PL B1. INSTYTUT IMMUNOLOGII I TERAPII DOŚWIADCZALNEJ PAN, Wrocław, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 7/01 ( ) C12N 7/02 ( ) A61K 35/76 ( ) (54) Oczyszczony preparat bakteriofagowy, sposób jego otrzymywania i zastosowanie (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT IMMUNOLOGII I TERAPII DOŚWIADCZALNEJ PAN, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/12 (72) Twórca(y) wynalazku: TOMASZ LIPIŃSKI, Wrocław, PL ANDRZEJ GAMIAN, Wrocław, PL EWA ZUZIAK, Brzeg Dolny, PL AGNIESZKA KORZENIOWSKA-KOWAL, Miękinia, PL ANDRZEJ GÓRSKI, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Witek Rafał WTS Rzecznicy Patentowi Witek Czernicki Śnieżko Spółka Partnerska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych o podwyższonej aktywności przeciwbakteryjnej przeznaczonych do terapii fagowej zakażeń i nowotworów oraz do wytwarzania fagopochodnych preparatów farmaceutycznych o podwyższonej czystości. Bakteriofagi są to wirusy zakażające komórki bakteryjne, stanowią zatem naturalny czynnik regulujący liczebność populacji bakteryjnych w przyrodzie. Stale obserwowany wzrost liczby patogennych bakterii opornych na obecnie stosowane antybiotyki wymusza konieczność poszukiwania alternatywnych środków antybakteryjnych [1]. Uważa się, że bakteriofagi, ze względu na sposób funkcjonowania są potencjalnie idealnym kandydatem na nowoczesne, skuteczne czynniki bakteriobójcze. Wzrost zainteresowania terapią bakteriofagami lub białkami izolowanymi z fagów; jest związany z wykazaną w kilku ośrodkach ich skutecznością w zwalczaniu zakażeń nie dających się leczyć antybiotykami [2,3]. Bakteriofagi stanowią kompleks kilku do kilkunastu rodzajów białek i kwasu nukleinowego DNA bądź RNA. Kwas nukleinowy może mieć postać jedno- lub dwuniciowej zamkniętej pętli lub włókna zawartego w białkowej osłonce, czyli kapsydzie. Białka fagowe mają zdolność do samoorganizacji w określone struktury morfologiczne pozwalające wyróżnić takie elementy faga jak głowa, ogonek, płytka adhezyjna, witki itd. [4,5]. Niektóre z tych białek wykazują aktywność enzymatyczną np. konieczną do rozpuszczenia ściany bakteryjnej czy otoczki. Zatem niektóre, oczyszczone białka faga są również potencjalnym czynnikiem bakteriobójczym [6], jak też stanowią enzymy o potencjalnej wartości handlowej. Ze względu na przebieg i skutki zakażenia komórki bakteryjnej, fagi dzieli się na lityczne (zjadliwe) i lizogenne (niezjadliwe). Fagi lityczne namnażają się w komórce bakteryjnej w krótkim czasie po zakażeniu, prowadząc do jej lizy, zaś uwolnione nowe cząstki wirusa zakażają kolejne komórki bakteryjne. Zakażenie płynnej hodowli bakteryjnej fagiem litycznym może spowodować całkowite jej wyjałowienie. W przypadku fagów lizogennych nie dochodzi do reprodukcji cząstek fagowych, lecz do wbudowania materiału genetycznego faga do genomu bakteryjnego, co nie wpływa zasadniczo na funkcje życiowe komórki bakteryjnej. Niekiedy spontanicznie lub pod wpływem czynników fizycznych, czy chemicznych dochodzi do aktywacji takiego profaga i wystąpienia cyklu litycznego [4,5]. Fagi lizogenne są nieprzydatne dla celów terapeutycznych. Prawdopodobnie dla każdej bakterii istnieje swoisty fag, zdolny ją zakażać, jednak szczególnie interesujące są tzw. fagi poliwalentne, swoiste dla szerokiego spektrum bakterii. W przypadku skutecznego opanowania techniki leczenia bakteriofagami oznacza to praktycznie nieograniczone i tanie źródło skutecznych antybiotyków, gdy tymczasem opracowanie nowego klasycznego antybiotyku jest związane z wysokimi kosztami. Bakteriofagi mają też szereg innych zalet w porównaniu do konwencjonalnych antybiotyków. Najważniejsza to swoistość, która pozwala niszczyć bakterie patogenne bez zabijania bakterii symbiotycznych, przez co nie narusza się subtelnej równowagi mikrobiologicznej organizmu. Wiadomo, bowiem, że wyjałowienie organizmu przez konwencjonalne antybiotyki jest przyczyną szeregu powikłań, w tym np. ciężkich zakażeń grzybiczych. Bakteriofagi posiadają cały szereg zalet [2,7]. Stężenie bakteriofagów w płynach chorego organizmu nie maleje od momentu podania, lecz podlega samoregulacji, liczba fagów rośnie ekspotencjalnie w obecności bakterii i szybko spada w przypadku ich braku. Nie zanotowano jak dotąd znaczących skutków ubocznych terapii fagami, które można stosować u pacjentów uczulonych na antybiotyki. Właściwie dobrane i wyselekcjonowane fagi mogą być zastosowane w profilaktyce antybakteryjnej w tym również do sanizacji, np. pomieszczeń szpitalnych. Znacznie rzadziej obserwuje się selekcję opornych bakterii, co często ma miejsce w przypadku antybiotyków; ponadto w przypadku wystąpienia oporności na danego faga u danej bakterii można dobrać innego faga zdolnego infekować oporną bakterię. Wreszcie mogą być stosowane równolegle z antybiotykami w terapii kombinowanej. Wprowadzenie terapii fagami do powszechnego zastosowania w lecznictwie wymaga opracowania metody pozwalającej uzyskiwać duże ilości czystych fagów o wysokim mianie aktywności. Badania właściwości immunologicznych fagów wymagają ich wysokiej czystości, co oznacza, że nie mogą zawierać śladów antygenów bakteryjnych zdolnych do indukcji układu odpornościowego, muszą być zatem immunologicznie neutralne. Fagi swoiste wobec bakterii Gram-ujemnych muszą być wolne od endotoksyn, peptydoglikanu i białek, czyli składników bakteryjnych aktywnych immunologicznie. Proponowane w niniejszym wynalazku rozwiązania zapewniają uzyskanie preparatów o takiej czystości poprzez wprowadzenie podczas

