Wykład Monograficzny Semestr 1M. Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej

Transkrypt

1 Wykład Monograficzny Semestr 1M Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej

2 Treść wykładu 1. gólne własności enzymów. 2. Zalety biokatalizy. 3. Rodzaje selektywności enzymów. 4. Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej. 5. Klasyfikacja enzymów. 6. Syntezy z udziałem: a. ksyreduktaz; b. Transferaz; c. ydrolaz; d. Liaz; e. Izomeraz; f. Syntetaz. 7. Kinetyka reakcji enzymatycznych.

3 Enzymy Enzymy są biologicznymi polimerami katalizującymi liczne procesy, bez których życie nie byłoby możliwe. Enzym to biokatalizator białkowy wytwarzany przez żywe komórki organizmu. Ten biokatalizator ma zdolność do obniżania energii aktywacji danej reakcji chemicznej, co skutkuje jej przyspieszeniem. Katalizują one reakcje w układach biologicznych. Bez ich obecności dana reakcja nie zachodzi, lub przebiega tak wolno, że jej rezultat jest niezauważalny. Enzymy charakteryzują się wysoką specyficznością, zarówno pod względem katalizowanej reakcji, jak substratów biorących w niej udział. Enzymy są białkami prostymi i złożonymi. Enzym złożony składa się z części białkowej i składnika niebiałkowego, zwanego kofaktorem. Część białkowa takiego enzymu jest zwana apoenzymem, a połączenie apoenzymu z kofaktorem nosi nazwę holoenzym. oloenzym = kofaktor + apoenzym Gdy kofaktor tj. część niebiałkowa jest związana na stale z apoenzymem nazywamy ją inaczej grupą prostetyczną. Gdy kofaktor jest nietrwale związany z apoenzymem jest zwany koenzymem.

4 Zalety biokatalizy 1. Enzymy to efektywne katalizatory zwiększają przynajmniej 10 6 szybkość reakcji. W razie ich nieobecności szybkość reakcji w układach biologicznych jest niezauważalna. 2. Enzymy charakteryzują się dużą specyficznością. 3. Enzymy działają w łagodnych warunkach tj. przy ciśnieniu atmosferycznym; W większości przypadków w przedziale temp o C; Przy p bliskim neutralnemu; Reakcje przebiegają w środowisku wodnym. 4. dpady z reakcji są mało szkodliwe dla środowiska. 5. Reakcje enzymatyczne prowadzi się w prostych aparatach. 6. Reakcje enzymatyczne wyróżniają się wysoka wydajnością. 7. Enzym nie katalizuje reakcji ubocznych.

5 Rodzaje selektywności enzymów 1. Chemoselektywność (np. hydrolizuje estry, a nie hydrolizuje acetali lub amidów). 2. Regioselektywność i diastereoselektywność (np. z kilku takich samych grup funkcyjnych w substracie wyróżnia tylko jedną). 3. Enancjoselektywność (np.katalizuje tylko reakcje z L-aminokwasem lub tylko z D-sacharydem).

6 Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej 1. Rozdzielanie mieszanin racemicznych. 2. trzymywanie związków optycznie czynnych. 3. Synteza związków użytecznych biologicznie lub chemicznie.(np.alkoholi, amidów, aminokwasów). 4. Synteza związków niemożliwych do otrzymania na drodze klasycznej syntezy organicznej. 5. Możliwość otrzymania związków selektywnie znakowanych izotopami stabilnymi lub promieniotwórczymi. a. Izotopami wodoru. b. Promieniotwórczym izotopem 32 P. c. Promieniotwórczym izotopem 35 S. d. Izotopami węgla (stabilnym 13 C i promieniotwórczymi 14 C i 11 C).

7 ŚWIATWA PRDUKCJA AMINKWASÓW PRZY UŻYCIU METD ENZYMATYCZNYC ( za 1980 r.) AMINKWAS ILŚĆ ( t / rok) L-ALANINA 130 KWAS L - ASPARAGINWY 450 L -2, 4 -DIYDRKSYFENYLALANINA 200 L - METININA 240* L - FENYLALANINA 240* L - TRYPTFAN 200 L - WALINA 150 * - produkcja w 1990 r.

8 1. Mikroskala. Wady przy stosowaniu enzymów 2. Wymagana jest wysoka czystość substratów. Niektóre zanieczyszczenia, nawet w małej ilości powodują inhibicję enzymów. 3. Niektóre enzymy są bardzo drogie. Nie wszystkie znajdują się w sprzedaży. Wydzielanie ich z materiału biologicznego jest bardzo pracochłonne i kosztowne.

9 Miejsce (centrum aktywne) enzymu W wiązaniu substratu i w przetwarzaniu go w produkt uczestniczy specyficzny region cząsteczki białka enzymatycznego, nazywany miejscem aktywnym lub centrum aktywnym enzymu.w jego strukturze można wyróżnić dwa elementy funkcjonalne. Są to: miejsce wiązania substratu i miejsce katalityczne. Centrum aktywne cechuje się następującymi właściwościami: A. Zajmuje stosunkowo mały fragment cząsteczki enzymu.tylko nieliczne reszty amino- kwasowe białka enzymatycznego wchodzą w bezpośredni kontakt z substratem. B. Miejsce aktywne jest układem przestrzennym, złożonym z łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych, zajmujących różne odległe pozycje. C. W tworzeniu miejsca aktywnego uczestniczą przede wszystkim te reszty aminokwasowe, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami lub akceptorami protonów. D. Miejsca aktywne są zagłębieniami lub szczelinami w strukturze cząsteczki białka enzymatycznego.

