Wykład Monograficzny dla Doktorantów

Transkrypt

1 Wykład Monograficzny dla Doktorantów Badanie mechanizmów reakcji katalizowanych przez enzymy Część pierwsza gólne informacje o enzymach

2 Treść I części wykładu 1. gólne własności enzymów. 2. Zalety biokatalizy. 3. odzaje selektywności enzymów. 4. Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej. 5. Klasyfikacja enzymów. 6. Enzymatyczne syntezy związków biologicznie czynnych. 7. Kinetyka reakcji enzymatycznych.

3 Enzymy Enzymy są biologicznymi polimerami katalizującymi liczne procesy, bez których życie nie byłoby możliwe. Enzym to biokatalizator białkowy wytwarzany przez żywe komórki organizmu. Ten biokatalizator ma zdolność do obniżania energii aktywacji danej reakcji chemicznej, co skutkuje jej przyspieszeniem. Katalizują one reakcje w układach biologicznych. Bez ich obecności dana reakcja nie zachodzi, lub przebiega tak wolno, że jej rezultat jest niezauważalny. Enzymy charakteryzują się wysoką specyficznością, zarówno pod względem katalizowanej reakcji, jak substratów biorących w niej udział. Enzymy są białkami prostymi i złożonymi. Enzym złożony składa się z części białkowej i składnika niebiałkowego, zwanego kofaktorem. Część białkowa takiego enzymu jest zwana apoenzymem, a połączenie apoenzymu z kofaktorem nosi nazwę holoenzym. oloenzym = kofaktor + apoenzym Gdy kofaktor tj. część niebiałkowa jest związana na stale z apoenzymem nazywamy ją inaczej grupą prostetyczną. Gdy kofaktor jest nietrwale związany z apoenzymem jest zwany koenzymem.

4 Zalety biokatalizy 1. Enzymy to efektywne katalizatory zwiększają przynajmniej 10 6 szybkość reakcji. W razie ich nieobecności szybkość reakcji w układach biologicznych jest niezauważalna. 2. Enzymy charakteryzują się dużą specyficznością. 3. Enzymy działają w łagodnych warunkach tj. przy ciśnieniu atmosferycznym; W większości przypadków w przedziale temp o C; Przy p bliskim neutralnemu; eakcje przebiegają w środowisku wodnym. 4. dpady z reakcji są mało szkodliwe dla środowiska. 5. eakcje enzymatyczne prowadzi się w prostych aparatach. 6. eakcje enzymatyczne wyróżniają się wysoka wydajnością. 7. Enzym nie katalizuje reakcji ubocznych.

5 odzaje selektywności enzymów 1. Chemoselektywność (np. hydrolizuje estry, a nie hydrolizuje acetali lub amidów). 2. egioselektywność i diastereoselektywność (np. z kilku takich samych grup funkcyjnych w substracie wyróżnia tylko jedną). 3. Enancjoselektywność (np.katalizuje tylko reakcje z L-aminokwasem lub tylko z D-sacharydem).

6 Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej 1. ozdzielanie mieszanin racemicznych. 2. trzymywanie związków optycznie czynnych. 3. Synteza związków użytecznych biologicznie lub chemicznie.(np.alkoholi, amidów, aminokwasów). 4. Synteza związków niemożliwych do otrzymania na drodze klasycznej syntezy organicznej. 5. Możliwość otrzymania związków selektywnie znakowanych izotopami stabilnymi lub promieniotwórczymi. a. Izotopami wodoru. b. Promieniotwórczym izotopem 32 P. c. Promieniotwórczym izotopem 35 S. d. Izotopami węgla (stabilnym 13 C i promieniotwórczymi 14 C i 11 C).

7 1. Mikroskala. Wady przy stosowaniu enzymów 2. Wymagana jest wysoka czystość substratów. Niektóre zanieczyszczenia, nawet w małej ilości powodują inhibicję enzymów. 3. Niektóre enzymy są bardzo drogie. Nie wszystkie znajdują się w sprzedaży. Wydzielanie ich z materiału biologicznego jest bardzo pracochłonne i kosztowne.

8 Miejsce (centrum aktywne) enzymu W wiązaniu substratu i w przetwarzaniu go w produkt uczestniczy specyficzny region cząsteczki białka enzymatycznego, nazywany miejscem aktywnym lub centrum aktywnym enzymu.w jego strukturze można wyróżnić dwa elementy funkcjonalne. Są to: miejsce wiązania substratu i miejsce katalityczne. Centrum aktywne cechuje się następującymi właściwościami: A. Zajmuje stosunkowo mały fragment cząsteczki enzymu.tylko nieliczne reszty amino- kwasowe białka enzymatycznego wchodzą w bezpośredni kontakt z substratem. B. Miejsce aktywne jest układem przestrzennym, złożonym z łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych, zajmujących różne odległe pozycje. C. W tworzeniu miejsca aktywnego uczestniczą przede wszystkim te reszty aminokwasowe, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami lub akceptorami protonów. D. Miejsca aktywne są zagłębieniami lub szczelinami w strukturze cząsteczki białka enzymatycznego.

9 Międzynarodowy kod enzymatyczny Międzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d. Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego kodu genetycznego. Liczba a określa numer klasy enzymu; Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy; Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy; Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej popodpodklasy. Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny numer identyfikacyjny. Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1, obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od grupy -C-. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy 1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy - C- na NAD +. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1

10 EGISELEKTYWNA YDLIZA ESTÓW PZEZ PLE 4 1 CMe C PLE CMe bufor CMe

11 EGISELEKTYWNA YDLIZA DIESTÓW E/Z DIASTEETPWYCZ UŻYCIEM PLE CEt PLE CEt E / Z CEt bufor Z C =, Me 2 N, N 2

12 ENZYMATYCZNY ZDZIAŁ ESTÓW AMINKWASWYC Z UŻYCIEM ESTEAZY 1 C N N esteraza lub proteaza C 1 C N 2 2 L D bufor = alkyl, aryl, 1 = Me, Et, 2 =, acyl