3 PL B1 3 filtracji czynników rozbijających peptydoglikan, destabilizujących ścianę komórkową bakterii, dezagregujących endotoksynę i usuwanie tych składników, bez naruszenia integralności fagów. Etap filtracji w procesie oczyszczania bakteriofagów jest stosowany w praktyce laboratoryjnej. W patencie amerykańskim nr 6,121,036 opisano zastosowanie filtracji przez membranę o wielkości porów w zakresie od około 0.01 do 1 µm, korzystnie od około 0.1 do około 0.5 µm, najkorzystniej od około 0.2 do około 0.4 µm, pozwalających na zatrzymanie bakterii i przepuszczanie przez membranę jedynie bakteriofagów. W celu usunięcia z filtratu toksyn i endotoksyn zanieczyszczających materiał bakteriofagowy poddawany jest ultrawirowaniu, dializie, sączeniu molekularnemu oraz ultrafiltracji. W opisie ujawniono stosowane w powyższych technikach parametry, w przypadku ultrafiltracji, oczyszczany preparat bakteriofagowy przepuszczany jest przez odpowiednią membranę o wielkości porów od 10 4 do 10 7 daltonów, korzystnie od 10 5 do 10 6 daltonów. Zgodnie z powyższym wynalazkiem, otrzymywano preparaty bakteriofagowe swoiste wobec wybranego gospodarza, wirulentne i skuteczne in vivo oraz oczyszczone z endotoksyn bakteryjnych na poziomie niższym niż 1.0% wagowy endotoksyn, korzystniej niższym niż 0.05% wagowych endotoksyn. Oczyszczanie fagów i usuwanie endotoksyn prowadzono stosując cykl wirowań, filtracji i technikę sączenia molekularnego. W patencie US nr 6,485,902, w celu uzyskania bakteriofagów znajdujących następnie zastosowanie w weterynaryjnej terapii fagowej skierowanej przeciwko E. coli, materiał biologiczny poddawano filtrowaniu przez 0.2 µm filtr. W zgłoszeniu patentowym nr WO 2004/091505, ujawniono zastosowanie bakteriofaga litycznego wobec Methylobacterium i oczyszczonego po przefiltrowaniu supernatantu hodowlanego przez 0.2 µm filtr, zatrzymujący komórki bakteryjne i przepuszczający bakteriofagi. Tak uzyskany preparat poddawano m.in. ultrawirowaniu przez membranę przepuszczającą na poziomie w przybliżeniu 10 4 do 10 7 daltonów, korzystnie w zakresie od 10 5 do 10 6 daltonów. Procedurę izolacji fagów opisaną w zgłoszeniu patentowym WO 2006/050193, oparto na filtracji, a następnie zagęszczaniu próby zawierającej bakteriofagi. Stosowano filtry MILLIPORE o porach wystarczająco małych by zatrzymać bakterie i przepuścić bakteriofagi, czyli w przybliżeniu 0.45 µm do 0.2 µm. W innych znanych metodach czyszczono cząstki fagowe z lizatu bakteryjnego zawierającego fagi przez wytrącanie siarczanem amonu i dializę oraz wytrącanie glikolem polietylenowym [10,11], także przez wirowanie w gradiencie sacharozy lub chlorku cezu [8,10-12]. W innych metodach do oczyszczania stosowano polisacharyd lub jego estry [13], albo membrany polianionowe [14], oraz kombinowane kilkuetapowe procedury z wytrącaniem glikolem polietylenowym, użyciem membran polianionowych i sączeniem molekularnym na kolumnach chromatograficznych [15]. Mimo wielokrotnego oczyszczenia, wciąż jednak otrzymywane preparaty nie są powtarzalne, nie udaje się uzyskiwać preparatów o jednakowym mianie i jednakowym stopniu oczyszczenia. Wadą wszystkich znanych metod jest konieczność stosowania wieloetapowej procedury oczyszczania, przez co znacznie spada wydajność preparacji oraz duża degradacja i spadek miana w trakcje poszczególnych kroków procesu oczyszczania fagów. Znane metody filtracji i ultrafiltracji nie zapewniają zadowalających wyników. Stąd też jednym z problemów wymagającym rozwiązania jest dostarczenie wydajnego sposobu oczyszczania fagów, korzystnie nadającego się do stosowania w skali przemysłowej. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania oczyszczonego preparatu bakteriofagowego, charakteryzujący się tym, że w kolejnych etapach: a) prowadzi się w procesie ciągłym oczyszczanie i łagodne zagęszczanie bakteryjnego lizatu fagowego przez ultrafiltrację za pomocą membrany selektywnie przepuszczającej niskocząsteczkowe zanieczyszczenia o masie cząsteczkowej poniżej , celem ich usunięcia, i zatrzymującej frakcję zawierającą bakteriofagi, z cyrkulacją oczyszczanego materiału; b) inkubuje się podczas zagęszczania w etapie a) frakcję zawierającą bakteriofagi z buforami płuczącymi i detergentem, a następnie z przynajmniej jednym czynnikiem wybranym z grupy zawierającej czynniki chelatujące i enzymy; c) prowadzi się dalej w procesie ciągłym oczyszczanie i zagęszczanie lizatu uzyskanego w etapie b) za pomocą selektywnie przepuszczalnej membrany przepuszczającej niskocząsteczkowe zanieczyszczenia i zatrzymującej frakcję zawierającą bakteriofagi, przy czym uzyskaną frakcję zawierającą bakteriofagi zawraca się ewentualnie do etapu a); d) zagęszcza się uzyskaną w etapie c) frakcję zawierającą bakteriofagi otrzymując oczyszczony preparat bakteriofagowy.

