnie, limfocyty pozyskiwane są ze śledziony. [0121] W tym dobrze znanym procesie (Kohler i wsp., Nature 256:495 (1975)), stosunkowo krótko żyjące lub śmiertelne limfocyty pochodzące od ssaka, któremu wstrzyknięto antygen są sprzęgane z linią nieśmiertelnych komórek nowotworowych (np. linią komórek szpiczaka), produkując w ten sposób hybrydy komórkowe lub "hybrydomy", które są zarówno nieśmiertelne, jak i zdolne do wytwarzania genetycznie kodowanych przeciwciał komórek B. Powstałe hybrydy są rozdzielane na pojedyncze szczepy genetyczne w drodze selekcji, rozcieńczania i ponownego hodowania, a każdy indywidualny szczep będzie zawierał specyficzne geny do wytworzenia pojedynczego przeciwciała. Wytwarzają one przeciwciała, które są jednolite wobec pożądanego antygenu i w nawiązaniu do ich czystego pochodzenia genetycznego są określane jako "monoklonalne". [0122] Tak przygotowane komórki hybrydom wysiewa się i hoduje na odpowiednim podłożu hodowlanym, które w korzystnym wykonaniu powinno zawierać jedną lub więcej substancji, które hamują wzrost lub przeżywalność niesprzężonych komórek rodzicielskich szpiczaka. Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że linie komórkowe, odczynniki i nośniki potrzebne do wytworzenia, selekcji i rozwoju hybrydom są dostępne na rynku z wielu źródeł oraz że ustalone zostały standardowe protokoły. Zazwyczaj, pożywkę, w której hodowane są komórki hybrydom testowane są pod kątem wytwarzania przeciwciał mono- 28

30 klonalnych przeciw danemu antygenowi. Korzystnie, specyficzność wiązania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki hybrydom jest określana w testach in vitro, takich jak immunoprecypitacja, test radioimmunologiczny (RIA) lub enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA). Po zidentyfikowaniu komórek hybrydom, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony można subklonować drogą procedur ograniczonych rozcieńczeń i hodować standardowymi metodami (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, s (1986)). Należy ponadto zauważyć, że przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony można oddzielić od podłoża hodowlanego, płynu wysiękowego lub surowicy zgodnie konwencjonalnymi procedurami oczyszczania, takimi jak np. chromatografii z użyciem białka A, hydroksyapatytu, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa. [0123] Fragmenty przeciwciał, które rozpoznają konkretne epitopy mogą być wytwarzane znanymi sposobami. Na przykład, fragmenty Fab i F(ab')2 można wytwarzać przez cięcie proteolityczne cząsteczek immunoglobulin, przy użyciu enzymów takich jak papaina (stosowana do wytwarzania fragmentów Fab) i pepsyna (stosowana do wytwarzania fragmentów F(ab')2). Fragmenty F(ab')2 zawierają region zmienny, region stały łańcucha lekkiego oraz domeny C H 1 łańcucha ciężkiego. [0124] Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że DNA kodujące przeciwciała lub fragmenty przeciwciał (np. miejsca wiązania antygenu) mogą pochodzić także z fagowych bibliotek przeciwciał. W szczególności, fagi takie mogą być wykorzystywane do ekspresji domen wiążących antygen ze zbiorów lub kombinatorycznej biblioteki przeciwciał (np. ludzkich lub mysich). Fag wyrażający domenę wiążącą antygen, która wiąże żądany antygen może być wybrany lub zidentyfikowany za pomocą antygenu np. przy użyciu znakowanego antygenu lub antygenu związanego lub unieruchomionego na stałej powierzchni lub kulce. Fagi stosowane w tych metodach są zwykle fagami nitkowatymi, w tym uzyskane z faga domeny wiążące fd i M13 z domenami przeciwciał Fab, Fv lub stabilizowanymi za pomocą mostków dwusiarczkowych domenami przeciwciał Fv rekombinacyjnie połączonymi z białkiem genu III lub genu VIII faga. Przykładowe metody zostały przedstawione, na przykład, w EP B1; amerykańskim opisie patentowym , Hoogenboom, H.R. i Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy i wsp., Nat. Med. 8:801 (2002); Huie i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:2682 (2001); Lui i wsp., J. Mo1. Biol 315:1063 (2002). Kilka publikacji (np. Marks i wsp., Bio/Technology 10: (1992)) opisuje wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie metodą tasowania łańcuchów jak również zakażenia kombinatorycznego i rekombinacji in vivo jako strategię konstruowania dużych bibliotek fagowych. W innym przypadku, można zastosować metodę wystawki rybozomowej w celu wymiany bakteriofagu jako platformy wystawki (zob. np. Hanes i wsp., Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750 (2001); lub Irving i wsp., J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). W jeszcze innym przypadku, można przeszukiwać powierzchnie komórek w celu odnalezienia przeciwciał (Boder i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherty i wsp., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Procedury takie stanowią alternatywę dla tradycyjnych technik tworzenia hybrydom w celu wyizolowania i następnie klonowania przeciwciał monoklonalnych. [125] W metodach ekspresji fagowej, domeny przeciwciał funkcjonalnych są eksponowane na powierzchni cząstek fagów, które zawierają kodujące je sekwencje polinukleotydowe. W szczególności, sekwencje DNA 29

31 kodujące regiony V H i V L wzmacniane są ze zwierzęcych bibliotek cdna (np. ludzkich lub mysich bibliotek cdna tkanki limfoidalnej) lub syntetycznych bibliotek cdna. W niektórych przypadkach, DNA kodujące regiony V H i V L łączone są za pomocą fragmentu wiążącego scfv w reakcji PCR i klonowane do wektora fagmid (np. pcantab 6 lub pcomb 3 HSS). Wektor jest elektroporowany do E. coli, a E. coli jest zakażane fagiem wspomagającym. Fagi stosowane w tych metodach są zwykle fagami nitkowatymi, w tym fagi fd i M13, a regiony V H i V L są zazwyczaj rekombinacyjnie połączone z genem III lub genem VIII faga. Fag wyrażający domenę wiążącą antygen, która wiąże żądany antygen (tj. polipeptyd Sp35 lub jego fragment) może być wybrany lub zidentyfikowany za pomocą antygenu np. przy użyciu znakowanego antygenu lub antygenu związanego lub unieruchomionego na stałej powierzchni lub kulce. [0126] Dodatkowe przykłady metod ekspresji fagów, których można użyć do wytwarzania przeciwciał obejmują metody ujawnione w Brinkman i wsp., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames i wsp., J. Immunol. Methods 184: (1995); Kettleborough i wsp. Eur. J. Immunol. 24: (1994); Persic i wsp., Gene 187:9-18 (1997); Burton i wsp., Advances in Immunology 57: (1994); Zgłoszenie PCT nr PCT/GB91/01134; publikacje PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; oraz amerykańskie patenty nr ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; oraz ; [0127] Jak opisano w wymienionych wyżej publikacjach, po wybraniu fagów, regiony kodujące przeciwciała mogą zostać wyizolowane z faga i użyte w celu wytworzenia całych przeciwciał, w tym przeciwciał ludzkich, lub innego pożądanego fragmentu wiążącego antygen, oraz wyrażone w dowolnym gospodarzu, w tym w komórkach ssaków, komórkach owadów, komórkach roślinnych, drożdżach i bakteriach. Na przykład, stosowane mogą być również techniki rekombinacji mające na celu wytwarzanie fragmentów Fab, Fab' i F(ab')2 znane w tej dziedzinie techniki, takie jak opisane w publikacji WO 92/22324; Mullinax i wsp., BioTechniques 12(6): (1992); i Sawai i wsp., AJRI 34:26-34 (1995); oraz Better i wsp., Science 240: (1988). [0128] Przykłady technik, które mogą być wykorzystywane do produkcji pojedynczych łańcuchów Fv oraz przeciwciał obejmują te opisane w amerykańskich opisach patentowych nr i ; Huston i wsp., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu i wsp., PNAS 90: (1993); oraz Skerra i wsp., Science 240: (1988). Dla niektórych zastosowań, w tym, dla stosowania przeciwciał in vivo u ludzi oraz w testach in vitro, korzystne może być stosowanie przeciwciał chimerycznych, humanizowanych lub ludzkich. Przeciwciało chimeryczne jest cząsteczką, w której różne części przeciwciała pochodzą od różnych gatunków zwierząt np. przeciwciała posiadające region zmienny pochodzący z mysiego przeciwciała monoklonalnego oraz region stały ludzkiej immunoglobuliny. Metody wytwarzania przeciwciał chimerycznych są znane w sztuce. Zob. np. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i wsp., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies i wsp., J. Immunol. Methods 125: (1989); opisy patentowe nr ; oraz Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami przeciwciał pochodzenia innego niż ludzkie, które wiąże się z żądanym antygenem, posiadające jeden lub więcej regionów determinujących dopasowanie (CDR) pochodzące od gatunków nieludzkich oraz regiony zrębowe z cząsteczek ludzkiej immunoglobuliny. Często, reszty 30

32 zrębowe w ludzkich regionach zrębowych zostają zastąpione odpowiednimi resztami przeciwciała dawcy CDR w celu zmiany, chętnie poprawy, wiązania antygenu. Te podstawienia zrębowe są identyfikowane metodami dobrze znanymi w sztuce np. przez modelowania oddziaływań CDR i reszt zrębowych, w celu określenia reszt ważnych pod względem wiązania antygenu oraz porównania sekwencji w celu identyfikacji nietypowych reszt zrębowych w poszczególnych pozycjach. (Zob. np. Queen i wsp., amerykański opis patentowy nr ; Riechmann i wsp., Nature 332:323 (1988). Przeciwciała mogą być humanizowane za pomocą różnych metod znanych w dziedzinie, w tym, na przykład, przeszczepów regionów CDR (EP , publikacja PCT WO 91/09967; amerykańskie opisy patentowe nr , i ), licowanie (veneering) lub zmiana powierzchni (resurfacing) (EP , EP , Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): (1991); Studnicka i wsp., Protein Engineering 7(6): (1994),. Roguska i wsp., PNAS 91: (1994)) i tasowanie łańcuchów (amerykański opis patentowy nr ). [0129] W pełni ludzkie przeciwciała są szczególnie pożądane w leczeniu pacjentów. Ludzkie przeciwciała mogą być wytwarzane różnymi metodami znanymi w sztuce, w tym opisanymi powyżej metodami ekspresji fagowej z wykorzystaniem bibliotek przeciwciał pochodzących z sekwencji immunoglobulin ludzkich. Zob. również amerykański opis patentowy i ; oraz publikacje PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 oraz WO 91/ [0130] Przeciwciała ludzkie można również wytwarzać za pomocą myszy transgenicznych, które są niezdolne do wyrażania endogennych immunoglobulin funkcjonalnych, ale mogą wyrażać geny ludzkich immunoglobulin. Na przykład, kompleksy ciężkiego i lekkiego łańcucha genów immunoglobulin ludzkich mogą być wprowadzone losowo lub w drodze rekombinacji homologicznej do mysich embrionalnych komórek macierzystych. Alternatywnie, ludzki region zmienny, region stały i region zróżnicowania może być wprowadzany do mysich embrionalnych komórek macierzystych oprócz ludzkich genów łańcuchów lekkiego i ciężkiego. Mysie geny ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobulin można uczynić niefunkcjonalnymi osobno lub równocześnie z wprowadzeniem loci immunoglobuliny ludzkiej metodą rekombinacji homologicznej. W szczególności, homozygotyczna delecja genu regionu JH zapobiega wytwarzaniu przeciwciał endogennych. Zmodyfikowane embrionalne komórki macierzyste są rozszerzane i wstrzykiwane metodą mikroiniekcji do blastocystów w celu produkcji myszy chimerycznych. Myszy chimeryczne są następnie rozmnażane w celu uzyskania homozygotycznego potomstwa, które wyraża ludzkie przeciwciała. Transgeniczne myszy są immunizowane w normalny sposób za pomocą wybranego antygenu np. całości lub części żądanego polipeptydu docelowego. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw antygenowi można uzyskać z immunizowanych myszy transgenicznych, stosując konwencjonalne techniki tworzenia hybrydom. Zaszczepione u myszy transgenicznych transgeny ludzkich immunoglobulin ulegają przegrupowaniu podczas różnicowania komórek B, a następnie przechodzą proces przełączania klas i mutacji somatycznej. Tak więc, dzięki tej technice, możliwe jest wytwarzanie użytecznych terapeutycznie przeciwciał IgG, IgA, IgM i IgE. Aby zrobić przegląd tej technologii wytwarzania ludzkich przeciwciał, zob. Lonberg i Huszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Szczegółowe omówienie tej technologii wytwarzania ludzkich przeciwciał i ludzkich przeciwciał monoklonalnych, a także protokoły wytwarzania takich przeciwciał zostały przedstawione np. w publikacjach PCT WO 98/24893, WO 96/34096, WO 96/33735, amerykańskich opisach patentowych nr ; ; ; ; ; ; oraz Ponadto, firmy takie jak Abgenix, 31

33 Inc (Freemont, CA) oraz GenPharm (San Jose, CA) mogą dostarczyć ludzkich przeciwciał skierowanych przeciwko wybranemu antygenowi z wykorzystaniem technologii podobnej do opisanej powyżej. [0131] W pełni ludzkie przeciwciała, które rozpoznają wybrany epitop mogą być wytwarzane przy zastosowaniu techniki zwanej "wyborem sterowanym". W tym podejściu wybrane przeciwciało monoklonalne pochodzenia innego niż ludzkie np. przeciwciało myszy, stosowane jest w celu nakierowania na wybór w pełni ludzkiego przeciwciała rozpoznającego ten sam epitop. (Jespers i wsp., Bio/Technology 12: (1988)). Zob. też amerykański opis patentowy [0132] W innym przypadku, DNA kodujące żądane przeciwciała monoklonalne może być łatwo wyizolowane i sekwencjonowane z zastosowaniem konwencjonalnych procedur (np. używając sond oligonukleotydowych, które specyficznie wiążą geny kodujące łańcuchy ciężki i lekki mysich przeciwciał). Preferowanym źródłem takiego DNA są wyodrębnione i subklonowane komórki hybrydom. Po wyizolowaniu, DNA można umieścić w wektorach ekspresyjnych, które następnie są transfekowane do prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które nie wytwarzają innych immunoglobulin. W szczególności, wyodrębnione DNA (które może być produkowane w ramach syntezy, jak opisano w niniejszym dokumencie) mogą być używane do klonowania sekwencji regionów stałych i zmiennych używanych do wytwarzania przeciwciała, jak opisali Newman i wsp., w amerykańskim zgłoszeniupatentowym nr , złożonym dnia 25 stycznia 1995 r. Zasadniczo oznacza to ekstrakcję RNA z wybranych komórek, konwersję na cdna oraz amplifikację metodą PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla Ig. Odpowiednie startery potrzebne dla tego celu zostały również opisane w amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr Jak omówiono bardziej szczegółowo poniżej, transformowane komórki wyrażające żądane przeciwciała mogą być hodowane w stosunkowo dużych ilościach, w celu zapewnienia klinicznych i handlowych dostaw immunoglobuliny. [0133] W szczególnym przypadku można sprawdzić sekwencję aminokwasów domen zmiennych ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha w celu określenia sekwencji regionów determinujących dopasowanie (CDR), metodami, które są dobrze znane sztuce np. przez porównanie ze znanymi sekwencjami aminokwasów innych regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha, aby zidentyfikować regiony hiperzmienności. Używając rutynowych technik rekombinacji DNA, co najmniej jeden region CDR można umieścić pomiędzy regionami zrębowymi np. ludzkimi regionami zrębowymi, w celu humanizacji przeciwciał pochodzenia nieludzkiego. Regiony zrębowe mogą być regionami występującymi naturalnie lub regionami zrębowymi najwyższej zgodności (Zob. np. Chothia i wsp., J. MoI. Biol. 278: (1998), aby uzyskać listę ludzkich regionów zrębowych). Korzystnie, polinukleotyd wytworzony przez połączenie regionów zrębowych i regionów CDR koduje przeciwciało, które swoiście wiąże się z przynajmniej jednym epitopem żądanego polipeptydu np. Sp35. Korzystnie, w regionach zrębowych można dokonać jednej lub więcej substytucji aminokwasów, i korzystnie, te substytucje polepszają wiązanie przeciwciała z jego antygenem. Ponadto, metody te można stosować na potrzeby substytucji lub delecji aminokwasów, usuwając jedną lub więcej reszt cysteinowych regionu zmiennego, uczestniczących w wewnątrzłańcuchowym wiązaniu dwusiarczkowym, w celu wytworzenia cząsteczek przeciwciał pozbawionych jednego lub więcej wewnątrzłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych. Inne zmiany w polinukleotydzie są objęte niniejszym ujawnienia i znane w tej dziedzinie techniki. 32

34 [0134] Ponadto, stosowane mogą być opracowane techniki wytwarzania "przeciwciał chimerycznych" (Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: (1984); Neuberger i wsp., Nature 312: (1984); Takeda i wsp., Nature 314: (1985)) przez łączenie genów pochodzących z cząsteczki mysiego przeciwciała o odpowiedniej specyficzności antygenowej z genami pochodzącymi z cząsteczki ludzkiego przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej. W niniejszym opisie, przeciwciało chimeryczne jest cząsteczką, w której różne części pochodzą od różnych gatunków zwierząt np. posiadającą region zmienny pochodzący z mysiego przeciwciała monoklonalnego oraz region stały ludzkiej immunoglobuliny np. przeciwciało humanizowane. [0135] Alternatywnie, opisane techniki wytwarzania pojedynczych łańcuchów przeciwciał (amerykański opis patentowy nr ; Bird, Science 242: (1988); Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 5: (1988) oraz Ward i wsp., Nature 334: (1989)) mogą być dostosowane do wytwarzania przeciwciał o pojedynczych łańcuchach. Przeciwciała jednołańcuchowe są tworzone przez połączenie fragmentów regionu Fv ciężkiego i lekkiego łańcucha za pośrednictwem mostku aminokwasowego, w wyniku czego powstaje przeciwciało jednołańcuchowe. Stosowane mogą być również techniki łączenia funkcjonalnych fragmentów Fv w E. coli (Skerra i wsp., Science 242: (1988)). [0136] Przeciwciała antagonistyczne do Sp35 mogą być przeciwciałami ludzkimi lub zasadniczo ludzkimi produkowanymi w zwierzętach transgenicznych (np. myszy), które są niezdolne do wytwarzania immunoglobulin endogennych (zob. np. amerykański opis patentowy nr , , i ). Na przykład, opisano, że wynikiem homozygotycznej delecji genu łańcucha ciężkiego regionu łączącego przeciwciała w chimerycznych, zmutowanych w linii płciowej myszach jest całkowite zahamowanie wytwarzania przeciwciał endogennych. Przeniesienie matrycy genów immunoglobulin ludzkich do takich zmutowanych w linii płciowej myszy spowoduje wytwarzanie przeciwciał ludzkich po prowokacji antygenem. Inny korzystny sposób wytwarzania przeciwciał ludzkich przy użyciu myszy SCID został ujawniony w opisie patentowym nr Należy zdawać sobie sprawę, że materiał genetyczny związany z tymi przeciwciałami ludzkimi może zostać wyizolowany i zmieniony jak opisano w niniejszym dokumencie. [0137] Jeszcze inny bardzo skuteczny sposób wytwarzania rekombinowanych przeciwciał został ujawniony przez Newmana, Biotechnology 10: (1992). Konkretnie, technika ta pozwala uzyskać prymatyzowane przeciwciała, zawierające małpie domeny zmienne i ludzkie sekwencje stałe. Ponadto, technika ta jest również opisana w często przywoływanych amerykańskich opisach patentowych o nr , oraz [0138] W innym przypadku, limfocyty można wybrać metodą mikromanipulacji i wyodrębnić geny zmienne. Na przykład, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą zostać wyizolowane z immunizowanego ssaka i hodowane przez około 7 dni w warunkach in vitro. Hodowle można poddać przesiewowi na specyficzne IgG, które spełniają kryteria przesiewu. Komórki z pozytywnych studzienek można wyodrębnić. Poszczególne komórki B wytwarzające Ig mogą zostać wyodrębnione metodą FACS lub przez zidentyfikowanie ich w teście hemolitycznym z udziałem dopełniacza. Komórki B wytwarzające Ig można mikrowmanipulować do probówki, a geny V H i V L można amplifikować stosując np. RT-PCR. Geny V H i V L można wklonować do wek- 33

35 tora ekspresji przeciwciał i transfekować do komórek (np. komórek eukariotycznych lub prokariotycznych) w celu ekspresji. [0139] Alternatywnie, linie komórkowe wytwarzające przeciwciała mogą zostać wyselekcjonowane i wyhodowane z zastosowaniem technik dobrze znanych specjalistom. Techniki te są opisane w wielu publikacjach i podstawowych instrukcjach laboratoryjnych. W tym zakresie, techniki odpowiednie do stosowania w ujawnionych w niniejszym dokumencie procesach zostały opisane w Current Protocols in Immunology, Coligan i wsp., red., Green Publishing Associates i Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991). [0140] Przeciwciała przewidziane do stosowania w terapeutycznych metodach ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą być wytwarzane dowolną znaną w sztuce metodą syntezy przeciwciał, a w szczególności, w drodze syntezy chemicznej lub, korzystnie, technik ekspresji rekombinacyjnej, jak opisano w niniejszym dokumencie. [0141] Należy ponadto zauważyć, że zakres niniejszego ujawnienia obejmuje ponadto wszelkie allele, warianty i mutacje DNA sekwencji wiążących antygen. [0142] Jak dobrze wiadomo, RNA można wyodrębnić z początkowych komórek hybrydomy lub z innych komórek zmienionych przy użyciu standardowych technik, takich jak ekstrakcja izotiocyjanianem guanidyny i wytrącenie, a następnie wirowanie lub chromatografia. Gdy jest to pożądane, mrna może być wyizolowany z całkowitego RNA przy użyciu standardowych technik, takich jak chromatografia na oligo dt celulozie. Odpowiednie techniki znane są w sztuce. [0143] W jednym przypadku, cdna kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała mogą być tworzone jednocześnie lub oddzielnie poprzez zastosowanie metody odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA, zgodnie z dobrze znanymi metodami. Reakcja PCR może być zainicjowana przez startery najwyższej zgodności regionu stałego lub bardziej specyficzne startery opierające się na opublikowanym ciężkim i lekkim łańcuchu DNA oraz sekwencjach aminokwasów. Jak omówiono powyżej, reakcje PCR mogą być również stosowane do wyodrębniania klonów DNA kodujących lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciał. W tym przypadku, biblioteki mogą być przeszukiwane za pomocą starterów najwyższej zgodności lub większych sond homologicznych, takich jak sondy regionu stałego myszy. [0144] DNA, zazwyczaj DNA plazmidu, może być wyodrębnione z komórek z użyciem technik znanych w sztuce, poddane analizie restrykcyjnej i sekwencjonowane zgodnie ze standardowymi, dobrze znanymi metodami, przedstawionymi szczegółowo np. w wyżej wymienionych opracowaniach dotyczących metod rekombinacji DNA. Oczywiście, DNA można uzyskać syntetycznie według niniejszego ujawnienia w dowolnym momencie podczas procesu wyodrębniania i późniejszej analizy. [0145] Ekspresja rekombinacyjna przeciwciała lub jego fragmentu, pochodnej lub analogu np. ciężkiego lub lekkiego łańcucha przeciwciała będącego antagonistą Sp35 wymaga stworzenie wektora ekspresji zawierającego polinukleotyd, który koduje przeciwciało. Po uzyskaniu polinukleotydu kodującego cząsteczkę przeciwciała, bądź ciężki lub lekki łańcuch przeciwciała lub jego część (najchętniej zawierającej domenę zmienną ciężkiego lub lekkiego łańcucha) według niniejszego ujawnienia, możliwe będzie stworzenie wektora do pro- 34