10 Międzynarodowy kod enzymatyczny Międzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d. Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego kodu genetycznego. Liczba a określa numer klasy enzymu; Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy; Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy; Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej popodpodklasy. Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny numer identyfikacyjny. Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1, obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od grupy -C-. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy 1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy - C- na NAD +. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1

11 REGISELEKTYWNA YDRLIZA ESTRÓW PRZEZ PLE 4 1 CMe C PLE CMe bufor CMe

12 REGISELEKTYWNA YDRLIZA DIESTRÓW E/Z DIASTERETPWYCZ UŻYCIEM PLE R R CEt PLE CEt E / Z CEt bufor Z C R =, Me 2 N, N 2

13 ENZYMATYCZNY RZDZIAŁ ESTRÓW AMINKWASWYC Z UŻYCIEM ESTERAZY 1 R C R NR R N esteraza lub proteaza C R 1 R C R NR 2 2 L D bufor R = alkyl, aryl, R 1 = Me, Et, R 2 =, acyl

14 RZDZIAŁ ESTRÓW N-ACYLAMINKWASWYC PRZY UŻYCIU -CYMTRYPSYNY MeC R NAc DL AcN L C R + MeC R NAc D - chymotrypsyna bufor e.e. > 97 % e.e. > 97 % R = n-c , n-c , Ph-, Ph-(C 2 ) 4 - e.e. - enantiomeric excess

15 ENZYMATYCZNY RZDZIAŁ AMIDÓW AMINKWASWYC Z UŻYCIEM AMIDAZY amidaza 2 NC R N 2 DL bufor 2 N L C R + 2 NC R N 2 D racemizacja 2 NC R N + Ph-C= R = alkyl, aryl zasada Schiffa

16 RZDZIAŁ RACEMICZNYC DILI W UKŁADZIE LAD / AlEYD -D R rac LAD NAD + recykling R D e.e. ( nie określono) + R L e.e > 97 % R C R = -C 2, -C 2 F, -C 2 Cl, -C 2 Br, -C 3, -C 2 N 2, -C=C 2, -C 2 C 3 L Aldehydo-D NAD + recykling LAD - orse Liver Alcohol Dehydrogenase (hydrogenaza alkoholowa z wątroby końskiej) D - Dehydrogenase

17

18 Przekształcania glukozo-6-fosforanu w zależności od enzymu C 2 glukozo-1- P P PGM P PI P C 2 fruktozo-6-p C 2 C 2 P DG-6- P G-6-F C 2 C 2 6- P -glukonolakton P = fosforan glukoza PGM = fosfogluomutaza PI = fosfoheksoizomeraza DG-6- P = dehydrogenaza glukozo-6- P G-6-F = glukozo-6-fosfotaza

19 Mechanizm biokatalizy na przykładzie wybranych enzymów Mechanizm biokatalizy został dość dobrze poznany dla kilku enzymów hydrolitycznych tj. Lizozymu, karboksypeptydazy A i chymotrypsyny. Lizozym jest białkiem enzymatycznym o dość prostej strukturze: zawiera 129 reszt aminokwasowych. Nie ma grupy prostetycznej. Jego struktura przestrzenna jest stabilizowana przez cztery wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe. Substratem lizozymu jest polisacharyd ściany bakteryjnej, zbudowany z powtarzającego się wielokrotnie dimeru: złożonego z kwasu N- acetylomuraminowego i N-acetyloglukozoaminy. bydwa te składniki są połączone wiązaniem 1,4- -glikozydowym. Wiązanie to jest rozkładane przez lizozym. Na powierzchni cząsteczki lizozymu znajduje się zagłębienie wiążące polisacharyd. Decydujące znaczenie dla biokatalizy mają dwie grupy karboksylowe. Są to: niezjonizowana grupa -karboksylowa glutaminianu w pozycji 35 i zjonizowana grupa -karboksylowa asparaginianu w pozycji 52

20 Reakcja katalizowana przez lizozym NAG NAM NAG NAM C C 2 R C 2 R C 2 R N C C 3 N C C 3 N C C 3 N C C 3 2 NAG = N-acetyloglukozoamina NAM = kwas N-acetylomuraminowy C 2 6 C C 2 C 2 N C C 3 4 R 3 2 N 1 C C 3 4 R 3 2 N 1 C C 3 R N C C 3 NAG NAM NAG NAM

21 Karboksypeptydaza A Jest enzymem proteolitycznym, odłącza od białka (peptydu) pojedyncze aminokwasy C-końcowe, z wyjątkiem lizyny i argininy. Wykazuje szczególnie wysoką aktywność wobec wiązań peptydowych, powstałych z udziałem aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny lub długołańcuchowy. Jest białkiem jednołańcuchowym, zbudowanym z 307 reszt aminokwasowych i objętych w 38 procentach strukturą -helisy. Cząsteczka enzymu jest zwarta, ma kształt elipsolidalny, a w miejscu aktywnym zawiera kowalencyjnie związany jon cynku (Zn 2+ ).Jon ten wytwarza wiązania koordynacyjne z dwoma łańcuchami bocznymi histydyny, łańcuchem bocznym glutaminianu i cząsteczką wody. Dzięki temu połączeniowi cząsteczka wody staje się bardzo aktywna.wiązanie substratu powoduje istotne zmiany centrum aktywnego enzymu.

22 Chymotrypsyna Jest ona także enzymem proteolitycznym. W odróżnieniu od karboksypeptydazy nie odłącza aminokwasów C-końcowych tylko hydrolizuje wiązania peptydowe położone w głębi łańcucha białkowego, co prowadzi do fragmentacji substratu na peptydy o różnej długości. Jest białkiem złożonym z trzech łańcuchów polipeptydowych, połączonych mostkami disiarczkowymi. Centrum aktywne chymotrypsyny: seryna 195, histydyna 57 i asparaginian 102.