4 4 PL B1 Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie b) celem usunięcia endotoksyny, prowadzi się przemywanie frakcji zawierającej bakteriofagi buforem fosforanowym zawierającym jako detergent dezoksycholan sodu o stężeniu 0.5-2%. Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie b) frakcję zawierającą bakteriofagi traktuje się EDTA czynnikiem chelatującym, EDTA i trawi się lizozymem. Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie c) stosuje się membranę selektywnie przepuszczalną dla zanieczyszczających substancji o masie cząsteczkowej poniżej , celem ich usunięcia. Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dodatkowo otrzymany w etapie d) preparat analizuje się kompleksowo pod względem obecności składników ściany bakteryjnej, w tym endotoksyny, metodą LAL i Kdo, w chromatografii HPLC, elektroforezie w obecności siarczanu dodecylu, immunoblotingu z surowicą ludzką, testach biologicznych lizy bakteryjnej, porównując z preparatami fagowymi oczyszczonymi innymi metodami. Przedmiotem wynalazku jest również oczyszczony preparat bakteriofagowy o podwyższonej aktywności przeciwbakteryjnej zasadniczo pozbawiony bakteryjnej ściany komórkowej oraz wszelkich białkowych i lipidowych zanieczyszczeń, szczególnie toksyn i endotoksyn, możliwy do otrzymania sposobem według wynalazku. Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie preparatu bekteriofagowego do wytwarzania fagopochodnych preparatów farmaceutycznych o podwyższonej czystości. Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że otrzymywany preparat farmaceutyczny o podwyższonej czystości przeznaczony jest do stosowania w terapii fagowej, korzystnie leczeniu lub prewencji zakażeń mikrobiologicznych lub nowotworów oraz jako biochemicznie i immunologicznie czysty odczynnik do badań immunologicznych. Krytycznym parametrem służącym do oznaczania czystości preparatu według wynalazku jest zawartość endotoksyn. Warto zauważyć, że obniżenie ich zawartości w preparacie według wynalazku jest także miarą obniżenia zawartości pozostałości bakteryjnej ściany komórkowej oraz wszelkich innych białkowych i lipidowych zanieczyszczeń. Korzystnie, zawartość endotoksyn bakteryjnych w preparacie według wynalazku jest niższa niż 1.0 jednostek endotoksyn EU/mg całkowitej wagi oczyszczonego preparatu, korzystniej niższym niż 0.05 EU/mg, przy czym zawartość endotoksyn oznancza się znanymi metodami np. może być mierzona w teście LAL lub poprzez pomiar Kdo. Korzystnie, pomiar metodą Kdo pozwala na ocenę poziomu endotoksyny całkowitej łącznie ze związaną w kompleksach. W teście LAL nie jest oznaczana część endotoksyny zawarta w kompleksach. W niniejszym wynalazku kompleksowa analiza zapewnia ocenę preparatu pod względem czystości immunologicznej, oraz umożliwia w systemie ciągłym wysoki stopień doczyszczenia. Dotychczas analiza preparatów ograniczała się tylko do aktywności bakteriobójczej i testu LAL na obecność endotoksyn. Parametrem służącym do oznaczania aktywności preparatu według wynalazku jest miano fagowe. Korzystnie miano preparatu według wynalazku wynosi co najmniej 10 7 pfu/ml, korzystnie więcej niż 10 8 pfu/ml, najkorzystniej więcej niż 10 9 pfu/ml. Miano wyznacza się metodą znaną ze stanu technik. Miano preparatu może być wyznaczone metodą opisaną w poniższych przykładach. Niniejszy wynalazek jest pozbawiony wad znanych w dziedzinie sposobów dzięki 1) redukcji etapów do ciągłego płynnego procesu w przepływie i 2) wyeliminowaniu drastycznych etapów i złagodzenia całej procedury oraz 3) możliwości doczyszczania przez kompleksową analizę stopnia czystości. Pozbawione toksyn preparaty mogą być wykorzystywane w terapii, do wytwarzania preparatów fagopochodnych oraz do badań biologicznych i immunologicznych, w tym do reaktywności z fagami, jednak przy braku immunologicznie czystych fagów istnieje duże ryzyko wystąpienia reakcji krzyżowych lub innych niepożądanych oddziaływań z elementami bakteryjnymi (endotoksyna, egzotoksyny, białka i polisacharydydy powierzchniowe itd.). W surowicy ludzkiej występują liczne przeciwciała na te składniki, dlatego do uzyskania bezpiecznych leków i wiarygodnych wyników konieczne jest dokładne i powtarzalne oczyszczenie cząstek bakteriofaga. Istotne jest także udoskonalenie technik uprzedniego wydajnego namnażania bakteriofagów, co dzięki zaproponowanym w niniejszym zgłoszeniu rozwiązaniom, pozwala teraz na praktyczne wykorzystanie fagów do terapii, prowadzenia badań i do produkcji preparatów terapeutycznych pochodzących z bakteriofagów. Niniejszy wynalazek oparto na wynikach badań trzech fagów swoistych dla E. coli, laboratoryjnego faga K1 dogodnego do eksperymentów, co ułatwiło opracowanie metod i testów, faga Im11 najczęściej typowanego w prowadzonej terapii eksperymentalnej oraz faga wieloważnego T4, zdolnego zakażać szerokie spektrum szczepów E. coli. Bakterie te są częstą przyczyną wielu schorzeń. Nowość