36 dukcji cząsteczki przeciwciała z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA z użyciem metod dobrze znanych w tej dziedzinie techniki. Tak więc w niniejszym dokumencie zostały opisane sposoby wytwarzania białka przez ekspresję polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą przeciwciała. Dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie metody mogą być stosowane do konstrukcji wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje kodujące przeciwciała i odpowiednie sygnały kontrolne transkrypcji i translacji. Sposoby te obejmują, na przykład, rekombinację DNA w warunkach in vitro, techniki syntezy oraz rekombinacji genetycznej in vivo. Tak więc, ujawnienie obejmuje replikowalne wektory zawierające sekwencję nukleotydów kodującą cząsteczkę przeciwciała według niniejszego ujawnienia, bądź jej ciężki lub lekki łańcuch, lub ciężki lub lekki łańcuch domeny zmiennej funkcjonalnie połączony z promotorem. Takie wektory mogą zawierać sekwencję nukleotydową kodującą region stały cząsteczki przeciwciała (zob. np. publikacja PCT WO 86/05807, publikacja PCT WO 89/01036 oraz amerykański opis patentowy nr ), a domena zmienna przeciwciała może zostać wklonowana do takiego wektora w celu ekspresji całego łańcucha ciężkiego lub lekkiego. [0146] Wektor ekspresyjny jest przenoszony do komórki gospodarza powszechnie znanymi metodami, a transfekowane komórki hodowane są z zastosowaniem konwencjonalnych technik wytwarzania przeciwciał przewidzianych do wykorzystania w metodach według niniejszego opisu. Tak więc, ujawnienie obejmuje komórki gospodarza zawierające polinukleotyd kodujący przeciwciało według niniejszego ujawnienia lub jego ciężki lub lekki łańcuch, funkcjonalnie połączony z heterologicznym promotorem. W preferowanych przypadkach ekspresji przeciwciał dwułańcuchowych, wektory kodujące zarówno łańcuch ciężki, jak i lekki mogą być jednocześnie wyrażane w komórce gospodarza, w celu ekspresji całej cząsteczki immunoglobuliny, jak opisano poniżej. [0147] W celu ekspresji cząsteczek przeciwciał przewidzianych do wykorzystania w metodach według niniejszego opisu można zastosować różne systemy wektorów ekspresyjnych i gospodarzy. Takie systemy ekspresji/gospodarza stanowią narzędzia umożliwiające wytwarzanie, a następnie oczyszczanie sekwencji kodujących, ale także stanowią komórki, które w przypadku transformacji lub transfekcji odpowiednich kodujących sekwencji nukleotydów mogą wyrażać cząsteczkę przeciwciała według niniejszego ujawnienia in situ. Obejmują one między innymi mikroorganizmy takie, jak bakterie (np. E. coli, B. subtilis) transformowane za pomocą wektorów ekspresyjnych obejmujących rekombinowane DNA bakteriofagów, DNA plazmidów lub DNA kosmidów, zawierające sekwencje kodujące przeciwciała; drożdże (np. Saccharomyces, Pichia), transformowane przez rekombinacyjne wektory ekspresyjne drożdży, zawierające sekwencje kodujące przeciwciała; układy komórek owadów zainfekowane rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. bakulowirusem) zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciała; systemy komórkowe roślin zainfekowane rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirusem mozaiki kalafiora CaMV, wirusem mozaiki tytoniu TMV) lub transformowane rekombinowanymi, plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. plazmidem Ti) zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciała; systemy komórkowe ssaków (np. komórki COS, CHO, BLK, 293, 3T3) zawierające konstrukty ekspresyjne z rekombinowanymi promotorami pochodzącymi z genomu komórek ssaków (np. promotorami metalotioneiny) lub wirusów ssaków (np. późnego promotora adenowirusa; promotora wirusa krowianki 7.5K). Do ekspresji rekombinowanej cząsteczki prze- 35

37 ciwciała stosowane są korzystnie komórki bakteryjne, takie jak Escherichia coli, a jeszcze korzystniej, komórki eukariotyczne, zwłaszcza w przypadku ekspresji całej rekombinowanej cząsteczki przeciwciała. Na przykład, komórki ssaków, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), w połączeniu z wektorem, takim jak główny pośredni element promotora wczesnego genu ludzkiego cytomegalowirusa, stanowią efektywny system ekspresji przeciwciał (Foecking i wsp. Gene 45:101 (1986); Cockett i wsp., Bio/Technology 8:2 (1990)). [0148] W systemach bakteryjnych można korzystnie wyselekcjonować wiele wektorów ekspresyjnych w zależności od przewidywanego zastosowania wyrażanej cząsteczki przeciwciała. Na przykład, w przypadku zamiaru wyprodukowania dużych ilości białka na potrzeby produkcji kompozycji farmaceutycznych cząsteczki przeciwciała, pożądane może być zastosowanie wektorów sterujących ekspresją wysokich poziomów łatwo oczyszczanych białek fuzyjnych. Wektory takie obejmują, lecz nie wyłącznie, wektor ekspresyjny E. coli pur278 (Ruther i wsp., EMBO J. 2:1791 (1983)), w którym sekwencja kodująca przeciwciała może być indywidualnie ligowana w wektorze z regionem kodującym lacz z zachowaniem ramki odczytu, w wyniku czego wytwarzane jest białko fuzyjne; wektory pin (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: (1989)) i tym podobne. Wektory pgex mogą być również stosowane do ekspresji polipeptydów obcych jako białka fuzyjne z transferazą S-glutationu (GST). Ogólnie, takie białka fuzyjne są rozpuszczalne i można je łatwo oczyścić z komórek poddanych lizie z zastosowaniem adsorpcji i wiązania na kulkach z matrycą z glutationu-agarozy, a następnie elucji w obecności wolnego glutationu. Wektory pgex zawierają miejsca cięcia trombiny lub proteazy czynnika Xa, tak aby klonowany produkt genu docelowego został uwolniony z ugrupowania GST. [0149] W systemach owadów, jako wektora ekspresji obcych genów stosuje się zazwyczaj wirus wielościenności jądra Autographa californica (AcNPV). Wirus dojrzewa w komórkach gatunku Spodoptera frugiperda. Sekwencja kodująca przeciwciała może być wklonowana w nieistotne regiony (na przykład genu wielościenności) wirusa i umieszczona pod kontrolą promotora AcNPV (na przykład promotora wielościenności). [0150] W komórkach ssaczego gospodarza może być wykorzystanych wiele systemów bazujących na ekspresji wirusowej. W przypadkach, gdzie jako wektor ekspresji używany jest adenowirus, sekwencja kodująca przeciwciała może być ligowana z kompleksem kontrolnym transkrypcji/translacji adenowirusa, np. z późnym promotorem lub trójdzielną sekwencją wiodącą. Taki chimeryczny gen może być następnie umieszczony w genomie adenowirusa poprzez rekombinację in vitro lub in vivo. Umieszczenie w nieistotnym regionie genomu wirusa (na przykład regionie E1 lub E3) będzie skutkowało otrzymaniem rekombinowanego wirusa, który będzie żywotny i zdolny do realizowania ekspresji peptydu polipeptydowego w zainfekowanych gospodarzach. (np. zob. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984)). Dla wydajnej translacji wstawionych sekwencji kodujących przeciwciała konieczne mogą być specyficzne sygnały inicjacji. Sygnały te obejmują kodon inicjacji ATG oraz przyległe sekwencje. Ponadto, kodon inicjacyjny musi być w fazie z ramką odczytu żądanej sekwencji kodującej w celu zapewnienia translacji całego wstawienia. Te egzogenne sygnały kontrolne translacji oraz kodony inicjacyjne mogą pochodzić z różnych źródeł, zarówno naturalnych jak i syntetycznych. Wydajność ekspresji można zwiększyć przez wprowadzenie odpowiednich elementów 36

38 wzmacniających transkrypcję, terminatory transkrypcji itp. (zob. Bittner i wsp., Methods in Enzymol. 153: (1987)). [0151] Ponadto, można wybrać szczep komórki gospodarza, który moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji lub modyfikuje i przetwarza produkt genowy w żądany specyficzny sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i obróbka (np. cięcie) produktów białkowych mogą mieć znaczenie dla funkcji białka. Różne komórki gospodarza posiadają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy obróbki potranslacyjnej i modyfikacji białek i produktów genów. W celu zapewnienia prawidłowości modyfikacji i przetwarzania wyrażanych białek obcych można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy. W tym celu mogą być stosowane eukariotyczne komórki gospodarza posiadające maszynerię komórkową zapewniającą prawidłowe przetwarzanie pierwotnego transkryptu, glikozylację i fosforylację produktu genowego. Takie ssacze komórki gospodarza obejmują między innymi CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, a w szczególności, linie komórek raka piersi, takie jak na przykład BT483, Hs578T, HTB2, BT20 i T47D oraz normalną linię komórkową gruczołu mlekowego, na przykład, CRL7030 i Hs578Bst. [0152] W celu uzyskania długotrwałej, wysokiej wydajności produkcji białek rekombinowanych, preferowana jest stabilna ekspresja. Przykładowo, linie komórkowe, które stabilnie wyrażają cząsteczki przeciwciała mogą być inżynierowane. Zamiast stosowania wektorów ekspresyjnych zawierających wirusowe miejsca początku replikacji, komórki gospodarza mogą być transformowane przez DNA kontrolowany przez odpowiednie elementy kontroli ekspresji (np. promotor, wzmacniacz, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji itp.) oraz wybieralne marker selekcyjny. Po wprowadzeniu obcego DNA, zmodyfikowane komórki mogą rozwijać się przez 1-2 dni na wzbogaconej pożywce, a następnie mogą zostać przeniesione na pożywkę selektywną. Marker selekcyjny w zrekombinowanym plazmidzie nadaje oporność na selekcję i umożliwia komórkom stabilną integrację plazmidu z chromosomami i wzrost, w wyniku którego powstają ogniska, które z kolei mogą być klonowane i rozszerzane na linie komórkowe. Metoda ta może być korzystnie stosowana do modyfikacji linii komórkowych, które stabilnie wyrażają cząsteczki przeciwciał. [0153] Stosowanych może być wiele systemów selekcji, w tym między innymi geny kinazy tymidynowej wirusa Herpes Simplex (Wigler i wsp., Cell 11:223 (1977)), fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) i fosforybozylotransferazy adeniny (Lowy i wsp., Cell 22: ) mogą być stosowane odpowiednio w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Ponadto, oporność na antymetabolity może stanowić podstawę wyboru następujących genów: dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Wigler i wsp., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)), gpt, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)), neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 Clinical Pharmacy 12: ; Wu i Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: (1993); Mulligan, Science 260: (1993); oraz Morgan i Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: (1993); TIB TECH 11(5): (Maj, 1993); oraz hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Powszechnie znane w dziedzinie technologii rekombinacji DNA metody, które mogą być stosowane, zostały opisane w Ausubel i wsp. (red.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nowy 37

39 Jork (1990); oraz w rozdziałach 12 i 13, Dracopoli i wsp. (red.), Current Prolocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1994); Colberre-Garapin i wsp. J. MoI. Biol. 150:1 (1981). [0154] Poziomy ekspresji cząsteczki przeciwciała mogą być zwiększone przez wzmocnienie wektora (aby uzyskać opis patrz. Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nowy Jork, Tom 3. (1987)). Jeżeli znacznik systemu wektora wyrażającego przeciwciało jest amplifikowalny, wzrost poziomu inhibitora obecnego w hodowli komórek gospodarza będzie powodował zwiększenie liczby kopii genu markerowego. Ponieważ amplifikowany region jest związany z genem przeciwciała, wzrośnie również produkcja przeciwciał (Crouse i wsp. Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)). [0155] Komórka gospodarza może być kotransfekowana przez dwa wektory ekspresyjne według niniejszego ujawnienia, gdzie pierwszy wektor koduje polipeptyd pochodzący z łańcucha ciężkiego, a drugi wektor koduje polipeptyd pochodzący z łańcucha lekkiego. Obydwa wektory mogą zawierać identyczne markery selekcyjne, które umożliwiają równą ekspresję polipeptydów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, pojedynczy wektor może służyć do kodowania polipeptydów zarówno ciężkiego, jak i lekkiego łańcucha. W takich sytuacjach, łańcuch lekki jest korzystnie umieszczany przed łańcuchem ciężkim, aby uniknąć nadmiaru toksycznego, niezwiązanego łańcucha ciężkiego (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Sekwencje kodujące łańcuchy ciężki i lekki mogą obejmować cdna lub genomowy DNA. [0156] Po rekombinacyjnej ekspresji cząsteczki przeciwciała według niniejszego ujawnienia, może ona zostać oczyszczona dowolną znaną w sztuce metodą oczyszczenia cząsteczki immunoglobuliny, na przykład metodą chromatografii (np. jonowymiennej, powinowactwa, a w szczególności powinowactwa do danego antygenu po zastosowaniu białka A, sortującej według wielkości chromatografii kolumnowej), wirowania, różnicy w rozpuszczalności lub inną standardową techniką oczyszczania białek. Alternatywnie, preferowana metoda zwiększenia powinowactwa przeciwciał według niniejszego ujawnienia została ujawniona w amerykańskim opisie patentowym US A1. [0157] W jednym przypadku, cząsteczka wiążąca lub cząsteczka wiążąca antygen przewidziana do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmuje syntetyczny region stały, w którym co najmniej jedna domena jest częściowo lub całkowicie usunięta ("przeciwciała z usuniętą domeną"). W niektórych przypadkach kompatybilne zmodyfikowane przeciwciała zawierają konstrukty z usuniętymi domenami lub warianty, w których cała domena C H 2 została usunięta (konstrukty C H 2). W innych przypadkach krótki peptyd łączący może zastąpić usuniętą domenę, aby zapewnić giętkość i swobodę ruchów regionu zmiennego. Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że tego typu konstrukty są szczególnie preferowane ze względu na właściwości regulacyjne domeny C H 2 odnoszące się do szybkości katabolicznej przeciwciała. [0158] W niektórych przypadkach, zmodyfikowane przeciwciała stosowane w metodach ujawnionych w niniejszym opisie są miniciałami. Miniciała mogą być wytwarzane przy użyciu metod opisanych w dziedzinie (zob. np. opis patentowy US lub WO 94/09817A1). 38

40 [0159] W innym przypadku, zmodyfikowane przeciwciała przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia stanowią przeciwciała z usuniętą domeną C H 2, które są znane w tej dziedzinie techniki. Konstrukty z usuniętą domeną mogą być pozyskiwane za pomocą wektora (np. z Biogen IDEC Incorporated) kodującego ludzką domenę stałą IgG 1 (zob. np. WO 02/060955A2 i WO 02/096948A2). Ten przykładowy wektor został zaprojektowany w taki sposób, aby usunąć domenę C H 2, dając syntetyczny wektor z usuniętą domeną wyrażający region stały IgG 1. [0160] W jednym przypadku, przeciwciało antagonistyczne Sp35 lub jego fragment, przewidziany do wykorzystania w ujawnionych tu metodach, zawiera łańcuch ciężki immunoglobuliny zawierający delecje lub substytucje kilku lub nawet pojedynczego aminokwasu, o ile umożliwia to powiązania pomiędzy monomerycznymi podjednostkami. Na przykład, mutacja pojedynczego aminokwasu w wybranych obszarach w domenie C H 2 może być wystarczająca, aby znacznie ograniczyć wiązanie z Fc i tym samym zwiększyć lokalizację do miejsca występowania nowotworu. Podobnie, pożądane może być usunięcie jednej lub wielu części domen regionu stałego kontrolujących funkcję efektorową (np. wiązanie dopełniacza), która ma zostać zmodulowana. Takie częściowe delecję regionów stałych umożliwiają poprawę właściwości wybranych przeciwciał (okres półtrwania w surowicy), pozostawiając nienaruszonymi inne pożądane funkcje domen regionu stałego. Ponadto, jak zasugerowano powyżej, stałe regiony opisywanych przeciwciał mogą być utworzone syntetycznie w drodze mutacji lub podstawienia jednego lub większej liczby aminokwasów, co wzmacnia profil powstałego konstruktu. W związku z tym możliwe jest zakłócenie aktywności konserwowanego miejsca wiązania (np. wiązania Fc), przy zasadniczym utrzymaniu konfiguracji oraz immunogennego profilu zmodyfikowanego przeciwciała. Jeszcze inne przykłady obejmują dodanie jednego lub większej liczby aminokwasów w regionie stałym w celu zwiększenia pożądanych cech, takich jak funkcja efektorowa lub zapewnienia większej liczby przyłączeń cytotoksyn lub węglowodanów. W takich przypadkach pożądana może być insercja lub replikacja specyficznych sekwencji pochodzących z wybranych domen regionu stałego. [161] Niniejsze ujawnienie dotyczy również wykorzystania przeciwciał zawierających, składających się zasadniczo lub składających się z wariantów (w tym z pochodnych) cząsteczek przeciwciał (np. regionów V H i/lub regionów V L ) opisanych w niniejszym dokumencie, które to przeciwciała lub ich fragmenty wiążą się immunospecyficznie z polipeptydem Sp35. Standardowe techniki znane specjalistom w tej dziedzinie, mogą być stosowane do wprowadzenia mutacji w sekwencji nukleotydowej kodującej cząsteczkę wiążącą, w tym, lecz niewyłącznie, mutagenezę ukierunkowaną czy mutagenezę metodą PCR, w wyniku których dochodzi do substytucji aminokwasów. Korzystnie, warianty (w tym pochodne) kodują mniej niż 50 podstawień aminokwasowych, mniej niż 40 podstawień aminokwasowych, mniej niż 30 podstawień aminokwasowych, mniej niż 25 podstawień aminokwasowych, mniej niż 20 podstawień aminokwasowych, mniej niż 15 podstawień aminokwasowych, mniej niż 10 podstawień aminokwasowych, mniej niż 5 podstawień aminokwasowych, mniej niż 4 podstawienia aminokwasowych, mniej niż 3 podstawienia aminokwasowe lub mniej niż 2 podstawienia aminokwasowe w stosunku do regionu odniesienia V H, V H CDR1, V H CDR2, V H CDR3, regionu V L, V L CDR1, V L CDR2 lub V L CDR3. "Konserwatywne podstawienie aminokwasowe" to takie, w którym reszta aminokwasowa zostaje zastąpiona resztą aminokwasową posiadającą łańcuch boczny o podobnym ładunku. Rodziny reszt aminokwasowych mających łańcuchy boczne o podobnych ładunkach zostały zdefiniowane w tej dziedzinie nauki. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, argi- 39

41 nina, histydyna), kwasowymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowanymi łańcuchami bocznymi (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), beta-rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Alternatywnie, mutacje można wprowadzać losowo wzdłuż całej lub części sekwencji kodującej np. metodą mutagenezy nasycenia, a powstałe mutanty można przeszukiwać pod kątem aktywności biologicznej, w celu zidentyfikowania mutantów, które zachowują aktywność. [0162] Na przykład, możliwe jest wprowadzenie mutacji tylko w regionach zrębowych lub jedynie w regionach CDR cząsteczki przeciwciała. Wprowadzone mutacje mogą być cichymi lub neutralnymi mutacjami zmiany sensu tj. takimi które nie posiadają wpływu lub posiadają niewielki wpływ na zdolność przeciwciała do wiązania antygenu. Te typy mutacji mogą być przydatne w celu optymalizacji kodonów lub stymulacji produkcji przeciwciał przez hybrydomy. Alternatywnie, nieneutralne mutacje zmiany sensu mogą zmienić zdolność przeciwciała do wiązania antygenu. Najbardziej prawdopodobnym miejscem występowania najcichszych i neutralnych mutacji zmiany sensu są regiony zrębowe, podczas gdy większość nieneutralnych mutacji zmiany sensu występuje prawdopodobnie w regionie CDR, choć nie jest to wymaganiem absolutnym. Specjalista w tej dziedzinie jest w stanie zaprojektować i przetestować zmutowane cząsteczki o pożądanych właściwościach, takich jak brak zmian aktywności wiązania antygenu lub zmiana zdolności wiązania (np. poprawa aktywności wiązania antygenu lub zmiana swoistości przeciwciał). Po mutagenezie, kodowane białko może być wyrażane rutynowo, a funkcjonalna i/lub biologiczna aktywność kodowanego białka może być określona przy użyciu technik opisanych w niniejszym dokumencie lub rutynowych technik modyfikujących, znanych w tej dziedzinie techniki. Białka fuzyjne oraz sprzężone polipeptydy i przeciwciała [0163] Polipeptydy Sp35 i przeciwciała przewidziane do wykorzystania w ujawnionych tu metodach leczenia mogą być ponadto rekombinacyjnie łączone z polipeptydem heterologicznym na N- lub C-końcu lub sprzęgane chemicznie (w tym w ramach koniugacji kowalencyjnej i nie-kowalencyjnej) z polipeptydami lub innymi kompozycjami. Na przykład, polipeptydy antagonistyczne lub przeciwciała przeciw Sp35 mogą być rekombinacyjnie łączone lub sprzęgane z cząsteczkami stosowanymi jako znakowanie użyteczne do detekcji oraz z cząstkami efektorowymi, takimi jak polipeptydy heterologiczne, leki, radionuklidy lub toksyny. Zob. np. publikacje PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; amerykański opis patentowy oraz EP [0164] Polipeptydy antagonistyczne lub przeciwciała przeciw Sp35 przewidziane do stosowania w metodach leczenia ujawnionych w niniejszym dokumencie obejmują pochodne zmodyfikowane tj. przez kowalencyjne przyłączenie dowolnego rodzaju cząsteczki w taki sposób, żeby przyłączenie kowalencyjne nie uniemożliwiło hamowania funkcji biologicznej Sp35 przez polipeptyd antagonistyczny lub przeciwciało przeciw Sp35. Dla przykładu, ale nie dla ograniczenia, polipeptydy antagonistyczne oraz przeciwciała przeciw Sp35 według niniejszego ujawnienia mogą być modyfikowane np. poprzez glikozylację, acetylację, pegylację, fosfinowanie, fosforylację, amidowanie, derywatyzację za pomocą znanych grup zabezpieczających/blokujących, cię- 40

42 cie proteolityczne, łączenie z ligandem komórkowym lub innym białkiem itp. Każdą z licznych modyfikacji chemicznych można przeprowadzić znanymi technikami, w tym między innymi w drodze określonego rozkładu chemicznego, acetylacji, formylowania, metabolicznej syntezy tunikamycyny itp. Dodatkowo, pochodne mogą zawierać jeden lub więcej nie-klasycznych aminokwasów. [0165] Polipeptydy antagonistyczne i przeciwciała przeciw Sp35 przewidziane do stosowania w metodach leczenia ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą składać się z aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi lub zmodyfikowanymi wiązaniami peptydowymi tj. izosterami peptydów i mogą zawierać aminokwasy inne niż te z grupy 20 aminokwasów kodowanych przez geny. Polipeptydy antagonistyczne i przeciwciała przeciw Sp35 mogą być modyfikowane zarówno w procesach naturalnych, takich jak modyfikacje potranslacyjne lub techniki modyfikacji chemicznych, które są dobrze znane w tej dziedzinie techniki. Takie modyfikacje są odpowiednio opisane w podstawowych tekstach oraz w bardziej szczegółowych monografiach jak również w obszernej literatury naukowej. Modyfikacje mogą zachodzić w dowolnym miejscu polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała Sp35, w tym w szkielecie peptydowym, łańcuchach bocznych lub w końcach aminowych lub karboksylowych, jak i w ugrupowaniach takich jak węglowodanowe. Należy zdawać sobie sprawę, że tego samego typu modyfikacje mogą występować w tym samym lub w różnym stopniu w różnych miejscach danego polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35. Ponadto, dany polipeptyd antagonistyczny lub przeciwciało przeciw Sp35 może zawierać wiele typów modyfikacji. Polipeptydy antagonistyczne lub przeciwciała Sp35 mogą być rozgałęzione, na przykład, w wyniku ubikwitynacji, a także mogą być cykliczne, z rozgałęzieniami lub bez. Cykliczne, rozgałęzione i cyklicznie rozgałęzione polipeptydy antagonistyczne i przeciwciała przeciw Sp35 mogą być wynikiem naturalnych procesów potranslacyjnych lub mogą być wytwarzane w drodze syntezy. Procesy modyfikacyjne obejmują: acetylację, acylację, ADP-rybozylację, amidowanie, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie ugrupowania hemowego, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu lub pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu lub pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie, cyklizację, tworzenie mostków dwusiarczkowych, demetylację, tworzenie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, tworzenie cysteiny, tworzenie piroglutaminianu, formylowanie, gamma-karboksylację, glikozylację, tworzenie kotwic GPI, hydroksylację, jodowanie, metylację, mirystylację, utlenianie, pegylację, obróbkę proteolityczną, fosforylację, prenylację, racemizację, selenizację, siarczanowanie, przyłączenie aminokwasów za pośrednictwem transportującego RNA do białek, w procesach takich jak arginylacja i ubikwitynacja. (zob. np. Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nowy Jork, 2 wyd., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, red., Academic Press, Nowy Jork, s (1983); Seifter i wsp. Meth Enzymol 182: (1990); Rattan i wsp. Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).) [0166] Niniejsze ujawnienie uwzględnia białka fuzyjne zawierające, składające się zasadniczo lub składające się z połączenia polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35, które hamuje funkcję Sp35. Korzystnie, heterologiczny polipeptyd, z którym łączony jest polipeptyd antagonistyczny lub przeciwciało Sp35, jest przydatny dla funkcjonowania lub identyfikacji polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35. W niektórych przypadkach ujawnionych w niniejszym opisie, rozpuszczalny polipeptyd antagonistyczny Sp35 np. polipeptyd Sp35 zawierający domeny LRR, domenę Ig lub całą domenę zewnątrzko- 41