23 PDZIAŁ ENZYMÓW XYDREDUKTAZY Katalizują reakcje utleniania i redukcji TRANSFERAZY Katalizują przenoszenie grup funkcyjnych (np. aldehydowych, ketonowych, acylowych) YDRLAZY Katalizują hydrolizę np. peptydów, estrów, amidów LIAZY Katalizują reakcje addycji i eliminacji IZMERAZY Katalizują racemizację, przenoszenie wiązań wielokrotnych, przekształcenie grup funkcyjnych LIGAZY ( SYNTETAZY ) Katalizują tworzenie wiązań C - C, C- heteroatom (mają zastosowanie w syntezie organicznej )

24 KENZYMY NIEZBĘDNE PDCZAS BITRANSFRMACJI KENZYM NAD + / NAD NADP + / NAD ATP /a SAM Acetyl - CoA Flawiny Pyridoksal-fosforan Biotyna Kompleksy metaloporfirynowe TYP REAKCJI usunięcie lub addycja wodoru jak wyżej fosforylacja C 1 - alkilacja C 2 - alkilacja utlenianie transaminacja karboksylacja utlenianie peroksydacja a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie. G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.

25 ksyreduktazy Katalizują reakcję utleniania i redukcji. Przykładem może być dehydrogenaza mleczanowa, która przekształca mleczan w pirogronian z udziałem NAD + i odwrotnie z udziałem NAD NAD + NAD + + C 3 C C - dehydrogenaza mleczanowa C 3 C C - mleczan pirogronian

26 UTLENIANIE ALKLI ASPEKT STRECEMICZNY C 3 D C D + N R' N 2 D AD C 3 C R -adenozyno-difosforan rybozy + D N R' N 2 UTLENIANIE ALDEYDÓW C R Acc C LAD C +.Acc R R Acc - grupa przyłączająca jon hydroniowy z utlenianej cząsteczki

27 UTLENIANIE PIERWSZRĘDWYC AMIN D ALDEYDÓW Eox + R S N 2 BSA Ered + R S BSA - Bovine Serum Amine xidase

28 WYTWARZANIE ARMATYCZNYC I ETERARMATYCZNYC KARBKSAMIDÓW PRZEZ MIKRBY (c.d.) Rhodococcus X CN rhodochrous X = S, stężenie produktu 210 g/l X N 2 X =, stężenie produktu 522 g/l

29 YDRKSYLACJA ZWIĄZKÓW ARMATYCZNYC PRZEZ MIKRBY C Pseudomonas sp. C N 2 Kwas 6-hydroksynikotynowy ( 100%) N

30 REAKCJE KATALIZWANE PRZEZ DI-KSYGENAZĘ + 2 di-oksygenaza dioksetan reduktaza cis-glikol [ 2 ] Sub = substrat

31 DEGRADACJA PIERŚCIENI ARMATYCZNYC PRZEZ DI-KSYGENAZY DRBNUSTRJÓW R di-oksygenaza R 2 reduktaza R [ 2 ] dihydrodiol dehydrogenaza NAD(P) NAD(P) + oksydacyjne pęknięcie pierścienia

32 REDUKCJA ALIFATYCZNYC I ARMATYCZNYC KETNÓW Z UŻYCIEM DRŻDŻY PIEKARSKIC R drożdże piekarskie R R R R 1 R 2 konfiguracja e.e. [%] Me Et S 67 Me n-bu S 82 Me Ph S 89 Me CF 3 S >80 CF 3 C 2 Br S >80 Me C(C 3 ) 2 N 2 S >96 Me C 2 S 91 Me (C 2 ) 2 C=C(C 3 ) 2 S 94 Me cyklo-c 6 11 S >95

33 REAKCJE ALKINÓW I CYKLPRPANÓW KATALIZWANE ALPERKSIDAZĄ C 3 chloroperoksidaza Cl -, Cl Cl Cl CCl 2 1 : 2 : 0, 3 chloroperoksidaza Br -, 2 2 Br + CBr 2 R chloroperoksidaza X -, 2 2 R X R = C 3, R = Ph, X = Cl X = Br

34 ALGENACJA ZWIĄZKÓW ARMATYCZNYC N 2 N 2 chloroperoksidaza Br Br -, 2 2 Cl Cl p-chloroanalina 2-bromo-4-chloroanilina AcN S chloroperoksidaza AcN S Br N Br -, 2 2 N N-acetylo-tiazol N-acetylo-2-bromotiazol

35 ALGENACJA AKTYWWANYC C - GRUP haloperoksidaza Cl Cl -, metylocyklopenta-2,5-dion 1-chloro-1-metylocyklopenta-2,5-dion Cl haloperoksidaza Cl Br Br -, chloro-4-dimetylocykloheksa-2,6-dion 1-bromo-1-chloro-4-dimetylocykloheksa-2,6-dion

36 TRZYMYWANIE ALYDRYN Z ALKENÓW chloroperoksidaza J -, 2 2 J + J 90 : 10 Br Br bromoperoksidaza Br -, 2 2 Br 90 : 10 ślady Br chloroperoksidaza Br -, 2 2 Br chloroperoksidaza Br -, 2 2 rac Br rac

37 REAKCJA ALGENWANIA L-TYRZYNY Z UDZIAŁEM ENZYMU CLRPERKSYDAZY C chloroperoksydaza I C N 2 2 2, X -, bufor N 2 gdzie X - = Cl -, Br -, I -

38 SYNTEZA L-DPY C oksydaza fenolowa C L-Tyr N 2 L-dopa N 2 C Melanina N 2 Dopachinon SYNTEZA L-DPAMINY C dopa dekarboksylaza L-Tyr N 2 Dopamina N 2

39 Transferazy Przenoszą grupy chemiczne z substratu (dawcy) na produkt (biorca lub akceptor). Np. aminotransferaza alaninowa przenosi -N 2 z glutaminianu na pirogronian w wyniku czego powstaje alanina i -ketoglutaran. Koenzymem jest fosforan pirodoksalu. C - C 2 C 2 + C N 3 C - + C 3 C C - PLP aminotransferaza alaninowa C - C 2 C 2 C C - + C 3 + C N 3 C - glutaminian pirogronian ketoglutaran alanina