5 PL B1 5 niniejszego wynalazku dotyczy, poza oryginalnymi rozwiązaniami dotyczącymi uniwersalnego i wydajnego namnażania i oczyszczania fagów, także użycia niezwykle istotnych, nowoczesnych metod analizy czystości preparatów, które przeprowadzano metodami chromatograficznymi, w elektroforezie SDS-PAGE, testami na zawartość endotoksyn i składników ściany bakteryjnej, jak testem LAL i metodami analiz chemicznych przy pomocy systemu GLC-MS (metoda Kdo [16]). Dotychczas bowiem nie dysponowano wystarczająco czułymi i specyficznymi metodami analizy czystości fagów. Nowatorskie podejście zastosowane w niniejszym wynalazku polega na oczyszczaniu preparatów fagowych systemem ciągłym przy pomocy filtracji z zagęszczaniem, gdzie przykładowo jednym z elementów jest urządzenie Pelikon z błoną 1000 kda i 100 kda, z równoczesnym wprowadzeniem do oczyszczania detergentu, najkorzystniej dezoksycholanu sodu, także czynnika chelatujacego i lizozymu. Ostatecznie preparat zagęszczano, np. na urządzeniu Amicon. Filtrowanie zaprojektowano w ten sposób, że materiał przepływa przez komorę z membraną, gdzie niskocząsteczkowe związki przechodzą przez membranę na zewnątrz, a zatrzymany materiał z fagiem wychodzi z komory i zawraca do niej w obiegu zamkniętym i cyrkuluje ulegając zagęszczeniu na membranie. Taki pierwszy moduł jest połączony w szereg z drugim modułem zawierającym komorę z inną membraną. Użycie połączonych szeregowo dwóch modułów korzystnie z różnymi membranami zapewnia ciągłość procesu z jednolitym przepływem materiału i ciągłą cyrkulacją. W obieg włączono przed komorą membranową drugiego modułu naczynie służące do inkubacji z enzymami, reagentami lub buforem płuczącym. Miano fagów oznaczano metodą dwuwarstwową Grattii lub RTD, a ilość białka metodą Lowry'- ego. Drugim nowatorskim rozwiązaniem jest kompleksowa analiza czystości, w której preparaty fagowe poddawano analitycznej i preparatywnej elektroforezie w warunkach denaturujących (SDS-PAGE), aby wydzielić poszczególne białka fagowe. Uzyskane żele barwiono analitycznie barwnikiem Commassie lub wybarwiano srebrem oraz analizowano z surowicą ludzką w immunoblotingu. Równoczesne zastosowanie lizozymu i czynnika chelatujacego pozwoliło na skuteczniejszą degradację bakteryjnej ściany komórkowej, gdyż czynnik chelatujący destabilizując osłonę bakteryjną ułatwia dostęp lizozymu do substratu. Dzięki cyrkulującemu z ciągłym przepływem systemowi filtracji i zagęszczania, bakteryjne produkty trawienia mogły być odfiltrowane, a tym samym nie przeszkadzały w dalszych etapach oczyszczania. Wprowadzenie do systemu detergentu z chelatorem okazało się zasadniczym elementem sposobu według wynalazku, gdyż korzystnie, nie niszcząc struktury ani aktywności żadnego z oczyszczanych fagów, pozwoliło na skuteczne usunięcie wszystkich hydrofobowych składników bakteryjnych, jak białka membranowe, endotoksyny i lipidy. Nieoczekiwanie skuteczne działanie detergentu objawiało się poprzez zwiększenie aktywności fagów w danej objętości preparatu, co można tłumaczyć dodatkowym uwalnianiem cząstek fagowych. Niniejszy wynalazek dotyczy, poza izolacją i oczyszczaniem, także analizy czystości i wyznaczania charakterystyki fagów odpowiedzialnych również za reakcję z surowicami. Kompleksowa analiza czystości preparatu fagowego (przykład 5) dotyczy testów na obecność składników bakteryjnej ściany komórkowej, endotoksyny metodą LAL i Kdo, chromatografii HPLC, elektroforezy w obecności siarczanu dodecylu, immunoblotingu z surowicą ludzką, testów biologicznych lizy bakteryjnej (przykład 4), porównując z preparatami fagowymi oczyszczonymi innymi metodami (przykład 3). Podkreślić należy wysoką skuteczność terapii fagowej, co zostało wykazane w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN i innych ośrodkach na świecie [2,7,17-20]. Wdrożenie preparatyki terapeutyków fagowych na skalę przemysłową jako wymagające mniejszych nakładów finansowych będzie łatwiejsze dla przemysłu farmaceutycznego. Wobec pojawiania się szczepów patogennych bakterii odpornych na wszystkie znane antybiotyki, zastosowanie tej terapii może być skuteczną alternatywą. Dlatego dysponowanie efektywnymi metodami analizy czystości fagów, proponowane w niniejszym wynalazku, może