(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12Q 1/70 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/08 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Test oporności HCV na leki obejmujący prawie pełny genom (30) Pierwszeństwo: WO PCT/IB2007/ (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/32 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/08 (73) Uprawniony z patentu: DEBIOPHARM S.A., Lausanne, CH Katholieke Universiteit Leuven, Leuven, BE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GRÉGOIRE VUAGNIAUX, Lausanne, CH JEAN-MAURICE DUMONT, Pully, CH JOKE SNOECK, Renens, CH SONIA VAN DOOREN, Meise, BE ANNE-MIEKE VANDAMME, Rotselaar, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-1622/VAL EP B1 Opis TŁO WYNALAZKU Dziedzina wynalazku 10 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy testów wykrywających i charakteryzujących pojedyncze lub sprzęŝone mutacje w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), które są związane z opornością na lek przeciw-hcv u pacjenta. Testy te moŝna takŝe stosować do przewidywania oporności na lek przeciw-hcv u pacjenta zakaŝonego HCV przed lub na wczesnym etapie terapii przeciwwirusowej albo do wybrania alternatywnej terapii dla pacjenta zakaŝonego HCV u którego rozwinęła się oporność na konkretny lek terapeutyczny lub połączenie leków. Wynalazek takŝe dotyczy par starterów nukleotydowych oraz zestawów do przeprowadzania tych testów. Opis pokrewnego stanu techniki [0002] Około 1 lat temu Choo i współpracownicy sklonowali i scharakteryzowali HCV. Choo i in., (1989) Science 244, HCV naleŝy do rodziny Flaviviridae i zawiera nukleokapsyd otoczony otoczką i genom w postaci jednoniciowego RNA o dodatniej polarności. (Bartenschlager i in., (2003) Antiviral Res 60, ) Genom HCV składa się z regionów niekodujących i 3 (UTR lub NCR), które flankują pojedynczą długą otwartą ramkę odczytu (ORF). Ta ORF koduje trzy białka strukturalne na końcu aminowym i sześć białek niestrukturalnych (NS) na końcu karboksylowym. Białka strukturalne stanowią białko rdzeniowe nukleokapsydu (C) oraz dwie glikoproteiny otoczkową 1 (E1) i otoczkową 2 (E2). Białka niestrukturalne nazwano NS2, NS3, NS4a, NS4b, NSa, NSb. NCR jest najsilniej konserwowanym regionem genomu HCV, podczas gdy sekwencje dwóch białek otoczkowych (E1 i E2) są wysoce zmienne pomiędzy róŝnymi izolatami HCV. NajwyŜszy stopień zmienności zaobserwowano w regionie w obrębie E2, obecnie często nazywanym regionem hiperzmiennym 1. [0003] Od czasu początkowej identyfikacji HCV zidentyfikowano co najmniej 7 róŝnych głównych typów wirusa i oznaczono jako genotypy od 1 do 7. Wśród tych genotypów istnieje kilka podtypów (np. HCV1a, 1b, 1c). Genotyp i podtyp wirusa, którym zakaŝony jest pacjent moŝe wpływać na prognozę kliniczną, a takŝe na odpowiedź na leczenie róŝnymi lekami (Simmonds i in., (199) Hepatology 21, 70-82; Bukh i in., (199) Semin Liver Dis 1, 41-63; Chevaliez i Pawlotsky (2007) World J Gastroenterol 13, ).

3 [0004] Do dnia dzisiejszego zakaŝenie HCV pozostaje powaŝnym problemem medycznym. Obecnie na świecie HCV zakaŝonych jest około 170 milionów ludzi. HCV przenosi się głównie przez krew i produkty krwiopochodne, a takŝe drogą przenoszenia wertykalnego podczas ciąŝy. Zazwyczaj początkowy przebieg zakaŝenia jest łagodny. JednakŜe układ immunologiczny jest często niezdolny do usunięcia wirusa, a u osób z utrzymującym się zakaŝeniem istnieje duŝe ryzyko marskości wątroby lub raka wątrobowokomórkowego (Poynard i in., (1997) Lancet 349, ). [000] Obecnie standardowe leczenie przewlekłego zakaŝenia HCV jest oparte na połączeniu pegilowanego interferonu alfa i rybawiryny. Terapia ta wytwarza utrzymującą się odpowiedź przeciwwirusową u 8-90% pacjentów zakaŝonych genotypami 2 i 3, ale niestety tylko u około 4% pacjentów zakaŝonych dominującym genotypem 1 (Stribling i in., (2006) Gastroenterol Clin North Am tom ). Wyraźnie potrzebne są dodatkowe terapie z zastosowaniem innych leków i połączeń leków wykazujących wyŝszą aktywność przeciwirusową i lepsze profile bezpieczeństwa, w szczególności do zapobiegania nawrotom HCV. [0006] Wprowadzenie testów diagnostycznych do badania przesiewowego produktów krwiopochodnych znacząco obniŝyło wskaźnik nowych zakaŝeń. Dostępność modeli in vitro, tj. subgenomowych modeli replikonu HCV i modelu zakaŝenia w hodowli komórek oraz ulepszenia technik badań molekularnych, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) ułatwiły opracowanie dodatkowych silnych inhibitorów replikacji HCV skierowanych bezpośrednio na białko wirusowe lub działających pośrednio poprzez białka gospodarza uczestniczące w infekcji wirusowej (Bartenschlager (2002) Nat Rev Drug Discov 1, ; Wakita i in., (200) Nat Med 11, ). Kilka z tych nowych związków włączono do badań klinicznych lub jest juŝ dostępnych na rynku ( /hepatitis/hepc/hcvdrugs_2007.pdf). [0007] Opracowano testy mające na celu dostarczenie informacji prognostycznej o prawdopodobieństwie odpowiedzi na terapię przeciw-hcv (Gretch i in., (1997) Hepatology 26, 43s-47s; Podzorski (2002) Arch Pathol Lab Med 126, ). Testy te obejmują testy serologiczne oraz jakościowe lub ilościowe testy molekularne. Przykładami opartych na PCR testów obciąŝenia wirusem są Cobas Amplicor (Roche) oraz m2000 Real-Time PCR Diagnostics System (Abott). Inne testy oparte na PCR, w tym np. Versant HCV Genotyping Assay (Bayer Diagnostics), INNO-LiPA HCV II (Innogenetics), zestaw GEN-ETI-K DEIA (Sorin, Saluggia, Włochy) i zestaw do genotypowania TRUGENE HCV NC (Visible Genetics Europe, Evry, Francja), pozwalają zidentyfikować genotyp i podtyp HCV. Innym sposobem wykrywania mutacji jest ten opisany w Yagi i in., Journal

