Porównanie dwiema metodami tworzenia biofilmu przez pałeczki Proteus mirabilis na powierzchni różnych biomateriałów

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Joanna Kwiecińska-Piróg, Tomasz Bogiel, Eugenia Gospodarek Porównanie dwiema metodami tworzenia biofilmu przez pałeczki Proteus mirabilis na powierzchni różnych biomateriałów Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Pałeczki Proteus sp. są bakteriami często izolowanymi z zakażeń związanych z wprowadzeniem cewnika do układu moczowego. Powierzchnia cewnika jest dogodnym miejscem tworzenia się biofilmu. W pracy oceniono dwiema metodami tworzenie biofilmu przez pałeczki Proteus mirabilis na powierzchni pięciu biomateriałów. Zastosowana metoda Richardsa pozwala na szybkie wykazanie biofilmu Proteus sp., a jej wyniki w wysokim stopniu korelują z wynikami otrzymanymi metodą ilościową. Pałeczki Proteus sp. należą do oportunistycznych patogenów człowieka. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest P. mirabilis. Rzadziej izoluje się P. vulgaris, P. penneri i P. hauseri. Pałeczki P. mirabilis wywołują głównie zakażenia układu moczowego, szczególnie u chorych z anatomicznymi lub funkcjonalnymi zaburzeniami w obrębie tego układu albo długotrwale cewnikowanych (2, 6, 15). Konsekwencją obecności bakterii w układzie moczowym może być tworzenie kamieni moczowych (2). Pałeczki tego rodzaju mogą wywoływać również zakażenia w obrębie układu oddechowego, pokarmowego, skóry; rzadziej - układu krwionośnego (5, 15). Podejrzewa się także występowanie związku pomiędzy zakażeniem Proteus sp. a reumatoidalnym zapaleniem stawów (12). Pałeczki Proteus sp. posiadają wiele czynników, które warunkują ich chorobotwórczość. Zaliczane do nich są: lipopolisacharyd (LPS), adhezyny, hemaglutyniny, toksyczna aglutynina Proteus (Proteus toxic agglutinin, Pta), rzęski, enzymy proteolityczne, ureaza, hydrofobowość powierzchni komórki, zjawisko mgławicowego wzrostu i tworzenie struktury biofilmu (1, 2, 14). Niektóre z nich są związane z dimorfizmem, czyli obecnością długich i krótkich komórek, w zależności od środowiska występowania. Formy długie cechuje, m. in. wyższa ekspresja genów kodujących ureazę, hemolizynę HpmA czy proteazy IgG i IgA przy jednoczesnej represji genów odpowiedzialnych za wytwarzanie fimbrii (2). Ważnym czynnikiem chorobotwórczości Proteus sp. jest biofilm (16, 18). Jest to trójwymiarowa, heterogenna struktura, składająca się z drobnoustrojów komunikujących się ze sobą, wody oraz pozakomórkowo wydzielanych polimerów (extracellular polymeric substances, EPS) (3, 19). Tworzony przez pałeczki Proteus sp. biofilm w układzie moczowym

2 132 J. Kwiecińska, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 2 ma specyficzną strukturę. Zawiera kryształy apatytu i struwitu, które mogą stanowić rdzeń kamienia moczowego, blokującego przepływ moczu lub mogącego powodować zamknięcie światła cewnika do pęcherza moczowego, co jest istotnym problemem u chorych poddawanych długotrwałemu cewnikowaniu (9, 17). Biofilm jest jednym z mechanizmów sprzyjających rozwojowi i utrzymywaniu się zakażeń miejscowych i/lub ogólnoustrojowych, które są poważnym problemem klinicznym (11). Wyniki badań wskazują, że zarówno zakażenia ostre, jak i ponad 80% zakażeń przewlekłych może być wynikiem tworzenia się biofilmu (3). W diagnozowaniu i leczeniu chorób powszechnie wykorzystywane są metody inwazyjne, które opierają się na wprowadzaniu do organizmu chorego biomateriałów (11). Za biomateriał uznaje się ciało stałe, które bezpośrednio kontaktuje się z tkankami, płynami ustrojowymi i gazami oddechowymi organizmu (10). W diagnostyce zakażeń ważne jest szybkie wykrycie biofilmu tworzącego się na powierzchni biomateriału wprowadzonego choremu. Powszechnym sposobem oceny jego występowania jest metoda Richardsa (13), której zasada opiera się na zdolności żywych drobnoustrojów do metabolizowania chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC) do czerwonego, widocznego makroskopowo trifenyloformazanu. Zaletą metody jest zmiana barwy TTC niezależnie od rodzaju biomateriału, na którym powstał biofilm (13). Celem pracy była ocena wpływu rodzaju biomateriału na stopień tworzenia biofilmu przez badane bakterie oraz porównanie wyników otrzymanych metodą Richardsa i metodą ilościową, w celu określenia jej przydatności do szybkiej identyfikacji biofilmu Proteus sp. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły 84 szczepy P. mirabilis izolowane z materiału od różnych chorych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Badane szczepy identyfikowano do gatunku na podstawie morfologii kolonii na podłożu MacConkey Agar (MCA, Becton Dickinson) oraz wyników reakcji biochemicznych (API 20E, ATB Expression V2.8.8, biomérieux). Wytwarzanie biofilmu przez pałeczki P. mirabilis oceniano metodą jakościową i ilościową na powierzchni 5 biomateriałów. Dwa z nich: polichlorek winylu (Unomedical) i lateks silikonowany (RedFol Medical) są używane do produkcji cewników do pęcherza moczowego. Trzy inne biomateriały: polipropylen (Braun), tereftalan polibutylenu (Braun) i poliamid (Braun) są wykorzystywane do tworzenia nici chirurgicznych. Biomateriały przygotowywano przez pocięcie w warunkach aseptycznych na fragmenty o długości: 1 cm dla cewników, 2 cm dla nici chirurgicznych. W celu oceny jakościowej wytwarzania biofilmu przez pałeczki P. mirabilis stosowano metodę Richardsa przedstawioną przez Różalską i wsp. (13) we własnej modyfikacji. Po 24 godzinach hodowli badanych szczepów na podłożu MCA w temperaturze 37 C sporządzano zawiesiny w bulionie tryptozowo sojowym (Tryptic Soya Broth, TSB, BioRad) zawierające 1,5 x 10 6 jednostek tworzących kolonie (j.t.k.), do których wprowadzano jałowe fragmenty biomateriałów. Inkubowano 48 godzin w temperaturze 37 C, wymieniając podłoże na jałowe co 24 godziny. W czasie wymiany podłoża przemywano fragmenty biomateriałów jałowym roztworem buforowanego fizjologiczneo roztworu NaCl o ph 7,2 (PBS, BTL). Po