40 SYNTEZA DIYDRKSYACETNU ZNAKWANEG FSFREM P- 32 C 2 32 C + AT P C 2 Fosforokinaza 32 C 2 P C C AD P + P = fosforan

41 ydrolazy ydrolizują wiązania np. amidowe, estrowe, itp. ydroliza peptydów i białek, kwasów nukleinowych

42 ASYMETRYZACJA bis(acylksymetyl)tetrafuranów PRZEZ LIPASY R R 2 5 Lipasa bufor R 2 5 R LIPASA R RZTWÓR e.e [%] CRL BUFR 12 PSL BUFR 81 MSL BUFR >99 MSL Me BUFR >99 PPL Me BUFR 20 PPL Me BUFR/c-C

43 Liazy Liazy są enzymami, które katalizują reakcje addycji lub eliminacji. W wyniku reakcji eliminacji powstają dwa produkty. Jednym z nich jest najczęściej woda, amoniak, dwutlenek węgla, czy cząsteczka aldehydu, które odrywają się od substratu i w wyniku tej reakcji powstaje w produkcie podwójne wiązanie lub układ cykliczny. Liazy dzielimy: -ze względu na rodzaj powstającego produktu; -ze względu na rodzaj użytego kofaktora.

44 LIAZY Są enzymami katalizującymi przekształcenie substratu, którym towarzyszy powstawania lub zanik wiązania podwójnego. Przykładem jest fumaraza enzym cyklu kwasów trikarboksylowych, katalizujący odwracalną przemianę fumaranu w jabłczan. W tej reakcji powstaje lub zanika wiązanie podwójne - C C C C fumaraza - C C C C - fumaran jabłczan

45

46

47

48

49

50

51 ADDYCJA WDY KATALIZWANA PRZEZ FUMARAZĘ C X fumaraza C bufor X C C X =, Cl Kwas (chloro)fumarowy [trans(chloro)butanodiowy] e.e. 100 % Kwas hydroksy(chloro)butanodiowy

52

53 Dekarboksylacja kwasów organicznych polega na rozerwaniu wiązania C-C, a jednym z jej produktów jest C 2. Enzymatycznej dekarboksylacji ulegają cztery typy kwasów karboksylowych: -ketonokwasy -ketonokwasy R C R C hydroksykwasy aminokwasy R C R C N 2

54 W wyniku enzymatycznej dekarboksylacji -aminokwasów powstają aminy biogenne. R N 2 C enzym R N 2 + C 2 Biogenne aminy spełniają doniosła rolę w metabolizmie organizmach żywych. Niektóre z nich wchodzą w skład błon organelli komórkowych. Są składnikami koenzymów, witamin, choliny. Pełnią rolę hormonów tkankowych, Pewne z nich są ważnymi neuroprzekaźnikami.

55 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 N 2 N 2 L-treonina propanoloamina Składnik witaminy B 12 N 2 C C 2 N 2 etanoloamina L-seryna Składnik fosfatydów i choliny.

56 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C C 2 C N 2 kwas L-glutaminowy kwas -aminomasłowy Produkt metabolizmu w mózgu. Neuroprzekaźnik S N 2 C C 2 S N 2 L-cysteina cystamina Składnik koenzymu A

57 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 N 2 N 2 N 2 N 2 L-lizyna kadaweryna Stabilizator rybosomów. Produk tmetabolizmu bakterii przewodu pokarmowego. C C C 2 C N 2 kwas L-asparginowy alanina Składnik koenzymu A

58 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim N N N 2 C C 2 N N N 2 L-histydyna histamina ormon tkankowy obniżający ciśnienie C C 2 N 2 N 2 L-tyrozyna tyramina ormon tkankowy powoduje skurcze macicy

59 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 N N 2 N N 2 L-tryptofan tryptamina ormon tkankowy C C 2 N N 2 N N 2 5'-hydroksy-L-tryptofan serotonina ormon tkankowy podwyższający ciśnienie krwi, neuroprzekaźnik

60 Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim C C 2 L-DPA N 2 N 2 (3',5'-dihydroxyphenylalanine) dopamina Prekursor w syntezie melanin (naturalnych pigmentów zwierzęcych) oraz katecholoamin takich jak: noradrenaliny i adrenaliny tj. jednych z najważniejszych neuroprzekażników

61 Stereospecyficzność enzymatycznej dekarboksylacji L-aminokwasów T (S) T (S) R C dekarboksylaza R N 2 2 N 2 (R) [2S- 3 ]- L-aminokwas [1S- 3 ]- amina (S) C R N 2 L-aminokwas dekarboksylaza T (S) R N 2 T (R) [1R- 3 ]- amina T (S) C R N 2 [2S- 3 ]- L-aminokwas dekarboksylaza D 2 T (S) R N 2 D(R) [1S- 3, 1R- 2 ]- amina

62 Synteza tyraminy znakowanej w pozycji 1 izotopami wodoru C EC C N 2 D 2 or T N 2 L-tyrozyna [2-2 ]-L-tyrozyna [2-3 ]-L-tyrozyna EC N 2 Gdzie: = deuter lub tryt [1-2 ]-L-tyramina [1-3 ]-L-tyramina

63 Synteza [2S- 3 ]- lub [2R- 3 ]-tyraminy C EC N 2 N 2 [3R- 2 ]-L-tyrozyna [2R- 2 ]-tyramina lub lub [3R- 3 ]-L-tyrozyna [2R- 3 ]-tyramina C EC N 2 N 2 [3S- 2 ]-L-tyrozyna lub [3S- 3 ]-L-tyrozyna Gdzie: = deuter lub tryt [2S- 2 ]-tyramina lub [2S- 3 ]-tyramina