43 mórkową (odpowiadający aminokwasom od 34 do 532 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2) jest połączony z ugrupowaniem polipeptydu heterologicznego tworząc polipeptyd fuzyjny antagonistyczny do Sp35. Białka fuzyjne będące antagonistami i przeciwciałami przeciw Sp35 mogą mieć różne zastosowania, na przykład: wydłużenie okresu półtrwania w surowicy, zwiększenie biodostępności, nakierowanie in vivo na konkretny narząd lub rodzaj tkanki, poprawa wydajności ekspresji rekombinacyjnej, lepsze wydzielanie komórek gospodarza, ułatwienie oczyszczania i wyższa zachłanność. W zależności od zakładanych cel(ów), ugrupowanie heterologiczne może być biologicznie obojętne lub aktywne. Ponadto, może ono być trwale powiązane z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 lub też może być rozszczepialne, in vitro lub in vivo. W opisywanej dziedzinie znane są ugrupowania heterologiczne pozwalające osiągnąć te cele. [0167] Jako alternatywę do ekspresji antagonistycznego polipeptydu fuzyjnego lub przeciwciała Sp35, można wstępnie ukształtować wybrane ugrupowanie heterologiczne, a następnie sprzęgnąć je chemicznie z antagonistycznym polipeptydem lub przeciwciałem przeciw Sp35. W większości przypadków, wybrane ugrupowanie heterologiczne będzie działać podobnie, niezależnie od tego, czy będzie spojone czy skoniugowane z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35. Dlatego też, w dalszej dyskusji na temat heterologicznych sekwencji aminokwasów, o ile nie podano inaczej, należy rozumieć, że heterologiczna sekwencja może być połączona z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 w postaci białka fuzyjnego lub jako koniugat chemiczny. [0168] Farmakologicznie aktywne polipeptydy, takie jak polipeptydy antagonistyczne lub przeciwciała przeciw Sp35 często wykazują znacznie szybki klirens in vivo, co wymaga dużych dawek w celu osiągnięcia terapeutycznie skutecznych wartości stężenia w organizmie. Ponadto, polipeptydy mniejsze niż ok. 60 kda mogą potencjalnie być poddane filtracji kłębuszkowej, co czasem prowadzi do nefrotoksyczności. Łączenie lub sprzęganie stosunkowo małych polipeptydów, takich jak polipeptydy antagonistyczne lub przeciwciała przeciw Sp35 mogą być stosowane w celu zmniejszenia lub uniknięcia takiego ryzyka nefrotoksyczności. Znane są różne heterologiczne sekwencje aminokwasów, np. ugrupowania lub "nośniki" polipeptydów dla zwiększenia stabilności in vivo tj. okresu półtrwania w surowicy, polipeptydów terapeutycznych. [0169] Ze względu na swój długi okres półtrwania, szeroką dystrybucję in vivo oraz brak funkcji enzymatycznej lub immunologicznej, ludzka albumina osocza (HSA) lub fragmenty HSA o zasadniczo pełnej długości są powszechnie stosowane jako ugrupowania heterologiczne. Dzięki zastosowaniu materiałów i metod, takich jak te opisane w Yeh i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: (1992), a Syed i wsp. Blood 89: (1997), HSA może być stosowane w celu utworzenia antagonistycznego polipeptydu fuzyjnego lub przeciwciała przeciw Sp35 lub koniugatu polipeptyd/przeciwciało, które dzięki obecności ugrupowania Sp35 wyrażają aktywność farmakologiczną przy znacznie zwiększonej stabilności in vivo np. 10-krotnie do 100-krotnie wyższej. C-koniec HSA może być połączony z N-końcem rozpuszczalnego ugrupowania Sp35. Ponieważ HSA jest naturalnie wydzielanym białkiem, sekwencja sygnałowa HSA może być wykorzystywana do wydzielania rozpuszczalnego białka fuzyjnego Sp35 w pożywce hodowli komórek, gdy białko fuzyjne jest wytwarzane w eukariotycznym układzie ekspresyjnym np. ssaków. 42

44 [0170] Sekwencja sygnałowa jest polinukleotydem, który koduje sekwencję aminokwasową, która inicjuje transport białka przez błonę retikulum endoplazmatycznego. Sekwencje sygnałowe użyteczne w procesie konstruowania białek immunofuzyjnych (immunofuzyn) obejmują sekwencje sygnałowe lekkiego łańcucha przeciwciała np. przeciwciało (Gillies i wsp., J. Immunol. Meth. 125: (1989)), sekwencje sygnałowe ciężkiego łańcucha przeciwciała np. sekwencja sygnałowa ciężkiego łańcucha MOPC141 (Sakano i wsp., Nature 286:5774 (1980)). Alternatywnie mogą być stosowane inne sekwencje sygnałowe. Zob. np. Watson, Nucl. Acids Res. 12:5145 (1984). Peptyd sygnałowy jest zazwyczaj odcinany w świetle retikulum endoplazmatycznego przez peptydazy sygnałowe. Uzyskuje się w ten sposób wydzielanie białka immunofuzyjnego zawierającego region Fc i rozpuszczalne ugrupowanie Sp35. [0171] W niektórych przypadkach, sekwencje DNA mogą kodować miejsca cięć proteolitycznych pomiędzy kasetą wydzielniczą, a ugrupowaniem rozpuszczalnego Sp35. Takie miejsce cięcia może służyć np. do proteolitycznego rozszczepienia kodowanego białka fuzyjnego, a tym samym oddzielenia domeny Fc od białka docelowego. Do przydatnych miejsc rozszczepienia proteolitycznego zalicza się sekwencje aminokwasowe rozpoznawane przez enzymy proteolityczne, takie jak trypsyna, plazmina, trombina, czynnik Xa lub enterokinaza K. [0172] Kaseta wydzielnicza może zostać włączona do zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego. Korzystne wektory obejmują liniowe kwasy nukleinowe, plazmidy, fagmidy, kosmidy i podobne. Przykładem jest wektor ekspresyjny pdc, w których transkrypcja DNA immunofusin znajduje się pod kontrolą wzmacniacza i promotora ludzkiego cytomegalowirusa. Zob. np. Lo et i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1088:712 (1991); oraz Lo i wsp., Protein Engineering 11: (1998). Odpowiednia komórka gospodarza może być transformowana lub transfekowana przez DNA kodujące rozpuszczalny polipeptyd Sp35 i używana do ekspresji i sekrecji rozpuszczalnego polipeptydu Sp35. Zazwyczaj używane komórki gospodarza obejmują nieśmiertelne komórki hybrydom, komórki szpiczaka, komórki 293, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki Hela, i komórki COS. [0173] W jednym przypadku, rozpuszczalny polipeptyd Sp35 jest sprzęgany z zawiasem i regionem Fc, tj. C- końcem regionu stałego ciężkiego łańcucha Ig. Potencjalne zalety połączenia Sp35-Fc obejmują rozpuszczalność, stabilność in vivo i multiwalentność np. dimeryzację. Stosowanym regionem Fc może być region IgA, IgD lub IgG Fc (zawias- C H 2- C H 3). Ewentualnie, może to być region IgE lub IgM Fc (zawias- C H 2- C H 3- C H 4). Zazwyczaj stosowany jest region IgG Fc np. region IgG 1 Fc lub region IgG 4 Fc. W jednym przypadku, w fuzji stosowany jest sekwencja rozpoczynająca się w regionie zawiasowym tuż powyżej miejsca cięcia papainy, określającego chemicznie Fc IgG (tj. reszta 216, przyjmując że pierwsza reszta regionu stałego łańcucha ciężkiego to 114 według systemu Kabat) lub analogicznych miejscach innych immunoglobulin używanych w fuzji. Precyzyjne określenie miejsca, w którym zachodzi fuzja nie ma znaczenia krytycznego; poszczególne miejsca są dobrze znane i mogą być dobrane w celu optymalizacji aktywności biologicznej, sekrecji lub właściwości wiążących cząsteczki. Materiały i metody do konstruowania i wyrażania DNA kodujących fuzje Fc są znane w sztuce i mogą być stosowane w celu uzyskania fuzji rozpuszczalnego Sp35 bez zbędnego eksperymentowania. W niektórych przypadkach określonych w niniejszym ujawnieniu wykorzy- 43

45 stywane są białka fuzyjne Sp35, takie jak opisano w Capon i wsp. w amerykańskich opisach patentowych nr i [0174] Całkowicie nienaruszone, regiony Fc dzikiego typu wyrażają funkcje efektorowe, które zazwyczaj są zbędne i niepożądane w białku fuzyjnym Fc stosowanym w metodach ujawnionych w niniejszym ujawnieniu. Zatem niektóre wiązania są zwykle usuwane z regionu Fc podczas tworzenia kasety wydzielniczej. Na przykład, ponieważ koekspresja z łańcuchem lekkim jest zbędna, miejsce wiązania białka wiążącego łańcuch ciężki, Bip (Hendershot i wsp., Immunol. Today 8: (1987)), jest usuwane z domeny C H 2 regionu Fc IgE tak, aby miejsce to nie zakłócało skutecznego wydzielania białka immunofuzyjnego. Sekwencje domeny transbłonowej, takie jak sekwencje obecne w IgM, są również zazwyczaj usuwane. [0175] Najczęściej używany jest region Fc IgG 1. Ewentualnie, w kasecie wydzielniczej może być stosowany region Fc innych podklas immunoglobuliny gamma (gamma-2, gamma-3 i gamma-4). W kasecie wydzielniczej stosuje się najczęściej region Fc lgg 1 immunoglobuliny gamma-1, który zawiera co najmniej część regionu zawiasowego, region C H 2 oraz region C H 3. W niektórych przypadkach, regionem Fc immunoglobuliny gamma-1 jest region Fc z usuniętym regionem C H 2, który zawiera również część regionu zawiasowego oraz regionu C H 3, ale nie region C H 2. Region Fc z usuniętym regionem C H 2, został opisany przez Gillies i wsp. Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990). W niektórych przypadkach, stosowany jest region Fc jednego z IgA, IgD, IgE lub IgM. [0176] Białka fuzyjne Sp35-Fc mogą być skonstruowane w wielu różnych konfiguracjach. W jednej konfiguracji C-koniec ugrupowania rozpuszczalnego Sp35 łączy się bezpośrednio z N-końcem ugrupowania zawiasu Fc. W nieco innym układzie, krótki polipeptyd, np. zawierający 2-10 aminokwasów, zostaje włączony do fuzji N-końca ugrupowania rozpuszczalnego Sp35 i C-końca ugrupowania Fc. Taki łącznik zapewnia giętkość konformacyjną, która w niektórych okolicznościach może zwiększać aktywność biologiczną. Gdy zachowana jest dostatecznie duża część regionu zawiasowego w ugrupowaniu Fc, fuzja Fc-Sp35 będzie ulegać dimeryzacji, tworząc tym samym cząsteczkę dwuwartościową. Jednorodna populacja monomerycznych fuzji Fc pozwoli uzyskać monospecyficzne dimery dwuwartościowe. Mieszanina dwóch monomerycznych fuzji Fc, z których każda posiada inną specyficzność, pozwoli uzyskać bispecyficzne dimery dwuwartościowe. [0177] Każdy z wielu łączników sieciujących, które zawierają odpowiednią reaktywną grupę aminową oraz reaktywną grupę tiolową może być stosowany do łączenia polipeptydów antagonistycznych do Sp35 z albuminą surowicy. Do przykładów odpowiednich łączników należą łączniki sieciujące zawierające reaktywną grupę aminową, które wstawiają maleimid wchodzący w reakcję z tiolem np. SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS i GMBS. Inne odpowiednie łączniki wstawiają haloacetylową, reaktywną grupę tiolową np. SBAP, SIA, SIAB. Łączniki zapewniające osłoniętą lub nieosłoniętą grupę tiolową reagującą z grupami sulfhydrylowymi, tworząc wiązania redukowalne obejmują SPDP, SMPT, SATA oraz SATP. Takie odczynniki są dostępne na rynku (np. Pierce Chemicals). [0178] Koniugacja nie musi obejmować N-końca rozpuszczalnego polipeptydu Sp35 lub ugrupowania tiolowego albuminy surowicy. Przykładowo, rozpuszczalne fuzje albuminy i Sp35 można uzyskać przy użyciu 44

46 technik inżynierii genetycznej, w których rozpuszczalne ugrupowanie Sp35 jest łączone z genem albuminy surowicy na jego N-końcu, C-końcu lub na obu z nich. [0179] Rozpuszczalne polipeptydy Sp35 mogą być łączone z heterologicznymi peptydami w celu ułatwienia oczyszczania lub identyfikacji ugrupowania rozpuszczalnego Sp35. Na przykład, znacznik histydynowy można sprząc z rozpuszczalnym polipeptydem Sp35 w celu ułatwienia oczyszczania polipeptydu przy użyciu dostępnych na rynku materiałów chromatograficznych. [0180] W niektórych przypadkach ujętych w niniejszym ujawnieniu, rozpuszczalny konstrukt fuzji Sp35 jest stosowany w celu zwiększenia produkcji rozpuszczalnego ugrupowania Sp35 w bakteriach. W takich konstruktach, białko bakteryjne zazwyczaj wyrażane i/lub wydzielane na wysokim poziomie jest stosowane jako partner fuzyjny na N-końcu rozpuszczalnego polipeptydu Sp35. Zob. np. Smith i wsp., Gene 67:31 (1988); Hopp i wsp.., Biotechnology 6:1204 (1988); La Vallie i wsp., Biotechnology 11:187 (1993). [0181] Przez połączenie rozpuszczalnego ugrupowania Sp35 na aminowych i karboksylowych końcach odpowiedniego partnera fuzyjnego, można uzyskać dwuwartościowe lub czterowartościowe postacie rozpuszczalnego polipeptydu Sp35. Przykładowo, rozpuszczalne ugrupowanie Sp35 można dołączyć na końcach aminowym i karboksylowym Ig, w celu uzyskania dwuwartościowego, monomerycznego polipeptydu zawierającego dwa rozpuszczalne ugrupowania Sp35. Po dimeryzacji tych dwóch monomerów za pomocą ugrupowania Ig, uzyskiwana jest czterowartościowa postać rozpuszczalnego białka Sp35. Takie multiwalentne postacie można zastosować, aby uzyskać zwiększone powinowactwo wiązania do substancji docelowej. Wielowartościowe postacie rozpuszczalnego Sp35 można również uzyskać przez umieszczenie reszt rozpuszczalnego Sp35 jedna za drugą, tworząc konkatemery, które mogą być stosowane same lub połączone fuzją z partnerem fuzyjnym, np. Ig lub HSA. Polimery sprzężone (inne niż polipeptydy) [0182] W niektórych przypadkach ujawnionych w niniejszym ujawnienia występuje rozpuszczalny polipeptyd Sp35 lub przeciwciało przeciw Sp35, gdzie co najmniej jeden polimer jest skoniugowany (połączony kowalencyjnie) z polipeptydem Sp35 lub przeciwciałem. Przykłady polimerów przydatnych do takiej koniugacji obejmują polipeptydy (omawiane powyżej), polimery cukru i łańcuchy glikolu polialkilenowego. Zazwyczaj, ale nie koniecznie, polimer jest koniugowany z rozpuszczalnym polipeptydem Sp35 lub przeciwciałem przeciw Sp35 w celu zwiększenia co najmniej jednej z następujących właściwości: rozpuszczalności, stabilności lub dostępności biologicznej. [0183] Klasą polimeru stosowaną zazwyczaj w koniugacji z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 jest glikol polialkilenowy. Najczęściej stosowany jest glikol polietylenowy (PEG). Ugrupowania PEG np. polimery PEG 1, 2, 3, 4 lub 5 mogą być koniugowane z dowolnym polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 w celu przedłużenia okresu półtrwania w surowicy, w porównaniu z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 występującym samodzielnie. Ugrupowania PEG nie są antygenowe i są zasadniczo biologicznie obojętne. Ugrupowania PEG stosowane w praktyce według niniejszego ujawnienia mogą być rozgałęzione lub nierozgałęzione. 45

47 [0184] Liczba cząsteczek PEG przyłączonych do polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35 oraz masa cząsteczkowa poszczególnych łańcuchów PEG mogą się różnić. Ogólnie, im wyższa jest masa cząsteczkowa polimeru, tym mniej łańcuchów polimerowych jest związanych z polipeptydem. Zazwyczaj całkowita masa polimeru przyłączanego do polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35 wynosi od 20 kda do 40 kda. Tak więc, gdy przyłączony jest jeden łańcuch polimerowy, masa cząsteczkowa łańcucha wynosi na ogół kda. Jeśli przyłączone są dwa łańcuchy, masa cząsteczkowa każdego łańcucha wynosi na ogół kda. Gdy przyłączone są trzy łańcuchy, masa cząsteczkowa każdego łańcucha wynosi na ogół 7-14 kda. [0185] Polimer, np. PEG, może być powiązany z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 za pomocą dowolnej, odpowiedniej, nieosłoniętej grupy reaktywnej w polipeptydzie. Nieosłoniętą grupą reaktywną może być np. grupa aminowa N-końca lub grupa aminowa epsilon wewnętrznej reszty lizyny, lub obydwie. Aktywowany polimer może reagować i łączyć się kowalencyjnie z dowolną niezwiązana grupą aminową polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35. Wolne grupy karboksylowe, korzystnie, odpowiednio aktywowane grupy karbonylowe, hydroksylowe, guanidylowe, imidazolowe, ugrupowania utlenionych węglowodanów i grupy merkapto polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35 (jeśli są dostępne) mogą również być wykorzystane jako grupy reaktywne do wiązania polimeru. [0186] W reakcji koniugacji używa się zazwyczaj od około 1,0 do około 10 moli aktywowanego polimeru na mol polipeptydu, w zależności od stężenia polipeptydu. Zazwyczaj, wybrany stosunek stanowi balans pomiędzy maksymalizacją reakcji, a minimalizacją reakcji ubocznych (często niespecyficznych), które mogą zmniejszyć żądaną aktywność farmakologiczną polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35. Korzystnie, zachowywane jest co najmniej 50% aktywności biologicznej (jak wykazano np. w dowolnym z testów opisanych lub znanych w tej dziedzinie) polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35, a najkorzystniej blisko 100% jest zachowywane. [0187] Polimer może być skoniugowany z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem Sp35 stosując konwencjonalne metody chemiczne. Na przykład, ugrupowanie glikolu polialkilenowego może być łączone z grupą aminową epsilon lizyny polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35. Połączenie z łańcuchem bocznym lizyny można przeprowadzić z zastosowaniem aktywnego estru N- hydroksysukcynimidu (NHS), takiego jak bursztynian sukcynimidowy PEG (SS-PEG) i sukcynimidylopropionian (SPA-PEG). Odpowiednie ugrupowania glikolu polialkilenowego obejmują np. karboksymetylo- NHS i norleucynę-nhs, SC. Odczynniki te są dostępne na rynku. Dodatkowe aminoreaktywne łączniki PEG można podstawić za ugrupowanie sukcynoimidylowe. Obejmują one np. izotiocyjaniany, nitrofenylowęglany (PNP), epoksydy i węglany benzotriazolowe, SC-PEG, tresylat, aldehyd, epoksyd, karbonylodiimidazol i węglan PNP. Warunki są zazwyczaj optymalizowane, w celu zmaksymalizowania selektywności i stopnia reakcji. Taka optymalizacja warunków reakcji należy do typowych elementów w tej dziedzinie techniki. [0188] PEGylację można przeprowadzić dowolną z technik PEGylacji znanych w tej dziedzinie. Zob. np. Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992) oraz europejskie zgłoszenia patentowe EP i EP PEGylacja może być przeprowadzana z zastosowaniem reakcji acylowania lub reakcji alkilowania z reak- 46

48 tywną cząsteczką glikolu polietylenowego (lub analogicznego reaktywnego polimeru rozpuszczalnego w wodzie). [0189] PEGylacja przez acylowanie ogólnie obejmuje reakcję pochodnej aktywnego estru glikolu polietylenowego. W PEGylacji może być stosowana dowolna reaktywna cząsteczka PEG. Często stosowanym aktywowanym estrem PEG jest PEG estryfikowane do N-hydroksysukcynimidu (NHS). W niniejszym opisie "acylowanie" obejmuje bez ograniczeń następujące typy wiązań między białkiem terapeutycznym, a rozpuszczalnym w wodzie polimerem, takim jak PEG: amid, karbaminian, uretan i tym podobne. Patrz, np., Bioconjugate Chem. 5: , Parametry reakcji wybiera się na ogół w taki sposób, aby uniknąć temperatury, rozpuszczalników i odczynu ph, które spowodowałyby zniszczenie lub inaktywację rozpuszczalnego polipeptydu Sp35. [0190] Zazwyczaj łącznikiem jest połączenie amidowe i zazwyczaj co najmniej 95% otrzymanych produktów to produkty mono-, di- lub tri-pegylowane. Pewna ilość produktów o wyższym stopniu PEGylacji może jednak powstawać w zależności od zastosowanych specyficznych warunków reakcji. Opcjonalnie, oczyszczone PEGylowane gatunki, a w szczególności gatunki nieprzereagowane, są wyodrębniane z mieszaniny konwencjonalnymi metodami oczyszczania, w tym, na przykład w drodze dializy, wysalania, ultrafiltracji, chromatografii jonowymiennej, chromatografii z filtracją żelową, chromatografii wymiany hydrofobowej i elektroforezy. [0191] PEGylacja przez alkilowanie obejmuje na ogół reakcję pochodnej końcowego aldehydu PEG z polipeptydem antagonistycznym lub przeciwciałem przeciw Sp35 w obecności środka redukującego. Ponadto, możliwa jest dostosowanie warunków reakcji w taki sposób, aby PEGylację była stymulowana zasadniczo tylko na N-końcowej grupie aminowej polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35 tj. białko mono-pegylowane. W każdym przypadku mono- lub poli-pegylacji, grupy PEG są zwykle połączone z białkiem przez grupę -C H 2-NH. W szczególności w odniesieniu do grupy -C H 2-, wiązanie tego typu znane jest jako wiązanie "alkilowe". [0192] Derywatyzacja przez alkilację redukcyjną z wytworzeniem mono-pegylowanego produktu ukierunkowanego na N-koniec wykorzystuje różnice reaktywności różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych (lizyny w stosunku do N-końca) dostępnych do derywatyzacji. Reakcja jest przeprowadzana przy wartości ph umożliwiającej wykorzystanie różnic pka pomiędzy grupami aminowymi epsilon reszt lizyny, a grupą aminową N-końca białka. Taka selektywna derywatyzacja umożliwia kontrolę przyłączania polimeru rozpuszczalnego w wodzie, który zawiera reaktywną grupę, na przykład aldehydu, do białka: koniugacja z polimerem zachodzi głównie na N-końcu białka bez znacznych zmian pozostałych grup reaktywnych, takich jak grupy aminowe łańcucha bocznego lizyny. [0193] Cząsteczki polimeru stosowane w metodzie acylowania i alkilowania są wybierane spośród polimerów rozpuszczalnych w wodzie. Wybrany polimer jest zazwyczaj modyfikowany w taki sposób, aby mieć jedną grupę reaktywną, na przykład aktywny ester do reakcji acylowania lub aldehyd do reakcji alkilowania, tak, że stopień polimeryzacji można regulowany dla omawianych metod. Przykładem reaktywnego aldehydu PEG jest propionowy glikol polietylenowy, który jest stabilny w wodzie, lub jego mono C1-C10 alkoksy- lub arylok- 47

49 sy- pochodne (zob. np. Harris i wsp. w amerykańskim opisie patentowym nr ). Polimer może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. W reakcji acylowania, dobrane polimery mają zazwyczaj jedną reaktywną grupę estrową. W reakcji redukcyjnego alkilowania, dobrane polimery mają zazwyczaj jedną reaktywną grupę aldehydową. Ogólnie, rozpuszczalny w wodzie polimer nie jest dobierany z naturalnie występujących reszt glikozylowych, ponieważ są one zazwyczaj łatwiej pozyskiwane ze zrekombinowanych układów ekspresji ssaków. [0194] Sposoby wytwarzania PEGylowanego rozpuszczalnego polipeptydu lub przeciwciała przeciw Sp35 obejmują zazwyczaj następujące etapy: (a) poddanie polipeptydu lub przeciwciała Sp35 reakcji z glikolem polietylenowym (np. reaktywnym estrem lub reaktywną pochodną aldehydową PEG) w warunkach, w których cząsteczka zostaje związana z co najmniej jedną grupą PEG i (b) uzyskania produktu reakcji. Ogólnie, optymalne warunki reakcji acylowania są ustalane indywidualnie dla poszczególnych przypadków na podstawie znanych parametrów i żądanych wyników. Na przykład, wyższy stosunek PEG do białka na ogół prowadzi do zwiększenia procentu produktu poli-pegylacji. [0195] Redukcyjne alkilowanie w celu wytworzenia zasadniczo homogennej populacji przeciwciał monopolimerowych/rozpuszczalnych peptydów Sp35 lub przeciwciał przeciw Sp35 ogólnie obejmuje etapy: (a) poddanie rozpuszczalnego białka lub przeciwciała przeciw Sp35 reakcji z reaktywną cząsteczką PEG w warunkach alkilacji reaktywnej w środowisku ph umożliwiającym modyfikację selektywną grupy aminowej N- końca polipeptydu lub przeciwciała i (b) uzyskania produktu reakcji. [0196] W celu uzyskania zasadniczo homogenicznej populacji mono-polimerowych/rozpuszczalnych peptydów Sp35 lub przeciwciał przeciw Sp35, warunki reakcji redukcyjnego alkilowania powinny umożliwiać selektywne przywiązanie ugrupowania rozpuszczalnego w wodzie polimeru do N-końca polipeptydu lub przeciwciała. Takie warunki reakcji zasadniczo powodują różnice pka między grupami aminowymi łańcucha bocznego lizyny, a grupą aminową N-końca. Dla celów niniejszego ujawnienia, ph mieści się na ogół w zakresie 3-9, a zwykle 3-6. [0197] Rozpuszczalne polipeptydy lub przeciwciała Sp35 mogą zawierać znacznik np. ugrupowanie, które może być następnie uwolnione w procesie proteolizy. Tak więc, ugrupowanie lizyny może być selektywnie modyfikowane najpierw w reakcji ze znacznikiem His zmodyfikowanym z łącznikiem o niskiej masie cząsteczkowej np. odczynnikiem Trauta (Pierce), które będzie reagować zarówno z lizyną, jak i N-końcem, a następnie uwolnienia znacznika His. Polipeptyd zawiera wtedy wolną grupę SH, która może być selektywnie modyfikowana za pomocą PEG zawierającego reaktywną grupę tiolową, taką jak grupa maleimidowa, grupa winylosulfonowa, grupa haloacetylowa lub wolna bądź osłonięta grupa SH. [0198] Odczynnik Trauta może być zastąpiony dowolnym łącznikiem, który będzie stanowił swoiste miejsce przyłączania PEG. Przykładowo, odczynnik Trauta może być zastąpiony przez SPDP, SMPT, SATA lub SATP (Pierce). Podobnie można przeprowadzić reakcję białka z łącznikiem reaktywnym wobec grup aminowych, który wprowadza resztę maleimidową (na przykład SMCC, AMAS, BMP, MBS, EMCS SMPB, SMPH, KMUS lub GMBS), grupą haloacetylową (SBAP, SIA, SIAB) lub grupą winylosulfonową, a powstały produkt poddać reakcji z produktem PEG zawierającym wolną grupę SH. 48