13 ZDZIAŁ ACEMICZNYC DILI W UKŁADZIE LAD / AlEYD -D rac LAD NAD + recykling D e.e. ( nie określono) + L e.e > 97 % C = -C 2, -C 2 F, -C 2 Cl, -C 2 Br, -C 3, -C 2 N 2, -C=C 2, -C 2 C 3 L Aldehydo-D NAD + recykling LAD - orse Liver Alcohol Dehydrogenase (hydrogenaza alkoholowa z wątroby końskiej) D - Dehydrogenase

14 Przekształcania glukozo-6-fosforanu w zależności od enzymu C 2 glukozo-1- P P PGM P PI P C 2 fruktozo-6-p C 2 C 2 P DG-6- P G-6-F C 2 C 2 6- P -glukonolakton P = fosforan glukoza PGM = fosfogluomutaza PI = fosfoheksoizomeraza DG-6- P = dehydrogenaza glukozo-6- P G-6-F = glukozo-6-fosfotaza

15 Mechanizm biokatalizy na przykładzie wybranych enzymów Mechanizm biokatalizy został dość dobrze poznany dla kilku enzymów hydrolitycznych tj. Lizozymu, karboksypeptydazy A i chymotrypsyny. Lizozym jest białkiem enzymatycznym o dość prostej strukturze: zawiera 129 reszt aminokwasowych. Nie ma grupy prostetycznej. Jego struktura przestrzenna jest stabilizowana przez cztery wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe. Substratem lizozymu jest polisacharyd ściany bakteryjnej, zbudowany z powtarzającego się wielokrotnie dimeru: złożonego z kwasu N- acetylomuraminowego i N-acetyloglukozoaminy. bydwa te składniki są połączone wiązaniem 1,4-β-glikozydowym. Wiązanie to jest rozkładane przez lizozym. Na powierzchni cząsteczki lizozymu znajduje się zagłębienie wiążące polisacharyd. Decydujące znaczenie dla biokatalizy mają dwie grupy karboksylowe. Są to: niezjonizowana grupa γ-karboksylowa glutaminianu w pozycji 35 i zjonizowana grupa β-karboksylowa asparaginianu w pozycji 52

16 eakcja katalizowana przez lizozym NAG NAM NAG NAM C C C C 2 N C C 3 N C C 3 N C C 3 N C C 3 2 NAG = N-acetyloglukozoamina NAM = kwas N-acetylomuraminowy C 2 6 C C 2 C 2 N C C N 1 C C N 1 C C 3 N C C 3 NAG NAM NAG NAM

17 Karboksypeptydaza A Jest enzymem proteolitycznym, odłącza od białka (peptydu) pojedyncze aminokwasy C-końcowe, z wyjątkiem lizyny i argininy. Wykazuje szczególnie wysoką aktywność wobec wiązań peptydowych, powstałych z udziałem aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny lub długołańcuchowy. Jest białkiem jednołańcuchowym, zbudowanym z 307 reszt aminokwasowych i objętych w 38 procentach strukturą α-helisy. Cząsteczka enzymu jest zwarta, ma kształt elipsolidalny, a w miejscu aktywnym zawiera kowalencyjnie związany jon cynku (Zn 2+ ).Jon ten wytwarza wiązania koordynacyjne z dwoma łańcuchami bocznymi histydyny, łańcuchem bocznym glutaminianu i cząsteczką wody. Dzięki temu połączeniowi cząsteczka wody staje się bardzo aktywna.wiązanie substratu powoduje istotne zmiany centrum aktywnego enzymu.

18 Chymotrypsyna Jest ona także enzymem proteolitycznym. W odróżnieniu od karboksypeptydazy nie odłącza aminokwasów C-końcowych tylko hydrolizuje wiązania peptydowe położone w głębi łańcucha białkowego, co prowadzi do fragmentacji substratu na peptydy o różnej długości. Jest białkiem złożonym z trzech łańcuchów polipeptydowych, połączonych mostkami disiarczkowymi. Centrum aktywne chymotrypsyny: seryna 195, histydyna 57 i asparaginian 102.

19 PDZIAŁ ENZYMÓW XYDEDUKTAZY Katalizują reakcje utleniania i redukcji TANSFEAZY Katalizują przenoszenie grup funkcyjnych (np. aldehydowych, ketonowych, acylowych) YDLAZY Katalizują hydrolizę np. peptydów, estrów, amidów LIAZY Katalizują reakcje addycji i eliminacji IZMEAZY Katalizują racemizację, przenoszenie wiązań wielokrotnych, przekształcenie grup funkcyjnych LIGAZY ( SYNTETAZY ) Katalizują tworzenie wiązań C - C, C- heteroatom (mają zastosowanie w syntezie organicznej )

20 KENZYMY NIEZBĘDNE PDCZAS BITANSFMACJI KENZYM NAD + / NAD NADP + / NAD ATP /a SAM Acetyl - CoA Flawiny Pyridoksal-fosforan Biotyna Kompleksy metaloporfirynowe TYP EAKCJI usunięcie lub addycja wodoru jak wyżej fosforylacja C 1 - alkilacja C 2 - alkilacja utlenianie transaminacja karboksylacja utlenianie peroksydacja a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie. G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.

21 ksyreduktazy Katalizują reakcję utleniania i redukcji. Przykładem może być dehydrogenaza mleczanowa, która przekształca mleczan w pirogronian z udziałem NAD + i odwrotnie z udziałem NAD NAD + NAD + + C 3 C C - dehydrogenaza mleczanowa C 3 C C - mleczan pirogronian

22 UTLENIANIE ALKLI ASPEKT STECEMICZNY C 3 D C D + N ' N 2 D AD C 3 C -adenozyno-difosforan rybozy + D N ' N 2 UTLENIANIE ALDEYDÓW C Acc C LAD C +.Acc Acc - grupa przyłączająca jon hydroniowy z utlenianej cząsteczki