4 3 10 of Medical Virology 77, strony (200), wyszczególniający genomy HCV pobrane z biopsji wątroby, które następnie sklonowano z zastosowaniem RT-PCR z odwrotną transkrypcją do długich sekwencji, a następnie trzech reakcji PCR, przy czym w pierwszej cały genom zostaje namnoŝony w reakcji PCR do długich sekwencji, po czym jako drugą i trzecią prowadzi się zagnieŝdŝone reakcje PCR; namnoŝony cdna poddaje się analizie sekwencji i określa się mutacje, por. Fig. 1A. Systematyczną ocenę genotypu HCV przed terapią doceniono niedawno, poniewaŝ genotyp HCV determinuje wybór leku i dawkowania najskuteczniejszego leku przeciw-hcv, np. rybawiryny lub interferonu, a takŝe czasu trwania leczenia. Obecnie identyfikacja genotypów oparta jest głównie na sekwencjonowaniu małego subregionu genomu HCV, np. UTR, a nie pełnego lub prawie pełnego genomu HCV. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0008] W swojej najbardziej ogólnej postaci niniejszy wynalazek dotyczy testu do identyfikacji mutacji w genomie HCV obecnego w próbce. Test obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno: a) ekstrakcję RNA wirusa z próbki zawierającej HCV; b) określanie genotypu i podtypu HCV; c) syntezę częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach odwrotnej transkrypcji, przy czym pierwsza reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z pierwszego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w 3 UTR genomu prototypowego HCV o takim samym genotypie i podtypie, druga reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z drugiego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w regionie NS4B-NSSA genomu prototypowego HCV, a trzecia reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z trzeciego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV; d) syntezę drugiej nici i namnaŝanie częściowych cdna z etapu c) w trzech oddzielnych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji odwrotnej transkrypcji, pierwszy zewnętrzny starter antysensowny i pierwszy zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną w regionie NS4B-NSSA genomu prototypowego HCV, mieszanina do drugiej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji odwrotnej transkrypcji, drugi zewnętrzny starter antysensowny i drugi

5 zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, a mieszanina do trzeciej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji odwrotnej transkrypcji, trzeci zewnętrzny starter antysensowny i trzeci zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną w regionie UTR genomu prototypowego HCV, przy czym drugi zewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS4B-NSA genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do pierwszego zewnętrznego startera sensownego oraz przy czym trzeci zewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do drugiego zewnętrznego startera sensownego; e) dalsze namnaŝanie częściowych cdna z etapu d) w trzech oddzielnych zagnieŝdŝonych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji PCR oraz pierwsze wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, mieszanina do drugiej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji PCR oraz drugie wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, a mieszanina do trzeciej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji PCR oraz trzecie wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, przy czym startery wewnętrzne nie pokrywają się ze starterami zewnętrznymi, drugi wewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS4B-NSSA genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do pierwszego wewnętrznego startera sensownego, a trzeci wewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do drugiego wewnętrznego startera sensownego; f) analizę sekwencji dalej namnoŝonych cdna z etapu e); oraz g) porównanie sekwencji uzyskanych w etapie f) z sekwencją prototypowego HCV. [0009] W innej postaci test według wynalazku stosuje się do identyfikacji i scharakteryzowania pojedynczych i sprzęŝonych mutacji związanych z opornością na konkretny lek lub połączenie leków przeciw-hcv u pacjenta zakaŝonego HCV oraz do utworzenia lub rozszerzenia banku danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw-hcv. Test obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno: a) ekstrakcję RNA wirusa z próbki pobranej od pacjenta będącego nosicielem HCV, który jest oporny na lek lub połączenie leków przeciw-hcv, którymi pacjent był leczo-

6 ny, co wykazano przez niepowodzenie leczenia; b) określanie genotypu i podtypu HCV; c) syntezę częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach odwrotnej transkrypcji, przy czym pierwsza reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z pierwszego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w 3 UTR genomu prototypowego HCV o takim samym genotypie i podtypie, druga reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z drugiego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w regionie NS4B-NSSA genomu prototypowego HCV, a trzecia reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z trzeciego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV; d) syntezę drugiej nici i namnaŝanie częściowych cdna z etapu c) w trzech oddzielnych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji odwrotnej transkrypcji, pierwszy zewnętrzny starter antysensowny i pierwszy zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną w regionie NS4B-NSA genomu prototypowego HCV, mieszanina do drugiej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji odwrotnej transkrypcji, drugi zewnętrzny starter antysensowny i drugi zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, a mieszanina do trzeciej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji odwrotnej transkrypcji, trzeci zewnętrzny starter antysensowny i trzeci zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną w regionie UTR genomu prototypowego HCV, przy czym drugi zewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS4B-NSA genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do pierwszego zewnętrznego startera sensownego oraz przy czym trzeci zewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do drugiego zewnętrznego startera sensownego; e) dalsze namnaŝanie częściowych cdna z etapu d) w trzech oddzielnych zagnieŝdŝonych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji PCR oraz pierwsze wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, mieszanina do drugiej zagnieŝdŝonej reakcji PCR za-