50 [0199] W niektórych przypadkach, cząsteczka glikolu polialkilenowego jest dołączony do grupy cysteinowej polipeptydu antagonistycznego lub przeciwciała przeciw Sp35. Połączenie może zostać wykonane przy zastosowaniu np. grupy maleimidowej, grupy winylosulfonowej, grupy haloacetylowej lub grupy tiolowej. [0200] Opcjonalnie, rozpuszczalny polipeptyd lub przeciwciało Sp35 jest sprzężone z ugrupowaniem glikolu polietylenowego wiązaniem nietrwałym. Wiązanie labilne może zostać rozszczepione np. w reakcji hydrolizy biochemicznej, proteolizy lub rozszczepienia tiolowego. Przykładowo, wiązanie może być rozszczepione w warunkach (fizjologicznych) in vivo. [0201] W reakcje mogą zachodzić za pomocą dowolnych odpowiednich metod stosowanych w reakcjach materiałów biologicznie czynnych z polimerami obojętnymi przy ph na poziomie około 5-8 np. ph 5, 6, 7 lub 8, w przypadku, gdy te reaktywne grupy umieszczone są na grupie aminowej alfa na N-końcu. Generalnie, proces ten obejmuje przygotowanie aktywowanego polimeru, a następnie poddanie białka reakcji z aktywnym polimerem w celu wytworzenia rozpuszczalnego białka odpowiedniego dla preparatu. Antagonisty polinukleotydu Sp35 [0202] Konkretne przykłady obejmują sposób leczenia stanów demielinizacji lub dysmielinizacji, polegający na podaniu skutecznej ilości antagonisty polinukleotydu Sp35 zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego, która specyficznie wiąże się z polinukleotydem kodującym Sp35. Antagonista polinukleotydu Sp35 zapobiega ekspresji Sp35 (knockdown). Antagonisty polinukleotydu Sp35 obejmują, ale nie są do nich ograniczone, cząsteczki antysensowne, rybozymy, sirna, shrna oraz RNAi. Zwykle, takie cząsteczki wiążące są oddzielnie podawane zwierzęciu (zob. np. Connor, J. Neurochem. 56:560 (1991), jednak takie cząsteczki wiążące mogą być także wyrażona in vivo z polinukleotydów zaabsorbowanych przez komórkę gospodarza i wyrażanych in vivo. Zob. także Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). [0203] RNAi odnosi się do ekspresji RNA, które wpływa negatywnie na ekspresją docelowego mrna. Konkretnie, RNAi wycisza docelowy gen poprzez interakcję z określonym mrna (np. Sp35) przez sirna (małe interferujące RNA). Kompleks ds RNA staje się wówczas celem degradacji przez komórkę. Dodatkowe cząsteczki RNAi obejmują srna o strukturze spinki do włosów (shrna). Cząsteczka shrna zawiera sekwencje sensowne i antysensowne genu docelowego połączone pętlą. shrna jest transportowane z jądra do cytoplazmy i ulega degradacji wraz z mrna. Do ekspresji RNAi RNA można zastosować promotory Pol III lub U6. [0204] Cząsteczki pośredniczące w RNAi to dwuniciowe RNA (dsrna), które ma homologię do specyficznych sekwencji "docelowych" mrna (Caplen i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 98: , 2001). Badania biochemiczne na lizatach bezkomórkowych muszki owocówki wskazują, że zależnymi od RNA mediatorami wyciszania genów są nukleotydowe dupleksy małego interferującego RNA (sirna). W związku z powyższym, cząsteczki sirna są korzystnie używane w metodach przedstawionych w niniejszym ujawnieniu. sirna wywodzą się z przetwarzania dsrna przez RNasę znaną jako DICER (Bernstein i wsp., Nature 409: , 2001). Okazuje się, że produkty dupleksu sirna są włączane do wielobiałkowego kompleksu sirna określanego jako RISC (kompleks wyciszający indukowany przez RNA). Bez ograniczania się przez 49

51 jakiejkolwiek teorię, uważane jest, że kompleks RISC jest naprowadzany na docelowe mrna, w którym dupleks sirna wchodzi w specyficzną dla sekwencji interakcję w celu pośredniczenia w reakcji cięcia w sposób charakterystyczny dla katalizy (Bernstein i wsp., Nature 409: , 2001; Boutla i wsp., Curr Biol 11: , 2001). [0205] RNAi było wykorzystane do analizy funkcji genów oraz identyfikacji niezbędnych genów w komórkach ssaków (Elbashir i wsp., Methods 26: , 2002; Harborth i wsp., J Cell Sci 114: , 2001), w tym m. in. przykładowo i bez ograniczania się, w neuronach (Krichevsky i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 99: , 2002). RNAi jest również oceniane pod względem funkcji terapeutycznych, takich jak hamowanie lub blokowanie infekcji, replikacja i/lub wzrost wirusów, w tym bez ograniczeń wirusa polio (Gitlin i wsp., Nature 418: , 2002) i HIV (Capodici i wsp., J Immunol 169: , 2002), oraz zmniejszania ekspresji onkogenów (np. genu bcr-abl; Scherr i wsp., Blood publikacja elektroniczna przed publikacją drukiem, 26 września 2002 r.). RNAi było wykorzystywane do modulacji ekspresji genów w zarodkach ssaków (myszy) i płazów (Xenopus) (odpowiednio Calegari i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 99: , 2002; oraz Zhou, i wsp., Nucleic Acids Res 30: , 2002), u myszy narodzonych (Lewis i wsp., Nat Genet 32: , 2002), oraz w celu zmniejszenia ekspresji transgenów u dorosłych myszy transgenicznych (McCaffrey i wsp., Nature 418:38-39, 2002). Metody określania skuteczności i specyficzność sirna w hodowli komórkowej oraz in vivo zostały opisane (zob. np. Bertrand i wsp., Biochem Biophys Res Commun 296: , 2002; Lassus i wsp., Sci STKE 2002(147):PL13, 2002; oraz Leirdal i wsp., Biochem Biophys Res Commun 295: , 2002). [0206] Cząsteczki pośredniczące w RNAi, w tym bez ograniczeń sirna, mogą być wytwarzane w warunkach in vitro w drodze syntezy chemicznej (Hohjoh, FEBS Lett 521: , 2002), hydrolizy dsrna (Yang i wsp., Proc. Natl Acad Sci USA 99: , 2002), transkrypcji in vitro z polimerazą RNA T7 (Donzeet i wsp., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 99: , 2002) oraz w drodze hydrolizy dwuniciowego RNA przy użyciu nukleazy, takiej jak RNaza III E.coli (Yang i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 99: , 2002). [0207] Cząsteczki sirna mogą być również tworzone przez dwa hybrydyzowane ze sobą oligonukleotydy, zwykle mające następującą strukturę, która zawiera zarówno fragmenty dwuniciowe, jak i jednoniciowe: (wystający koniec) ("Rdzeń" ) (Numer identyfikacyjny sekwencji : 73) (Numer identyfikacyjny sekwencji : 74) (wystający koniec) [0208] Gdzie N, X i Y są nukleotydami; X wiąże się wiązaniem wodorowym z Y; ":" oznacza wiązanie wodorowe pomiędzy dwoma zasadami; x oznacza liczbę całkowitą o wartości od 1 do około 100, a m i n są liczbami całkowitymi mającymi, niezależnie, wartości między 0 i około 100. W niektórych przypadkach N, X i Y stanowią niezależnie A, G, C, T lub U. Mogą być obecne nie występujące naturalnie zasady i nukleotydy, a 50

52 w szczególności w przypadku syntetycznego sirna (np. produkt hybrydyzacji dwóch oligonukleotydów). Dwuniciowa środkowa część odcinka nosi nazwę "rdzenia" i posiada pary zasad (pz) pełniące rolę jednostek miary; jednoniciowe fragmenty to wystające końce (ang. overhangs) posiadające nukleotydy (nt) jako jednostki miary. Pokazane wystające końce to wystające końce 3', ale cząsteczki z wystającymi końcami 5' również wchodzą w zakres niniejszego ujawnienia. Ponadto, w zakres ujawnienia wchodzą cząsteczki sirna bez wystających końców (np. m = 0 i n = 0) oraz te, które mają wystający koniec z jednej strony rdzenia, ale nie z drugiej (np., m = 0 i n 1 lub vice-versa). [0209] Początkowo, wydawało się, że technologia RNAi nie znajdzie powszechnego zastosowania u ssaków. To dlatego, że u ssaków, dsrna aktywuje aktywowaną przez dsrna kinazę białkową (PKR), co skutkuje kaskadą apoptozy i śmiercią komórek (Der et i wsp. Natl. Acad. Sci. USA 94: , 1997). Ponadto, od dawna wiadomo, że dsrna aktywuje kaskadę interferonu w komórkach ssaków, co również może prowadzić do zmiany fizjologii komórek (Colby i wsp., Annu. Rev. Microbiol. 25:333, 1971; Kleinschmidt i wsp., Annu. Rev. Biochem. 41:517, 1972; Lampson i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58L782, 1967; Lomniczi i wsp., J. Gen. Virol. 8:55, 1970; oraz Younger i wsp., J. Bacteriol 92:862, 1966). Jednakże, aktywacja kaskad PKR i interferonu przez dsrna wymaga, aby łańcuch dsrna był dłuższy niż około 30 par zasad. Dla porównania, wykazano, że dsrna o długości mniejszej niż 30 par powoduje RNAi w komórkach ssaków (Caplen i wsp., Proc. Natl Acad. Sci. USA 98: , 2001). Tak więc, oczekuje się, że niepożądanych i nietypowych skutków związanych z dłuższymi cząsteczkami dsrna można uniknąć wytwarzając krótkie łańcuchy RNA, która zasadniczo nie zawierają dłuższych dsrna. [0210] Odnośniki dotyczące sirna: Bernstein i wsp., Nature 409: , 2001; Boutla i wsp., Curr Biol 11: , 2001; Cullen, Nat Immunol 3: , 2002; Caplen i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 98: , 2001; Hamilton i wsp., Science 286: , 1999; Nagase i wsp., DNA Res. 6:63-70, 1999; Napoli i wsp., Plant Cell 2: , 1990; Nicholson i wsp., Mamm. Genome 13:67-73, 2002; Parrish i wsp., Mol Cell 6: , 2000; Romano i wsp., Mol Microbiol 6: , 1992; Tabara i wsp., Cell 99: , 1999 oraz Tuschl, Chembiochem. 2: , [0211] Paddison i wsp. (Genes & Dev. 16: , 2002) użyli małych cząsteczek RNA o strukturze spinki do włosów jako czynnika pozwalającego uzyskać RNAi. W związku z powyższym, te krótkie cząsteczki RNA o strukturze spinki do włosów (shrna) są również z korzyścią stosowane w metodach według niniejszego ujawnienia. Długość rdzenia i pętli funkcjonalnych shrna jest różna; długości rdzenia mogą mieścić się w przedziale od około 25 do około 30 nukleotydów, natomiast wielkość pętli może wynosić od 4 do 25 nukleotydów bez wpływu na funkcję tłumiącą. Bez zamiaru wiązania się jakąkolwiek szczególną teorią, uważa się, że te shrna przypominają produkty dsrna RNazy białka DICER i w każdym przypadku, mają taką samą zdolność do hamowania ekspresji genu specyficznego. [0212] W niektórych przypadkach niniejszego ujawnienie, shrna jest wyrażane za pomocą wektora lentiwirusowego (pll3.7) jak opisano w Przykładzie 1. [0213] Technologia antysensowna może być wykorzystywana do kontroli ekspresji genów przez antysensowny DNA lub RNA lub przez tworzenie potrójnej helisy. Techniki antysensowne zostały omówione np. w 51

53 Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Tworzenie potrójnej helisy omówiono, na przykład, w Lee i wsp., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney i wsp., Science 241:456 (1988) oraz Dervan i wsp., Science 257:1300 (1991). Metody te oparte są na wiązaniu polinukleotydu z komplementarnym DNA lub RNA. [0214] Na przykład, kodująca część 5' polinukleotydu, który koduje Sp35 może służyć jako podstawa do konstrukcji oligonukleotydu antysensownego RNA o długości od około 10 do 40 par zasad. Oligonukleotyd DNA skonstruowany jest, aby być komplementarny do regionu genu zaangażowanego w transkrypcję, tym samym zapobiegając transkrypcji i produkcji białka docelowego. Antysensowny oligonukleotyd RNA hybrydyzuje z mrna w warunkach in vivo i blokuje translację cząsteczki mrna na polipeptyd docelowy. [0215] W jednym przypadku, antysensowne kwasy nukleinowe specyficzne dla genu Sp35 są wytwarzane wewnątrzkomórkowo poprzez transkrypcję z sekwencji egzogennej. Przykładowo, wektor lub jego część, jest transkrybowana wytwarzając antysensowny kwas nukleinowy (RNA). Taki wektor może pozostać episomalny lub zostać zintegrowany w chromosomie, o ile może być transkrybowany w celu produkcji pożądanego antysensownego RNA. Wektory takie mogą być konstruowane metodami technologii rekombinacji DNA znanymi w tej dziedzinie. Wektory mogą być plazmidowe, wirusowe lub inne znane w tej dziedzinie i stosowane do replikacji i ekspresji w komórkach kręgowców. Ekspresja cząsteczki antysensownej może być kierowana przez dowolny promotor, o którym wiadomo, że działa w komórkach kręgowców, najlepiej komórek ludzkich, takich jak te, które zostały opisane w innych częściach niniejszego dokumentu. [0216] Absolutna komplementarność cząsteczki antysensownej, choć jest preferowana, nie jest konieczna. Sekwencja komplementarna do co najmniej części RNA kodującego Sp35 oznacza sekwencję mającą wystarczającą komplementarność, aby umożliwić hybrydyzację z RNA oraz utworzenie trwałego dupleksu lub tripleksu, który można oznaczyć. Zdolność do hybrydyzacji będzie zależała zarówno od stopnia komplementarności, jak i o długości antysensownego kwasu nukleinowego. Generalnie, im większy jest hybrydyzujący kwas nukleinowy, tym więcej niedopasowanych zasad może on zawierać tworząc nadal stabilny dupleks (lub tripleks w zależności od przypadku). Specjalista w tej dziedzinie może ustalić dopuszczalny stopień niedopasowania poprzez zastosowanie standardowych procedur w celu określenia punktu topnienia hybrydyzowanego kompleksu. [0217] Oligonukleotydy, które są komplementarne do końca 5' mrna np. nieulegającej translacji sekwencji 5', a w tym do kodonu inicjującego AUG, będą działać najefektywniej w zakresie hamowania translacji. Jednakże, sekwencje komplementarne do nieulegających translacji sekwencji 3' mrna okazały się również skuteczne w zakresie hamowania translacji mrna. Zob. Wagner, R., Nature 372: (1994). Tak więc oligonukleotydy komplementarne w stosunku do nieulegających translacji, niekodujących regionów 5' i 3' mogłyby być stosowane antysensownie w celu zahamowania translacji Sp35. Oligonukleotydy komplementarne w stosunku do nieulegającego translacji regionu 5' mrna powinny zawierać sekwencję komplementarną do kodonu startu AUG. Antysensowne oligonukleotydy komplementarne w stosunku do regionów kodujących mrna są mniej skutecznymi inhibitorami translacji, ale mogłyby być stosowane zgodnie z treścią ujawnienia. Antysensowne kwasy nukleinowe komplementarne do regionów kodujących RNA powinny mieć 52

54 długość co najmniej sześciu nukleotydów i, korzystnie, powinny być oligonukleotydami o długości od 6 do około 50 nukleotydów. W konkretnych aspektach, oligonukleotyd ma co najmniej 10 nukleotydów, co najmniej 17 nukleotydów, co najmniej 25 nukleotydów albo co najmniej 50 nukleotydów długości. [0218] Polinukleotydami przeznaczonymi do stosowania w metodach terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą być DNA lub RNA lub ich chimeryczne połączenia i pochodne lub ich zmodyfikowane wersje, jednoniciowe lub dwuniciowe. Oligonukleotyd może być zmodyfikowany na poziomie ugrupowania zasady, ugrupowanie cukru lub szkieletu fosforanowego, na przykład, w celu zwiększenia stabilności cząsteczki, hybrydyzacji itp. Oligonukleotyd może zawierać inne dołączone grupy, takie jak peptydy (np. w celu nakierowania na receptory komórki gospodarza in vivo) albo środki ułatwiające transport przez błonę komórkową (patrz np. Letsinger i wsp., Proc. Nat. Natl. Acad. Sci. USA 86: (1989); Lemaitre i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci 84: (1987)), Publikacja PCT nr WO88/09810, (publikacja z dnia 15 grudnia 1988) albo barierę krew-mózg (patrz np. publikacja PCT nr WO89/10134, publikacja z dnia 25 kwietnia 1988), wyzwalane przez hybrydyzację środki powodujące rozkład (patrz np. Krol i wsp. BioTechniques 6: (1988)) lub związki interkalacyjne (patrz np. Zon, Pharm. Res. 5: (1988)). W tym celu, oligonukleotyd może być sprzęgany z inną cząsteczką, np. peptydu, wyzwalanego przez hybrydyzację środka ułatwiającego połączenie sieciujące, środka transportującego, wyzwalanego przez hybrydyzację środka powodującego rozkład itp. [0219] Antysensowny oligonukleotyd przewidziany do stosowania w ujawnionych tu metodach terapeutycznych może zawierać co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę zasadową z grupy obejmującej między innymi: 5fluorouracil, 5-bromouracyl, 5-chlorouracil, 5-jodouracil, hipoksantynę, ksantynę, 4-acetylocytozynę, 5- (karboksyhydroksymetylo) uracyl, 5-karboksyhydroksymetylo-2-tiourydynę, 5- karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, beta-d-galaktosylkueozynę, inozynę, N-6- izopentenyloadeninę, 1-metyloguaninę, 1-metylolinozynę, 2,2-dimetyloguaninę, 2-metyloadeninę, 2- metyloguaninę, 3-metylocytozynę, 5-metylocytozynę, N-6-adeninę, 7-metyloguaninę, 5- metyloaminometylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, beta-d-mannosylkueozynę, 5'metoksykarboksymetylouracyl, 5-metoksyuracyl, 2-metyltio-N-6-izopentenyloadeninę, uracyl-5-kwas oksyoctowy (v), wybutoksozyna, pseudouracyl, kueozynę, 2-tiocytozynę, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4- tiouracyl, 5-metylouracyl, ester metylowy kwasu uracyl-5-oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v),, 5- metylo-2-tiouracyl, 3(3-amino-3-N2-karboksypropylo) uracyl, (acp3)w oraz 2,6-diaminopuryna. [0220] Antysensowny oligonukleotyd przeznaczony do stosowania w metodach terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie może zawierać również co najmniej jedno zmodyfikowane ugrupowanie cukrowe wybrane z grupy obejmującej, między innymi arabinozę, 2-fluoro-arabinozę, ksylulozę i heksozę. [0221] W jeszcze innym przypadku, antysensowny oligonukleotyd przeznaczony do stosowania w metodach terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie może zawierać co najmniej jeden zmodyfikowany szkielet fosforanowy wybrany z grupy obejmującej, między innymi, fosforotionian, fosforoditionian, fosforoamidotionian, fosforoamidonian, fosforodiamidonian, metylofosfonian, alkil fosfotriestrowy i formacetal lub ich analogi. 53

55 [0222] W jeszcze innym przypadku, antysensownym oligonukleotydem przeznaczonym do stosowania w metodach terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie może być α-anomeryczny oligonukleotyd. α-anomeryczny oligonukleotyd tworzy specyficzne dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA, w którym, w przeciwieństwie do zwykłej sytuacji, nici biegną równolegle do siebie (Gautier i wsp., Nucl. Acids Res. 15: (1987)). Oligonukleotydem tym jest 2'-0-metylorybonukleotyd (Inoue i wsp., Nucl. Acids Res. 15: (1987)) lub chimeryczny analog RNA-DNA (Inoue i wsp., FEBS Lett.. 215: (1987)). [0223] Polinukleotydy według niniejszego ujawnienia mogą być syntetyzowane standardowymi metodami znanymi w tej dziedzinie techniki np. przy użyciu automatycznego syntezatora DNA (takiego, jakie są dostępne w handlu z Biosearch, Applied Biosystems itd.). Przykładowo, oligonukleotydy fosforotionianowe mogą być syntetyzowane metodą eg. Stein i wsp. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), oligonukleotydy metylofosfonianowe mogą być preparowane przy zastosowaniu szkła o kontrolowanej porowatości (Sarin i wsp., Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 55: (1988)) itd. [0224] Kompozycje polinukleotydowe przeznaczony do stosowania w metodach terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą ponadto zawierać katalityczne RNA lub rybozym (patrz np. międzynarodowa publikacja PCT WO 90/11364, opublikowana 4 października 1990; Sarver i wsp., Science 247: (1990). Zaleca się stosowanie rybozymów hammerhead. Rybozymy hammerhead rozszczepiają rnr- NA w miejscach określonych przez regiony flankujące, które tworzą komplementarne pary zasad z docelowym mrna. Jedynym wymogiem jest to, aby docelowe mrna miały następującą sekwencję dwóch zasad: 5'-UG-3'. Konstrukcja i wytwarzanie rybozymów hammerhead jest dobrze znane w tej dziedzinie i zostało opisane bardziej szczegółowo w Haseloff i Gerlach, Nature 334: (1988). Korzystnie, rybozym jest zbudowany w taki sposób, że zidentyfikowane miejsce cięcia znajduje się w pobliżu końca 5' docelowego mrna; tzn. w celu zwiększenia efektywności i minimalizacji wewnątrzkomórkowej akumulacji niefunkcjonalnych transkryptów mrna. [0225] Tak jak w przypadku metody antysensownej, rybozymy przeznaczone do stosowania w metodach diagnostycznych i terapeutycznych ujawnionych w niniejszym dokumencie mogą być zbudowane z modyfikowanych oligonukleotydów (np. w celu zwiększenia stabilności, ukierunkowania, itp.) oraz mogą być dostarczane do komórek w których zachodzi ekspresja Sp35 in vivo. Konstrukty DNA kodujące rybozym mogą być wprowadzone do komórki w taki sam sposób, jak opisano powyżej w odniesieniu do wprowadzenia antysensownego DNA kodującego. Preferowaną metodą uzyskania tego rezultatu jest zastosowanie konstruktu DNA "kodującego" rybozym pod kontrolą silnego promotora konstytutywnego, na przykład promotora pol III lub pol II, aby komórki transfekowane produkowały wystarczające ilości rybozymu w celu zniszczenia endogennych przekaźnikowych mrna kodujących Sp35 i zahamowania translacji. Ponieważ rybozymy, w odróżnieniu od cząsteczek antysensowych, są katalityczne, w celu zapewnienia wydajności wymagane jest niższe stężenie wewnątrzkomórkowe. Wektory [0226] Wektory zawierające kwasy nukleinowe kodujące antagonistów Sp35 również mogą być stosowane do wytwarzania antagonistów przeznaczonych do stosowania w sposobach według niniejszego ujawnienia. 54

56 Wybór wektora i sekwencji kontrolnych ekspresji, z którymi takie kwasy nukleinowe są funkcjonalnie połączone zależy od pożądanych właściwości funkcjonalnych np. ekspresji białka oraz komórki gospodarza która ma być transformowana. [0227] Elementy kontroli ekspresji stosowane do regulacji ekspresji związanych z nimi funkcjonalnie sekwencji kodujących są znane w tej dziedzinie techniki. Przykłady obejmują między innymi promotory indukowalne, promotory konstytutywne, sygnały sekrecji i inne elementy regulacyjne. W przypadku zastosowania promotora indukowalnego, może on być kontrolowany, na przykład przez zmianę składników pożywki lub zmianę temperatury, w środowisku komórki gospodarza. [0228] Wektor może zawierać replikon prokariotyczny, to jest sekwencję DNA posiadającą zdolność do kierowania autonomiczną replikacją i utrzymywania cząsteczki rekombinowanego DNA poza chromosomami w bakteryjnej komórce gospodarza. Takie replikony są dobrze znane w tej dziedzinie techniki. Ponadto, wektory, które zawierają prokariotyczny replikon mogą również zawierać gen, którego ekspresja powoduje przeniesienie wykrywalnego znacznika takiego jak odporność na leki. Przykładem genów bakteryjnych przenoszących odporność na leki są geny przenoszące odporność na ampicylinę lub tetracyklinę. [0229] Wektory zawierające replikon prokariotyczny mogą również zawierać promotor prokariotyczny lub bakteriofagowy kierujący ekspresją sekwencji genu kodującego w komórce bakteryjnego gospodarza. Sekwencje promotora zgodne z gospodarzami bakteryjnymi są zazwyczaj zawarte w wektorach plazmidowych zawierających miejsca restrykcyjne dogodne do wstawienia segmentu DNA, który ma zostać poddany ekspresji. Przykładami takich wektorów plazmidowych są puc8, puc9, pbr322 i pbr329 (BioRad), ppl i pkk223 (Pharmacia). W celu ekspresji cząsteczki rekombinowanego DNA kodującego białko stosowane w sposobach przedstawionych w niniejszym ujawnieniu można użyć dowolnego odpowiedniego gospodarza prokariotycznego. [0230] Na potrzeby niniejszego ujawnienia, można stosować wiele systemów wektorów ekspresyjnych. Na przykład, wektor jednej z klas wykorzystuje elementy DNA pochodzące od wirusów zwierzęcych np. bydlęcego wirusa brodawczaka, wirusa polyoma, adenowirusa, wirusa krowianki, bakulowirusa, retrowirusów (RSV, MMTV lub MOMLV) lub wirusa SV40. Inne zakładają wykorzystanie systemów policistronowych z wewnętrznymi miejscami wiązania rybosomów. Dodatkowo, komórki które mają DNA zintegrowane w swoich chromosomach mogą zostać wybrane przez wprowadzenie jednego lub więcej markerów umożliwiających wybór transfekowanych komórek gospodarza. Marker może zapewniać prototroficzność dla auksotroficznego gospodarza, oporność na biocyd (np. antybiotyk) lub odporności na metale ciężkie takie jak miedź. Gen markera selekcyjnego może być bezpośrednio powiązany z sekwencjami DNA, które mają zostać wyrażone albo wprowadzony do tej samej komórki w drodze kotransformacji. Gen fosfotransferazy neomycyny (neo) stanowi przykład genu markera selekcyjnego (Southern i wsp., J. MoI. Anal. Genet. 1: (1982)). Optymalna synteza mrna może wymagać obecności dodatkowych elementów. Elementy te mogą zawierać sekwencje sygnałowe, sygnały splicingowe jak i promotory transkrypcyjne, wzmacniacze i sygnały terminacji. [0231] W jednym przypadku, zastosowany może być wektor ekspresyjny zastrzeżony przez Biogen IDEC, Inc. zwany NEOSPLA (patent amerykański nr ). Wektor ten zawiera promotor/wzmacniacz cytome- 55