23 UTLENIANIE PIEWSZĘDWYC AMIN D ALDEYDÓW Eox + S N 2 BSA Ered + S BSA - Bovine Serum Amine xidase

24 EAKCJE ALKINÓW I CYKLPPANÓW KATALIZWANE ALPEKSIDAZĘ C 3 chloroperoksidaza Cl -, Cl Cl Cl CCl 2 1 : 2 : 0, 3 chloroperoksidaza Br -, 2 2 Br + CBr 2 chloroperoksidaza X -, 2 2 X = C 3, X = Cl = Ph, X = Br

25 ALGENACJA ZWIĄZKÓW AMATYCZNYC N 2 N 2 chloroperoksidaza Br Br -, 2 2 Cl Cl p-chloroanalina 2-bromo-4-chloroanilina AcN S chloroperoksidaza AcN S Br N Br -, 2 2 N N-acetylo-tiazol N-acetylo-2-bromotiazol

26 TZYMYWANIE ALYDYN Z ALKENÓW chloroperoksidaza J -, 2 2 J + J 90 : 10 Br Br bromoperoksidaza Br -, 2 2 Br 90 : 10 ślady Br chloroperoksidaza Br -, 2 2 Br chloroperoksidaza Br -, 2 2 rac Br rac

27 EAKCJA ALGENWANIA L-TYZYNY Z UDZIAŁEM ENZYMU CLPEKSYDAZY C chloroperoksydaza I C N 2 2 2, X -, bufor N 2 gdzie X - = Cl -, Br -, I -

28 Transferazy Przenoszą grupy chemiczne z substratu (dawcy) na produkt (biorca lub akceptor). Np. aminotransferaza alaninowa przenosi -N 2 z glutaminianu na pirogronian w wyniku czego powstaje alanina i α-ketoglutaran. Koenzymem jest fosforan pirodoksalu. C - C 2 C 2 + C N 3 C - + C 3 C C - PLP aminotransferaza alaninowa C - C 2 C 2 C C - + C 3 + C N 3 C - glutaminian pirogronian α ketoglutaran alanina

29 SYNTEZA DIYDKSYACETNU ZNAKWANEG FSFEM P- 32 C 2 C C AT P Fosforokinaza 32 C 2 P C C AD P + P = fosforan

30 ydrolazy ydrolizują wiązania np. amidowe, estrowe, itp. ydroliza peptydów i białek, kwasów nukleinowych

31 Liazy Liazy są enzymami, które katalizują reakcje addycji lub eliminacji. W wyniku reakcji eliminacji powstają dwa produkty. Jednym z nich jest najczęściej woda, amoniak, dwutlenek węgla, czy cząsteczka aldehydu, które odrywają się od substratu i w wyniku tej reakcji powstaje w produkcie podwójne wiązanie lub układ cykliczny. Liazy dzielimy: -ze względu na rodzaj powstającego produktu; -ze względu na rodzaj użytego kofaktora.

32 LIAZY Są enzymami katalizującymi przekształcenie substratu, którym towarzyszy powstawania lub zanik wiązania podwójnego. Przykładem jest fumaraza enzym cyklu kwasów trikarboksylowych, katalizujący odwracalną przemianę fumaranu w jabłczan. W tej reakcji powstaje lub zanika wiązanie podwójne - C C C C fumaraza - C C C C - fumaran jabłczan

33

34

35 Addycja amoniaku do kwasu (E)-cynamonowego Ph C PAL T(or D) N 2 C [3S- 2 ]-, or [3S- 3 ]-L-Phe

36

37 ADDYCJA WDY KATALIZWANA PZEZ FUMAAZĘ C X fumaraza C bufor X C C X =, Cl Kwas (chloro)fumarowy [trans(chloro)butanodiowy] e.e. 100 % Kwas hydroksy(chloro)butanodiowy

38

39 Dekarboksylacja kwasów organicznych polega na rozerwaniu wiązania C-C, a jednym z jej produktów jest C 2. Enzymatycznej dekarboksylacji ulegają cztery typy kwasów karboksylowych: α-ketonokwasy β-ketonokwasy C C hydroksykwasy aminokwasy C C N 2

40 W wyniku enzymatycznej dekarboksylacji α-aminokwasów powstają aminy biogenne. N 2 C enzym N 2 + C 2 Biogenne aminy spełniają doniosła rolę w metabolizmie organizmach żywych. Niektóre z nich wchodzą w skład błon organelli komórkowych. Są składnikami koenzymów, witamin, choliny. Pełnią rolę hormonów tkankowych, Pewne z nich są ważnymi neuroprzekaźnikami.

41 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 N 2 N 2 L-treonina propanoloamina Składnik witaminy B 12 N 2 C C 2 N 2 etanoloamina L-seryna Składnik fosfatydów i choliny.

42 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C C 2 C N 2 ΝΗ 2 kwas L-glutaminowy kwas χ-aminomasłowy Produkt metabolizmu w mózgu. Neuroprzekaźnik S N 2 C C 2 S N 2 L-cysteina cystamina Składnik koenzymu A

43 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 N 2 N 2 N 2 N 2 L-lizyna kadaweryna Stabilizator rybosomów. Produk tmetabolizmu bakterii przewodu pokarmowego. C C C 2 C N 2 ΝΗ 2 kwas L-asparginowy β alanina Składnik koenzymu A

44 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim N N N 2 C C 2 N N N 2 L-histydyna histamina ormon tkankowy obniżający ciśnienie C C 2 N 2 N 2 L-tyrozyna tyramina ormon tkankowy powoduje skurcze macicy

45 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 N N 2 N N 2 L-tryptofan tryptamina ormon tkankowy C C 2 N N 2 N N 2 5'-hydroksy-L-tryptofan serotonina ormon tkankowy podwyższający ciśnienie krwi, neuroprzekaźnik

46 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 L-DPA N 2 N 2 (3',5'-dihydroxyphenylalanine) dopamina Prekursor w syntezie melanin (naturalnych pigmentów zwierzęcych) oraz katecholoamin takich jak: noradrenaliny i adrenaliny tj. jednych z najważniejszych neuroprzekażników