64 IZMERAZY Są enzymami katalizującymi reakcje izomeryzacji. Przykładem może być jeden z enzymów glikolizy tj. izomeraza fosfotriozowa. Przekształca ona odwracalnie aldehyd 3-fosfoglicerolowy w fosfodihydroksyaceton. C C C P izomeraza fosfotriozowa C C C P aldehyd 3-fosfoglicerynowy fosfodihydroksyaceton

65

66

67

68

69

70 SYNTETAZY czyli LIGAZY Są enzymami katalizującymi reakcje syntezy kosztem energii pochodzącej od ATP (lub innego nukleotydu trifosforanowego). Np.. Enzym syntetaza glutaminy wiąże amoniak z grupą -karboksylową kwasu glutaminowego, tworzac glutaminę. W reakcji zużuwa się jedna cząsteczka ATP. C C C 2 C 2 - C - N 3 + ATP ADP + syntetaza glutaminy Pi N 2 C C 2 C 2 C C - N 3 + glutaminian glutamina

71 KENZYMY NIEZBĘDNE PDCZAS BITRANSFRMACJI KENZYM NAD + / NAD NADP + / NAD ATP /a SAM Acetyl - CoA Flawiny Pyridoksal-fosforan Biotyna Kompleksy metaloporfirynowe TYP REAKCJI usunięcie lub addycja wodoru jak wyżej fosforylacja C 1 - alkilacja C 2 - alkilacja utlenianie transaminacja karboksylacja utlenianie peroksydacja a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie. G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.

72 Koenzymy mogą być klasyfikowane zależnie od grupy, przeniesienie której ułatwiają NAD +, NADP + FMN, FAD Kwas liponowy Koenzym Q Koenzymy przenoszące wodór : Koenzymy przenoszące inne grupy niż CoA-S Pirofosforan tiaminy Fosforan pirodoksalu Koenzymy folianowe Biotyna Koenzymy kobamidowe

73 Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy - NAD + amid kwasu nikotynowego N 2 N 2 N N adenina N - - C 2 P P C 2 N N P ryboza ryboza Przez przyłączenie fosforanu P poprzez wiązanie estrowe w miejscu wskazanym strzałką, powstaje fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP + )

74 Flawinomononukleotyd (FMN) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) dimetyloizoalloksazyna dimetyloizoalloksazyna 3 C N N 3 C N N 3 C N N 3 C N N rybitol C 2 C C C rybitol C 2 C C C N N 2 N N N adenina C P C P P C 2 FMN ryboza FAD

75 Koenzym A (CoA) Jest przenośnikiem grup acylowych (reszt kwasowych). W jego strukturze można wyróżnić trzy elementy składowe. - Nukleotyd difosforanowy adenozynodifosforan (ADP) - Kwas pantotenowy (witaminab 5 ), będący połączeniem -alaniny i kwasu pantoinowego - Cysteamina. Cysteamina zawiera grupę S, która wytwarza wiązania tioestrowe z różnymi kwasami organicznymi. Na tej drodze powstają acylowe pochodne CoA, określane w skrócie jako acylo S-CoA.Ta forma zapisu acylowych pochodnych CoA ma na celu wskazanie, że miejscem wiązania grupy acylowej jest atom siarki, a połączenie pomiędzy siarką CoA a grupą acylową (przedstawione falista kreską ) jest wiązaniem bogatym w energię.tą droga reszty kwasowe zostają aktywowane. W tej postaci mogą być substratami w syntezie różnych estrów np. acetocholiny, acylogliceroli, bądź włączać się do szlaków katabolicznych, takich jak: -oksydacja kwasów tłuszczowych lub cykl kwasów trikarboksylowych.

76 Koenzym A cysteamina kwas pantotenowy N N 2 N S C 2 C 2 N C C 2 C 2 N C C C 3 C C 2 C 3 P N P C 2 N alanina kwas pantoinowy P Zaznaczono składniki koenzymu A oraz grupę S będącą miejscem wiązania reszt acylowych

77 S-Adenozylometionina (SAM) Koenzym SAM jest przenościkiem C 3 na różne akceptory. Po odłączeniu C 3 powstaje S-adenozylohomocysteina zdolna do przyłączenia grupy metylowej i odtworzenia cząsteczki SAM N 2 N N N N 3 C S C 2 metionina + 3 N C 2 C 2 C C - SAM

78 Biotyna Koenzym biotyna wiąże C 2 tworząc karboksybiotynę substrat w reakcjach karboksylacji. Jest to reakcja odwracalna. C 2 BITYNA N S N C 2 C 2 C 2 C 2 C kwas walerianowy

79 Liponian/lipoamid Ten tiokwas występuje w dwóch postaciach. W formie zredukowanej ma dwie grupy S przy C 6 i C 8, a w formie utlenionej zawiera mostek disiarczkowy. GrupaC - jest połączona z enzymem przez wiązanie amidowe -N 2 reszty Lys, dlate-go koenzym jest zwany lipoamidem. Liponian jest przejściowym akceptorem grup acylowych w procesie oksydacyjnej dekarboksylacji -aminokwasów. C 2 C 2 C C 2 C 2 C 2 C 2 C - +2 S S liponian -2 C 2 C 2 C C 2 C 2 C 2 C 2 C - S S dihydroliponian