7 wiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji PCR oraz drugie wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, a mieszanina do trzeciej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji PCR oraz trzecie wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, przy czym startery wewnętrzne nie pokrywają się ze starterami zewnętrznymi, drugi wewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS4B-NSA genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do pierwszego wewnętrznego startera sensownego, a trzeci wewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do drugiego wewnętrznego startera sensownego; f) analizę sekwencji dalej namnoŝonych cdna z etapu e); g) porównanie sekwencji uzyskanych w etapie f) z sekwencją prototypowego HCV oraz identyfikację mutacji; oraz h) wprowadzenie zidentyfikowanych mutacji do banku danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw-hcv. [0010] W pokrewnej postaci stosuje się test według wynalazku do identyfikacji lub scharakteryzowania pojedynczych i sprzęŝonych mutacji związanych z opornością na stosowane leczenie u pacjenta zakaŝonego HCV z wykorzystaniem banku danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw-hcv do wybrania do dalszej terapii pacjenta alternatywnego leku lub połączenia leków przeciw-hcv, na które, jak się oczekuje, wariant wirusa występujący u pacjenta nie będzie oporny. Test obejmuje te same etapy jak test z poprzedniej postaci, za wyjątkiem etapu h), który zastąpiono etapem obejmującym przeszukanie banku danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw-hcv pod względem zidentyfikowanych mutacji oraz wybranie do dalszego leczenia pacjenta leku lub połączenia leków przeciw-hcv, na które, jak się oczekuje, HCV nie będzie oporny. [0011] W innej postaci test z poprzedniej postaci stosuje się do analizy próbki pobranej od pacjenta zakaŝonego HCV przed rozpoczęciem jakiejkolwiek terapii farmakologicznej u pacjenta. Informacja uzyskana z tej analizy pozwoli prowadzącemu lekarzowi na wybranie leku lub połączenia leków przeciw-hcv do leczenia pacjenta, na który to lek lub połączenie leków przeciw-hcv, jak się oczekuje, wariant lub warianty HCV obecne u pacjenta nie będą oporne. [0012] Bardziej szczególna postać wynalazku dotyczy testu do identyfikacji mutacji w genomie HCV 1 b obecnego w próbce. Test obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno:

8 a) ekstrakcję RNA wirusa z próbki zawierającej HCV; b) określanie genotypu i podtypu HCV; c) pod warunkiem, Ŝe w etapie b) wskazano, Ŝe HCV jest typu 1 b, syntezę częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach odwrotnej transkrypcji, przy czym pierwsza reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera poli-a, druga reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera HCV1 bor6312, a trzecia reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera HCV1bOR3306; d) syntezę drugiej nici i namnaŝanie częściowych cdna z etapu c) w trzech oddzielnych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów poli- A/HCV1bOF6074, mieszanina do drugiej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów HCV1 bor6312/ HCV1bOF1977, a mieszanina do trzeciej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów HCV1 bor3306/ HCVOF129; e) dalsze namnaŝanie częściowych cdna z etapu d) w trzech oddzielnych zagnieŝdŝonych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1 bir9339/hcv1 bif6126, mieszanina do drugiej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1 bir6282/ HCV1 bif223, a mieszanina do trzeciej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1bIR2770/HCVIF278; f) analizę sekwencji dalej namnoŝonych cdna z etapu e); oraz g) porównanie sekwencji uzyskanych w etapie f) z sekwencją prototypowego HCV1b. [0013] W innej postaci test według wynalazku stosuje się do identyfikacji i scharakteryzowania pojedynczych i sprzęŝonych mutacji związanych z opornością na konkretny lek lub połączenie leków przeciw-hcv u pacjenta zakaŝonego HCV 1 b oraz do utworzenia lub rozszerzenia banku danych o mutacjach HCV związanych z opornością na leki przeciw- HCV. Test obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno: a) ekstrakcję RNA wirusa z próbki pobranej od pacjenta z HCV, który jest oporny na lek lub połączenie leków przeciw-hcv, którymi pacjent był leczony; b) określanie genotypu i podtypu HCV; c) pod warunkiem, Ŝe w etapie b) wskazano, Ŝe HCV jest typu 1 b, syntezę częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach odwrotnej transkrypcji, przy czym pierwsza reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera poli-a, druga re-

9 akcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera HCV1 bor6312, a trzecia reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera HCV1bOR3306; d) syntezę drugiej nici i namnaŝanie częściowych cdna z etapu c) w trzech oddzielnych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów poli- A/HCV1bOF6074, mieszanina do drugiej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów HCV1 bor6312/ HCV1bOF1977, a mieszanina do trzeciej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów HCV1 bor3306/ HCVOF129; e) dalsze namnaŝanie częściowych cdna z etapu d) w trzech oddzielnych zagnieŝdŝonych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1bIR9339/HCV1bIF6126, mieszanina do drugiej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1 bir6282/hcv1 bif223, a mieszanina do trzeciej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1bIR2770/ HCVIF278; f) analizę sekwencji dalej namnoŝonych cdna z etapu e); g) porównanie sekwencji uzyskanych w etapie f) z sekwencją prototypowego HCV 1 b oraz identyfikację mutacji; oraz h) wprowadzenie zidentyfikowanych mutacji do banku danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw-hcv. [0014] Po zgromadzeniu przydatnego banku danych podobny test moŝna zastosować do analizy próbek pobranych od nieleczonych wcześniej pacjentów zakaŝonych HCV 1 b lub od pacjentów zakaŝonych HCV 1 b, którzy byli leczeni i rozwinęli oporność na tryb leczenia, w celu wybrania odpowiedniego leku lub połączenia leków przeciw-hcv odpowiednio do leczenia lub dalszego leczenia. W takich postaciach etap h) testu opisanego bezpośrednio powyŝej zastąpiono etapem obejmującym przeszukanie banku danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw-hcv pod względem zidentyfikowanych mutacji oraz wybranie do dalszego leczenia pacjenta leku lub połączenia leków przeciw- HCV, na które, jak się oczekuje, HCV nie będzie oporny. [001] Wynalazek dotyczy takŝe par starterów, które stanowią poli-a i HCV1bOF6074, HCV1 bor6312 i HCV1bOF1977, HCV1 bor3306 i HCVOF129, HCV1bIR9339 i HCV1bIF6126, HCV1bIR6282 i HCV1bIF223 oraz HCV1bIR2770 i HCVIF278. Zesta-