47 Stereospecyficzność enzymatycznej dekarboksylacji L-aminokwasów T (S) T (S) C dekarboksylaza N 2 2 N 2 () [2S- 3 ]-α L-aminokwas [1S- 3 ]-α amina (S) C N 2 α L-aminokwas dekarboksylaza T (S) N 2 T () [1-3 ]-α amina T (S) C N 2 [2S- 3 ]-α L-aminokwas dekarboksylaza D 2 T (S) N 2 D() [1S- 3, 1-2 ]-α amina

48 IZMEAZY Są enzymami katalizującymi reakcje izomeryzacji. Przykładem może być jeden z enzymów glikolizy tj. izomeraza fosfotriozowa. Przekształca ona odwracalnie aldehyd 3-fosfoglicerolowy w fosfodihydroksyaceton. C C C P izo meraza fosfotriozowa C C C P aldehyd 3-fos foglicerynowy fosfodihydroksyaceton

49

50

51

52

53

54 SYNTETAZY czyli LIGAZY Są enzymami katalizującymi reakcje syntezy kosztem energii pochodzącej od ATP (lub innego nukleotydu trifosforanowego). Np.. Enzym syntetaza glutaminy wiąże amoniak z grupą γ-karboksylową kwasu glutaminowego, tworzac glutaminę. W reakcji zużuwa się jedna cząsteczka ATP. C C C 2 C 2 - C - N 3 + ATP syntetaza glutaminy ADP + Pi N 2 C C 2 C 2 C C - N 3 + glutaminian glutamina

55 KENZYMY NIEZBĘDNE PDCZAS BITANSFMACJI KENZYM NAD + / NAD NADP + / NAD ATP /a SAM Acetyl - CoA Flawiny Pyridoksal-fosforan Biotyna Kompleksy metaloporfirynowe TYP EAKCJI usunięcie lub addycja wodoru jak wyżej fosforylacja C 1 - alkilacja C 2 - alkilacja utlenianie transaminacja karboksylacja utlenianie peroksydacja a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie. G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.

56 Koenzymy mogą być klasyfikowane zależnie od grupy, przeniesienie której ułatwiają NAD +, NADP + FMN, FAD Kwas liponowy Koenzym Q Koenzymy przenoszące wodór : Koenzymy przenoszące inne grupy niż CoA-S Pirofosforan tiaminy Fosforan pirodoksalu Koenzymy folianowe Biotyna Koenzymy kobamidowe

57 Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy - NAD + amid kwasu nikotynowego N 2 N 2 N N adenina N - - C 2 P P C 2 N N P ryboza ryboza Przez przyłączenie fosforanu P poprzez wiązanie estrowe w miejscu wskazanym strzałką, powstaje fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP + )

58 Flawinomononukleotyd (FMN) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) dimetyloizoalloksazyna dimetyloizoalloksazyna 3 C N N 3 C N N 3 C N N 3 C N N C 2 C 2 N 2 rybitol C C C rybitol C C C N N N N adenina C P C P P C 2 FMN ryboza FAD

59 Koenzym A (CoA) Jest przenośnikiem grup acylowych (reszt kwasowych). W jego strukturze można wyróżnić trzy elementy składowe. - Nukleotyd difosforanowy adenozynodifosforan (ADP) - Kwas pantotenowy (witaminab 5 ), będący połączeniem β-alaniny i kwasu pantoinowego - Cysteamina. Cysteamina zawiera grupę S, która wytwarza wiązania tioestrowe z różnymi kwasami organicznymi. Na tej drodze powstają acylowe pochodne CoA, określane w skrócie jako acylo S-CoA.Ta forma zapisu acylowych pochodnych CoA ma na celu wskazanie, że miejscem wiązania grupy acylowej jest atom siarki, a połączenie pomiędzy siarką CoA a grupą acylową (przedstawione falista kreską ) jest wiązaniem bogatym w energię.tą droga reszty kwasowe zostają aktywowane. W tej postaci mogą być substratami w syntezie różnych estrów np. acetocholiny, acylogliceroli, bądź włączać się do szlaków katabolicznych, takich jak: β-oksydacja kwasów tłuszczowych lub cykl kwasów trikarboksylowych.

60 Koenzym A cysteamina kwas pantotenowy N N 2 N S C 2 C 2 N C C 2 C 2 N C C C 3 C C 2 C 3 P N P C 2 N β alanina kwas pantoinowy P Zaznaczono składniki koenzymu A oraz grupę S będącą miejscem wiązania reszt acylowych

61 S-Adenozylometionina (SAM) Koenzym SAM jest przenościkiem C 3 na różne akceptory. Po odłączeniu C 3 powstaje S-adenozylohomocysteina zdolna do przyłączenia grupy metylowej i odtworzenia cząsteczki SAM N N 2 N N N 3 C S C 2 metionina + 3 N C 2 C 2 C C - SAM

62 Biotyna Koenzym biotyna wiąże C 2 tworząc karboksybiotynę substrat w reakcjach karboksylacji. Jest to reakcja odwracalna. C 2 BITYNA N S N C 2 C 2 C 2 C 2 C kwas walerianowy

63 Liponian/lipoamid Ten tiokwas występuje w dwóch postaciach. W formie zredukowanej ma dwie grupy S przy C 6 i C 8, a w formie utlenionej zawiera mostek disiarczkowy. GrupaC - jest połączona z enzymem przez wiązanie amidowe ε-n 2 reszty Lys, dlate-go koenzym jest zwany lipoamidem. Liponian jest przejściowym akceptorem grup acylowych w procesie oksydacyjnej dekarboksylacji α-aminokwasów. C 2 C 2 C C 2 C 2 C 2 C 2 C - +2 S S liponian -2 C 2 C 2 C C 2 C 2 C 2 C 2 C - S S dihydroliponian