posłużyć do wdrożenia norm analizy czystości preparatów fagowych. Oczyszczone preparaty fagowe otrzymane według tego wynalazku przeznaczone są do kontrolowanej terapii fagowej zakażeń i nowotworów oraz do wytwarzania fagopochodnych preparatów farmaceutycznych o podwyższonej czystości. Opracowano procedurę wydajnej hodowli bakteriofagów, korzystnie na pożywce z hydrolizatem kazeiny, a następnie ich dokładnego oczyszczania, co pozwoliło uzyskiwać duże ilości czystych fagów o wysokim mianie aktywności. Do tej pory bowiem, zanieczyszczenia preparatów bakteriofagowych, jakimi są endotoksyny i inne składniki uwolnione przez zlizowane bakterie, uniemożliwiały zastosowanie szeregu aplikacji [7]. Uzyskanie dużych ilości cząstek fagowych pozwala na rozdzielenie ich poszczególnych składników białkowych. P r z y k ł a d y 1. Namnażanie bakteriofagów w hodowli bakteryjnej

6 6 PL B1 Szczep bakterii Escherichia coli B oraz szczep bakteriofaga T4 uzyskano z Polskiej Kolekcji Drobnoustrojów (PCM), znajdującej się Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu. Probówki z 5 ml pożywki handlowej LB, zaszczepiono komórkami E. coli B z hodowli na płytce agarowej. Inokulum inkubowano przez noc w temp. 37 C, po czym przeniesiono do 100 ml pożywki LB zawierającej 0.5% glukozy (po dodaniu 1 ml 50% roztworu glukozy). Namnażanie bakterii kontrolowano przez pomiar absorbancji Aćoo wobec pożywki stosowanej jako odnośnik. Hodowlę z wytrząsaniem w 37 C prowadzono przez 3-4 godz., do uzyskania absorbancji ok. A 600 = 1-00, odpowiadającej mianu 10 9 cfu/ml tych bakterii, które następnie odwirowano (5000 x g, 15 min, 4 C, Heraeus) w sterylnych probówkach typu falkon (Sarstedt, 45 ml). Masę bakteryjną zawieszono w 20 ml LB i przeniesiono do pożywki bakteriofagowej (1200 ml pożywki handlowej LB, lub korzystniej hydrolizatu kazeiny), do której dodano również 1,2 ml 2,5 M MgCl 2 (do stężenia 2.5 mm) oraz 12 ml 50% glukozy (do stężenia 0.5%). Hodowlę prowadzono korzystnie w butli 2-litrowej, wyposażonej w system napowietrzania, na mieszadle magnetycznym, w temp. 37 C, do momentu osiągnięcia gęstości optycznej A 600 = Do tak przygotowanej hodowli bakteryjnej dodano 80 ml faga T4 o mianie 1,4 x pfu/ml, (stosunek ilości bakterii do faga powinien wynosić co najmniej 1:1, korzystniej jest jeśli na jedną komórkę bakteryjną przypada więcej niż jedna cząstka fagowa). Po 5 minutach od wprowadzenia faga dodano 12 ml 50% glukozy (do stężenia 0,5%), a po 30 min. dodano 300 ml 5 mm indolu (do stężenia 1 mm). Lizę bakterii prowadzono korzystnie z napowietrzaniem, na mieszadle magnetycznym, w temp. 37 C, z kontrolowaniem lizy przez pomiar absorbancji A 600 do osiągnięcia stałej wartości A 600, po ok. 4 godz. Po zakończeniu lizy dodano chloroform do stężenia 1%, intensywnie schłodzono w łaźni lodowej do temp. 4 C i odwirowano (5000xg, 15 min, 5 C, Heraeus). Supernatant zawierający faga zlano razem i sączono przez filtr antybakteryjny 0,22 µm. Sączenie odbywało się w warunkach sterylnych z użyciem jednorazowego sączka STERITOP firmy Millipore. Tak sporządzony lizat bakteryjny zawierający cząstki fagowe przechowywano w temp. 4 C. Miano faga wyznacza się metodą Grattii lub RTD (Routine Test Dilution) i podaje się w jednostkach pfu/ml (plaque-forming units). Wydajność namnażania faga podaje się jako stosunek ilości cząstek fagowych obecnych w lizacie bakteryjnym uzyskanym zgodnie z wyżej opisaną procedurą do ilości cząstek fagowych namnożonych powszechnie stosowanymi metodami. 2. Oczyszczanie bakteriofagów z lizatu bakteryjnego Preparat po namnażaniu filtrowano przez błonę 1000 kda (PLCXK, Millipore) z użyciem aparatu Pelikon (Millipore), uzyskując częściowe oczyszczenie i 5-krotne zagęszczenie. Filtrowanie zaprojektowano w ten sposób, że materiał przepływa przez komorę z membraną, przy czym niskocząsteczkowe związki przechodzą przez membranę na zewnątrz, a zatrzymany materiał z fagiem wychodzi z komory i zawraca do niej w obiegu zamkniętym z użyciem silikonowego węża i cyrkuluje ulegając zagęszczeniu na membranie. Ciśnienie jest monitorowane na wejściu i wyjściu z komory. Taki pierwszy moduł jest połączony wężami w szereg z drugim modułem zawierającym komorę z membraną 100 kda (PLCHK, Millipore). Użycie połączonych szeregowo dwóch modułów z różnymi membranami jest korzystniejsze niż ich wymiana w jednym module, dla zapewnienia ciągłości procesu z jednolitym przepływem materiału i ciągłą cyrkulacją. W obieg włączono przed komorą membranową drugiego modułu, naczynie służące do inkubacji z enzymami, odczynnikami lub buforem