10 9 wy do wykrywania mutacji w genomie HCV są takŝe przedmiotem wynalazku. Zestawy te zawierają co najmniej jedną lub wszystkie z wspomnianych powyŝej par starterów oraz mogą zawierać dodatkowe odczynniki, takie jak np. polimeraza, bufory i trifosforany nukleozydów. 10 KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0016] FIG. 1 schematycznie przedstawia etapy syntezy i namnaŝania częściowych cdna testów według wynalazku na przykładzie HCV typu 1 b. FIG. 2 porównuje czułość sposobu namnaŝania częściowych cdna według wynalazku z namnoŝeniem genomów wirusa pełnej długości. FIGS. 3a i b porównują poddane translacji sekwencje aminokwasowe HCV pobrane od dwóch zakaŝonych pacjentów uzyskane z uŝyciem testu według wynalazku z sekwencją genomu prototypowego HCV. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0017] W celu ułatwienia zrozumienia wynalazku poniŝej zdefiniowano kilka określeń. [0018] Określenia kwas nukleinowy i oligonukleotyd dotyczą starterów lub fragmentów oligomerycznych, które mają być namnoŝone lub wykryte i dotyczą ogólnie polideoksyrybonukleotydów (zawierających 2-deoksy-D-rybozę), nazywanych takŝe DNA, polirybonukleotydów (zawierających D-rybozę), nazywanych takŝe RNA, oraz jakiegokolwiek innego typu polinukleotydu, który jest N-glikozydem zasady purynowej lub pirymidynowej lub zmodyfikowanej zasady purynowej lub pirymidynowej. Z załoŝenia nie istnieje rozróŝnienie długości pomiędzy znaczeniami określeń kwas nukleinowy i oligonukleotyd, a określenia te są stosowane zamiennie. Określenia te dotyczą tylko pierwszorzędowej struktury cząsteczki. Zatem określenia te obejmują dwuniciowy i jednoniciowy DNA, a takŝe dwuniciowy i jednoniciowy RNA. [0019] Określenie cdna dotyczy komplementarnego DNA, który jest DNA syntetyzowanym z matrycy RNA przez działanie RNA-zaleŜnej polimerazy DNA lub odwrotnej transkryptazy lub polimerazy DNA. Określenia te obejmują dwuniciowy i jednoniciowy komplementarny DNA. [0020] Oligonukleotydy moŝna wytwarzać dowolnym odpowiednim sposobem, włącznie z przykładowo klonowaniem i trawieniem restrykcyjnym odpowiednich sekwencji oraz bezpośrednią syntezą chemiczną z zastosowaniem metody, takiej jak metoda fosfotriestrowa według Narang i in., (1979) Meth Enzymol 68, 90-99; metoda fosfodiestrowa według Brown i in., (1979) Meth Enzymol 68, ; metoda dietyloamidofosforynowa według

11 Beaucage i in., (1981) Tetrahedron Lett 22, ; oraz synteza na stałym nośniku według opisu patentowego US nr [0021] Określenia hybrydyzacja i hybrydyzuje dotyczą tworzenia struktury dupleksu przez dwa jednoniciowe kwasy nukleinowe ze względu na parowanie komplementarnych zasad. Hybrydyzacja moŝe wystąpić pomiędzy całkowicie (dokładnie) komplementarnymi nićmi kwasu nukleinowego lub pomiędzy zasadniczo komplementarnymi nićmi kwasu nukleinowego, które zawierają niewielkie regiony niedopasowania. Warunki, w których hybrydyzują całkowicie komplementarne nici kwasu nukleinowego są nazywane ostrymi warunkami hybrydyzacji. Stabilne dupleksy zasadniczo komplementarnych sekwencji moŝna uzyskać w mniej ostrych warunkach hybrydyzacji. Fachowcy w dziedzinie technologii kwasów nukleinowych mogą doświadczalnie określić stabilność dupleksu zgodnie z wytycznymi dostępnymi w dziedzinie (patrz, przykładowo, Sambrook i in., (198) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Ogólnie ostre warunki wybiera się jako temperaturę o o C niŝszą niŝ temperatura topnienia (Tm) dla specyficznej sekwencji przy zdefiniowanej sile jonowej i ph. Tm oznacza temperaturę (przy zdefiniowanej sile jonowej i ph) przy której 0% par zasad jest zdysocjowanych. Osłabienie ostrości warunków hybrydyzacji pozwoli na tolerowanie niedopasowania sekwencji; stopień tolerowanego niedopasowania moŝna kontrolować przez odpowiednie dostosowanie warunków hybrydyzacji. Hybrydyzację zarówno całkowicie komplementarnych, jak i zasadniczo komplementarnych nici kwasu nukleinowego nazywa się tutaj specyficzną. [0022] Określenie starter dotyczy oligonukleotydu zdolnego do działania jako punkt rozpoczęcia syntezy DNA w warunkach, w których wywoływana jest synteza produktu wydłuŝania startera komplementarnego do nici kwasu nukleinowego, tj. w obecności czterech róŝnych trifosforanów nukleozydów i środka polimeryzującego (tj. polimerazy DNA lub odwrotnej transkryptazy) w odpowiednim buforze i w odpowiedniej temperaturze. Starterem jest korzystnie jednoniciowy oligodeoksyrybonukleotyd. Odpowiednia długość startera zaleŝy od zamierzonego zastosowania startera, ale zazwyczaj jest w zakresie od około 1 do około 3 nukleotydów. Krótkie cząsteczki starterów zazwyczaj wymagają niŝszej temperatury do wytworzenia z matrycą wystarczająco trwałych kompleksów hybrydowych. Starter nie musi odzwierciedlać dokładnej sekwencji matrycy kwasu nukleinowego, ale musi być wystarczająco komplementarny, aby hybrydyzował z matrycą. Startery mogą wprowadzać dodatkowe cechy, które umoŝliwią wykrycie lub unieruchomienie startera, ale nie zmieniają podstawowej właściwości startera, działania jako punkt rozpoczęcia syntezy DNA. Region startera, który jest wystarczająco komplementarny do matry-