57 galowirusa, główny promotor mysiej beta globiny, miejsce inicjacji replikacji SV40, sekwencję poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu, eksony 1 i 2 fosfotransferazy neomycyny, gen reduktazy dihydrofolianowej i sekwencję lidera. Stwierdzono, iż wektor ten powoduje bardzo wysoki wzrost poziomu ekspresji po transfekcji do komórek CHO, po którym następuje selekcja na pożywce zawierającej G418 oraz amplifikacja z zastosowaniem metotreksatu. Oczywiście w niniejszym ujawnieniu można zastosować każdy wektor ekspresyjny, który jest zdolny do wywołania ekspresji w komórkach eukariotycznych. Do przykładów odpowiednich wektorów należą, między innymi, plazmidy pcdna3, phcmv/zeo, pcr3.1, pef1/his, pind/gs, prc/hcmv2, psv40/zeo2, ptracer-hcmv, pub6/v5-his, pvaxl oraz pzeosv2 (dostępne od Invitrogen, San Diego, CA) oraz plazmid PCI (dostępny od Promega, Madison, WI). Dodatkowe wektory ekspresyjne komórek eukariotycznych są znane w dziedzinie i są dostępne w handlu. Zazwyczaj, wektory takie zawierają miejsca restrykcyjne dogodne do wprowadzenia żądanego segmentu DNA. Do przykładów wektorów należą psvl i pksv-10 (Pharmacia), pbpv-1, pm12d (International Biotechnologies), ptdt1 (ATCC 31255), retrowirusowy wektor ekspresyjny pmig i pll3.7, adenowirusowy wektor wahadłowy pdc315 i wektory AAV. Inne przykładowe układy wektorowe zostały ujawnione, np. w opisie patentowym US [0232] Ogólnie, przesiewanie dużych ilości transformowanych komórek w celu uzyskania tych, które wyrażają odpowiednio wysokie poziomy antagonisty jest rutynową czynnością, która może być wykonana przez, na przykład, zrobotyzowane systemy. [0233] Do często stosowanych sekwencji regulacyjnych ekspresji w ssaczych komórkach gospodarza należą elementy wirusowe kierujące wysokimi poziomami ekspresji białka w komórkach ssaków, takie jak promotory i wzmacniacze pochodzące z retrowirusowych LTR, wirusa cytomegalii (CMV) (takie jak promotor/wzmacniacz CMV), małpiego wirusa 40 (SV40) (takie jak promotor/wzmacniacz SV40), adenowirusa, (np. główny późny promotor adenowirusa (AdmIP)) poliomy oraz silne promotory ssaków takie jak promotory natywnej immunoglobuliny i aktyny. Aby uzyskać dalszy opis wirusowych elementów regulacyjnych i ich sekwencji patrz np. Stinski, amerykański opis patentowy nr ; Bell, amerykański opis patentowy nr ; oraz amerykański opis patentowy nr [0234] Rekombinowane wektory ekspresyjne mogą przenosić sekwencje regulujące replikację wektora w komórkach gospodarza (np. początki replikacji) i genów markerów selekcyjnych. Gen markera selekcyjnego umożliwia selekcję komórek gospodarza, do których wprowadzono wektor (patrz np. Axel, amerykańskie opisy patentowe nr , oraz Na przykład, gen markera selekcyjnego przenosi oporność na lek, np. G418, higromycynę lub metotreksat, na komórki gospodarza, do których wprowadzono wektor. Do najczęściej stosowanych genów markera selekcyjnego należą gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do stosowania w komórkach gospodarza -dhfr z selekcją/amplifikacją metotreksatu) oraz neo gen (do selekcji G418). [0235] Wektory kodujące antagonistów Sp35 mogą służyć do transformacji odpowiedniej komórki gospodarza. Transformację można przeprowadzić dowolnym odpowiednim sposobem. Metody wprowadzania egzogennego DNA do komórek ssaków są również znane w tej dziedzinie i obejmują transfekcję za pośrednictwem dekstranu, wytrącanie fosforanem wapnia, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, kapsułkowanie polinukleotydów w liposomach oraz bezpośrednią mikroiniekcję DNA do ją- 56

58 dra. Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być wprowadzane do komórek ssaków za pomocą wektorów wirusowych. [0236] Transformacja komórek gospodarza może zostać osiągnięta za pomocą konwencjonalnych metod dopasowanych do używanego wektora oraz komórki gospodarza. W transformacji komórek prokariotycznych gospodarza, można stosować elektroporację oraz inne metody z zastosowaniem soli (Cohen i wsp., Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. USA 69: (1972)). W transformacji komórek kręgowców, można stosować elektroporację, metody transformacji z zastosowaniem lipidów kationowych lub solią. Patrz np. Graham i wsp., Virology 52: (1973); Wigler i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: (1979). [0237] Najkorzystniej jest, jeśli linia komórek gospodarza stosowana do ekspresji białka pochodzi od ssaków; uznaje się, że fachowcy w tej dziedzinie posiadają zdolność określenia specyficznych korzystnych linii komórkowych gospodarza, które najlepiej nadają się do wyrażenia w nich pożądanego genu. Do przykładowych linii komórek gospodarza należą między innymi komórki NSO, SP2, komórki nerek noworodka chomika (BHK), komórki nerki małpy (COS), komórki ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (np. Hep G2), komórki A549, DG44 i DUXB11 (linie komórek jajnika chomika chińskiego, DHFR minus), HELA (komórki ludzkiego raka szyjki macicy), CVI (linia komórek nerki małpy), COS (pochodna CVI z antygenem T SV40), R1610 (fibroblasty chomika chińskiego) BALBC/3T3 (fibroblasty myszy), HAK (linia komórek nerek chomika), SP2/O (szpiczak myszy), P3x63-Ag3.653 (szpiczak myszy), BFA-1c1BPT (komórki śródbłonka bydła), RAJI (ludzkie limfocyty) i 293 (komórki ludzkiej nerki). Linie komórek gospodarza są zazwyczaj dostępne w usługach handlowych, od Amerykańskiej Kolekcji Hodowli Tkanek lub z opublikowanej literatury. [0238] Ekspresja polipeptydów z linii komórkowych może być wzmacniana za pomocą znanych technik. Na przykład, system syntetazy glutaminowej (GS) jest powszechnie stosowane w celu zwiększenia ekspresji w określonych warunkach. Patrz np., europejskie opisy patentowe nr , i oraz europejskie zgłoszenie patentowe nr Komórki gospodarza [0239] Komórki gospodarza służące do ekspresji antagonisty Sp35 do stosowania w metodach według niniejszego ujawnienia mogą być prokariotyczne lub eukariotyczne. Do przykładowych eukariotycznych komórek gospodarza należą miedzy innymi drożdże oraz komórki ssaków np. komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) (nr dostępu ATCC CCL61), komórki embrionalne myszy NIH NIH-3T3 (nr dostępu ATCC CRL1658) i komórki nerek noworodka chomika (BHK). Do innych przydatnych eukariotycznych komórek gospodarza należą komórki owadów i komórki roślinne. Do przykładowych komórek prokariotycznych gospodarzy należą E. coli oraz Streptomyces. Terapia genowa [0240] Antagonistę Sp35 można produkować u ssaków in vivo np. u ludzkiego pacjenta przy użyciu terapii genowej w ramach leczenia chorób, zaburzeń lub urazów układu nerwowego, w którym przyczynianie się do przeżywalności, proliferacji i różnicowania oligodendrocytów lub sprzyjanie mielinizacji neuronów byłoby terapeutycznie korzystne. Terapia ta polega na podaniu odpowiedniego antagonisty Sp35 kodującego kwas 57

59 nukleinowy funkcjonalnie połączonego z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję. Zwykle, sekwencje te są wprowadzone do wektora wirusowego. Do wektorów wirusowych odpowiednich do takiej terapii genowej zalicza się wektor adenowirusowy, wektor alfawirusowy, wektor enterowirusowy, wektor pestiwirusowy, wektor lentiwirusowy, wektor bakulowirusowy, wektor herpeswirusowy, wektor wirusa Epsteina- Barra, wektor papowawirusowy, wektor poksywirusowy, wektor wirusowy krowianki, wektor wirusa skojarzonego z adenowirusami oraz wektor wirusa opryszczki. Wektor wirusowy może być wektorem wirusowym o wadliwej replikacji. Zazwyczaj stosowane są wektory adenowirusowe zawierające delecję w swoich genach E1 lub E3. Gdy stosuje się wektor adenowirusowy, wektor ten zazwyczaj nie zawiera genu wybieralnego markera. Kompozycje farmaceutyczne [0241] Antagonisty Sp35 przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia mogą przyjmować formę kompozycji farmaceutycznych do podawania ssakom, w tym ludziom. Kompozycje farmaceutyczne przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia obejmują dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, w tym np. wymieniacze jonowe, tlenek glinu, stearynian glinu, lecytynę, białka surowicy, takie jak albumina surowicy ludzkiej, substancje buforujące, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasu, mieszaniny częściowe glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, wodę, sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy, wodorofosforan disodu, wodorofosforan potasu, chlorek sodu, sole cynku, krzemionka koloidalna, trikrzemian magnezu, poliwinylopirolidon, substancje oparte na celulozie, glikol polietylenowy, karboksymetyloceluloza sodowa, poliakrylany, woski, polimery blokowe polietylen-polioksypropylen, glikol polietylenowy i lanolinę. [0242] Kompozycje przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia mogą być podawane dowolną odpowiednią metodą np. pozajelitowo, dokomorowo, doustnie, przez inhalację pyłu, miejscowo, doodbytniczo, donosowo, dopoliczkowo, dopochwowo lub przez wszczepiony zbiorniczek. Termin "pozajelitowo" w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje techniki wstrzyknięć lub infuzji podskórnych, dożylnych, domięśniowych, wewnątrz-stawowych, wewnątrzmaziówkowych, domostkowych, dooponowych, doogniskowych, wewnątrzwątrobowych i doczaszkowych. Jak opisano wcześniej, antagonisty Sp35 do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia działają w układzie nerwowym, wspierając przeżywalność, proliferację i różnicowanie oligodendrocytów, jak i mielinizację neuronów. W związku z powyższym, w metodach według niniejszego ujawnienia, antagonisty Sp35 są podawane w taki sposób, żeby przechodzić przez barierę krew-mózg. Przejście przez tę barierę może być możliwe dzięki właściwościom fizycznochemicznym samej cząsteczki antagonisty Sp35, innym składnikom kompozycji farmaceutycznej lub zastosowaniu urządzenia mechanicznego, takiego jak igła, kaniula lub narzędzie chirurgiczne do penetracji bariery krew-mózg. W przypadku, gdy antagonistą Sp35 jest cząsteczka, która samoistnie nie przechodzi przez barierę krew-mózg, np. w fuzji z ugrupowaniem ułatwiającym przejście, odpowiednimi metodami podawania są np. metody dooponowa i wewnątrzczaszkowa, np. bezpośrednio w miejsce przewlekłego uszkodzenia spowodowanego przez MS. W przypadku, gdy antagonistą Sp35 jest cząsteczka, która samoistnie przechodzi przez barierę krew-mózg, metodą podawania może być jeden lub kilka różnych sposobów opisanych poniżej. 58

60 [0243] Sterylne formy wstrzykiwania kompozycji stosowane w sposobach według niniejszego ujawnienia obejmują zawiesiny wodne lub olejowe. Zawiesiny te mogą być wytwarzane zgodnie z technikami znanymi w dziedzinie, przy zastosowaniu odpowiednich środków dyspergujących lub zwilżających oraz środków zawiesinowych. Sterylnym preparatem do iniekcji może być również sterylny roztwór lub zawiesina do wstrzykiwania w nietoksycznym dopuszczalnym pozajelitowo rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, np. w postaci zawiesiny w 1,3-butanodiolu. Do dopuszczalnych podłoży i rozpuszczalników, które można stosować zalicza się wodę, roztwór Ringera oraz izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto sterylne oleje roślinne są stosowane konwencjonalnie jako rozpuszczalnik lub środek rozpraszający. W tym celu, stosowany może być dowolny łagodny ciekły olej, w tym syntetyczne mono- lub di- glicerydy. Kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy i jego pochodne glicerydowe są przydatne do wytwarzania preparatów do iniekcji, podobnie jak naturalne farmaceutycznie dopuszczalne oleje, takie jak olej z oliwek lub olej rycynowy, zwłaszcza w ich polioksyetylowanych wersjach. Takie olejowe roztwory lub zawiesiny mogą także zawierać długołańcuchowy alkoholowy rozcieńczalnik lub środek dyspergujący, taki jak karboksymetyloceluloza lub podobne środki dyspergujące, które są powszechnie używane do wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych postaci dozowania, w tym emulsji i zawiesin. Inne powszechnie stosowane środki powierzchniowo czynne, takie jak Tween, Span i inne czynniki emulgujące lub środki zwiększające biodostępność, które są powszechnie stosowane do wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych stałych, ciekłych lub innych postaci dawkowania mogą być również stosowane na potrzeby sformułowania preparatu. [0244] Preparaty podawane pozajelitowo mogą być podawane w formie pojedynczej dawki w bolusie, bolusa infuzyjnego lub ładowanego, po którym następuje podanie dawki podtrzymującej. Kompozycje te mogą być podawane w określonych stałych lub zmiennych odstępach czasu, np. raz na dziennie albo "w zależności od potrzeb". [0245] Kompozycje farmaceutyczne przewidziane do wykorzystania w metodach według niniejszego ujawnienia mogą być podawane doustnie w postaci dopuszczalnych dawek, w tym np. w formie kapsułek, tabletek, wodnej zawiesiny lub roztworu. Niektóre kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane również w formie aerozolu donosowego lub inhalacji. Takie kompozycje można wytwarzać w postaci roztworów w soli fizjologicznej, stosując alkohol benzylowy lub inne odpowiednie środki konserwujące, promotory absorpcji do zwiększenia biodostępności i/lub inne konwencjonalne środki rozpuszczające lub dyspergujące. [0246] Ilość antagonisty Sp35, którą można połączyć z nośnikami w celu otrzymania pojedynczej postaci dawkowania będzie się zmieniać w zależności od leczonej komórki, rodzaju stosowanego antagonisty oraz sposobu podawania. Kompozycja może być podawana w postaci pojedynczej dawki, wielu dawek lub przez ustalony okres czasu w infuzji. Schematy dawkowania mogą również być dostosowane w sposób zapewniający optymalną pożądaną reakcję (np. reakcję terapeutyczną lub profilaktyczną). [0247] Metody przedstawione w niniejszym ujawnieniu wykorzystują "terapeutycznie skuteczną ilość" lub "profilaktycznie skuteczną ilość" antagonisty Sp35. Takie terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczne ilości mogą różnić się w zależności od czynników, takich jak stan choroby, wiek, płeć i waga osobnika. Terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną ilością jest też taka, w której żadne toksyczne lub szkodliwe efekty nie przeważają nad terapeutycznie korzystnymi efektami. 59

61 [0248] Konkretne dawkowanie i schemat leczenia dla konkretnego pacjenta będą zależne od wielu czynników, w tym w szczególności od zastosowanego antagonisty Sp35, wieku pacjenta, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci i diety, oraz czasu podawania, szybkości wydalania, kombinacji leków i stanu zaawansowania leczonej danej choroby. Osąd takich czynników przez opiekunów medycznych wchodzi w zakres podstawowych umiejętności w tej dziedzinie techniki. Ilość ta będzie również zależeć od konkretnego leczonego pacjenta, drogi podania, rodzaju preparatu, cech zastosowanego związku, zaawansowania choroby i pożądanego efektu. Użyta ilość może być określona przy zastosowaniu zasad farmakologicznych i farmakokinetycznych znanych w tej dziedzinie techniki. [0249] W ujawnionych sposobach, antagonisty Sp35 są ogólnie podawane bezpośrednio do układu nerwowego, doczaszkowo lub dooponowo, np. w do przewlekłej zmiany spowodowanej przez SM. Kompozycje do podawania według metod określonych w niniejszym ujawnieniu mogą zostać sporządzone w taki sposób, aby dzienna dawka antagonistycznego polipeptydu Sp35 wynosiła 0, mg/kg masy ciała. W niektórych przypadkach niniejszego ujawnienia, dawka wynosi od 0,01-1,0 mg/kg masy ciała dziennie. W niektórych przypadkach, dawka wynosi od 0,001-0,5 mg/kg masy ciała dziennie. [0250] W leczeniu przeciwciałem antagonisty Sp35, dawka może wahać się, np. od około 0,0001 do 100 mg/kg, a częściej od 0,01 do 5 mg/kg (np. 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg itp.) masy ciała osobnika. Przykładowo dawki mogą wynosić 1 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała lub wahać się w zakresie 1-10 mg/kg, korzystnie co najmniej 1 mg/kg. Dawki pośrednie w powyższych zakresach również wchodzą w zakres niniejszego ujawnienia. Dawki mogą być podawane osobnikom dziennie, co drugi dzień, cotygodniowo lub według innego harmonogramu określonego na podstawie analizy empirycznej. Przykładowe leczenie obejmuje podawanie leku w wielu dawkach przez długi okres czasu, na przykład przez co najmniej sześć miesięcy. Inne przykładowe systemy leczenia zakładają podawanie raz na dwa tygodnie lub raz na miesiąc lub raz na 3 do 6 miesięcy. Przykładowe schematy dawkowania to: 1-10 mg/kg lub 15 mg/kg przez kolejne dni, 30 mg/kg co drugi dzień lub 60 mg/kg co tydzień. W niektórych metodach, co najmniej dwa przeciwciała monoklonalne o różnej specyficzności wiązania są podawane jednocześnie, w którym to przypadku dawki każdego z podawanych przeciwciał zawierają się we wskazanym zakresie. [0251] W niektórych przypadkach, pacjent może być leczony z zastosowaniem cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polinukleotyd antagonistyczny do Sp35. Dawki kwasów nukleinowych mieszczą się w zakresie od około 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 µg do 10 mg lub µg DNA na pacjenta. Dawki infekcyjnych wektorów wirusowych mieszczą się w zakresie od , lub więcej wirionów na dawkę. [0252] Uzupełniające związki aktywne mogą być również włączone do kompozycji stosowanych w sposobach określonych w niniejszym ujawnieniu. Na przykład, rozpuszczalny polipeptyd Sp35 lub białko fuzyjne może być łączone z co najmniej jednym dodatkowym środkiem terapeutycznym i/lub podawane równocześnie z nim. [0253] Ujawnienie obejmuje dowolny odpowiedni sposób dostarczania antagonisty Sp35 do wybranej tkanki docelowej, w tym w postaci iniekcji bolusa wodnego roztworu lub wszczepienia układu kontrolowanego uwalniania. Zastosowanie implantu kontrolowanego uwalniania zmniejsza potrzebę powtarzania zastrzyków. 60

62 [0254] Antagonisty Sp35 stosowane w sposobach według niniejszego ujawnienia mogą być podawane bezpośrednio do mózgu w drodze infuzji. Znane są różne implanty stosowane do bezpośredniej infuzji związków do mózgu i są one skuteczne w dostarczaniu związków terapeutycznych u ludzkich pacjentów z zaburzeniami neurologicznymi. Należą do nich implanty zapewniające przewlekłą infuzję do mózgu za pomocą pompy, wszczepione stereotaktycznie tymczasowe śródmiąższowe cewniki, implanty stałych cewników wewnątrzczaszkowych oraz wszczepiane chirurgicznie implanty ulegające biodegradacji. Patrz np. Gill i wsp., jak wyżej; Scharfen i wsp., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4): (1992); Gaspar i wsp., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5): (1999); rozdział 66, str , Bellezza i wsp., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," w Gildenberg i wsp., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); oraz Brem i wsp., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU- Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J. Neuro-Oncology 26: (1995). [0255] Zestawy składników mogą także zawierać antagonisty Sp35 rozproszone w biokompatybilnym materiale nośnym, który funkcjonuje jako odpowiedni system dostaw lub wsparcia dla związków. Do odpowiednich przykładów nośników do przedłużonego uwalniania należą półprzepuszczalne matryce polimerowe w postaci ukształtowanych artykułów takich jak czopki lub kapsułki. Wszczepialne lub mikrokapsularne matryce przedłużonego uwalniania obejmują polilaktydy (opisy patentowe nr US , EP 58481), kopolimery kwasu L-glutaminowego i gamma-etylo-l-glutaminianu (Sidman i wsp., Biopolymers 22: (1985)); poli(2-hydroksyetylo-metakrylan), poli(etylen-co-octan winylu (Langer i wsp., J. Biomed. Mater. Res. 15: (1981); Langer, Chem. Tech. 12: (1982)) lub kwas poli-d-(-) -3 hydroksymasłowy (EP ). [0256] W niektórych przypadkach ujawnienia, antagonistę Sp35 podaje się pacjentowi w drodze bezpośredniej infuzji w odpowiedni region mózgu. Patrz np. Gill i wsp. "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: (2003). Dostępne są alternatywne metody, które mogą być stosowane do podawania antagonisty Sp35 według niniejszego ujawnienia. Na przykład, stereotaktyczna implantacja cewnika lub implantu może zostać przeprowadzona za pomocą systemu Riecherta-Mundingera oraz uniwersalnego systemu lokalizacji ZD (Zamorano i Duchovnego). Tomografia komputerowa (CT) z kontrastem, wstrzyknięcie 120 ml Omnipaque, 350 mg jodu/ml, grubość plastra 2 mm, umożliwia trójwymiarowe wielopłaszczyznowe planowanie leczenia (STP, Fischer, Freiburg, Niemcy). Urządzenie to pozwala na planowanie na podstawie badań rezonansem magnetycznym, wykorzystując równocześnie informacje pochodzące z badań CT i MRI w celu wyraźnego potwierdzenia informacji o miejscu docelowym. [0257] System stereotaktyczny Leksella (Downs Surgical, Inc, Decatur, GA) zmodyfikowany do współpracy ze skanerem TK firmy GE (General Electric Company, Milwaukee, WI), jak również system stereotaktyczny Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) mogą być stosowane w tym celu. Tak więc, rano w dniu wszczepienia, okrągły pierścień podstawy ramy stereotaktycznej BRW może zostać przytwierdzony do czaszki pacjenta. Kolejne obrazy seryjne TK można uzyskać w odstępach co 3 mm w regionie (tkance docelowej),w którym grafitowy pręt ramy lokalizatora jest przymocowany do podstawy. Skomputeryzowany pro- 61