64 Zastosowanie enzymów w praktyce medycznej Enzymy znajdują liczne praktyczne zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej wielu chorób; są odczynnikami laboratoryjnymi lub lekami. Zastosowanie enzymów do naprawy materiału genetycznego komórki stwarza nowe możliwości leczenia wrodzonych wad metabolicznych i chorób nowotworowych. Enzymy jako markery chorób. Aktywność niektórych enzymów w tkankach i płynach ustrojowych zmienia się w przebiegu różnych chorób. Na przykład aktywność aminotransferaz w osoczu krwi rośnie w przebiegu zawału mięśnia sercowego lub uszkodzenia wątroby. Aktywność amylazy enzymu rozkładającego skrobię wzrasta u chorych na zapalenie trzustki. Znaczenie diagnostyczne maja tez wzajemne relacje pomiędzy aktywnościami określonych izoenzymów np. -u ludzi zdrowych aktywność LD-1 w osoczu krwi jest niższa niż LD-2. -u chorych z zawałem serca aktywność LD-1 przewyższa aktywność LD-2

65 Enzymy jako leki i odczynniki Niektóre enzymy służą jako leki np. - Lipaza enzym hydrolizujący tłuszcze jest użyteczna w leczeniu niedomogi wydzielniczej trzustki. - Asparaginaza enzym rozkładający asparaginę jest przydatna w leczeniu białaczek. Pewne enzymy służą jako odczynniki w praktyce laboratoryjnej np. - Ureaza może być zastosowana do oznaczania mocznika, - Dehydrogenaza mleczanowa - do oznaczania mleczanu. Enzymy w biotechnologii i terapii genowej Za pomocą nukleaz można wycinać wadliwe skonstruowane odcinki DNA, a powstałe ubytki wypełniać odpowiednimi fragmentami pochodzących z komórek zdrowych tego samego gatunku. Zespalanie fragmentów DNA jest możliwe dzięki ligazom DNA. Stwarza to możliwość naprawy uszkodzonego genu i otwiera perspektywę rozwoju nowej dziedziny medycyny, określanej mianem terapii genowej.

66 Międzynarodowy kod enzymatyczny Międzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d. Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego kodu genetycznego. Liczba a określa numer klasy enzymu; Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy; Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy; Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej popodpodklasy. Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny numer identyfikacyjny. Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1, obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od grupy -C-. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy 1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy - C- na NAD +. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1

67 ENZYMY KINETYKA FMALNA Część II

68 Katabolizm Anabolizm Procesy metaboliczne Procesy kataboliczne przekształcają składniki tkanek do mniejszych, prostszych cząsteczek. Końcowymi produktami katabolizmu są bardzo proste substancje jak woda, dwutlenek węgla, amoniak, mocznik czy kwas moczowy. Procesom katabolicznym (np.reakcje utleniania) towarzyszy uwalnianie energii i jest ona przetwarzana w formę użyteczną dla komórki. Jest magazynowana w postaci związków bogato energetycznych. Procesy anaboliczne polegają na syntezie składników złożonych ze składników prostych wykorzystując energię uzyskaną z procesów katabolicznych. Synteza zachodząca w układzie biologicznym często nazywa się biosyntezą. W wyniku biosyntezy powstają z prostych związków wielkocząsteczkowe tj. białka, polisacharydy czy kwasy nukleinowe. Większość energii zmagazynowanej w wiązaniach chemicznych składników odżywczych ulega rozproszeniu w postaci ciepła, dlatego masa pożywienia potrzebna organizmowi jest zdecydowanie większa niż łączna masa produktów, które mogą być wytworzone w procesach anabolicznych.

69 Entropia Entropia, funkcja termodynamiczna, jest miarą uporządkowania układu. Im większy jest stan nie uporządkowania (chaos), tym większa jest entropia układu. Procesy anaboliczne prowadzą do wzrostu uporządkowania materii biologicznej.w tym przypadku entropia maleje Procesy kataboliczne zmniejszają stopień uporządkowanie materii. W tym przypadku entropia wzrasta.

70 Energia swobodna ` Zawartość energii swobodnej w produktach reakcji jest niższa lub wyższa od jej zawartości w substratach reakcji. óżnica ta nosi nazwę zmiany energii swobodnej ( G). Wartość ta mierzona w standardowych warunkach (standardowych warunkach tj. wtedy gdy stężenie substratów wynosi 1M, p 7,0) nosi nazwę standardowej zmiany energii swobodnej i jest określana symbolem G 0. A+ B C + D G 0 K = [C][D] [A][B] [ C][ D] = T ln [ A][ B] G 0 =- TlnK = -2,303 TlogK Z powyższego równania wynika, że przy stałej temperaturze G 0 zależy wyłącznie od od K. Jeżeli K = 1, to G 0 = 0. Nie zachodzi żadna reakcja lub przebiega ona w obu kierunkach z taką samą szybkością.

71 Energia swobodna cd. Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów jest większy niż iloczyn stężeń substratów, to stała równowagi K jest wyższa od 1, a G 0 ma wartość ujemną. znacza to, że reakcja jest egzoergiczna. eakcja jest spontaniczna i zachodzi tak długo, aż G 0 osiągnie wartość zerową. Ustala się wtedy stan równowagi. Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów C i D jest niższy od iloczynu stężeń substratów to stała równowagi K jest niższa od 1, a G 0 ma wartość dodatnią. znacza to ze reakcja przebiega z pobieraniem energii, jest endoergiczna i nie zachodzi spontanicznie w kierunku A + B C + D. W odwracalnej reakcji wartość bezwzględna a G 0 w obydwu kierunkach jest jednakowa tylko różni się znakiem. Jeżeli G 0 ma wartość ujemną, nosi nazwę termodynamicznie korzystnej. Może ona zachodzić samorzutnie. Jeżeli dla reakcji wartość G 0 jest dodatnia, to ta reakcja jest termodynamicznie niekorzystna. Nie może zajść spontanicznie. W organizmie zachodzą reakcje obydwu rodzajów. eakcje termodynamicznie niekorzystne są napędzane reakcjami termodynamicznie korzystnymi.