12 cy, aby hybrydyzował nazywa się tutaj regionem hybrydyzującym. [0023] W stosowanym tutaj znaczeniu, określenie starter sensowny lub w górę dotyczy startera, którego produkt wydłuŝenia jest subsekwencją nici kodującej; określenie starter antysensowny lub w dół dotyczy startera, którego produkt wydłuŝenia jest subsekwencją komplementarnej nici niekodującej [0024] Określenia starter zewnętrzny lub startery zewnętrzne dotyczą pierwszego startera lub pary starterów, które są stosowane do odwrotnej transkrypcji lub początkowego namnoŝenia fragmentu kwasu nukleinowego. Określenia starter wewnętrzny lub startery wewnętrzne dotyczą startera lub pary starterów, które stosuje się do dalszego namna- Ŝania początkowego produktu namnaŝania. Startery wewnętrzne nie wykazują znacznej homologii sekwencji z odpowiadającymi im starterami zewnętrznymi, a namnoŝenie przez startery wewnętrzne zazwyczaj wytwarza drugorzędowy produkt namnaŝania, który jest nieznacznie krótszy niŝ początkowy produkt namnaŝania. [002] W stosowanym tutaj znaczeniu, starter oligonukleotydowy jest specyficzny względem sekwencji docelowej, jeŝeli liczba niedopasowań obecnych pomiędzy oligonukleotydem a sekwencją docelową jest mniejsza niŝ liczba niedopasowań obecnych pomiędzy oligonukleotydem a sekwencjami nie docelowymi. MoŜna wybrać warunki hybrydyzacji, w których tworzone są trwałe dupleksy tylko jeŝeli liczba obecnych niedopasowań nie jest wyŝsza niŝ liczba obecnych niedopasowań pomiędzy oligonukleotydem a sekwencja docelową. W tych warunkach oligonukleotyd specyficzny względem sekwencji docelowej moŝe wytworzyć trwały dupleks tylko z sekwencją docelową. Zastosowanie starterów specyficznych dla sekwencji docelowej w warunkach namnaŝania o odpowiedniej ostrości umoŝliwia specyficzne namnoŝenie tych sekwencji docelowych, które zawierają docelowe miejsca wiązania startera. [0026] Określenia docelowy region i docelowy kwas nukleinowy dotyczą regionu kwasu nukleinowego, który ma zostać namnoŝony lub w inny sposób zanalizowany. Sekwencja z którą hybrydyzuje starter moŝe być nazywana docelową. [0027] Określenia wariant lub wariant HCV dotyczą HCV o genomie róŝniącym się od genomu odpowiadającego prototypowego wirusa ze względu na obecność co najmniej jednej mutacji, która wywołuje co najmniej jedną zmianę aminokwasu w produkcie białkowym wirusa. Zgodnie z tym określenie mutacja dotyczy takich zmian w genomie wariantu, które powodują wytworzenie produktu białkowego wirusa, który róŝni się od tego z prototypowego wirusa co najmniej jednym aminokwasem. [0028] Określenie prototypowy wirus lub prototypowy HCV oznacza wirus HCV odniesienia, który dostarcza genom odniesienia, z którym porównywane są sekwencje wiru-

13 sowe wytworzone w testach według wynalazku i który słuŝy jako podstawa do projektowania starterów do syntezy cdna, namnaŝania i sekwencjonowania stosowanych w testach. Określenie prototypowy wirus moŝe odnosić się do konkretnego izolatu wirusa. Alternatywnie, moŝe on odnosić się do hipotetycznego wirusa HCV, który zawiera genom konsensusowy pochodzący z porównania sekwencji genomowych wielu izolatów wirusa. Jeden taki prototypowy wirus, HCV szczepu H77 (numer dostępu Genbank AF01171), zastosowano w przykładzie 1 do zaprojektowania starterów HCV 1 b. HCV con1 (numer dostępu Genbank AJ238799) zastosowano jako prototypową sekwencje genomową HCV 1 b w testach z Przykładu 3. Fachowiec w dziedzinie będzie wiedział jak wybrać prototypowe sekwencje HCV dla innych genotypów i podtypów. Przykładowo, szczepy HCV HC-J6 (numer dostępu Genbank D00944) lub JFH1 (numer dostępu Genbank AB047639) moŝna uznać za prototypowy HCV 2a. [0029] Określenie quasi-gatunek dotyczy grupy wysoce pokrewnych HCV o identycznym genotypie i podtypie często obecnych u zakaŝonego osobnika. [0030] Określenia lek lub połączenie leków przeciw-hcv dotyczą jakiegokolwiek odpowiednio leku lub połączenia leków, które są zdolne do obniŝenia obciąŝenia wirusem lub miana wirusa HCV u co najmniej podzbioru pacjentów zakaŝonych HCV. W szczególności określenia te takŝe dotyczą jakiegokolwiek odpowiednio leku lub połączenia leków, które są zdolne do znacznego lub istotnego obniŝenia obciąŝenia wirusem lub miana wirusa HCV u co najmniej podzbioru pacjentów zakaŝonych HCV. Leki przeciw-hcv obejmują, ale nie tylko, inhibitory replikacji HCV, takie jak inhibitory polimeraz, inhibitory proteaz lub inhibitory cyklofiliny, modulatory odpowiedzi immunologicznej lub gospodarza, inhibitory wejścia wirusa i inhibitory czynników gospodarza. [0031] Określenie bank danych mutacji HCV związanych z opornością na leki przeciw- HCV dotyczy zestawienia, w jakiejkolwiek postaci, mutacji, które są związane z opornością na jakikolwiek lek lub połączenie leków przeciw-hcv, przy czym oporność jest wykazana przez niepowodzenie przebiegu leczenia lekiem lub połączeniem leków przeciw- HCV w zasadniczym obniŝeniu obciąŝenia wirusem (nazywanego takŝe niepowodzeniem leczenia). Taki bank danych moŝna zgromadzić z wykorzystaniem informacji dostępnej w dziedzinie lub która stanie się dostępna w dziedzinie, a takŝe informacji uzyskanej z analiz próbek pobranych od zakaŝonych pacjentów z opornością na lek przeprowadzonych z zastosowaniem testów według niniejszego wynalazku. [0032] Obecnie dostępne testy nie wskazują czy członek populacji wariantów HCV obecny u pacjenta (quasi-gatunek) lub nawet czy dominujący wariant będzie oporny na leczenie konkretnym lekiem przeciw-hcv lub połączeniem leków przeciw-hcv. Ponadto testy te