80 Zastosowanie enzymów w praktyce medycznej Enzymy znajdują liczne praktyczne zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej wielu chorób; są odczynnikami laboratoryjnymi lub lekami. Zastosowanie enzymów do naprawy materiału genetycznego komórki stwarza nowe możliwości leczenia wrodzonych wad metabolicznych i chorób nowotworowych. Enzymy jako markery chorób. Aktywność niektórych enzymów w tkankach i płynach ustrojowych zmienia się w przebiegu różnych chorób. Na przykład aktywność aminotransferaz w osoczu krwi rośnie w przebiegu zawału mięśnia sercowego lub uszkodzenia wątroby. Aktywność amylazy enzymu rozkładającego skrobię wzrasta u chorych na zapalenie trzustki. Znaczenie diagnostyczne maja tez wzajemne relacje pomiędzy aktywnościami określonych izoenzymów np. -u ludzi zdrowych aktywność LD-1 w osoczu krwi jest niższa niż LD-2. -u chorych z zawałem serca aktywność LD-1 przewyższa aktywność LD-2

81 Enzymy jako leki i odczynniki Niektóre enzymy służą jako leki np. - Lipaza enzym hydrolizujący tłuszcze jest użyteczna w leczeniu niedomogi wydzielniczej trzustki. - Asparaginaza enzym rozkładający asparaginę jest przydatna w leczeniu białaczek. Pewne enzymy służą jako odczynniki w praktyce laboratoryjnej np. - Ureaza może być zastosowana do oznaczania mocznika, - Dehydrogenaza mleczanowa - do oznaczania mleczanu. Enzymy w biotechnologii i terapii genowej Za pomocą nukleaz można wycinać wadliwe skonstruowane odcinki DNA, a powstałe ubytki wypełniać odpowiednimi fragmentami pochodzących z komórek zdrowych tego samego gatunku. Zespalanie fragmentów DNA jest możliwe dzięki ligazom DNA. Stwarza to możliwość naprawy uszkodzonego genu i otwiera perspektywę rozwoju nowej dziedziny medycyny, określanej mianem terapii genowej.

82 Międzynarodowy kod enzymatyczny Międzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d. Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego kodu genetycznego. Liczba a określa numer klasy enzymu; Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy; Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy; Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej popodpodklasy. Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny numer identyfikacyjny. Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1, obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od grupy -C-. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy 1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy - C- na NAD +. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1

83 Enzymy katalizujące reakcje w ekstremalnych warunkach

84 EWLUCJA MIKRRGANIZMÓW W WYSKTEMPERATURWYM ŚRDWISKU PRACEANU PRKARITY (bakterie, sinice ) EUKARITY ARCAEA s p a d e k PRACEAN (wysoka temperatura) T WSPÓLNY PRZDEK Archaea i Bacteria rozwijające się w temp. około 100 o C (gruba linia na ścieżce ewolucyjnej) to najprymitywniejsze i najwolniej ewolujące mikroorganizmy z dotychczas poznanych. Prokariota - prymitywna komórka z wolną nicią DNA Eukariota - złożona komórka z DNA w jądrze komórkowym, organele, aparat Golgiego itp.

85 NIEKTÓRE ENZYMY YPERTERMFILNE (oczyszczone i scharakteryzowane) ENZYMY T opt. o C Aktywność katalityczna rganizm YDRLAZY Proteaza 100 ydroliza peptydów Pf Amylaza 100 ydroliza skrobi Pf Amylopululanaza 118 Degradacja skrobii Tl -Glukozydaza 110 ydroliza maltozy Pf -Glukozydaza 105 ydroliza celulozy Pf Sacharozo- -glukohydrolaza 105 ydroliza sacharozy Pf Ksylanaza 105 ydroliza ksylozy Tm -Galaktozydaza >90 ydroliza galaktomanozy Tn -Mananaza 100 ydroliza manozy Tn KSYDREDUKTAZY ksyreduktaza pirogronowa > 90 Utlenianie pirogronianów Tm ksyreduktaza aldehydowa > 90 Utlenianie aldrhydów Pf T opt = optymalna temperatura do katalizy, Pf = Pyrococcus furiosus, Tl = Thermococcus litoralis Tm = Thermotoga maritima, Tn = Thermotoga neapolitana

86 NIEKTÓRE ENZYMY YPERTERMFILNE ENZYMY T opt. o C Aktywność katalityczna rganizm PRTEINY REDX Ferodoksyna > 95 Przeniesienie elektronu Pf Rubredoksyna > 95 Nieznane Pf DEYDRGENAZY Dehydrogenaza glutaminowa > 95 Utlenianie glutaminatów Pf Dehydrogenaza siarczkowa > 95 Redukcja siarki Pf Dehydrogenaza alkoholowa > 95 Redukcja alkoholi Tl YDRGENAZY ydrogenaza > 95 Produkcja 2 Pf Sulfohydrogenaza > 95 Redukcja siarki Pf INNE DNA polimeraza > 75 Synteza DNA Pf Enolaza > 95 ydroliza fosfogliceranu Pf Izomeraza glukozy 105 Izomeracja glukozy Tm T opt = optymalna temperatura do katalizy, Pf = Pyrococcus furiosus, Tl = Thermococcus litoralis Tm = Thermotoga maritima, Tn = Thermotoga neapolitana

87 RGANIZMY TERMFILNE RDZAJ Temperatura, o C Środowisko Fizjologia ARCAEA Zależne od S(elemet.) Thermoproteus 102 c / A Staphylothermus 98 d Desulfurococcus 90 d, c Thermofilum 100 c Pyrobaculum 102 c, m / A Acidianus 96 m / c / A Pyrodictium 110 d / m / A Thermodisus 98 m Pyrococcus 105 d / m Thermococcus 97 d / m yperthermus 110 m Pyrolobus 113 d m - morski, plytkowodny wentyl wulkaniczny, d - morski, głębokowodny wentyl wulkaniczny, c- kontynentalne, gorące źródła i gejzery, - heterotrofy (Ich źródłem węgla muszą być obce proteiny i złożone węglowodany ), A- autotrofy (źródłem węgla jest C 2 )