72 Efekt termodynamiczny reakcji A (substrat) --- B (produkt) C (substrat) --- D (produkt) G G A D Stan początkowy G < 0 B Stan początkowy G > 0 Stan końcowy Stan końcowy C Przebieg reakcji eakcja termodynamicznie korzystna Przebieg reakcji eakcja termodynamicznie niekorzystna

73 Addytywność zmian energii swobodnej Zmiany wolnej energii, towarzyszące następującym po sobie reakcjom, sumują się. kreśla się to mianem addytywności zmian wolnej energii. W organizmie funkcjonują ciągi reakcji enzymatycznych, których celem jest wieloetapowe przekształcenie substratów w określone produkty. Substrat A, pod działaniem enzymu a przechodzi w produkt B, a ten staje się substratem do enzymu b, który przekształca go w produkt C itd. Dzięki addytywnej właściwości wolnej energii szlak metaboliczny może funkcjonować w kierunku: A B C D dopóki suma G 0 wszystkich reakcji składowych jest ujemna. Może to występować także wtedy, gdy niektóre reakcje z reakcji cząstkowych wykazują G 0 dodatnie. Przykładem takiego szlaku metabolicznego jest glikoliza.

74 eakcja przebiegająca z enzymem i bez udziału enzymu G G a bez enzymu G a z enzymem Stan początkowy Stan końcowy Przebieg reakcji

75 FMALNA KINETYKA EAKCJI KATALIZWANYC PZEZ ENZYMY (1) E + S k k +1-1 ES k +2 produkty 1.1 v(szybkość) = k +2 [ ES ] 1.2 Jeżeli oznaczymy K s jako stałą równowagi dysocjacji kompleksu ES na E i S, i jeżeli przez [E'] oznaczymy początkowe stężenie enzymu; wtedy stężenie wolnego enzymu wynosi ([E'] - [ES]). Wówczas: [E][S] K s = = [ES] K s ([E] - [ES])[S] [ES] ([E][S] - [ES][S]) = [ES] Z równania 1.2 otrzymujemy: v = k [ E] +2 K s 1+ [ S] 1.5

76 FMALNA KINETYKA EAKCJI KATALIZWANYC PZEZ ENZYMY (2) Kiedy stężenie substratu jest bardzo duże, wtedy równanie (1.5) określa maksymalną szybkość reakcji V i zbliża się do wyrażenia V = k [E'] +2 Wstawiając to wyrażenie na V do równania (1.5) otrzymujemy v = Jest to równanie Michaelisa - Menten'a V 1 + K s [S] Stałą Michaelisa, K m, definiuje się jako takie stężenie [S], przy którym osiąga się połowę szybkości maksymalnej V. Wartość K m można otrzymać eksperymentalnie z (1.6) Chociaż jest możliwe wyznaczyć K m z wykresu, lecz dokładność jest mała, ze względu na asymptotyczny charakter zależności. W praktyce preferuje się stosowanie przez przekształcenie (1.6): 1 v = 1 Km [S] V + 1 V równania (1.7) otrzymanego

77 WYKES MICAELISA- MENTEN A V/2 K m stężenie substratu [ S ] Zależność szybkości reakcji v od stężenia substratu [S] w warunkach stałego stężenia enzymu. Przy wysokich stężeniach substratu szybkość reakcji v osiąga wartość maksymalną V. K m równa się stężeniu substratu przy wartości v = 0.5 V.

78 WYKES LINEWEAVEA - BUK A ( podwójne odwrotności) 1/v nachylenie = K / V m odcięta = -1 / K m odcięta = 1 / V 1 / [ S] Zależność 1/v od 1/[S] dla reakcji katalizowanej enzymatycznie opisanej równaniem Michaelis-Menten a Zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten a, K m = K s. Wobec tego K m siły wiązania między enzymem a substratem. jest bezpośrednią miarą Powyższy wykres jest też bardzo użyteczny do badania inhibicji w reakcjach enzymatycznych.

79 Zależność prędkości reakcji enzymatycznej (V) od temperatury V Temperatura [ o C]

80 Zależność prędkości reakcji katalizowanych przez niektóre enzymy od p V pepsyna amylaza trypsyna p

81 Przykładowe wartości stałej Michaelisa Fumaraza Enzym Substrat fumaran K M [mol/l] 5, Penicylinaza benzylopenicylina 5, Esteraza acetylocholinowa acetylocholina 9, β-galaktozydaza laktoza 4, Anhydraza węglanowa C 2 1, Ureaza mocznik 2,5 10-2

82 Efektory allosteryczne Efektory allosteryczne są drobno cząsteczkowymi metabolitami, które łącząc się z białkiem enzymatycznym modyfikują jego strukturę czwartorzędową, a niekiedy strukturę trzeciorzędową. Efektem tego jest zmiana powinowactwa enzymu do substratu, co skutkuje zmianą wartości K m. Enzymy podatne na działanie tych efektorów noszą nazwę efektorów allosterycznych. Powoduje to zmianę wykresu Michaelisa- Mentena. Efektory allosteryczne dzielą się na dodatnie (aktywatory allosteryczne) i ujemne (inhibitory allosteryczne). Aktywator allosteryczny sprawia,że prędkość maksymalna reakcji zostaje osiągnięta przy niższym p. Wartość K m maleje. Inhibitor allosteryczny powoduje efekt odwrotny. Wartość K m wzrasta.

83 Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcji z udziałem inhibitora kompetycyjnego (-) inhibitor V max (-) inhibitor (+)inhibitor V max 2 (+)inhibitor 1/V max = 1/V max (i) K M K M (i) [S] -1/K M 1/K M (i) [S] A B

84 Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcji z udziałem inhibitora niekompetycyjnego V 1/V (+) inhibitor V max 1/V max (i) (-) inhibitor V max (i) max/2 (+) inhibitor 1/V max (-) inhibitor V ma (i) 2 K M =K M (i) [S] 1/K M = 1/K M (i) B [S] A

85 óżnice między inhibitorami kompetycyjnymi i niekompetycyjnymi Budowa Inhibitor kompetycyjny Podobny do substratu Inhibitor niekompetycyjny Niepodobny do substratu Miejsce wiązania dwracalność inhibicji V max K M Miejsce aktywne Inhibicja odwracalna przez wzrost stężenia substratu Bez zmian wzrasta Inhibicja nieodwracalna przez wzrost stężenia substratu maleje Bez zmian Poza miejscem aktywnym

86 Wykres Michaelisa-Menten zależności V od [S] glukozy dla heksokinazy () i glukokinazy (G) V heksokinaza V max ()/2 V max (G)/2 glukokinaza K M () K M (G) glukoza [S]

87 Część III BADANIA MECANIZMÓW EAKCJI

88 Mechanizm reakcji Mechanizm opisuje przebieg reakcji chemicznej. Mówi on o tym: a) które wiązania ulegają pęknięciu, b) jakie wiązania się się tworzą, c) jaka jest kolejność tych zjawisk, d) z ilu etapów składa się rozpatrywany proces, e) jakie są względne szybkości poszczególnych etapów Poznanie odpowiedzi na te pytania jest często bardzo trudnym zadaniem. Szczególnie może to być skomplikowane w przypadku reakcji enzymatycznych, ze względu na złożoną strukturę enzymu i zachodzące procesy katalityczne.