63 gram planowania leczenia można uruchomić na komputerze VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, MA), korzystając ze współrzędnych TK z obrazów pręta grafitowego, w celu odwzorowania między przestrzenią TK a przestrzenią BRW. [0258] Opisane w niniejszym dokumencie metody leczenia zaburzeń demielinizacji lub dysmielnizacji są zazwyczaj testowane in vitro, a następnie in vivo w akceptowanym modelu zwierzęcym, pod kątem żądanego działania terapeutycznego lub profilaktycznego, przed zastosowaniem u ludzi. Odpowiednie modele zwierzęce, w tym zwierzęta transgeniczne, są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie techniki. Przykładowo, testy in vitro mające na celu zademonstrowanie efektu antagonistów Sp35 na różnicowanie i przeżywalność zostały opisane w niniejszym dokumencie. Oddziaływanie antagonistów Sp35 na mielinizację aksonów można zbadać in vitro w sposób opisany w Przykładach. I wreszcie, badania in vivo można przeprowadzić tworząc myszy transgeniczne, które wyrażają antagonistę Sp35 lub przez podanie antagonisty Sp35 myszom i szczurom w modelach opisanych w niniejszym dokumencie. Przykłady Przykład 1 Sp35 Odgrywa rolę w biologii oligodendrocytów [0259] Oligodendrocyty dojrzewają w kilku etapach rozwoju od komórek progenitorowych A2B5 (które wyrażają A2B5), które przeobrażają się w oligodendrocyty przedmielinizacyjne (które wyrażają O1 i O4) i wreszcie w dojrzałe oligodendrocyty mielinizacyjne (które wyrażają O1, O4 i MBP). Tak więc, na podstawie monitorowania obecności i nieobecności markerów A2B5, O1, O4 i MBP można określić stadium rozwoju danej komórki i ocenić rolę Sp35-Fc w biologii oligodendrocytów. Ogólny opis biologii oligodendrocytów został przedstawiony np. w Baumann i Pham-Dinh, Physiol. Rev. 81: (2001). [0260] Przeciwciała monoklonalne przeciwko O4, MBP oraz CNPase zostały pozyskane od Sternberger Monoclonals; przeciwciało przeciw APC (klon CC-1; nr 29) zostało pozyskane od Calbiochem. Pozostałe przeciwciała przeciw tubulinie βiii (Covance), Sp35 (Bio gen Idec), Fyn (Santa Cruz Biotechnology) oraz fosfo- Fyn (Biosource). Przeciwciała monoklonalne przeciwko A2B5 są dostępne od Chemicon. Sp35 jest wyrażane w oligodendrocytach. [0261] Ekspresja Sp35 w oczyszczonym szczurzym neuronie P13 CG, oligodendrocycie P2 i kulturach astrocytów P4 została przeanalizowana w drodze reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). W celu wyodrębnienia mrna z komórek mózgu szczura zastosowano zestaw firmy Ambion, Inc., przestrzegając instrukcji producenta. Reakcja RT-PCR metodą półilościową została przeprowadzona z użyciem startera przedniego 5' AGAGACATGCGATTGGTGA 3' (Numer identyfikacyjny sekwencji: 38) oraz startera wstecznego 5' AGAGATGTAGACGAGGTCATT 3' (Numer identyfikacyjny sekwencji: 39) wykazała wysoki poziom ekspresji w neuronach, niższy poziom ekspresji w oligodendrocytach oraz brak ekspresji w astrocytach. (Rys. 5) 62

64 [0262] Ekspresję Sp35 w oligodendrocytach potwierdzono przez hybrydyzację in situ w odcinkach pochodzących z nerwu wzrokowego dorosłych szczurów. Odcinki nerwu wzrokowego u szczurów zostały przygotowywane i przetworzone w sposób opisany w Mi i wsp. "Sp35 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex," Nat. Neurosci. 7: (2004) i poddane sondowaniu antysensownymi lub sensownymi Sp35 RNA oznaczonymi digoksygeniną przy zastosowaniu pierwszych 500 nukleotydów z sekwencji kodującej Sp35. Skrawki były barwione zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu Zestawu wzmacniającego sygnał tyramidy (Amersham Biosciences) i fluorescencyjnego sprzężonego z digoksygeniną zestawu przeciwciał (Perkin Elmer). W przypadku łączonych analiz in situ i immunofluorescencyjnej, odcinki były najpierw sondowane RNA oznaczonymi digoksygeniną, a następnie przeciwciałami, np. przeciwciałem CC1 (Calbiochem, marker dojrzałych oligodendrocytów) lub przeciwciałem anty-sp35. Stwierdzono, że oligodendrocyty hybrydyzujące z sondą antysensownego Sp35 również barwiły się pod wpływem przeciwciała CC1 (danych nie przedstawiono). Nie stwierdzono swoistego znakowania przy zastosowaniu sensownej sondy Sp35. Ekspresja Sp35 w oligodendrocytach została potwierdzona również w badaniach immunohistochemicznych odcinków tkanek z regionu bocznej komory kory szczura P7. Większość komórek kory oznaczonych przeciwciałem CC1 były również oznaczane przeciwciałem anty-sp35. Danych nie przedstawiono. Swoistość interakcji została potwierdzona przez pre-adsorpcję przeciwciała anty-sp35 przez Sp35-Fc (patrz Przykład 2), co eliminowało sygnał. Knockdown specyficznego dla Sp35 RNAi w ekspresji Sp35 stymuluje wzrost oraz różnicowanie się oligodendrocytów. [0263] Specyficzne dla Sp35 RNAi zostało użyte w celu ablacji ekspresji Sp35 w komórkach prekursorowych oligodendrocytów w celu zbadania, w jaki sposób Sp35 przyczynia się do wzrostu i różnicowania oligodendrocytów komórek prekursorowych oligodendrocytów A2B5 zakażano lentiwirusem zawierającym sekwencję specyficznego dla Sp35 RNAi lub kontrolne RNAi przygotowanym w następujący sposób. [0264] Sekwencje mysiego i szczurzego Sp35 DNA porównano w celu znalezienia homologicznego regionu do użycia jako przyszłe RNA o strukturze spinki do włosów (shrna). CH324, do ekspresji lentiwirusa z Sp35 RNAi, zostało zbudowane przez hybrydyzację oligonukleotydów LV1-035 i LV1-036 oraz ligację z pll3.7 przeciętym przez HpaI i XhoI. Wektor PLL3.7, inne metody oraz produkcja wirusów zostały opisane w Rubinson i wsp., Nat. Genet. 33, (2003). Oligonukleotydy RNAi Sp35 zostały zakupione od MWG i mają następujące sekwencje: LV1-035 (sensowne oligo) 5' TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCT AGCAGGATGACGATCTTTTTTC - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji:40) oraz LV1-036 (antysensowne oligo) 5' TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACT CTCTTGAAGTCTAGCAGGATGACGATCA - 3' (Numer identyfikacyjny sekwencji: 41). 63

65 [0265] Kontrolne RNAi zostało zaprojektowane z zastosowaniem tych samych sekwencji oligonukleotydów z wyjątkiem zmian nukleotydów zaznaczonych małymi literami: 5'- TGATCcTCATcCttCTAtACTTCAAGAGAGTgTAGCAGGATGAcGATCTTTTTTCTCGA-3' (Numer identyfikacyjny sekwencji: 42) oraz 5'- TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTaTAGaAGGATGACGATCA-3'. (Numer identyfikacyjny sekwencji: 43). [0266] Przed wytworzeniem lentiwirusa, DNA z pll3.7 lub kandydata na shrna w pll3.7 kotransfekowano z mysim plazmidem oznakowanym Sp35-HA w stosunku 5 do 1 w komórkach CHO w formie 6- studzienkowej. Knockdown analizowano za pomocą testu western blot specyficznego dla znacznika Sp35- HA w lizatach transfekowanych komórek CHO oraz testu northern blot na całkowitym RNA wypreparowanym z podwójnych studzienek. Membrana byłą inkubowana z sondą zawierającą fragment Sp35 cdna. Testy przeprowadzono 48 godzin po transfekcji. Zgodnie z oczekiwaniami, nastąpiła 10-krotna redukcja Sp35 mr- NA w komórkach CHO poddanych działaniu RNAi CH324 w stosunku do komórek kontrolnych. Danych nie przedstawiono. Lentiwirusy RNAi zawierające zielone białko fluorescencyjne (GFP) wytworzono zgodnie z opisem przedstawionym w Rubinson i wsp. W hodowlach poddanych działaniu kontrolnemu RNAi lub Sp35 RNAi, około 80% oligodendrocytów dało wynik pozytywny dla GFP. Całkowita liczba komórek nie zmieniła się pod wpływem działania RNAi. Aby określić ilościowo wpływ RNAi na różnicowanie, zliczone zostały jedynie oligodendrocyty wyrażające GFP. [0267] Wzbogacone populacje oligodendrocytów samic szczurów Long Evans P2 były hodowane zgodnie z opisem Conn, Meth. Neurosci. 2:1-4 (Academic Press; 1990) z następującymi modyfikacjami. W skrócie, wycięto przodomózgowie i umieszczono je w buforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS; Invitrogen). Tkankę pocięto na 1 mm kawałki i inkubowano w temperaturze 37 C przez 15 minut w 0,01% roztworze trypsyny z dodatkiem 10 µg/ml DNase. Zdysocjowane komórki wysiano na kolbach do hodowli tkankowych pokrytych poli-l-lizyną T75 i hodowano w temperaturze 37 C przez 10 dni w pożywce DMEM z zawartością 20% płodowej surowicy cielęcej (Invitrogen). Prekursory oligodendrocytów (A2B5 + ) zebrano przez potrząsanie kolby w ciągu nocy z prędkością 200 obr/min w temperaturze 37 C, w wyniku czego otrzymano 95% czystej populacji. Hodowle były utrzymywane na podłożu Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokim stężeniu glukozy z FGF/PDGF (10 ng/ml; Peprotech) przez 1 tydzień. Usunięcie FGF/ PDGF umożliwiło różnicowanie się komórek A2B5 + w oligodendrocyty O4 + przedmielinizacyjne po 3-7 dniach oraz różnicowanie się w dojrzałe oligodendrocyty O4 + i MBP + po 7-10 dniach. Te stany różnicowania można było określić w oczywisty sposób na podstawie zmian w morfologii: komórki A2B5 + mają kształt dwubiegunowy, oligodendrocyty przedmielinizacyjne O4 + cechują się dłuższymi i bardziej rozgałęzionymi wypustkami, a dojrzałe oligodendrocyty MBP + zawierają struktury arkuszy mieliny między wypustkami. [0268] Komórki prekursorowe oligodendrocytów A2B5 zostały zakażone lentiwirusem zawierającym CH324 RNAi. Uzyskane komórki hodowano przez 3 dni, a następnie zliczono liczbę oligodendrocytów z dodatnim wynikiem na obecność O4 (markerem różnicowania się oligodendrocytów). Ekspresja endogennego Sp35 zmniejszyła się przez zakażenie lentiwirusem RNAi Sp35 i została potwierdzona w reakcji RT-PCR (fig. 6A). 64

66 Redukcja Sp35 przyniosła skutek w postaci bardziej zróżnicowanych dojrzałych oligodendrocytów w porównaniu z kontrolnie zakażonymi komórkami, co uwidoczniło się przez zwiększenie długości wypustek komórkowych oraz przez obecności obfitych struktur arkuszy mieliny (danych nie przedstawiono). W komórkach, które wyrażały RNAi Sp35 było trzy razy więcej dojrzałych oligodendrocytów (z dodatnim wynikiem testu na O4) niż w kulturach kontrolnych (fig. 6B). Dane te wskazują, że Sp35 może negatywnie regulować różnicowanie się oligodendrocytów. Dominująco-negatywne Sp35 stymuluje wzrost i różnicowanie się oligodendrocytów. [0269] Skonstruowaliśmy wektory lentiwirusowe wyrażające formy Sp35 typu dzikiego oraz dominująconegatywne. Sekwencję DNA kodującego pełną długość mysiego Sp35 (FL-Sp35, reszty aminokwasowe o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 2) amplifikowano przez PCR stosując startery 5' - GAGGATCTCGACGCGGCCGCATGGAGACAGACACACTCCTG - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 44) i 5' GGGGCGGAATTGGATCCTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 45) i wstawiono do wektora lentiwirusowego HRST-IRESeGFP w miejscach NotI i BamHI. Podobnie, sekwencję DNA kodującą dominująco-negatywne Sp35 (DN-Sp35, reszty aminokwasowe o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 2) amplifikowano przy użyciu PCT korzystając ze starterów 5' - GAGGATCTCGACGCGGCCGCATGGAGACAGACACACTCCTG - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 46) i 5' - GATACGGATCCTCAGCCTTTGCCCCGGCTCCATAGAAACAGC-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 47). Plazmidy FL-Sp35 i DN-Sp35 transfekowano do 293 komórek w celu wytworzenia lentiwirusa opisanego przez Rubinsona i wsp. "A lentivirus- based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference," Nat. Genet. 33: (2003). Oligodendrocyty (wytworzone jak opisano w przykładzie 4) zakażano lentiwirusem przy współczynniku zakażenia 2 MOI na komórkę, a ekspresję FL-Sp35 i DN-Sp35 potwierdzono za pomocą testów Western blot. [0270] DN-Sp35 stymulowało różnicowanie oligodendrocytów, skutkując wzrostem produkcji liczby dojrzałych oligodendrocytów. Dla kontrastu, nadekspresja pełnej długości Sp35 (FL-Sp35) miała przeciwny skutek i hamowała różnicowanie, co uwidoczniło się przez zmniejszenie liczby dojrzałych oligodendrocytów w porównaniu z próbka kontrolną (danych nie przedstawiono). Przykład 2 Konstruowanie i oczyszczanie białka fuzyjnego Sp35-Fc [0271] Konstrukt został utworzony poprzez połączenie pozakomórkowej części ludzkiego Sp35 (reszty 1-532) z regionem zawiasu i Fc ludzkiej IgGl, w celu zbadania biologicznej funkcji Sp35. Częściowa sekwencja kodująca ludzkie Sp35 została uzyskana w reakcji PCR z klonu przy użyciu startera przedniego 5'- CAGCAGGTCGACGCGGCCGCATGCTGGCG GGGGGCGT - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 48) oraz startera wstecznego 5'- CAGCAGGTCGACCTCGCCCGGCTGGTTGGCCAACCAGCCGGGCGAGGTCGACCTCGAGG - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 49 ). 65

67 [0272] Produkt PCR o tępym zakończeniu subklonowano w miejsce SrfI wektora PCR SCRIPT AMP (Stratagene), tworząc PCR SCRIPT AMP-Sp35. Fragment Sall wyizolowano z PCR SCRIPT AMP-Sp35 i subklonowano do wektora PCRCAMP Ig (pochodnego wektora PCR SCRIPT AMP, firmy Stratagene). W wektorze PCRCAMP Ig, sekwencja zawiasu i Fc gamma subklonowana jest jako fragment między SalI(5') a NotI(3'). Fragment SalI Sp35 subklonowano do SalI w wektorze PCRCAMP Ig, łącząc w ten sposób sekwencję sygnałową i domenę zewnątrzkomórkową (kodony 1-532) Sp35 z zachowaniem ramki odczytu z sekwencjami kodującymi zawias i region Fc ludzkiej Ig1. Zidentyfikowano prawidłowe izolaty, a fragment NotI, obejmujący fragment Fc Sp35, subklonowano w jedyne miejsce klonowania NotI wektora ekspresyjnego CHO, PV90 (Biogen Idec). Powstały plazmid potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA i nazwano GT123. [0273] Stabilne linie komórkowe wyrażające białko fuzyjne Sp35-Fc zostały utworzone przez elektroporację plazmidu GT123 do komórek gospodarza CHO DG44. Transfekowane komórki CHO były hodowane w alfa minus MEM w obecności 10% dializowanej surowicy i 4 mm glutaminy dla zapewnienia wzrostu niezależnego od nukleozydów. Czternaście dni po transfekcji, komórki otrzymały świeżą pożywkę. W celu przesiania komórek wyrażających Sp35-Fc, komórki CHO zostały oznaczone kozim przeciw-ludzkim IgG oznakowanym fikoerytryną (PE) (Jackson Labs) i poddane cytometrii przepływowej o wysokiej prędkości sortowania w cytometrze FACS Mo-Flo (Cytomation). Wybrane zostały komórki, które wyrażały najwyższe poziomy Sp35-Fc. Komórki namnażano w hodowli przez 7 dni, a następnie ponownie oznakowano i posortowano. Na płytkach zawierających 96 studzienek wyizolowano osobne klony komórek wyrażających najwyższy poziom Sp35-Fc. Klony te hodowano przez dwa tygodnie, a następnie wprowadzono świeżą pożywkę na jeden dzień przed przeprowadzeniem analizy FACS w celu zbadania poziomów ekspresji. Klony, które wyrażały najwyższe poziomy Sp35-Fc zostały namnożone i utworzono banki zamrożonych komórek. Linie komórkowe zostały przystosowane do wzrostu w hodowli zawiesinowej na podłożu niezawierającym surowicy BCM16. Miano Sp35-Fc, wytworzone przez te klony, zostało określone przez hodowlę linii komórkowych w temperaturze 37 C przez 4-5 pasaży, a następnie wzrost komórek do 50% ich maksymalnej gęstości oraz hodowlę przez dni w temperaturze 28 C do chwili spadku gęstości żywotnych komórek do 75%. W tym czasie dokonano zbioru pożywki, oczyszczono ją z komórek i resztek przez odwirowanie i supernatanty hodowli miareczkowano w celu określenia poziomów Sp35-Fc metodą Western blotting przy użyciu przeciwciała przeciw ludzkiemu Ig (Jackson Lab) jako sondy. [0274] Białko fuzyjne Sp35-Fc zostało oczyszczone z wyklarowanej pożywki w następujący sposób: 9 ml 1M HEPES o ph 7,5 dodano do 900 ml kondycjonowanej pożywki. Pożywkę ładowano porcjami przez 3 godziny w temperaturze 4 C na 3 ml Protein A Sepharose (Amersham Bioscience). Żywicę zebrano w kolumnie 1,5 cm (średnica wewnętrzna) i przemyto cztery razy w 3 ml PBS, dwa razy w 4 ml PBS zawierającym 800 mm NaCl, a następnie ponownie w 3 ml PBS. Sp35-Fc wyeluowano z kolumny za pomocą 25 mm NaH 2 PO 4 o ph 2,8 i 100 mm NaCl w 1,5 ml frakcjach i zobojętniono przez dodanie 75 µl 0,5 M NaH 2 PO 4 o ph 8,6. Frakcje zawierające maksymalną ilość białka zidentyfikowano mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm, połączono i poddano dalszemu oczyszczaniu na kolumnie zawierającej 1 ml białka A. Przed załadowaniem dodano 600 mm NaCl oraz 50 mm HEPES o ph 7,5. Kolumnę przemyto dwukrotnie za pomocą 600 µl 10 mm HEPES o ph 7,5 i 1 M NaCl, a następnie 1 ml PBS. Sp35-Fc wyeluowano z kolumny za pomocą 25 mm NaH 2 PO 4 o ph 2,8 i 100 mm NaCl, zbierając 0,5 mililitrowe frakcje i zobojętniono przez dodanie 25 µl 0,5 M 66

68 NaH 2 PO 4 o ph 8,6. Frakcje zawierające maksymalną ilość białka zidentyfikowano mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm i połączono. Na redukującym żelu SDS-PAGE białko Sp35-Fc migrowało jako jedno pasmo (o czystości > 95%) o pozornej masie 90 kda. W warunkach nieredukujących białko przybierało formę dimeru o przybliżonej masie 180 kda. Oczyszczone białko Sp35-Fc porcjowano i przechowywano w temperaturze -70 C. Przykład 3 Egzogenne Sp35-Fc wspiera przeżywalność/proliferację/ różnicowanie się oligodendrocytów. [0275] Oceniliśmy ekspresję Sp35 mrna w oligodendrocytach w różnych stadiach rozwojowych w następujący sposób. Oligodendrocyty indukowano, w celu ich różnicowania, jak opisano w przykładzie 1, a mrna wyizolowano za pomocą zestawu Ambion. Kwantyfikacja ekspresji Sp35 mrna została przeprowadzona za pomocą zestawu Taqman RT-PCR (Applied Biosystems), zgodnie z zaleceniami producenta, z zastosowaniem następujących starterów: 5' - CTTTCCCCTTCGACATCAAGAC - 3' (przedni; numer identyfikacyjny sekwencji: 50) oraz 5' -CAGCAGCACCAGGCAGAA - 3' (wsteczny; numer identyfikacyjny sekwencji: 51) oraz sondy oznaczonej FAM, 5' - ATCGCCACCACCATGGGCTTCAT - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 52). Dane zostały znormalizowane używając poziom GAPDH jako wewnętrznej kontroli. Wczesne progenitory oligodendrocytów (A2B5 + ) oraz oligodendrocyty przedmielinizacyjne (O4 + ) wykazywały równoważne poziomy Sp35 mrna, ale poziom Sp35 mrna w dojrzałych oligodendrocytach (MBP + ) był ponad dwukrotnie wyższy. Rys. 7 [0276] Oligodendrocyty A2B5 +, przygotowane jak opisano w przykładzie 1, zostały poddane działaniu rosnących stężeń Sp35-Fc lub fragmentu kontrolnego Fc przez okres 3 dni (Sp35-Fc przygotowano zgodnie z opisem w przykładzie 2). Dla oceny różnicowania, komórki A2B5 + wysiano w 4-studzienkowych komorach w pożywce niezawierającej FGF/PDGF z dodatkiem 10 ng/ml CNTF i 15 nm trijodo-l-tyroniny i natychmiast poddano działaniu wzrastających stężeń Sp35-Fc lub kontrolnego fragmentu Fc. Po 48 godzinach (72 godz. dla RNAi), hodowle poddano barwieniu przeciwciałem przeciw O4 oraz skwantyfikowano całkowitą liczbę oligodendrocytów O4 + oraz dojrzałych oligodendrocytów O4 +. Próbki analizowano w dwóch egzemplarzach. Sp35-Fc stymulowało różnicowanie komórek A2B5 + do komórek O4 + w sposób zależny od stężenia. Rys. 8 [0277] Okres półtrwania in vitro dojrzałych oligodendrocytów wynosi około 48 do 72 godzin, a komórki ulegają apoptozie zazwyczaj po 72 godzinach. Gdy hodowle oligodendrocytów zostały poddane działaniu Sp35-Fc (10 µg/ml przez 5 dni), zaobserwowaliśmy znacznie zwiększoną przeżywalność dojrzałych oligodendrocytów, na podstawie badania żywotności komórek metodą barwienia w stosunku do próbki kontrolnej poddanej działaniu kontrolnego Fc. Ekspresja MBP była monitorowana jako marker dla dojrzałych oligodendrocytów. Zaobserwowano około 3-krotny wzrost ekspresji białka MBP w komórkach poddanych działaniu Sp35-Fc na podstawie przez barwienia komórek oraz testów Western blot przy użyciu przeciwciał anty-mbp w stosunku do komórek poddanych działaniu kontrolnego Fc. Przykład 4 Antagoniści Sp35 regulują RhoA i Fyn 67

69 [0278] Dobrym kandydatem na szlak sygnalizacyjny implikowany w regulację różnicowania się oligodendrocytów jest rodzina Rho GTPaz. Rho GTPazy regulują morfologię komórkową, a dla różnicowania się oligodendrocytów wymagany jest obniżony poziom RhoA-GTP. Patrz Liang, X, i wsp. J. Neurosci. 24: (2004). Aby określić, czy Sp35 przesyła sygnały przez ścieżkę RhoA, poziomy RhoAGTP w lizatach komórek oligodendrocytów poddanych działaniu Sp35-Fc zostały porównane z poziomami w analogicznych próbkach kontrolnych w teście Western blot. Po zastosowaniu Sp35-Fc zaobserwowano znaczącą trzykrotną redukcję RhoA-GTP (Rys. 9a), wskazującą, że tłumienie funkcji Sp35 może wywoływać różnicowanie oliogodendrocytów przez obniżenie RhoA GTP, z późniejszym wzrostem ekspresji MBP. Podobne zmniejszenie ilości RhoA GTP zaobserwowano po poddaniu oligodendrocytów działaniu DN-Sp35 lub RNAi Sp35 (danych nie przedstawiono). [0279] Aktywność RhoA GTPazy jest regulowana przez Fyn kinazę Patrz Liang, X, i wsp., J. Neurosci. 24: (2004). 24: (2004). Zwiększona ekspresja Fyn i fosforylacja korelują z różnicowaniem się oligodendrocytów. Id. Zobacz także Osterhout, DJ. i wsp., J. Cell Biol. 145: (1999). Aby sprawdzić, czy antagoniści Sp35 mają wpływ na funkcję Fyn, ekspresję Fyn oraz fosforylację zmierzono bezpośrednio w teście Western blot. Poddanie działaniu DN-Sp35, jak opisano w przykładzie 1, spowodowało dwukrotny wzrost poziomu białka Fyn oraz fosforylacji Fyn (Rys. 9B). Odwrotnie, po przeanalizowaniu komórek wyrażających FL-Sp35, ekspresja Fyn oraz fosforylacja zmniejszyły się dwukrotnie (Rys. 9B). Przykład 5 Sp35-Fc stymualuje mielinizację in vitro [0280] Rolę Sp35 w mielinizacji zbadano in vitro przez poddanie hodowli neuronów i oligodendrocytów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) działaniu Sp35-Fc i zbadanie mielinizacji immunohistochemicznie oraz za pomocą mikroskopii elektronowej. Na potrzeby tych badań należało najpierw stworzyć pierwotne hodowle neuronów i oligodendrocytów DRG. [0281] Embrionalne zwoje korzeni grzbietowych samicy szczura Evans E14-E17 hodowano jak opisano w Plant i wsp., J. Neurosci. 22: (2002). Wypreparowane DRG posiano na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-l-lizyną (100 µg/ml) na 2 tygodnie w obecności fluorodeoksyurydyny w dniach 2-6 oraz 8-11 w pożywce NLA zawierającej 1 x B27, 100 ng/ml NGF (Invitrogen). [0282] Oligodendrocyty A2B5 + przygotowano jak opisano w przykładzie 1 i zebrano przez trypsynizację. [0283] W przypadku badań wspólnych hodowli, oligodendrocyty A2B5 + dodano do hodowli neuronów DRG w obecności lub nieobecności 10 µg/ml Sp35-Fc. Pożywka (Pożywka Neurobasal uzupełniona przez B27 i 100 ng/ml NGF) była zmieniana i świeże Sp35-Fc było dodawane do komórek co 3 dni. W celu identyfikacji zmian w mielinizacji, 2-tygodniowe kultury barwiono barwnikiem immunohistochemicznym ("IHC") dla neurofilamentów zawierającym przeciwciała przeciw βiii-tubulinie dla identyfikacji aksonów lub przeciwciała przeciw MBP dla identyfikacji oligodendrocytów, i 4-tygodniowe kultury poddano SDS-PAGE, a następnie testowi Western blot w celu kwantyfikacji MBP. W wybranych przykładach, komórki utrwalano na potrzeby badań mikroskopii elektronowej przez dodanie 2,5% glutaraldehydu bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe. Zmieli- 68