88 RGANIZMY TERMFILNE RDZAJ Temperatura, o C Środowisko Fizjologia ARCAEA Redukujące siarczany Archaeoglobus 95 d / m / A Metanogeniczne Methanococcus 91 d / m A Methanothermus 97 c A Methanopyrus 110 d A BAKTERIE Thermotoga 90 m Aquifex 95 m A m - morski, plytkowodny wentyl wulkaniczny, d - morski, głębokowodny wentyl wulkaniczny, c- kontynentalne, gorące źródła i gejzery, - heterotrofy (Ich źródłem węgla muszą być obce proteiny i złożone węglowodany ), A- autotrofy (źródłem węgla jest C 2 )

89 NIEDWRACALNA DEAKTYWACJA ENZYMÓW ALFILNYC Względna katalityczna aktywność 1 4M KCl ( warunki normalne ) M KCl M KCl 2M KCl Katalityczna aktywność halofilicznej proteazy, działającej normalnie w 4 M zasolonym środowisku, spada szybko i nieodwracalnie przy niższych stężeniach soli. Proteaza była inkubowana w 30 o C w 1, 2, 3 i 4M KCl przez odpowiedni czas, a jej aktywność była określana po ponownym rozpuszczeniu jej w 4 M KCl buforze Czas [godz]

90 ENZYMY KINETYKA FRMALNA

91 Katabolizm Anabolizm Procesy metaboliczne Procesy kataboliczne przekształcają składniki tkanek do mniejszych, prostszych cząsteczek. Końcowymi produktami katabolizmu są bardzo proste substancje jak woda, dwutlenek węgla, amoniak, mocznik czy kwas moczowy. Procesom katabolicznym (np.reakcje utleniania) towarzyszy uwalnianie energii i jest ona przetwarzana w formę użyteczną dla komórki. Jest magazynowana w postaci związków bogato energetycznych. Procesy anaboliczne polegają na syntezie składników złożonych ze składników prostych wykorzystując energię uzyskaną z procesów katabolicznych. Synteza zachodząca w układzie biologicznym często nazywa się biosyntezą. W wyniku biosyntezy powstają z prostych związków wielkocząsteczkowe tj. białka, polisacharydy czy kwasy nukleinowe. Większość energii zmagazynowanej w wiązaniach chemicznych składników odżywczych ulega rozproszeniu w postaci ciepła, dlatego masa pożywienia potrzebna organizmowi jest zdecydowanie większa niż łączna masa produktów, które mogą być wytworzone w procesach anabolicznych.

92 Entropia Entropia, funkcja termodynamiczna, jest miarą uporządkowania układu. Im większy jest stan nie uporządkowania (chaos), tym większa jest entropia układu. Procesy anaboliczne prowadzą do wzrostu uporządkowania materii biologicznej.w tym przypadku entropia maleje Procesy kataboliczne zmniejszają stopień uporządkowanie materii. W tym przypadku entropia wzrasta.

93 Energia swobodna ` Zawartość energii swobodnej w produktach reakcji jest niższa lub wyższa od jej zawartości w substratach reakcji. Różnica ta nosi nazwę zmiany energii swobodnej ( G). Wartość ta mierzona w standardowych warunkach (standardowych warunkach tj. wtedy gdy stężenie substratów wynosi 1M, p 7,0) nosi nazwę standardowej zmiany energii swobodnej i jest określana symbolem G 0. A+ B C + D G 0 K [C][D] [A][B] [ C][ D] RT ln [ A][ B] G 0 =- RTlnK = -2,303 RTlogK Z powyższego równania wynika, że przy stałej temperaturze G 0 zależy wyłącznie od od K. Jeżeli K = 1, to G 0 = 0. Nie zachodzi żadna reakcja lub przebiega ona w obu kierunkach z taką samą szybkością.

94 Energia swobodna cd. Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów jest większy niż iloczyn stężeń substratów, to stała równowagi K jest wyższa od 1, a G 0 ma wartość ujemną. znacza to, że reakcja jest egzoergiczna. Reakcja jest spontaniczna i zachodzi tak długo, aż G 0 osiągnie wartość zerową. Ustala się wtedy stan równowagi. Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów C i D jest niższy od iloczynu stężeń substratów to stała równowagi K jest niższa od 1, a G 0 ma wartość dodatnią. znacza to ze reakcja przebiega z pobieraniem energii, jest endoergiczna i nie zachodzi spontanicznie w kierunku A + B C + D. W odwracalnej reakcji wartość bezwzględna a G 0 w obydwu kierunkach jest jednakowa tylko różni się znakiem. Jeżeli G 0 ma wartość ujemną, nosi nazwę termodynamicznie korzystnej. Może ona zachodzić samorzutnie. Jeżeli dla reakcji wartość G 0 jest dodatnia, to ta reakcja jest termodynamicznie niekorzystna. Nie może zajść spontanicznie. W organizmie zachodzą reakcje obydwu rodzajów. Reakcje termodynamicznie niekorzystne są napędzane reakcjami termodynamicznie korzystnymi.

95 Efekt termodynamiczny reakcji A (substrat) --- B (produkt) C (substrat) --- D (produkt) G G A D Stan początkowy G < 0 B Stan początkowy G > 0 Stan końcowy Stan końcowy C Przebieg reakcji Reakcja termodynamicznie korzystna Przebieg reakcji Reakcja termodynamicznie niekorzystna

96 Addytywność zmian energii swobodnej Zmiany wolnej energii, towarzyszące następującym po sobie reakcjom, sumują się. kreśla się to mianem addytywności zmian wolnej energii. W organizmie funkcjonują ciągi reakcji enzymatycznych, których celem jest wieloetapowe przekształcenie substratów w określone produkty. Substrat A, pod działaniem enzymu a przechodzi w produkt B, a ten staje się substratem do enzymu b, który przekształca go w produkt C itd. Dzięki addytywnej właściwości wolnej energii szlak metaboliczny może funkcjonować w kierunku: A B C D dopóki suma G 0 wszystkich reakcji składowych jest ujemna. Może to występować także wtedy, gdy niektóre reakcje z reakcji cząstkowych wykazują G 0 dodatnie. Przykładem takiego szlaku metabolicznego jest glikoliza.