89 Metody wyznaczania mechanizmów reakcji 1. Badanie produktów produktów reakcji: identyfikacja, dowody stereochemiczne. 2. Badanie produktów pośrednich: izolacja produktów pośrednich, wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe), wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować z danym reagentem dając ściśle określony produkt), dodatek oczekiwanego produku pośredniego. 3. Badania kinetyczne: równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji), badania katalizy (również inhibicji), efekty izotopowe. 4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi technikami, jak MS, NM itp.).

90 Kinetyczny efekt izotopowy k 1 A + 1 B A 1 B k 2 A + 2 B A 2 B k 1 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego ( 1 B) k 2 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego ( 2 B) k 1 = k 2 1 nie ma KIE k k 1 2 φ 1 jest KIE k k 1 2 π 1 odwrotny KIE

91 Kinetyczny efekt izotopowy Jednym z najpotężniejszych narzędzi w badaniu mechanizmów reakcji jest metoda kinetycznego efektu izotopowego. Jest ona bardzo często stosowana do badania mechanizmów reakcji enzymatycznych. Teoretyczne wyjaśnienie kinetycznych efektów izotopowych jest złożonym i trudnym zadaniem. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest jedynie uzmysłowienie sensu fizycznego tego zjawiska. Zastąpienie atomu pierwiastka, w cząsteczce związku biorącym udział w reakcji, na jego cięższy izotop często powoduje zmianę szybkości reakcji. óżna szybkość tych dwóch reakcji jest nazywana kinetycznym efektem izotopowym i określa się ją jako stosunek stałych szybkości: k iz. lżejszego / k iz. cięższego

92 óżnica ta wynika z tego, że energia oscylacyjna wiązania chemicznego na najniższym możliwym poziomie (zero-point energy) nie jest zerowa (wynosi: E = hυ) i zależy od masy zredukowanej: zgodnie z prawem ook a: µ = m1m2 m + m 1 2 υ 1 2 k µ (k- stała siłowa niezależna od masy). Z tego wynika że wiązanie z cięższym izotopem będzie miało niższą energię oscylacji i rozerwanie wiązania będzie wymagało większej energii.

93 brazowo przedstawiono to na poniższym schemacie: Energia dysocjacji wiązań C- i C-D Ta właśnie różnica w energiach dysocjacji jest powodem różnych szybkości procesów z udziałem izotopów. Efekt izotopowy obserwujemy jedynie wówczas, gdy rozpatrywany etap jest wystarczająco wolny, aby mieć decydujący wpływ na szybkość całego procesu.

94 Kinetyczne efekty izotopowe. Najważniejsze kryteria podziału. 1. Podział KEI ze względu na wielkość stosunku k k is.lighter is.heavier efekty normalne, występują wówczas gdy szybkość reakcji dla związku z izotopem lżejszym jest większa niż dla związku z izotopem cięższym k k is lighter. > 1 is. heavier brak efektu izotopowego k k is. lighter is. heavier = 1 efekty odwrotne (obserwowane rzadko) gdy: k k is lighter. < 1 is. heavier

95 2. Podział KEI ze względu na położenie znacznika izotopowego w stosunku do miejsca w cząsteczce, gdzie zachodzi etap determinujący szybkość reakcji: a) pierwszorzędowe, b) α drugorzędowe c) β drugorzędowe Na przykładzie mechanizmu E1 można wyjaśnić te efekty. Według tego mechanizmu, najwolniejszym etapem jest rozerwanie wiązania pomiędzy atomem węgla a grupą X (odchodzącą), co prowadzi do utworzenia karbokationu. Ten etap będzie decydował o szybkości całego procesu. W związku z tym podstawienie atomu 12 C 1 izotopem 14 C spowolni reakcję. Taki efekt izotopowy jest nazywany efektem pierwszorzędowym. Analogicznie dla wodoru 2 wystąpi efekt α drugorzędowy, a dla wodoru 3 wystąpi efekt β drugorzędowy. 3 2 C C 1 X wolno 3 2 C C C C + szybko 1 C C 1 Mechanizm E1

96 3. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe substratowe występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu powoduje zmianę szybkości reakcji, rozpuszczalnikowe występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. z 2 na D 2 powoduje zmianę szybkości reakcji. 4. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych: kinetyczne efekty izotopowe na V max kinetyczne efekty izotopowe na V max /K m

97 4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe substratowe występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu powoduje zmianę szybkości reakcji, rozpuszczalnikowe występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. z 2 na D 2 powoduje zmianę szybkości reakcji. 5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych: kinetyczne efekty izotopowe na V max kinetyczne efekty izotopowe na V max /K m

98 METDY WYZNACZANIA KINETYCZNYC EFEKTÓW IZTPWYC 1. Bezpośrednie wyznaczanie kinetycznych efektów izotopowych. 2. Metoda zaburzeń równowagi. 3. Metody z użyciem spektrometrii mas.