70 nizowane aksony w dwutygodniowych kulturach zostały zliczone poprzez określenie liczby zmielinizowanych połączeń międzywęzłowych pochodzących z tych samych oligodendrocytów MBP +. Próbki analizowano w dwóch egzemplarzach. Słupki błędów symbolizują indywidualne ustalenia. Wartości P we wszystkich badaniach oznaczano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji. [0284] W kulturach pierwotnych szczurzych oligodendrocytów i neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG), zaobserwowano niski podstawowy poziom mielinizacji. Dla porównania, poddanie działaniu Sp35-Fc przez okres 2 tygodni skutkowało obfitą mielinizacją aksonów, co uwidoczniło się przez obecność zmielinizowanych aksonów MBP +, które rozwinęły się w kulturach poddanych działaniu Sp35-Fc zależnie od dawki (Rys. 10A). Analiza Western blot wykazała, że ekspresja MBP, głównego składnika białka mieliny, wzrosła w kulturach poddanych działaniu Sp35-Fc (Rys. 10B). Mielinizacja w obecności Sp35-Fc została dodatkowo potwierdzona w mikroskopii konfokalnej, która zweryfikowała, że MBP otorbia aksony (danych nie przedstawiono). Za pomocą mikroskopu elektronowego zaobserwowano wiele należycie uformowanych międzywęźli w hodowlach poddanych działaniu Sp35-Fc, jak również struktur bardzo zbliżonych do przewężeń Ranviera (Rys. 10C). W hodowlach kontrolnych wykryto jedynie sporadyczne segmenty zmielinizowane oraz brak przewężeń Ranviera (Rys. 10D). [0285] Wpływ antagonistów Sp35 na mielinizację aksonów został dodatkowo potwierdzony za pomocą DN- Sp35. Ekspresja DN-Sp35 zwiększała liczbę mielinizujących komórek MBP + od pięciu do dziesięciu razy w porównaniu z hodowlami kontrolnymi (Rys. 10E). Dla porównania, nadekspresja FL-Sp35 zmniejszyła liczbę mielinizujących komórek MBP + dwukrotnie w porównaniu z hodowlami kontrolnymi Rys. 10E). W celu kwantyfikacji MBP w kulturach zastosowano analizę Western blot. DN-Sp35 spowodowało dziesięciokrotny wzrost MBP, natomiast FL-Sp35 spowodowało dwukrotny spadek MBP (Rys. 10F). Ekspresja białek FL- Sp35 i DN-Sp35 w hodowlach została potwierdzona w testach Western blot (Rys. 10F). Te badania wskazują ponadto, że endogenne Sp35 hamuje mielinizacją oraz że antagonizm Sp35 może odwrócić proces hamowania. Przykład 6 Peptydy domeny Ig Sp35 stymulują mielinizację in vitro [0286] Niektóre peptydy zawierające części domeny Ig Sp35 zbadano in vitro, poddając hodowle wspólne oligodendrocytów i neuronów zwoju korzenia grzbietowych (DRG) działaniu peptydów Ig Sp35 oraz badając mielinizację jak opisano w przykładzie 5. [0287] W przypadku badań wspólnych hodowli, oligodendrocyty A2B5 + dodano do hodowli neuronów DRG w obecności lub nieobecności 10 µg/ml Sp35-Ig-Fc (aminokwasy Sp spojone z Fc). Pożywka (Pożywka Neurobasal uzupełniona o B27 i 100 ng/ml NGF) została zmieniona i świeże Sp35-Ig-Fc było dodawane do komórek co 3 dni. W celu identyfikacji zmian w mielinizacji, 2-tygodniowe kultury barwiono przez barwienie immunohistochemiczne ("IHC") dla neurofilamentów zawierające przeciwciała przeciw βiiitubulinie dla identyfikacji aksonów lub przeciwciała MBP dla identyfikacji oligodendrocytów, a 4-tygodniowe kultury analizowano na SDS-PAGE, a następnie poddano testowi Western blot w celu kwantyfikacji MBP. 69

71 [0288] Analiza Western blot wykazała, że ekspresja MBP, głównego składnika białka mieliny, wzrosła w kulturach poddanych działaniu Sp35-Ig-Fc (Rys. 15). Zmutowany peptyd Sp35-Ig-Fc został również zbadany w tym samym teście. Po zmutowaniu argininy w pozycji 456 i histydyny w pozycji 458, odpowiednio, na kwas glutaminowy i walinę, peptydy nie stymulowały mielinizacji w porównaniu z działaniem peptydu Sp35-Ig-Fc. (Rys. 15) Arginina w pozycji 456 stanowi część "pętli RKH" (aminokwasy arginina-lizyna-histydyna ) w domenie Ig Sp35 i jest uważana za istotną dla wiązania polipeptydu antagonisty Sp35. Wzrost białka MBP w obecności Sp35-Fc-Ig jest porównywalny do wzrostu białka MPB w obecności cząsteczki Sp35-Fc. (Rys. 15) [0289] Cykliczne peptydy zawierające części domeny Ig Sp35 zbadano również pod kątem ich zdolności do stymulacji mielinizacji w badaniu opisanym w przykładzie 5. Peptyd LSPRKH Sp35 (aminokwasy ) (numer identyfikacyjny sekwencji: 61) został poddany cyklizacji przez dodanie cysteiny na N-końcu oraz reszty cysteinowej na C-końcu. Peptyd zamknięto grupą acetylową (Ac) na N-końcu oraz ugrupowaniem NH 2 na C-końcu. Dodatkowo, peptyd LSPRKH (Nr id sekwencji: 61) został zsyntetyzowany z grupą biotyny połączoną za pomocą łącznika aminokwasowego GSGC na N-końcu i reszty cysteinowej NH 2 na C-końcu i został zcyklizowany. Powstałe cykliczne peptydy Sp35, Ac-CLSPRKHC (numer identyfikacyjny sekwencji:66) oraz Biotyna-GSGCLSPRKHC (numer identyfikacyjny sekwencji:63) zwiększyła ekspresję MBP, głównego składnika białka mieliny w kulturach poddanych ich działaniu, jak przedstawiono na Western blot. (Rys. 16) Inne cykliczne peptydy zastosowano jako peptydy kontrolne: biotyna-gsgclspekvc (numer identyfikacyjny sekwencji:65), biotyna-gsgckhsplrc (numer identyfikacyjny sekwencji:64) oraz Ac-CLSPEKVC (numer identyfikacyjny sekwencji: 67). Żadne peptydy kontrolne nie wykazały wzrostu poziomu MBP w hodowlach wspólnych poddanych ich działaniu. (Rys. 16) [0290] Te badania wskazują ponadto, że mniejsze peptydy z domeny Ig Sp35 mogą pełnić rolę antagonisty Sp35, w celu ograniczenia hamowania mielinizacji przez Sp35. Przykład 7 DN-Sp35 działa w neuronach i oligodendrocytach DRG, wspierając mielinizację. [0291] Przeprowadzono eksperymenty w celu zbadania względnego udziału Sp35 w procesie mielinizacji w neuronach DRG w porównaniu z oligodendrocytami. Zakaziliśmy neurony DRG, oligodendrocyty i hodowle wspólne (przygotowane jak opisano w przykładzie 5) wektorami lentiwirusowymi FL-Sp35 i DN-Sp35, opisanymi w przykładzie 1, i po dwóch tygodniach wykonaliśmy barwienie immunohistochemiczne dla zmielinizowanych komórek MBP +. Zaobserwowano dwukrotny wzrost poziomu MBP w hodowlach wspólnych, gdzie obie komórki wyrażały DN-Sp35 oraz dwukrotne zmniejszenie poziomu MBP w hodowlach wspólnych, gdzie obie komórki wyrażały FL-Sp35 (Rys. 10G). [0292] Nadekspresja FL-Sp35 w jednym lub obu rodzajach komórek znacznie zmniejszyła podstawowy poziom mielinizacji w porównaniu z hodowlą kontrolną (pusty wektor). Z drugiej strony, nadekspresja DN-Sp35 w jednym lub w obu rodzajach komórek zwiększyła podstawowy poziom mielinizacji dwu- lub trzykrotnie w porównaniu z hodowlą kontrolną (Rys. 10G). Egzogennie dodane Sp35-Fc odwróciło proces hamowanie mielinizacji przez nadekspresję FL-Sp35 w jednym lub w obu rodzajach komórek. Ponadto, egzogenne 70

72 Sp35-Fc dodatkowo wzmocniło mielinizację w przypadkach, gdy tylko jeden z rodzajów komórek wykazywał nadekspresją DN-Sp35 i dawało nieznaczne skutki w przypadkach, gdy obydwa rodzaje komórek wskazywały nadekspresję DN-Sp35. Badania te wskazują, że ekspresja dominująco-negatywnego białka Sp35 zarówno w oligodendrocytach, jak i w neuronach DRG, lub poddanie działaniu białka Sp35-Fc, przyczynia się do skutecznej mielinizacji. Przykład 8 Myszy nokautowe dla Sp35 wykazują wczesną mielinizację [0293] Myszy nokautowe dla Sp35 zostały stworzone przy zastosowaniu wektora wymiennego GFP/Neo (zielone białko fluorescencyjne/neomycyna), którego celem był cały pojedynczy egzon kodujący sekwencję Sp35 jak opisano w Schiemann i wsp. (Science 293: (2001). Genomowe mysie DNA 129/SvJ wyizolowano z genomowej biblioteki lambda (Stratagene # ). Fragment EcoRV o długości 14.6-kb subklonowano w pbsk +, a następnie użyto na drodze rekombinacji homologicznej w bakterii, jako sekwencję docelową do wstawienia genu reporterowego egfp Q40 przy inicjującym kodonie ATG. Ostateczny konstrukt usunął całą sekwencję nukleotydów z jednoeksonowej sekwencji kodującej Sp35. Konstrukt ten został użyty w celu zastąpienia locusu Sp35 w embrionalnych komórkach macierzystych D3 (129/Sv). Prawidłowo genetycznie zmienione komórki docelowe zidentyfikowano za pomocą testu Southern blot wykonanego na DNA tych zarodkowych komórek macierzystych przetrawionego enzymem EcoRI, i wstrzyknięto do blastocystów C57B1/6 w celu wytworzenia myszy chimerycznych. Chimery zostały skrzyżowane z myszami C57B1/6 w celu stworzenia heterozygotycznych myszy założycielek. Genotypy oznaczono metodą PCR z użyciem trzech starterów używając DNA z ogona. Starter przedni 5 '- CTATCCAAGCACTGCCTGCTC- 3' (NR ID SEKWENCJI.53) oraz dwa startery wsteczne 5' GAGTTCTAGCTCCTCCAGGTGTG 3 (NR ID SEKWENCJI:54) oraz 5' GATGCCCTTCAGCTCGATGCG - 3' (NR ID SEKWENCJI:55) dały, odpowiednio, allel typu dzikiego o długości 275-bp oraz zmutowany allel o długości 356-bp w 35-cyklicznej reakcji (94 1C przez 20 s, 65 1C przez 30 s, 72 1C przez 30 s). Patrz Mi., S. i wsp. Nat. Neurosci. 7: (2004). Walidacja delecji genów Sp35 została dokonana w testach Southern blot, RTPCR oraz Northern blot. Wyróżniające się prążki wykryto w testach Northern blot oraz w RT-PCR u myszy typu dzikiego, jednak u myszy nokautowych stwierdzono brak prążków. Testy Southern blot wykonane na myszach heterozygotycznych wykazały obecność alleli Sp35 zarówno u myszy typu dzikiego jak i u myszy ze zmodyfikowanym allelem Sp35. Myszy nokautowe Sp35 sprawiały normalne wrażenie, bez ewidentnych nieprawidłowości fizycznych lub zmian w zachowaniu, poruszaniu się czy płodności. Myszy z heterozygotycznego miotu F1 różniły się pod względem wielkości. [0294] Wyhodowane oligodendrocyty z myszy nokautowych Sp35 zbadano metodą IHC pod względem potencjalnych zmian w różnicowaniu. Oligodendrocyty, które cechowały się większym zróżnicowaniem oraz większym odsetkiem dojrzałych oligodendrocytów zaobserwowano u myszy nokautowych Sp35 w porównaniu do myszy typu dzikiego z tego samego miotu. Ponieważ początek mielinizacji w rozwoju normalnych myszy następuje zazwyczaj w (P) 5 dniu po urodzeniu, przeanalizowaliśmy mielinizację w kręgosłupach P1 u myszy typu dzikiego i myszy nokautowych w badaniu mikroskopem elektronowym. Podobnie jak hodowle in vitro, rdzenie kręgowe z myszy nokautowych Sp35 zawierały więcej zmielinizowanych włókien aksonów niż 71

73 ich odpowiedniki typu dzikiego z tego samego miotu Rys. 11. Nie zaobserwowano oczywistych zmian w nerwie kulszowym obwodowego systemu nerwowego u myszy nokautowych, co sugeruje, że wpływ mielinizacji ograniczał się do CNS. [0295] Hodowane wspólnie DRG i oligodendrocyty z myszy nokautowych wykazywały większą interakcję między DRG a oligodendrocytami oraz większą mielinizację. Hodowane wspólnie DRG i oligodendrocyty z myszy nokautowych Sp35 wykazywały większe różnicowanie się i mielinizację. W analizie tkanki rdzenia kręgowego u myszy nokautowych pod mikroskopem elektronowym, nowonarodzone myszy nokautowe Sp35 (dzień 1 po narodzeniu (P1) oraz dzień 6 (P6)) miały więcej włókien mielinizacji niż ich odpowiedniki typu dzikiego z tego samego miotu. [0296] Myszy transgeniczne wykazujące nadekspresję Sp35 typu dzikiego zostały utworzone również metodą przedstawioną przez Hogana B. w Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (1986), s W badaniu myszy transgenicznych wykazujących nadekspresję Sp35 za pomocą mikroskopu elektronowego, nowonarodzone myszy (w (P8) dniu 8 po urodzeniu) wykazały mniejszą włókien mielinizacji niż ich odpowiedniki typu dzikiego z tego samego miotu. Przykład 9 Sp35-Fc wspiera przeżywalność oligodendrocytów oraz mielinizację in vivo [0297] Dorosłe samce myszy typu dzikiego C57B1/6 karmiono kupryzonem (zmielonym w ilości wagowej wynoszącej 0,2% z karmą dla myszy) przez 6 tygodni w celu wywołania demielinizacji w obrębie ciała modzelowatego. Sp35-Fc zostało stereotaktycznie wstrzyknięte do ulegającego demielinizacji ciała modzelowatego po 2, 2,5 i 3 tygodniach karmienia kupryzonem. Myszom kontrolnym wstrzyknięto stereotaktycznie w tych samych odstępach czasu sterylną pożywkę bez Sp35-Fc. Po 6 tygodniach karmienia kupryzonem, myszy powrócił do normalnej diety na okres 2, 4 i 6 tygodni (tylko mielona karma dla myszy) w celu umożliwienia ponownej mielinizacji. [0298] Myszy karmione kupryzonem znieczulono ketaminą (80 mg/kg masy ciała) i ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i umieszczono w urządzeniu unieruchamiającym przeznaczonym do operacji stereotaktycznych (David Kopf Instruments). Otwarto skórę głowy i wstrzyknięto sterylne związki (1 µm w 1 ml HBSS) jednostronnie do ciała modzelowatego, które uległo ostrej demielinizacji u myszy typu dzikiego, za pomocą 10 ml strzykawki Hamiltona przy wykorzystaniu współrzędnych stereotaktycznych: 0,7 mm z tyłu i 0,3 mm z boku ciemienia dużego na głębokości 1,7 mm (Messier i wsp., Pharmacol. Biochem. Behav. 63(2): (1999)). Dodatkowo, myszom kontrolnym wstrzyknięto stereotaktycznie HBSS bez związków. Otwór w czaszce wypełniono Gelfoam (żelem-pianką) oraz w miejscu tym nałożono penicylinę i streptomycynę (Gibco), a następnie zaszyto ranę. Po wstrzyknięciu, myszy uśmiercano co tydzień w ciągu trwania eksperymentu, a ich mózgi były usuwane i przetwarzane na potrzeby analiz molekularnych, biochemicznych i histologicznych. 72

74 [0299] Zwierzęta poddane działaniu Sp35-Fc wykazały zwiększoną przeżywalność dojrzałych oligodendrocytów (na podstawie barwienia przeciwciał CC1, Rys. 12) oraz mielinizację aksonów w badaniu IHC przy użyciu przeciwciał białka anty-mbp lub barwnika luxol fast blue (danych nie przedstawiono). Przykład 10 Przeszczep in vivo transformowanych komórek Sp35 [0300] Badamy również biologiczną funkcję Sp35 w przypadku urazu rdzenia kręgowego. Zainfekowaliśmy hodowane pierwotne komórki kory (hodowla mieszana) retrowirusem wyrażającym Sp35 lub retrowirusem kontrolnym, w celu dostarczenia go do uszkodzonego epicentrum kręgosłupa szczura. Wprowadzono 2x10 6 komórek, a szczury uśmiercono w 10 dniu. Rdzenie kręgowe utrwalano w 4% roztworze paraformaldehydu przez noc, a później suszono w 70% roztworze etanolu, a następnie w 95% roztworze etanolu. Próbki tkanek zatopiono w parafinie. Odcinki (o grubości 10 mikronów) są wykorzystywane do barwienia immunohistochemicznego. Monitorowaliśmy przeżywalność oligodendrocytów oraz mielinizację aksonów u szczurów z urazem otrzymujących Sp35. Zaobserwowaliśmy więcej oligodendrocytów oraz mielinizacji aksonów, przy jednocześnie zmniejszonym kurczeniu się aksonów u zwierząt otrzymujących komórki, które wyrażają Sp35. [0301] Konstrukt zawierający retrowirusa i Sp35 dla tych eksperymentów został przygotowany w następujący sposób. Gen Sp35 został amplifikowany w reakcji PCR przy użyciu starterów 5' GATTACTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG - 3 (numer identyfikacyjny sekwencji: 56), zawierających miejsce Xhol oraz 5 CGCGGGAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG - 3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 57), zawierający miejsce EcoRI. Produkt PCR był trawiony za pomocą XhoI i EcoRI, a następnie poddany ligacji do wektora retrowirusowego pmig (zawierającego IRΕS-GFP), który uprzednio przecięto za pomocą XhoI i EcoRI. Nowemu wektorowi nadano nazwę pmmc078. Wszystkie izolaty pmmc078 zawierały przypadkowe mutacje punktowe więc dwa izolaty pmmc078 poddano wzajemnej ligacji. pmmc078.6 przecięto za pomocą XhoI i AccI, a pmmc078.7 przecięto za pomocą XhoI i AccI. Te dwa fragmenty zligowano razem w celu otrzymania ostatecznego właściwego plazmidu pmmc089. Sekwencję DNA wstawki potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Retrowirus Sp35 został przygotowany w opisany sposób. Komórki 293G podzielono jeden dzień przed transfekcją. Użyto 8 µg DNA retrowirusa Sp35 do transfekcji 5x10 6 komórek za pomocą lipofektaminy (Invitrogen). Kondycjonowana pożywka została zebrana po 92 godzinach od transfekcji. Kondycjonowana pożywka była wirowana przy 5000 g przez 10 minut, a nadsącz użyty został jako podstawowy zapas retrowirusa Sp35. Ten podstawowy zapas przechowywano w temperaturze 4 C przez 1 tydzień lub -80 C przez 6 miesięcy. Przykład 11 Sp35-Fc wspiera przeżywalność neuronów i oligodendrocytów po urazie rdzenia kręgowego (SCI) w warunkach in vivo [0302] Uraz rdzenia kręgowego spowodowano u dorosłych samic szczurów Long Evans ( g, Charles River). Grzbietowa hemisekcja została wykonana na odcinku T6/T7, z całkowitym przerwaniem elementów grzbietowo-przyśrodkowej oraz grzbietowo-bocznej drogi korowo-rdzeniowej (CST). Rdzeń został przecięty 73

75 stereotaktycznie na głębokości 1,8 mm od powierzchni za pomocą mikroskalpela. Natychmiast po przecięciu CST, wprowadzono cewnik dooponowy do przestrzeni podpajęczynówkowej przy T7 i podłączono do minipompy osmotycznej Alzet (Model Alzet 2004, Alza Corp.), umieszczonej w przestrzeni podskórnej. Minipompy osmotyczne dostarczały 0.25 µl/godz. 25 µm białka fuzyjnego Sp35-Fc, lub jako kontroli, ludzkiej IgG (5 mg/ml) lub PBS. Opieka pooperacyjna obejmowała analgezję (Buprenorphine/Buprenex, Reckitt Benckiset Healthcare Ltd., 0,05 mg/kg podskórnie) co 8-12 godzin przez 3 dni i leczenie antybiotykami (ampicylina, Bristol Myers Squibb, 100 mg/kg podskórnie dwa razy na dobę) przez 7 dni po zabiegu. Pęcherze wyciskano ręcznie dwa razy dziennie w czasie trwania badania (4 tygodnie) lub do powrotu funkcji. Na zakończenie badania, szczury znieczulono i przez-sercowo poddano perfuzji z zastosowaniem soli fizjologicznej z heparyną, a następnie 4% roztworu paraformaldehydu (PFA). Rdzenie kręgowe usunięto, zatopiono w parafinie, a 10-mikrometrowe odcinki zostały odcięte do analizy histologicznej. [0303] W celu ilościowego ujęcia apoptotycznej śmiertelności komórek po urazie rdzenia kręgowego, zwierzęta uśmiercono 3 lub 7 dni po urazie rdzenia kręgowego i zabarwiono przy użyciu przeciwciała przeciw aktywowanej kaspazie-3 (Cell Signaling Technologies) i barwienia metodą TUNEL (Promega). Odcinki były również barwione przeciwciałem anty-neun (Chemicon) oraz przeciwciałem anty-cc1 (Calbiochem) w celu zidentyfikowania, odpowiednio, neuronów i oligodendrocytów. [0304] Zaobserwowano rozległe barwienie TUNEL zarówno dogłowowo, jak i doogonowo w stosunku do miejsca przecięcia 3 dni po urazie rdzenia kręgowego oraz barwienie aktywowaną kaspazą-3 współlokalizowane zarówno do neuronów jak i oligodendrocytów. Liczba oligodendrocytów i neuronów pozytywnych na aktywowaną kaspazę-3 była znacznie mniejsza u zwierząt poddanych działaniu SpP35-Fc w porównaniu do zwierząt kontrolnych w 3 dni po urazie rdzenia kręgowego. Ponadto, cztery tygodnie po urazie rdzenia kręgowego, więcej neuronów i oligodendrocytów przeżyło w tkance rdzenia kręgowego otaczającej miejsce uszkodzenia u zwierząt poddanych działaniu Sp35-Fc niż u zwierząt kontrolnych, co stwierdzono po barwieniu przeciwciałem anty-βiii-tubuliny (przeżycie neuronów) oraz przeciwciałem anty-o4 (przeżycie oligodendrocytów). Przykład 12 Sp35-Fc zmniejsza aktywację kaspazy-3 i śmiertelność komórek in vitro [0305] Komórki PC12 (Neuroscreen) różnicowano na podłożu RPMI-1640 z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej, 10% surowicy końskiej, 2 mm glutaminy, 100U/ml penicyliny i 100mg/ml streptomycyny zawierającej 200 ng/ml NGF przez 7 dni. Do eksperymentów, pożywkę zastąpiono pożywką bez NGF zawierającą Sp35-Fc, ludzką IgG jako kontrolę negatywną (0,1-10 µm) lub zvad jako kontrolę pozytywną (0.1 µm). 18 godzin po wycofaniu NGF, aktywowana kaspaza-3 została określona ilościowo przy zastosowaniu zestawu Caspase 3/7 Glo kit (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. 42 godziny po wycofaniu NGF, określono ilościowo apoptotyczną śmiertelność komórek przy zastosowaniu zestawu do określania śmiertelności komórek ELISA Glo kit (Roche) zgodnie z instrukcjami producenta. [0306] Stwierdzono, że 0,1 µm Sp35-Fc zmniejszyło aktywację kaspazy-3 w zróżnicowanych komórkach PC12 pozbawionych wsparcia troficznego 18 godzin po usunięciu NGF z pożywki. Wpływ Sp35-Fc na akty- 74

76 wację kaspazy-3 był zależny od dawki, a przy wyższych dawkach (1 lub 10 µm) był równie skuteczny jak neuroochronna dawka inhibitora kaspazy zvad (0,1 µm) (Rys. 14). Jako dodatkową metodę określenia śmiertelności komórek, skwantyfikowaliśmy apoptozę za pomocą metody TUNEL ELISA i stwierdziliśmy, że Sp35-Fc znacznie zmniejsza śmiertelność komórek mierzoną 42 godzin po odstawieniu NGF (Rys. 13). LISTA SEKWENCJI <110> Biogen Idec MA, Inc. Mi, Sha Pepinsky, R. Blake McCoy, John <120> Treatment of conditions Involving Demyelination (Leczenie stanów związynych z demielinizacją) <130> PC06 <140> Do ustalenia <141> w załączeniu <150> 60/680,475 <151> <150> 60/628,435 <151> <150> 60/617,297 <151> <150> 60/582,966 <151> <160> 79 <170> Patent wersja 3.2 <210> 1 <211> 1845 <212> DNA <213> Homo sapiens 75