płuczącym. Do preparatu w naczyniu inkubacyjnym dodano najpierw detergent, korzystnie dezoksycholan sodu (DOC) do stężenia 1% i po inkubacji w temp. 4 C przez noc, preparat filtrowano dalej przez 100 kda błonę 0,05 M buforem Tris/HCl ph 8,0 z 0,25 M NaCl i 0,005 M MgCl 2, a następnie 0,05 M buforem fosforanowym ph 7,0 zawierającym 5 mm EDTA (0,05 M Na 2 HPO 4 i 0,05 M NaH 2 PO 4 mieszano w takim stosunku objętościowym żeby końcowe ph wynosiło 7,0), a po dodaniu lizozymu jaja kurzego (38500 U/mg, Sigma) do stężenia 0.05% trawiono mureinę w temp. 4 C przez noc. Filtrację przez błonę 100 kda kontynuowano do momentu odmycia lizozymu, korzystnie gdy wartość A 280 spada do 0.05 AU (Absorption Units). Na koniec zagęszczono preparat z wykorzystaniem ultrafiltracji pod ciśnieniem azotu przez błonę 100 kda (PLHK, Millipore). Uzyskiwano zazwyczaj zagęszczenie faga z 20 1 do 100 ml przy równoczesnym oczyszczeniu od bakterii i endotoksyn mierzone w teście LAL spadkiem ilości endotoksyny przykładowo dla faga T4 do 2.9 x 10 4 EU/ml i faga I11 m do 1,2 x 10 3 EU/ml. Obniżenie zawartości endotoksyny uzyskuje się przez zwiększenie liczby cykli filtracji. Wydajność preparacji wynosiła przykładowo 10% dla faga T4 lub 17% dla faga I11 m (7 x 10 9 pfu/ml z wyjściowego miana 2 x 1010 pfu/ml). Zgodnie z niniejszym wynalazkiem otrzymywano preparaty bakteriofagowe swoiste wobec wybranego gospodarza, wirulentne i skuteczne in vivo oraz oczyszczone z endotoksyn bakteryjnych na

7 PL B1 7 poziomie niższym niż 1.0 EU/mg wagowy endotoksyn w preparacie, korzystniej niższym niż 0.05 EU/mg endotoksyn w preparacie, przy czym 1 ng wynosi 5EU (jednostek endotoksyny-endotoxin units). Uzyskiwana wydajność oczyszczania tych preparatów bakteriofagowych swoistych, wirulentnych i skutecznych in vivo była porównywalna z metodą z ultrawirowaniem w gradiencie z chlorku cezu i wynosiła od 10-30% wyjściowej aktywności przy oczyszczaniu zgodnie z niniejszym wynalazkiem. 3. Oczyszczanie bakteriofagów glikolem polietylenowym i metodą ultra wirowania Po przeprowadzeniu hodowli bakteriofaga T 4, do lizatu dodano glikol polietyleowy (PEG) 6000 Da (do stężenia 8%) oraz 0.5 M NaCl i mieszano przez 15 minut w 37 C, do całkowitego rozpuszczenia PEG. Całość pozostawiano na ok. 24 godz. w 4 C, a następnie wirowano (17000 obr/min, 3 h, 4 C, Heraeus), po czym supernatant zlano, a osad zawieszono w 20 ml buforu T-phage. Do rozpuszczonego w buforze osadu dodano KCl (do stężenia 1 M) i mieszano energicznie przez 15 minut. Tak uzyskany roztwór wirowano (10000 obr/min, 20 min, 4 C), a do supernatantu dodano CsCl (do stężenia 0.01 M). Całość przeniesiono do probówek i wirowano na ultrawirówce (32000 obr/min, 24 godz. 4 C, Beckman). Po zebraniu kolejnych frakcji uzyskane preparaty dializowano przez około 4 godz. Wobec 0.1 M buforu Tris/HCl, ph 8.0, zawierającego NaCl 0.5 M, MgCl M. W celu oczyszczania faga w gradiencie sacharozy przygotowano pięć roztworów sacharozy o stężeniach: 40%, 32.25%, 22.5%, 13.75% i 5%. Następnie, wszystkie roztwory sacharozy umieszczono w porbówkach ultra wirówkowych (Beckman) w następującej kolejności: 4 ml 40% sacharozy, 4 ml 32.25%, 4 ml 22.5%, 4 ml 13.75% i 4 ml 4% sacharozy. Probówki zrównoważono i ultra wirowano (50000 obr/min, 5 h, 4 C, Beckman). Po zakończeniu wirowania probówki przeniesiono do łaźni z lodem i pobierano po 0.5 ml frakcji do ependorfek umieszczonych na lodzie. Frakcje dializowano w wodzie milli Q przez noc, a następnie analizowano w elektroforezie SDS-PAGE. 4. Oznaczanie miana fagowego Miano bakteriofaga określa się metodą dwuwarstwową Grattie lub RTD (Routine Test Dilution) jako ilość cząstek fagowych zakażających bakterie w objętości 1 ml. Jednostką miana jest pfu/ml [plague-forming unist/ml]. Probówki z 5 ml LB zaszczepiono komórkami E. coli B z hodowli na płytce agarowej i inkubowano w 37 C przez 3 godz. Przygotowano kolejne, dziesiętne rozcieńczenia faga w PBS. Przygotowany w probówkach jałowych, płynny 0.7% agar (3 ml) utrzymywano w łaźni wodnej w temp. 80 C. Płytki z podłożem fagowym (NaCl 5.0 g, Na 2 HPO g, agar 17.0 g, hydrolizat kazeiny 10.0 g, wyciąg mięsny 3.0 g), suszono pod lampą UV. Rozgrzany, płynny agar schłodzono do temp. 40 C, następnie dodano 0.2 ml szczepu bakterii i 0.2 ml faga (z każdego rozcieńczenia) i wylano na płytkę (jedna probówka z agarem przypadała na jedną płytkę fagową). Po zastygnięciu agaru na płytkach, wstawionoe do temp. 37 C i inkubowano przez noc. Metodą RTD probówki z 5 ml LB zaszczepiono szczepem E. coli B z hodowli na płytce agarowej i inkubowano w temp. 37 