14 nie określają które poszczególne mutacje, sprzęŝone mutacje lub odciski palca w genomie wirusa są związane z opornością wirusa na konkretną terapię przeciw-hcv. Większość terapii przeciw HCV jest bardzo droga i długotrwała. Leczenie pacjenta zakaŝonego HCV bez wcześniejszej wiedzy czy wirus jest oporny na konkretny stosowany lek lub połączenie leków przeciw-hcv moŝe powodować działania niepoŝądane u pacjenta ze względu na konsekwencje stałej obecności wirusa na wysokich poziomach, a takŝe drugorzędowe efekty (toksyczność) leczenia przeciw-hcv. [0033] Fachowcy w dziedzinie, tj. lekarze, klinicyści lub pielęgniarki w szpitalu lub jednostce opieki medycznej, od dawna mają zapotrzebowanie na test diagnostyczny charakteryzujący mutacje w kompletnym lub prawie kompletnym genomie HCV konkretnego genotypu i/lub podtypu, które są związane z opornością na konkretny lek lub połączenie leków przeciw-hcv. Niniejszy wynalazek dostarcza taki test. Test ten jest oparty na namnoŝeniu z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) genomu HCV w postaci trzech nachodzących na siebie fragmentów DNA o podobnych długościach. Wynalazcy stwierdzili, Ŝe namnoŝenie genomu w postaci trzech fragmentów stanowi najlepszy kompromis pomiędzy potrzebą czułości testu a unikaniem selekcji sekwencji wariantu wirusa. W tych granicach czułość testu będzie wzrastać wraz z liczbą oddzielnych namnaŝanych fragmentów, podczas gdy minimalizacja selekcji będzie wymagać zmniejszenia liczby oddzielnych namnaŝanych fragmentów. Testy według wynalazku są wysoce czułe oraz, w odróŝnieniu od testów opartych na odwrotnej transkrypcji i namnoŝeniu genomów wirusowych pełnej długości, umoŝliwiają wykrycie i analizę genomów HCV z próbek pobranych od pacjentów o bardzo niskim obciąŝeniu wirusem. [0034] Testy według wynalazku umoŝliwią systematyczne gromadzenie banku danych mutacji, które są związane z opornością na konkretne leki przeciw-hcv, a po zgromadzeniu przydatnego zestawu danych moŝna je zastosować jako testy prognostyczne do określania obecności u zakaŝonego pacjenta wariantu HCV, który jest oporny na leczenie konkretnym(i) lekiem(-ami) przeciw-hcv. W oparciu o taką informację moŝliwe będzie wybranie odpowiedniego leku lub połączenia leków przeciw-hcv do terapii zakaŝonego pacjenta, która nie będzie hamowana przez oporność wykrywalnego wariantu HCV juŝ obecnego u pacjenta przed terapią. Ponadto, po wybraniu konkretnego trybu leczenia i po rozpoczęciu leczenia pacjenta, wirusa wyizolowanego od pacjenta moŝna wprowadzić do modelu zakaŝenia w hodowli komórek i umoŝliwić jego przejście przez kilka rund replikacji w warunkach presji selekcyjnej leku lub połączenia leków stosowanych u tego pacjenta. Następnie moŝna przeprowadzić test według wynalazku na wybranej populacji wirusa w celu określenia czy wystąpiło namnoŝenie mniej licznego wariantu opornego na lek, który

15 nie mógł być wykryty przed namnoŝeniem. Uzyskane wyniki moŝna zastosować do szybkiego dostosowania lub zmiany trybu związanego z lekiem podawanym pacjentowi. [003] Oprócz pomiarów obciąŝenia wirusem test według wynalazku moŝna takŝe stosować do monitorowania rozwoju oporności na lek u pacjenta leczonego lekiem lub połączeniem leków przeciw-hcv. Wirus będzie izolowany pod koniec przebiegu terapii lub w róŝnych punktach czasowych podczas leczenia i analizowany z zastosowaniem testu według wynalazku. Wykrycie głównego wariantu zawierającego znaną mutację związaną z opornością lub zestawu sprzęŝonych mutacji dostarczy wskazanie, które jest niezaleŝne od określenia obciąŝenia wirusem, Ŝe tryb leczenia musi zostać dostosowany lub zastąpiony innym trybem. Wspomniany powyŝej bank danych mutacji pomoŝe lekarzowi prowadzącemu w wyborze dostosowanego lub alternatywnego trybu. [0036] Testy według niniejszego wynalazku są wysoce czułe i umoŝliwiają wykrycie, z zastosowaniem pojedynczej procedury, poszczególnych mutacji lub sprzęŝonych mutacji występujących zasadniczo gdziekolwiek w genomie HCV, które są związane z opornością na leczenie jakimkolwiek połączeniem jednego lub większej liczby leków przeciw-hcv. [0037] O ile nie wskazano inaczej, w realizacji niniejszego wynalazku będzie się stosować standardowe techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, syntezy polipeptydów i kwasów nukleinowych oraz immunologii, które są w zakresie biegłości w dziedzinie. Takie techniki zostały szczegółowo wyjaśnione w literaturze. Patrz np. Sambrook i in., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning - a Practical Approach, tomy 1 i 2 (D.M. Glover, red., 198); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, red., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames i S.J. Higgins, red., 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames i S.J. Higgins, red., 1984); Animal Cell Culture - a Practical Approach (R.I. Freshney, red., 1986); Immobilized Cells and Enzymes - A Practical Approach (J. Woodward, red., 198); B. Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York, N.Y.; seria Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., w tym tom 14 (R. Wu i L. Grossman, red., 1987) i tom 1 (R. Wu, red., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller i M.P. Calos, red., 1987); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (R.J. Mayer i J.H. Walker, red., 1987), Protein Purification - Principles and Practice (R.K. Scopes, 1987); oraz Handbook of Experimental immunology, tomy 1-4 (D.M. Weir i C.C. Blackwell, red., 1986). [0038] W najbardziej ogólnej postaci niniejszy wynalazek dotyczy testu, który nadaje się do identyfikacji i scharakteryzowania pojedynczych i sprzęŝonych mutacji w genomie wariantu HCV obecnego w próbce, który to test obejmuje następujące etapy, które prowadzi