97 Reakcja przebiegająca z enzymem i bez udziału enzymu G G a bez enzymu G a z enzymem Stan początkowy Stan końcowy Przebieg reakcji

98 FRMALNA KINETYKA REAKCJI KATALIZWANYC PRZEZ ENZYMY (1) E + S k k +1-1 ES k +2 produkty 1.1 v(szybkość) = k +2 [ ES ] 1.2 Jeżeli oznaczymy K s jako stałą równowagi dysocjacji kompleksu ES na E i S, i jeżeli przez [E'] oznaczymy początkowe stężenie enzymu; wtedy stężenie wolnego enzymu wynosi ([E'] - [ES]). Wówczas: K s K s [E][S] ([E]-[ES])[S] = [ES] [ES] ([E][S]-[ES][S]) [ES] Z równania 1.2 otrzymujemy: v = k [ E] +2 Ks 1+ [ S] 1.5

99 FRMALNA KINETYKA REAKCJI KATALIZWANYC PRZEZ ENZYMY (2) Kiedy stężenie substratu jest bardzo duże, wtedy równanie (1.5) określa maksymalną szybkość reakcji V i zbliża się do wyrażenia V = k [E'] +2 Wstawiając to wyrażenie na V do równania (1.5) otrzymujemy v = Jest to równanie Michaelisa - Menten'a V 1 + K s [S] Stałą Michaelisa, K m, definiuje się jako takie stężenie [S], przy którym osiąga się połowę szybkości maksymalnej V. Wartość K m można otrzymać eksperymentalnie z (1.6) Chociaż jest możliwe wyznaczyć K m z wykresu, lecz dokładność jest mała, ze względu na asymptotyczny charakter zależności. W praktyce preferuje się stosowanie równania (1.7) otrzymanego przez przekształcenie (1.6): 1 v 1 Km [S] V V 1.6

100 WYKRES MICAELISA- MENTEN A V/2 K m stężenie substratu [ S ] Zależność szybkości reakcji v od stężenia substratu [S] w warunkach stałego stężenia enzymu. Przy wysokich stężeniach substratu szybkość reakcji v osiąga wartość maksymalną V. K m równa się stężeniu substratu przy wartości v = 0.5 V.

101 WYKRES LINEWEAVERA - BURK A ( podwójne odwrotności) 1/v nachylenie = K / V m odcięta = -1 / K m odcięta = 1 / V 1 / [ S] Zależność 1/v od 1/[S] dla reakcji katalizowanej enzymatycznie opisanej równaniem Michaelis-Menten a Zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten a, K m = K s. Wobec tego K m jest bezpośrednią miarą siły wiązania między enzymem a substratem. Powyższy wykres jest też bardzo użyteczny do badania inhibicji w reakcjach enzymatycznych.

102 Zależność prędkości reakcji enzymatycznej (V) od temperatury V Temperatura [ o C]

103 Zależność prędkości reakcji katalizowanych przez niektóre enzymy od p V pepsyna amylaza trypsyna p

104 Przykładowe wartości stałej Michaelisa Enzym Substrat K M [mol/l] Fumaraza fumaran 5, Penicylinaza benzylopenicylina 5, Esteraza acetylocholinowa acetylocholina 9, Galaktozydaza laktoza 4, Anhydraza węglanowa C 2 1, Ureaza mocznik 2,5 10-2

105 Efektory allosteryczne Efektory allosteryczne są drobno cząsteczkowymi metabolitami, które łącząc się z białkiem enzymatycznym modyfikują jego strukturę czwartorzędową, a niekiedy strukturę trzeciorzędową. Efektem tego jest zmiana powinowactwa enzymu do substratu, co skutkuje zmianą wartości K m. Enzymy podatne na działanie tych efektorów noszą nazwę efektorów allosterycznych. Powoduje to zmianę wykresu Michaelisa- Mentena. Efektory allosteryczne dzielą się na dodatnie (aktywatory allosteryczne) i ujemne (inhibitory allosteryczne). Aktywator allosteryczny sprawia,że prędkość maksymalna reakcji zostaje osiągnięta przy niższym p. Wartość K m maleje. Inhibitor allosteryczny powoduje efekt odwrotny. Wartość K m wzrasta.

106 Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcji z udziałem inhibitora kompetycyjnego (-) inhibitor V max (-) inhibitor (+)inhibitor V max 2 (+)inhibitor 1/V max = 1/V max (i) K M K M (i) [S] -1/K M 1/K M (i) [S] A B

107 Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcji z udziałem inhibitora niekompetycyjnego V 1/V (+) inhibitor V max 1/V max (i) (-) inhibitor V max (i) max/2 (+) inhibitor 1/V max (-) inhibitor V ma (i) 2 K M =K M (i) A [S] 1/K M = 1/K M (i) B [S]

108 Różnice między inhibitorami kompetycyjnymi i niekompetycyjnymi Inhibitor kompetycyjny Inhibitor niekompetycyjny Budowa Podobny do substratu Niepodobny do substratu Miejsce wiązania Miejsce aktywne Poza miejscem aktywnym dwracalność inhibicji Inhibicja odwracalna przez wzrost stężenia substratu V max Bez zmian maleje K M wzrasta Bez zmian Inhibicja nieodwracalna przez wzrost stężenia substratu

109 Wykres Michaelisa-Menten zależności V od [S] glukozy dla heksokinazy () i glukokinazy (G) V heksokinaza V max ()/2 V max (G)/2 glukokinaza K M () K M (G) glukoza [S]