77 <400> 1 EP atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60 ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120 gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc 180 gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240 aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc 300 gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc 360 cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420 aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480 tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540 ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600 cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac 660 atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720 tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780 tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840 gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900 ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960 gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020 ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080 gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140 ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag

78 ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260 cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320 cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380 tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440 gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500 tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560 aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620 actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680 tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740 ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc 1800 agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845 <210> 2 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala

79 Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu

80 His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val Ser Gly Asn Gln Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Val Phe His Ser Val Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn 79

81 Arg Gln Gln Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Val Gln Gly Lys Glu Phe Lys Asp Phe Pro Asp Val Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro Ala Ile Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Val Ser Ala Lys Ser Asn Gly Arg Leu Thr Val Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Tyr Ala Gln Val Gln Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu His Val Arg Ser Tyr Ser Pro Asp Trp Pro His Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn Gln Pro Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Val Pro Phe

82 Pro Phe Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile Ser Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Trp Ser Arg Gly Lys Gly Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Val Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys Phe Asn Met Lys Met Ile 610 <210> 3 <211> 1845 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 3 atgctggcag ggggtatgag aagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60 ctcctgctgg tactgggctc agtgctgtca ggctctgcta caggctgccc gccccgctgc 120 gagtgctcag cgcaggaccg agccgtgctc tgccaccgca aacgctttgt ggcggtgccc 180 gagggcatcc ccaccgagac tcgcctgctg gacctgggca aaaaccgcat caagacactc 240 aaccaggacg agtttgccag cttcccacac ctggaggagc tagaactcaa tgaaaacatc 300 gtgagcgccg tggagccagg cgccttcaac aacctcttca acctgaggac tctggggctg

83 cgcagcaacc gcctgaagct tatcccgctg ggcgtcttca ccggcctcag caacttgacc 420 aagctggaca tcagtgagaa caagatcgtc atcctgctag actacatgtt ccaagaccta 480 tacaacctca agtcgctgga ggtcggcgac aacgacctcg tctacatctc ccatcgagcc 540 ttcagcggcc tcaacagcct ggaacagctg acgctggaga aatgcaatct gacctccatc 600 cccacggagg cgctctccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgcggctacg acatctcaac 660 atcaatgcca tcagggacta ctccttcaag aggctgtacc gacttaaggt cttagagatc 720 tcccactggc cctacctgga caccatgacc cccaactgcc tctacggcct caacctgaca 780 tccctatcca tcacgcactg caacctgaca gccgtgccct atctggcagt gcgtcacctg 840 gtctatctcc gtttcctcaa cctttcctac aacccaatcg gtacaatcga gggctccatg 900 ctgcatgagc tgctgcggtt gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960 gagccctatg cctttcgtgg gctcaactac ctgcgtgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020 ctgaccaccc tggaggagtc agccttccat tcggtgggca acctggagac gctcatcctg 1080 gactccaacc cactggcctg tgactgccgg ctgctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140 ctcaacttca acaggcagca gcccacctgc gccacacctg agttcgtcca gggcaaagag 1200 ttcaaggact ttccggatgt actcctaccc aactacttca cctgccgccg ggcccacatc 1260 cgggaccgca aggcacagca ggtgtttgta gatgagggcc acacggtgca gtttgtatgc 1320 cgggcagatg gcgaccctcc accagctatc ctttggctct caccccgcaa gcacttggtc 1380 tcggccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440 gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcag ccaatgctgg cggcaacgac 1500 tccatgcccg cccacttgca tgtgcgcagc tactcgcctg actggcccca tcaacccaac 1560 aagaccttcg ccttcatctc caaccagcca ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc

84 actgtgcctt tccccttcga catcaagacg ctcattatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680 tccttcctgg gcgttgtcct attctgcctg gtgctgctgt ttctatggag ccggggcaaa 1740 ggcaacacaa agcacaacat cgaaattgag tatgtgcccc ggaaatcgga cgcaggcatc 1800 agctcagctg atgcaccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845 <210> 4 <211> 614 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Met Leu Ala Gly Gly Met Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu

85 Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val 84

86 Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Pro Ile Gly Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val Ser Gly Asn Gln Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Ala Phe His Ser Val Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn Arg Gln Gln Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Val Gln Gly Lys Glu Phe Lys Asp Phe Pro Asp Val Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg Arg Ala His Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu

87 Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro Ala Ile Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Val Ser Ala Lys Ser Asn Gly Arg Leu Thr Val Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Tyr Ala Gln Val Gln Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu His Val Arg Ser Tyr Ser Pro Asp Trp Pro His Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn Gln Pro Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Val Pro Phe Pro Phe Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile Ser Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Trp Ser Arg Gly Lys Gly Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Val

88 Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys Phe Asn Met Lys Met Ile 610 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gln Val Ser Lys Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 6 Ile Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens 87

89 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 7 Ala Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 8 Val Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas 88

90 <400> 9 Ser Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Pro Arg Lys His 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Pro Arg Lys Lys 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Pro Arg Lys Arg 1 5 <210> 13 <211> 5 89

91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Pro Lys Lys His 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Pro His Lys His 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Pro Arg Arg His 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Pro Arg His His

92 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Pro Arg Arg Arg 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Pro His His His 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ser Pro Lys Lys Lys 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 91

93 Ile Thr Pro Lys Arg Arg 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Cys His His Lys 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Cys His His Lys 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 23 Xaa Xaa Arg Lys His

94 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 24 Xaa Xaa Arg Arg Arg 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 25 Xaa Xaa Lys Lys Lys 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens 93

95 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 26 Xaa Xaa His His His 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 27 Xaa Xaa Arg Lys Lys 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 28 94

96 Xaa Xaa Arg Lys Arg 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 29 Xaa Xaa Lys Lys His 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 30 Xaa Xaa His Lys His 1 5 <210> 31 <211> 5 95

97 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 31 Xaa Xaa Arg Arg His 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa może być dowolnym naturalnie występującym aminokwasem <400> 32 Xaa Xaa Arg His His 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Arg Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys

98 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Lys Lys Val Lys Val Lys Glu Lys Arg 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Arg Arg Leu Arg Leu Arg Asp Arg Lys 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Arg Gly Arg Gly Arg Asp Arg Lys 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 97

99 Arg Arg Ile Arg Ala Arg Asp Arg Lys 1 5 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Szczur, RT-PCR, przedni starter <400> 38 agagacatgc gattggtga 19 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Szczur, RT-PCR starter wsteczny <400> 39 agagatgtag acgaggtcat t 21 <210> 40 <211> 55 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> LV1-035 (sensowny oligo) <400> 40 tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag tctagcagga tgacgatctt ttttc 55 98

100 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> LV1-036 (antysensowny oligo) <400> 41 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca 59 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Kontrola LV1-035 <400> 42 tgatcctcat ccttctatac ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59 <210> 43 <211> 59 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Kontrola LV1-036 <400> 43 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59 <210> 44 <211> 41 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja 99

101 <220> <223> Starter FL-Sp35 <400> 44 gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter FL-Sp35 <400> 45 ggggcggaat tggatcctca cagatcctct tctgagatga g 41 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter DN-Sp35 <400> 46 gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41 <210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter DN-Sp35 <400> 47 gatacggatc ctcagccttt gccccggctc catagaaaca gc

102 <210> 48 <211> 37 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Ludzki Sp35, starter przedni <400> 48 cagcaggtcg acgcggccgc atgctggcgg ggggcgt 37 <210> 49 <211> 59 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Ludzki Sp35, starter wsteczny <400> 49 cagcaggtcg acctcgcccg gctggttggc caaccagccg ggcgaggtcg acctcgagg 59 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter przedni Sp35 <400> 50 ctttcccctt cgacatcaag ac 22 <210> 51 <211> 18 <212> DNA 101

103 <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Odwrotny starter Sp35 <400> 51 cagcagcacc aggcagaa 18 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Probówka z etykietką FAM <400> 52 atcgccacca ccatgggctt cat 23 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Mysi starter przedni <400> 53 ctatccaagc actgcctgct c 21 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Mysi starter wsteczny 102

104 <400> 54 EP gagttctagc tcctccaggt gtg 23 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Mysi starter wsteczny <400> 55 gatgcccttc agctcgatgc g 21 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter Sp35 <400> 56 gattactcga gatgctggcg gggggcgtga gg 32 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter Sp35 <400> 57 cgcgggaatt ctcatatcat cttcatgttg aacttg 36 <210>

105 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gly Ser Gly Cys Leu Ser Pro Arg Lys His <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gly Ser Gly Cys Leu Ser Pro Arg Ile His <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gly Ser Gly Cys Ile Pro Gln Ser 1 5 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Leu Ser Pro Arg Lys His

106 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Leu Ser Pro Glu Lys Val 1 5 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pozycja 1 jest glicyną biotynylowaną <400> 63 Gly Ser Gly Cys Leu Ser Pro Arg Lys His Cys <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pozycja 1 jest glicyną biotynylowaną 105

107 <400> 64 Gly Ser Gly Cys Lys His Ser Pro Leu Arg Cys <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pozycja 1 jest glicyną biotynylowaną <400> 65 Gly Ser Gly Cys Leu Ser Pro Glu Lys Val Cys <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pozycja 1 jest acetylowaną cysteiną <400> 66 Cys Leu Ser Pro Arg Lys His Cys 1 5 <210>

108 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pozycja 1 jest acetylowaną cysteiną <400> 67 Cys Leu Ser Pro Glu Lys Val Cys 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa oznacza dowolny aminokwas <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 68 Ile Thr Xaa Xaa Xaa

109 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa oznacza dowolny aminokwas <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 69 Ala Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <220> 108

110 <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa oznacza dowolny aminokwas EP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 70 Val Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa oznacza dowolny aminokwas <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa oznacza dowolny zasadowy aminokwas <400> 71 Ser Pro Xaa Xaa Xaa

111 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ser Pro Arg Leu His 1 5 <210> 73 <211> 200 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Ogólna struktura oligonukleotydu użyta w przygotowaniu cząsteczki sirna <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> może brakować nukleotydu <400> 73 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn

112 <210> 74 <211> 200 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Ogólna struktura oligonukleotydu użyta w przygotowaniu cząsteczki sirna <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> może brakować nukleotydu <400> 74 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gly Ser Gly Cys Leu Ser Pro Arg Lys His Cys

113 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Ser Gly Cys Lys His Ser Pro Leu Arg Cys <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gly Ser Gly Cys Leu Ser Pro Glu Lys Val Cys <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Cys Leu Ser Pro Arg Lys His Cys 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

114 Cys Leu Ser Pro Glu Lys Val Cys 1 5 ZASTRZEŻENIA 1. Metoda in vitro wspomagająca różnicowanie się lub przeżywalność oligodendrocytów, metoda polegająca na wprowadzaniu w kontakt z oligodendrocytami wyrażającymi Sp35 skutecznej ilości składników zawierających antagonistę Sp35 (LINGO-1), wybranego z grupy obejmującej: (i) rozpuszczalny polipeptyd Sp35 pozbawiony domeny transbłonowej Sp35 oraz domeny cytoplazmatycznej Sp35; (ii) przeciwciało przeciw Sp35 lub jego fragment wiążący antygen; (iii) polinukleotyd antagonisty Sp35, wybrany z grupy obejmującej; (a) polinukleotyd antysensowny, (b) rybozym, (c) (małe interferujące RNA (sirna) i (d) RNA o strukturze spinki do włosów (shrna) oraz (iv) połączenie dwóch lub więcej wspomnianych antagonistów Sp Antagonista Sp35 (LINGO-1) wybrany z grupy obejmującej: (i) rozpuszczalny polipeptyd Sp35 pozbawiony domeny transbłonowej Sp35 oraz domeny cytoplazmatycznej Sp35; (ii) przeciwciało Sp35 lub jego fragment wiążący antygen; (iii) polinukleotyd antagonisty Sp35 wybrany z grupy obejmującej: (a) polinukleotyd antysensowny, (b) rybozym, (c) (małe interferujące RNA (sirna) i (d) RNA o strukturze spinki do włosów (shrna) oraz (iv) połączenie dwóch lub więcej wspomnianych antagonistów Sp35; do wykorzystania w metodzie leczenia stwardnienia rozsianego u ssaków poprzez wspomaganie różnicowania się lub przeżywalności oligodendrocytów wyrażających Sp Metoda opisana w zastrzeżeniu 1 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 2, znamienne tym, że antagonista Sp35 zawiera rozpuszczalny polipeptyd Sp Metoda opisana w zastrzeżeniu 3 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 3, znamienne tym, że rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera: (i) domenę Ig Sp35 (ii) domenę LRR Sp35 oraz 113

115 (iii) Region zasadowy Sp35 położony C-terminalnie w stosunku do domeny LRR 5. Metoda opisana w zastrzeżeniu 3 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 3, znamienne tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera domenę LRR Sp35 i jest pozbawiony: (i) domeny Ig Sp35 oraz (ii) regionu zasadowego Sp35 położonego C-terminalnie w stosunku do domeny LRR 6. Metoda opisana w zastrzeżeniu 3 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 3, znamienne tym, że wymieniony rozpuszczalny polipeptyd Sp35 jest pozbawiony domeny Ig Sp35 oraz domeny LRR Sp Metoda według dowolnego z zastrzeżeń 1 lub od 3 do 6 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 2 do 6, znamienny tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera fragment polipeptydu wybrany z grupy obejmującej: (i) aminokwasy 1 do 33 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ii) aminokwasy 1 do 35 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iii) aminokwasy 34 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iv) aminokwasy 36 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (v) aminokwasy 66 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vi) aminokwasy 90 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vii) aminokwasy 114 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (viii) aminokwasy 138 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ix) aminokwasy 162 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (x) aminokwasy 186 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xi) aminokwasy 210 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xii) aminokwasy 234 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiii) aminokwasy 258 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiv) aminokwasy 282 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xv) aminokwasy 306 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xvi) aminokwasy 330 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 114

116 (xvii) aminokwasy 363 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xviii) aminokwasy 417 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xix) aminokwasy 419 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz (xx) aminokwasy 494 do 551 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: Metoda według dowolnego z zastrzeżeń 1 lub od 3 do 6 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 2 do 6, znamienne tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera fragment polipeptydu wybrany z grupy obejmującej: (i) aminokwasy 1 do 64 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ii) aminokwasy 1 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iii) aminokwasy 1 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iv) aminokwasy 1 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (v) aminokwasy 1 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vi) aminokwasy 1 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vii) aminokwasy 1 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (viii) aminokwasy 1 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ix) aminokwasy 1 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (x) aminokwasy 1 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xi) aminokwasy 1 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xii) aminokwasy 1 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiii) aminokwasy 1 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiv) aminokwasy 1 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xv) aminokwasy 1 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xvi) aminokwasy 1 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xvii) aminokwasy 1 do 551 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xviii) aminokwasy 1 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz (ixx) aminokwasy 1 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym:

117 9. Metoda według dowolnego z zastrzeżeń 1 lub od 3 do 6 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 2 do 6, znamienny tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera fragment polipeptydu wybrany z grupy obejmującej: (i) aminokwasy 34 do 89 sekwencji o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 2; (ii) aminokwasy 34 do 113 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iii) aminokwasy 34 do 137 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iv) aminokwasy 34 do 161 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (v) aminokwasy 34 do 185 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vi) aminokwasy 34 do 209 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vii) aminokwasy 34 do 233 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (viii) aminokwasy 34 do 257 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ix) aminokwasy 34 do 281 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (x) aminokwasy 34 do 305 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xi) aminokwasy 34 do 329 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xii) aminokwasy 34 do 353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiii) aminokwasy 34 do 416 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiv) aminokwasy 34 do 424 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xv) aminokwasy 34 do 493 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz (xvi) aminokwasy 34 do 551 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: Metoda według dowolnego z zastrzeżeń 1 lub od 3 do 6 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 2 do 6, znamienne tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera fragment polipeptydu wybrany z grupy obejmującej: (i) aminokwasy 34 do 530 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ii) aminokwasy 34 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iii) aminokwasy 34 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (iv) aminokwasy 34 do 533 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (v) aminokwasy 34 do 534 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; 116

118 (vi) aminokwasy 34 do 535 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (vii) aminokwasy 34 do 536 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (viii) aminokwasy 34 do 537 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (ix) aminokwasy 34 do 538 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (x) aminokwasy 34 do 539 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xi) aminokwasy 30 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xii) aminokwasy 31 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiii) aminokwasy 32 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiv) aminokwasy 33 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xv) aminokwasy 34 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xvi) aminokwasy 35 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xvii) aminokwasy 36 do 532 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xiii) aminokwasy 30 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xix) aminokwasy 31 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xx) aminokwasy 32 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xxi) aminokwasy 33 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xxii) aminokwasy 34 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2; (xxiii) aminokwasy 35 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 oraz (xxiv) aminokwasy 36 do 531 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: Metoda opisana w zastrzeżeniu 10 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 10, znamienne tym, że rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera reszty aminokwasowe sekwencji o numerze identyfikacyjnym: Metoda według dowolnego z zastrzeżeń od 3 do 11 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 3 do 11, znamienne tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 zawiera ponadto polipeptyd heterologiczny. 13. Metoda opisana w zastrzeżeniu 12 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 12, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd heterologiczny jest połączony w fuzji ze wspomnianym rozpuszczalnym polipeptydem Sp

119 14. Metoda opisana w zastrzeżeniu 13 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 13, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd heterologiczny jest wybierany z grupy zawierającej: polipeptyd przeciwciała Ig, polipeptyd albuminy surowicy, polipeptyd naprowadzający, polipeptyd reporterowy oraz polipeptyd ułatwiający oczyszczanie. 15. Metoda opisana w zastrzeżeniu 14 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 14, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd heterologiczny jest wybierany z grupy zawierającej: zawias oraz region Fc immunoglobuliny, albuminę surowicy ludzkiej i znacznik histydynowy. 16. Metoda według dowolnego z zastrzeżeń od 3 do 15 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 3 do 15, znamienne tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 jest sprzężony z polimerem. 17. Metoda opisana w zastrzeżeniu 16 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 16, znamienne tym, że wspomniany polimer jest wybierany z grupy obejmującej glikol polialkilenowy, polimer cukru i polipeptyd. 18. Metoda opisana w zastrzeżeniu 17 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 17, znamienne tym, że polimerem jest glikol polialkilenowy, 19. Metoda opisana w zastrzeżeniu 18 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 18, znamienne tym, że glikolem polialkilenowym jest glikol polietylenowy (PEG). 20. Metoda według dowolnego z zastrzeżeń od 16 do 19 lub antagonista przewidziany do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń od 16 do 19, znamienne tym, że wspomniany rozpuszczalny polipeptyd Sp35 jest sprzężony z 1, 2, 3 lub 4 polimerami. 21. Metoda opisana w zastrzeżeniu 20 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 20, znamienne tym, że całkowita masa cząsteczkowa polimerów wynosi od Da do Da. 22. Metoda opisana w zastrzeżeniu 1 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 2, znamienne tym, że antagonista Sp35 zawiera przeciwciało przeciw Sp35 lub jego fragment wiążący antygen. 23. Metoda opisana w zastrzeżeniu 1 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 2, znamienne tym, że wspomniany antagonista Sp35 zawiera polinukleotyd antagonistyczny do Sp35 wybrany z grupy obejmującej: (a) polinukleotyd antysensowny, (b) rybozym, (c) (małe interferujące RNA (sirna) i (d) RNA o strukturze spinki do włosów (shrna). 24. Metoda opisana w zastrzeżeniu 23 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 23, znamienne tym, że wspomnianym polinukleotydem antagonisty Sp35 jest shrna. 25. Metoda opisana w zastrzeżeniu 24 lub antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 24, znamienne tym, że wspomniane shrna zawiera sekwencję nukleotydową: TGATCGTCAT CCTGCTAGAC TTCAAGAGAG TCTAGCAGGA TGACGATCTT TTTTC (numer identyfikacyjny sekwencji: 40). 118

120 26. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że stwardnienie rozsiane (SM) ma przebieg zaostrzająco-zwalniający. 27. Antagonista przewidziany do stosowania według dowolnego z zastrzeżeń od 2 do 26, znamienny tym, że wspomniany antagonista Sp35 zostaje podany poprzez zastrzyk w bolusie lub infuzję chroniczną. 28. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 27, znamienny tym, że wspomniany antagonista Sp35 jest podawany bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego. 29. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 28, znamienny tym, że wspomniany antagonista Sp35 jest podawany bezpośrednio w miejsce przewlekłego uszkodzenia spowodowanego przez SM. 30. Metoda opisana w zastrzeżeniu 1, obejmująca: (a) transfekcję wspomnianych oligodendrocytów z polinukleotydem, który koduje wspomnianego antagonistę Sp35 przez funkcjonalne powiązania z sekwencją kontrolującą ekspresję, a także (b) umożliwienie ekspresji wspomnianego antagonisty Sp Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że wspomniany antagonista jest kodowany przez polinukleotyd funkcjonalne powiązany z sekwencją kontrolującą ekspresję. 32. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 31, znamienny tym, że wspomniany polinukleotyd znajduje się w wektorze ekspresyjnym. 33. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 32, znamienny tym, że wspomniany wektor ekspresyjny jest wektorem wirusowym. 34. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 32 lub 33, znamienny tym, że wspomniany wektor znajduje się w komórce gospodarza. 35. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 34, znamienny tym, że wspomniana komórka gospodarza ma zostać wprowadzona w miejsce lub w pobliżu miejsca występowania stwardnienia rozsianego. 36. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 34 lub 35, znamienny tym, że wspomniana komórka gospodarza zostaje utworzona według metody obejmującej: (a) transformację lub transfekcję odbiorczej komórki gospodarza za pomocą polinukleotydu wspomnianego w zastrzeżeniu 30 lub z wektorem wspomnianym w zastrzeżeniu 32 lub 33 oraz (b) hodowanie tejże transformowanej lub transfekowanej komórki gospodarza. 37. Antagonista przewidziany do stosowania według dowolnego z zastrzeżeń od 34 do 36, znamienny tym, że komórka gospodarza pochodzi od ssaka, który ma zostać objęty leczeniem. 38. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia od 2 do 37, znamienny tym, że wspomniany antagonista Sp35 występuje w ilości wystarczającej do zmniejszenia hamowania różnicowania lub przeżywalności oligodendrocytów w miejscu lub w pobliżu miejsca stwardnienia rozsianego. 119

121 39. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia od 2 lub 38, znamienny tym, że wspomniany antagonista Sp35 występuje w ilości wystarczającej do zmniejszenia hamowania mielinizacji za pośrednictwem oligodendrocytów w miejscu lub w pobliżu miejsca stwardnienia rozsianego. 40. Antagonista przewidziany do stosowania według zastrzeżenia 33, znamienny tym, że wektor wirusowy wybierany jest z grupy obejmującej wektor adenowirusowy, wektor lentiwirusowy, wektor bakulowirusowy, wektor papowawirusowy, wektor wirusa opryszczki oraz wektor wirusa Epsteina-Barra. 41. Antagonista przewidziany do stosowania według dowolnego z zastrzeżeń 32, 33 lub 40, znamienny tym, że wspomniany wektor ma zostać podany jednym ze sposobów z grupy obejmującej: podanie miejscowe, podanie pozajelitowe, podanie dooponowe i podanie podskórne. 120

122 Rys. 1a. 121

123 Rys. 1b. 122

124 Rys

125 Rys

126 Rys

127 Rysunek 5 126

128 Rysunek 6 β-aktyna Bez RNAi Kontrolne RNAi LINGO-1 RNAi 127

129 Rysunek 7 128

130 Rysunek 8 % dojrzałych oligodendrocytów Kontrolne-FC Stężenie białek (µg/ml) Kontrolne-FC Kontrolne-FC Kontrolne-FC 129

131 Rysunek 9 Całkowite RhoA β-aktyna Kontrolne-Fc Kontrola 130

132 Rysunek 10A Mielinizujące MBP + komórek/studzienkę Stężenie białek (µg/ml) Rysunek 10B Kontrolne-Fc Kontrolne-Fc Kontrolne-Fc Kontrolne-Fc Kontrolne-Fc Tubulina βiii 131

133 Rysunek 10C i 10D Rozpuszczalny LINGO-1 wzmacnia mielinizację aksonów za pomocą oligodendrocytów. Kontrolne-Fc Przewężenie Ranviera 132

134 Rysunek 10E Mielinizujące MBP + komórek/studzienkę Kontrola Rysunek 10F β-aktyna Kontrola 133

135 Rysunek 10G Mielinizujące MBP + komórek/studzienkę Kontrola Zakażenie DRG Zakażenie oligo Podwójne zakażenie 134

136 Rysunek 11 Względna obfitość zmielinizowanych aksonów Myszy nokautowe LINGO-1 wykazują hypermielinizację rdzenia kręgowego 135

137 Rysunek 12 Kontrolne-Fc tydzień tydzień tydzień 136

138 Rysunek 13 Kontrola 137

139 Rysunek 14 Kontrola 138

140 Rysunek 15 Domena Ig LINGO-1 wzmacnia mielinizację we wspólnych hodowlach 139

141 Rysunek 16 β-aktyna Peptyd RKH LINGO-1 wzmacnia mielinizację we wspólnych hodowlach 140

142 ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Lista przytoczonych przez zgłaszającego odnośników ma na uwadze jedynie wygodę czytelnika. Nie stanowi ona części Europejskiego dokumentu patentowego. Mimo, że zestawienie było wykonane z dużą starannością, nie można wykluczyć błędów lub pominięć i EUP nie bierze za nie żadnej odpowiedzialności. Dokumenty patentowe cytowane w opisie 141

143 Literatura niepatentowa cytowana w opisie 142

144 143

145 144

146 145