16 się kolejno: Etap 1: ekstrakcja RNA wirusa z próbki zawierającej HCV; Etap 2: określanie genotypu i podtypu HCV; Etap 3: synteza częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach odwrotnej transkrypcji, przy czym pierwsza reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z pierwszego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w 3 UTR genomu prototypowego HCV o takim samym genotypie i podtypie, druga reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z drugiego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w regionie NS4B-NSSA genomu prototypowego HCV, a trzecia reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana z trzeciego zewnętrznego startera antysensownego wybranego tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV; Etap 4: synteza drugiej nici i namnaŝanie częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji odwrotnej transkrypcji, pierwszy zewnętrzny starter antysensowny i pierwszy zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną do sekwencji w regionie NS4B- NSSA genomu prototypowego HCV, mieszanina do drugiej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji odwrotnej transkrypcji, drugi zewnętrzny starter antysensowny i drugi zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną do sekwencji w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, a mieszanina do trzeciej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji odwrotnej transkrypcji, trzeci zewnętrzny starter antysensowny oraz trzeci zewnętrzny starter sensowny wybrany tak, aby specyficznie hybrydyzował z sekwencją komplementarną do sekwencji w regionie UTR genomu prototypowego HCV, przy czym drugi zewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS4B-NSA genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do pierwszego zewnętrznego startera sensownego oraz przy czym trzeci zewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do drugiego zewnętrznego startera sensownego; Etap : dalsze namnaŝanie częściowych cdna z etapu 4 w trzech oddzielnych zagnieŝdŝonych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji PCR oraz pierwsze wewnętrz-

17 ne startery antysensowny i sensowny, mieszanina do drugiej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji PCR oraz drugie wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, a mieszanina do trzeciej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji PCR oraz trzecie wewnętrzne startery antysensowny i sensowny, przy czym startery wewnętrzne nie pokrywają się ze starterami zewnętrznymi, drugi wewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS4B-NSA genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do pierwszego wewnętrznego startera sensownego, a trzeci wewnętrzny starter antysensowny hybrydyzuje z sekwencją w regionie NS2 genomu prototypowego HCV, która jest zlokalizowana po stronie 3 regionu, który jest komplementarny do drugiego wewnętrznego startera sensownego; Etap 6: analiza sekwencji dalej namnoŝonych cdna z etapu ; oraz Etap 7: porównanie uzyskanych sekwencji z sekwencją prototypowego HCV. [0039] W bardziej szczególnej postaci niniejszy wynalazek dotyczy testu, który nadaje się do identyfikacji i scharakteryzowania pojedynczych i sprzęŝonych mutacji w genomie wariantu HCV opornego na lek lub połączenie leków przeciw-hcv w próbce pobranej od pacjenta, który przechodził leczenie lekiem lub połączeniem leków przeciw-hcv. Test ten obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno: Etap 1: ekstrakcja RNA wirusa z próbki pobranej od pacjenta z HCV, który jest oporny na lek lub połączenie leków przeciw-hcv, którymi pacjent był leczony; Etapy 2 6: jak w teście opisanym powyŝej. Etap 7: porównanie sekwencji uzyskanych w etapie 6 z sekwencją genomu prototypowego HCV i identyfikacja mutacji; oraz Etap 8: wprowadzenie zidentyfikowanych mutacji do banku danych mutacji związanych z opornością na leki przeciw-hcv. [0040] Po ustaleniu przydatnego banku danych mutacji związanych z opornością na leki, niniejszy wynalazek będzie takŝe dotyczyć testu, który jest identyczny jak test opisany bezpośrednio powyŝej, za wyjątkiem tego, Ŝe etap 8 będzie obejmował przeszukanie banku danych pod względem zidentyfikowanych mutacji oraz wybór do dalszego leczenia pacjenta alternatywnego leku lub połączenia leków przeciw-hcv, na które, jak się oczekuje, HCV nie będzie oporny. [0041] Ostatni test według wynalazku moŝna takŝe przeprowadzić na próbce pobranej od pacjenta zakaŝonego HCV przed rozpoczęciem jakiejkolwiek terapii farmakologicznej u pacjenta. Wyniki tego testu pozwolą lekarzowi na wybranie leku lub połączenia leków przeciw-hcv, na który HCV, którym zakaŝony jest pacjent, nie jest oporny. NaleŜy zda-