99 Wyznaczanie KIE wg równań Bigeleisena i Wolsgerga ) ln(1 ) ln(1 ] 1) ( 1) ( ln[1 ) ln( f f f f p p p p = α ) ln(1 ) (1 ln 1) ( 1) ( ) (1 ln 1 1) ( ) (1 ln f f f f s s s s = α ] ) (1 ) ( 1 1 ln[ ] ) (1 ) ( 1 1 ln[ ] 1) ( ) (1 ) ( 1 1 ln[ ] 1) ( ) (1 ) ( 1 1 ln[ p s s p p s p p s s p p s p f f f f f f f f f f f f + + = α ) ( ) ( ln ln s p s p s p p = α aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie przed rozpoczęciem reakcji, - p - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w produkcie w chwili, gdy stopień przereagowania wynosi f, - s - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie, gdy stopień przereagowania wynosi f, -f -stopień przereagowania. - α - kinetyczny efekt izotopowy,

100 Zakładany mechanizm eliminacji amoniaku i odtworzenie miejsca aktywnego Enzym N + N C N 3 N Enzym N a) b) N 2 + C 2 - Enzym N N N 2 + C 2 - c) a) Addycja Michaela b) β e liminacja c) odtworzenie dehydroalaniny przez β-eliminację Enzym N N + N 3

101 Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez avir a i anson a N + B N N 2 Ph C - e Si B : - N B: + 2 N N Ph C - e Si B : - N B: + 2 N N Ph - C - B e N B: 2 N N Ph B C -

102 Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez Schuster a i etey a N + N + 3 N - C N N + 3 N : B e Si e Si - + C N N + B N + N + B - C - C + 3 N N 3

103 Kinetyczny efekt izotopowy /T w pozycji 3-pro-S L-tyrozyny Liaza fenyloalaninowa katalizuje również eliminację amoniaku z L-tyrozyny, co pozwala na zbadanie wpływu grupy elektrodonorowej na wielkość kinetycznego efektu izotopowego w tej reakcji. Nie można jednocześnie wykluczyć, że reakcja eliminacji z udziałem L-tyrozyny przebiega według innego mechanizmu. Potwierdzeniem takiej tezy byłby wynik znacząco różny od otrzymanego dla L-Phe, czyli na przykład brak efektu lub duży efekt. T 14 C N 2 PAL p = 8,7, 30 o C 14 C + N 2 T

104 Kinetyczny efekt izotopowy /T w pozycji orto pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny T 14 C PAL T 14 C p = 8,7 + N 3 T N 2 T Wyniki badań kinetycznego efektu izotopowego /T w pozycji 2 i 6 pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny. Nr eksperymentu nr frakcji Stopień przereagowania [%] KEI 1-1 5,89 0, ,32 0, ,09 1, ,86 1, ,22 1, ,95 1, ,34 1, ,70 1, ,82 1, ,12 1,1598

105 Kinetyczny efekt izotopowy 12 C/ 14 C w pozycji 2 L-Phe C * N 2 PAL p = 8,7 * C Kinetyczny efekt izotopowy 12 C/ 14 C w pozycji 2 L-fenyloalaniny Nr eksp. * 0, p, f 0, r, f p, r, f 0, r, p Średnia średnia ± ±0.0019

106 Procedura wyznaczenie KEI /T w pozycji 3-pro- Mieszanina reakcyjna: enzym, L-Phe [1-14 C, 3-3 ] bufor boranowy 0,2M p = 8,7 Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej Mierzę aktywność (A 0 ) 14 C oraz stosunek aktywności 3 / 14 C ( 0 ) t 1 t2 t 3 t 4 t 5 Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20% Procedura postępowania dla każdej frakcji Mieszanina reakcyjna p=8,7 T 14 C N 3 + T 14 C + eakcja enzymatyczna zatrzymana p=0-1 T 14 C N 3 + T 14 C Ekstrakcja (Et 2 ) Warstwa eterowa T 14 C Pomiar aktywnosci 14 C (A i ) oraz stosunku aktywności 3 / 14 C p Warstwa wodna T 14 C N 3 + Po wydzieleniu L-Phe zastosowana do następnego eksperymentu

107 Kinetyczny efekt izotopowy /T w pozycji 3-pro- L-Phe Nr Eksp. KEI dchylenie stand. 1 1,0594 0, ,0535 0, ,0566 0, ,0480 0, ,0585 0,0193 Średnia 1,0552 0,0046

108 Procedura badania KEI w pozycji 3-pro-S L-Phe Mieszanina reakcyjna: enzym, L-Phe [1-14 C, 3S- 3 ] bufor boranowy 0,2M p = 8,7 Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej Mierzę aktywność (A 0 ) 14 C oraz stosunek aktywności 3 / 14 C ( 0 ) t 1 t2 t 3 t 4 t 5 Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20% Procedura postępowania dla każdej frakcji Mieszanina reakcyjna p=8,7 T 14 C N 3 + N 2 T elucja 2 14 C + eakcja enzymatyczna zatrzymana p=0-1 + T N 3 T 14 C N 3 + Ekstrakcja (Et 2 ) 14 C 0,3 M N 3 Kolumna jonowymienna Amberlit I 120 ( + ) T 14 C N 3 + Warstwa wodna + T N 3 T 14 C N 3 + Warstwa eterowa 14 C Pomiar aktywnosci 14 C (A i ) T T 14 C N 3 + dparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem Pomiar stosunku aktywności 3 / 14 C ( ri )

109 Kinetyczny efekt izotopowy D/T w pozycji 3-pro-S L-Phe Nr Eksp. KEI dchylenie Stand. 1 1,0750 0, ,0953 0, ,0899 0, ,0734 0,0167 Średnia 1,0834 0,0109 (1,01%)

110 Zależność Swain a-schaad a α = k k T = k k D 144, α = k k D 326, = k k k k T T obl T obs Gdzie: k /k T - KIE dla 1 / 3. k /k D - KIE dla 1 / 2. k D /k T - KIE dla 2 / 3. Jeśli efekt 1 / 3, obliczony z efektów 1 / 2 lub 2 / 3 przy pomocy wspomnianych zależności, jest mniejszy od efektu zaobserwowanego, wtedy prawdopodobnie w reakcji następuje tunelowanie protonu. Jeśli wartość wyliczonego KIE jest większa od zaobserwowanej, to mamy do czynienia ze złożonością kinetyczną, tzn. nie tylko etap odrywania protonu decyduje o szybkości reakcji.