C przez 3 godz. Przygotowano kolejne, dziesiętne rozcieńczenia faga w PBS. Płytki z podłożem fagowym, suszono pod lampą UV. Następnie, wylano na nie po około 2 ml szczepu bakterii E. coli B i pozostawiono do suszenia na 15 min. Na tak przygotowane płytki nakrapiano po 10 µl faga, z każdego rozcieńczenia. Płytki inkubowano w temp. 37 C przez noc. 5. Analiza stopnia czystości metodą elektroforezy i immunoblotingu Elektroforezę białek w w 10% lub 12,5% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS (SDS-PAGE) prowadzono metodą Laemmli w buforze elektrodowym o ph Próby przed naniesieniem na żel suszono w 37 C przez dobę, następnie rozpuszczono je w wodzie milli Q i buforze do prób (2 x stężonym) i gotowano 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Rozdział białek prowadzono ok. 1 godz., na płytkach o wymiarach 83x73x0.75 mm, początkowo przy natężeniu prądu 10 ma, a po wejściu w żel zagęszczający przy 20 ma na płytkę [BioRad]. Żele barwiono 0.1% odczynnikiem Coomassie Brillant Blue R-250, przez 30 minut. Nadmiar barwnika odmyto 40% metanolem z 10% kwasem octowym. Barwienie prowadzono także odczynnikiem srebrowym, gdy żel po elektroforezie pozostawiono na noc w temp. pokojowej w roztworze 40% MeOH z 10% kwasem octowym. Następnie, wytrząsano na kołysce ze świeżo przygotowanym 0.7% HJO 4, przez 5 minut. Po tym czasie płukano 4 x 10 minut w wodzie milli Q. Tak wypłukany żel wytrząsano na kołysce z odczynnikiem srebrowym, przez 10 min., po czym płukano 4x10 min. w wodzie milli Q. Na koniec żel barwiono w odczynniku srebrowym. Immunobloting wykonywano po elektroforezie SDS-PAGE z użyciem żelu trzymanego 15 minut w buforze do transferu. Membranę Immobilon-P moczono 15 sekund w 100% MeOH, 2 minuty w wodzie milli Q i 2 minuty w buforze do transferu.

8 8 PL B1 Transfer prowadzono przez 1 godz. przy napięciu 100 V [BioRad]. Membranę po transferze barwiono w Ponceau S, a następnie odbarwiono w wodzie milli Q do momentu całkowitego zaniku koloru różowego. Membranę suszono na bibule Whatman 1 i przechowywano. Suchą membranę moczono w 100% MeOH i płukano w wodzie milli Q; następnie blokowano pięcioma mililitrami 1% BSA w buforze TBS-T (TBS Tween 20 z 0.5 ml 1% BSA) w 37 C przez 1 godz., po czym membranę (immobilon-p) płukano buforem TBS-T 1 x 15 minut i 2 x 5 minut. Następnie, immobilon-p inkubowano z roztworem ludzkiej surowicy 250 x rozcieńczonej (5ml TBS-T z 1% BSA + 20 µl surowicy). Pierwsza faza inkubacji przebiegała w 37 C przez 1 godz. z wytrząsaniem, a następnie w 4 C przez noc. Niezwiązane przeciwciała odmywano buforem TBS-T (raz przez 15 minut i 2 razy po 5 minut). Przygotowano roztwór kozich przeciwciał anty-human IgG znakowanych fosfatazą zasadową (0,5 µl przeciwciał w 10 ml TBS-T z 1% BSA) i inkubowano w nim membranę w temp. 37 C, przez 1 godz. Nadmiar przeciwciał odmyto buforem TBS. Obraz wywoływano w roztworze 5 ml buforu TBS-Mg 2 + z 50 µl BCIP (30 mg/ml w 70% DMF) i 50 µl NBT (15 mg/ml w 100% DMF). Piśmiennictwo: 1. Biswas B., Adhya S., Washart P., Brain P.,Trostel A.N., Powell B., Carlton R., and Merril CR. (2002): Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from clinical isolate of vancomycineresistant Enterococcus faecium. Infect. Immun., Sulakvelidze A., Morris J.G. (2001): Bacteriophages as therapeutic agents. Ann Med. 33(8): Kucharewicz-Krukowska A., Slopek S. (1987): Immunogenic effect of bacteriophage in patients subjected to phage therapy. Arch. Immunol. Ther. Exp. 35: Zaremba M. L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska, Warszawa (1997) Wydawnictwo Lekarskie PZWL 5. Ross F. C: Introductory Microbiology, (1983), Merril C E. Publishing Co., A. Bell and Howell Company 6. Loeffler J.M., Nelson D., Fischetti V.A. (2001): Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with bacteriophage cell wali hydrolase. Science 294 (5549): Carlton R. M. (1999): Phage therapy: past history and futurę prospects. Arch. Immunol. Ther. Exp., 47, Merril CR., Biswas B., Carlton R., Jensen NC., Creed GJ., Zullo S. and Adhya S. (1996): Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93: Hedstrom S.A., Kamme C (1973): Antibodies against staphylococcal bacteriophages in human sera. Acta Path. Microbiol. Scand. Section B. 81, Ehara M., Shimodori S., Kojima F., Ichinose Y., Hirayama T., Albert MJ., Supawat K., Honma Y., Iwanaga M., Amoko K. (1997): Characterisation of filamentous phages of Vibrio cholerae 0139 and 01. FEMS Microbiol. Let. 154: Svenson SB., Lonngren J., Karlin N. and Lindberg AA. (1979): Salmonella bacteriopage glucanases: endorhamnosidases