18 wać sobie sprawę, Ŝe pacjent jest często zakaŝony quasi-gatunkami HCV obejmującymi dominujący wariant oraz wiele mniej licznych wariantów. Test głównie pozwoli odkryć mutacje obecne w dominującym mutancie. To czy moŝna takŝe będzie odkryć mutacje obecne w mniej licznych wariantach, będzie zaleŝeć od wielu czynników, w szczególności od względnej liczebności mniej licznych wariantów oraz zastosowanej technologii sekwencjonowania. JeŜeli względna liczebność mniej licznego wariantu wynosi mniej niŝ 20%, mutacje w mniej licznych wariantach powinny dać się zidentyfikować z zastosowaniem rutynowego sekwencjonowania kapilarnego, tj. standardowego sekwencjonowania zautomatyzowanego. JeŜeli występowanie wariantu jest niŝsze do uzyskania informacji o mutacjach konieczne będzie zastosowanie zaawansowanej metodologii sekwencjonowania, takiej jak technologie wysokoprzepustowego sekwencjonowania przez syntezę. Takie technologie sekwencjonowania zostały opracowane np. przez Illumina Inc., San Diego, CA, 44 Life Sciences, Branford, CT oraz Applied Biosciences, Foster City, CA. Wyposa- Ŝenie do sekwencjonowania i usługi są dostępne w handlu. [0042] Szczególne postacie testów do stosowania z próbkami zawierającymi wariant HCV 1 b przedstawiono poniŝej i są one dalej przedstawione w części Przykłady. Jeden taki test obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno: Etap 1: ekstrakcja RNA wirusa z próbki zawierającej HCV; Etap 2: określanie genotypu i podtypu HCV; Etap 3: pod warunkiem, Ŝe w etapie 2 wskazano, Ŝe HCV jest typu 1b, synteza częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach odwrotnej transkrypcji, przy czym pierwsza reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera poli-a, druga reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera HCV1 bor6312, a trzecia reakcja odwrotnej transkrypcji jest rozpoczynana ze startera HCV1bOR3306; Etap 4: synteza drugiej nici i namnaŝanie częściowych cdna genomu HCV w trzech oddzielnych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów poli-a/hcv1bof6074, mieszanina do drugiej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów HCV1bOR6312/HCV1bOF1977, a mieszanina do trzeciej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji odwrotnej transkrypcji oraz parę starterów HCV1bOR3306/HCVOF129; Etap : dalsze namnaŝanie częściowych cdna z etapu 4 w trzech oddzielnych zagnieŝdŝonych reakcjach PCR, przy czym mieszanina do pierwszej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z pierwszej reakcji PCR oraz parę starterów

19 HCV1bIR9339/HCV1bIF6126, mieszanina do drugiej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z drugiej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1bIR6282/HCV1bIF223, a mieszanina do trzeciej zagnieŝdŝonej reakcji PCR zawiera podwielokrotną próbkę z trzeciej reakcji PCR oraz parę starterów HCV1bIR2770/HCVIF278; Etap 6: analiza sekwencji dalej namnoŝonych cdna z etapu ; oraz Etap 7: porównanie uzyskanych sekwencji z sekwencją prototypowego HCV1b. [0043] Inny taki test do stosowania z próbkami uzyskanymi od pacjenta z HCV 1 b, który jest oporny na terapię, którą pacjent otrzymał obejmuje następujące etapy, które prowadzi się kolejno: Etap 1: ekstrakcja RNA wirusa z próbki pobranej od pacjenta zakaŝonego HCV, który jest oporny na lek lub połączenie leków przeciw-hcv, którymi pacjent był leczony; Etapy 2 6: jak w poprzednim teście. Etap 7: porównanie sekwencji uzyskanych w etapie 6 z sekwencją genomu prototypowego HCV oraz identyfikacja mutacji; oraz Etap 8: wprowadzenie zidentyfikowanych mutacji do banku danych mutacji związanych z opornością na leki przeciw-hcv. [0044] Podobny test, który moŝna przeprowadzić po utworzeniu przydatnego banku danych mutacji HCV1 b związanych z opornością na leki jest identyczny jak test opisany bezpośrednio powyŝej, za wyjątkiem tego, Ŝe etap 8 będzie obejmował przeszukanie tego banku danych pod względem zidentyfikowanych mutacji oraz wybór do dalszego leczenia pacjenta alternatywnego leku lub połączenia leków przeciw-hcv, na które, jak się oczekuje, HCV nie będzie oporny. [004] PowyŜszy test moŝna takŝe przeprowadzić na próbce pobranej od pacjenta zakaŝonego HCV przed rozpoczęciem jakiejkolwiek terapii farmakologicznej u pacjenta. Pod warunkiem, Ŝe HCV występujący u pacjenta jest typu 1b, wyniki z tego testu pozwolą lekarzowi na wybranie leku lub połączenia leków przeciw-hcv, na które HCV, którym zakaŝony jest pacjent, nie jest oporny. [0046] Kluczowe aspekty powyŝszych testów specyficznych względem HCV1b takŝe zilustrowano na Fig.1 oraz w części Przykłady. Sekwencje nukleotydowe starterów do syntezy syntezy i namnaŝania cdna, a takŝe zaproponowany zestaw starterów do sekwencjonowania przedstawiono w Tabeli 1.

20 19 Tabela 1: Startery HCV 1b Nazwa startera HCV1bOR3306 HCVOF129 HCVIF278 HCV1bIR2770 HCV1bOR6312 HCV1bOF1977 HCV1bIF223 HCV1bIR6282 poli-a HCVOF6074 HCV1bIF6126 HCV1bIR9339 Cel cdna/zewnętrzna PCR, region UTR- NS2 zewnętrzna PCR, region UTR-NS2 wewnętrzna PCR region UTR-NS2 wewnętrzna PCR, region UTR-NS2 antysensowny cdna/zewnętrzna PCR, region NS2- NSA zewnętrzna PCR, region NS2-NSA wewnętrzna PCR, region NS2-NSA wewnętrzna PCR, region NS2-NSA antysensowny cdna/zewnętrzny PCR, region NS4B- 3 UTR zewnętrzna PCR, region NS4B-3 UTR wewnętrzna PCR, region NS4B-3 UTR wewnętrzna PCR, region NS4B-3 UTR Kierunek Sekwencja startera Lokalizacja w genomie (w odniesieniu do H77) SEQ ID NO: sensowny sensowny antysensowny sensowny sensowny antysensowny mer sensowny sensowny antysensowny antysensowny

21 Nazwa startera HCV1bSF310 HCV1bSF807 HCV1bSR80 HCV1bSF1202 HCV1bSR1302 HCV1bSF197 HCV1bSR163 HCV1bSF184 HCV1bSR1990 HCV1bSF2242 Cel do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 do sekwencjonowania, region UTR- NS2 20 Kierunek Sekwencja startera Lokalizacja w genomie (w odniesieniu do H77) SEQ ID NO: sensowny sensowny antysensowny sensowny antysensowny sensowny antysensowny sensowny antysensowny sensowny