of Salmonella typhimurium bacteriophages. J. ViroL 1979: Nimmich W., Schmidt G., Krallmann-Wenzel U. (1991): Two different Escherichia coli capsular polysaccharide depolymerases each associated with one of the coliphage K5 and K20. FEMS Microbiol. Let. 82: Boratyński J., Górski A., Syper D., Weber-Dąbrowska B., zgłoszenie patentowe P Weber-Dąbrowska B., Mulczyk M., Górski A., Boratyński J., Lusiak M., Syper D., zgłoszenie patentowe P Boratyński J., Górski A., Lipiński T., Syper D., Weber-Dąbrowska B., 2002, zgłoszenie patentowe P Rybka J., Gamian A., Determination of endotoxin by the measurement of the acetylated methyl glycoside derivative of Kdo with gas-liquid chromatography-mass spectrometry, J. Microbiol. Meth., 2006, 64, Ślopek S., Durlakowa I., Weber-Dąbrowska B., Kucharewicz-Krukowska A., Dąbrowski M. and Bisikiewicz R. (1981): Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections I. General evaluation of the results. Arch. Immunol. Ther. Exp. 31: Ślopek S., Kucharewicz-Krukowska A., Weber-Dąbrowska B., Dąbrowski M (1985): Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. IV. Evaluation of the results obtained in 370 cases. Arch. Immunol. Ther. Exp. 33(2):219-40

9 PL B Ślopek S., Kucharewicz-Krukowska A., Weber-Dąbrowska B., Dąbrowski M. (1985): Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. V. Evaluation of the results obtained in children, Arch. Immunol. Ther. Exp. 33(2): Ślopek S., Weber-Dąbrowska B., Dąbrowski M. and Kucharewicz-Krukowska A. (1987): Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections in the years Arch. Immunol. Ther. Exp. 35: Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania oczyszczonego preparatu bakteriofagowego, znamienny tym, że w kolejnych etapach: a) prowadzi się w procesie ciągłym oczyszczanie i łagodne zagęszczanie bakteryjnego lizatu fagowego przez ultrafiltrację za pomocą membrany selektywnie przepuszczającej niskocząsteczkowe zanieczyszczenia o masie cząsteczkowej poniżej , celem ich usunięcia, i zatrzymującej frakcję zawierającą bakteriofagi, z cyrkulacją oczyszczanego materiału; b) inkubuje się podczas zagęszczania w etapie a) frakcję zawierającą bakteriofagi z buforami płuczącymi i detergentem, a następnie z przynajmniej jednym czynnikiem wybranym z grupy zawierającej czynniki chelatujące i enzymy; c) prowadzi się dalej w procesie ciągłym oczyszczanie i zagęszczanie lizatu uzyskanego w etapie b) za pomocą selektywnie przepuszczalnej membrany przepuszczającej niskocząsteczkowe zanieczyszczenia i zatrzymującej frakcję zawierającą bakteriofagi, przy czym uzyskaną frakcję zawierającą bakteriofagi zawraca się ewentualnie do etapu a); d) zagęszcza się uzyskaną w etapie c) frakcję zawierającą bakteriofagi otrzymując oczyszczony preparat bakteriofagowy. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) celem usunięcia endotoksyny prowadzi się przemywanie frakcji zawierającej bakteriofagi buforem fosforanowym zawierającym jako detergent dezoksycholan sodu o stężeniu 0.5-2%. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) frakcję zawierającą bakteriofagi traktuje się EDTA czynnikiem chelatującym, EDTA i trawi się lizozymem. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie c) stosuje się membranę selektywnie przepuszczalną dla substancji o masie cząsteczkowej poniżej , celem ich usunięcia. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo otrzymany w etapie d) preparat analizuje się kompleksowo na obecność składników ściany bakteryjnej, w tym endotoksyny, metodą LAL i Kdo, w chromatografii HPLC, elektroforezie w obecności siarczanu dodecylu, immunoblotingu z surowicą ludzką, testach biologicznych lizy bakteryjnej, porównując z preparatami fagowymi oczyszczonymi innymi metodami. 6. Oczyszczony preparat bakteriofagowy o podwyższonej aktywności przeciwbakteryjnej zasadniczo pozbawiony bakteryjnej ściany komórkowej oraz wszelkich białkowych i lipidowych zanieczyszczeń, szczególnie toksyn i endotoksyn, możliwy do otrzymania sposobem jak określono w zastrz. od 1 do Zastosowanie preparatu bekteriofagowego, jak określono w zastrz. 6, do wytwarzania fagopochodnych preparatów farmaceutycznych o podwyższonej czystości. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że otrzymywany preparat farmaceutyczny o podwyższonej czystości przeznaczony jest do stosowania w terapii fagowej, korzystnie leczeniu lub prewencji zakażeń mikrobiologicznych lub nowotworów oraz jako biochemicznie i immunologicznie czysty odczynnik do badań immunologicznych.

10 10 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)