3 Nr 2 Tworzenie biofilmu na biomateriałach przez P. mirabilis godzinach wymieniano podłoże i dodawano 20 μl 0,5% roztworu TTC (BTL). Wyniki oceniano wizualnie jako zmianę zabarwienia biofilmu pokrywającego fragment biomateriału w umownej skali od 1 do 4 dla polichlorku winylu i lateksu silikonowanego oraz w skali od 1 do 3 dla polipropylenu, poliamidu i tereftalanu polibutylenu. Za wynik ujemny, w obu przypadkach oznaczany jako 0, przyjmowano brak zmiany zabarwienia fragmentu biomateriału. Kolejne stopnie skali korelowały ze stopniem intensywności wybarwienia ocenianego fragmentu biomateriału. W ocenie nie uwzględniano zabarwienia powierzchni powstałej w wyniku przecięcia biomateriału w trakcie przygotowywania do badań. Wyniki odczytywano po 24 godzinach inkubacji z TTC. Kontrolę ujemną stanowiły fragmenty biomateriałów inkubowane w jałowym podłożu TSB. W celu ilościowej oceny fragmenty biomateriałów pokryte 72-godzinnym biofilmem P. mirabilis, tworzonym w temperaturze 37 C, wprowadzano do 1 ml 0,5% roztworu saponiny (Sigma) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37ºC. Następnie wytrząsano (1100 rpm) przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w celu uwolnienia do roztworu komórek zawartych w biofilmie. Wykonywano seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia otrzymanej zawiesiny bakterii i wysiewano po 100 μl na trzy płytki Petriego z agarem tryptozowo- -sojowym (Tryptic Soy Agar, TSA, Becton Dickinson) dla każdego rozcieńczenia. Wynik odczytywano po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C i podawano w j.k.t. ml -1. Dla każdego biomateriału obliczano średnią z trzech posiewów dla danego rozcieńczenia. Odrzucano wyniki nie mieszczące się w przedziale j.t.k./płytkę oraz hodowle, gdzie kolonie nie były wyraźnie odgraniczone od siebie. Analizę statystyczną wykonano w programie StatSoft, Inc. (2008) STATISTICA 8.0 (data analysis software system), przyjmując za poziom istotności wartość α 0,05. WYNIKI Wyniki jakościowej oceny tworzenia biofilmu na powierzchni badanych biomateriałów przedstawiono w tabeli I. Po dobie inkubacji z TTC wszystkie szczepy P. mirabilis tworzyły biofilm na powierzchni lateksu silikonowanego i polichlorku winylu. Na powierzchni teraftalenu polibutylenu i poliamidu nie wykazano obecności szczepów, które tworzyły biofilm bardzo silnie. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy pomiędzy tworzeniem Tabela I. Tworzenie biofilmu przez szczepy P. mirabilis (n=84) na powierzchni badanych biomateriałów oceniane metodą jakościową po 24 godzinach inkubacji z TTC Stopień/skala redukcji TTC* Biomateriał Lateks Polichlorek Tereftalan Polipropylen silikonowany winylu polibutylenu Poliamid n % n % n % n % n % 0 0 0,0 0 0,0 8 9,5 3 3,6 5 6, ,2 2 2, , , , , , , , , , ,3 3 3,6 0 0,0 0 0, , , * skala 1-4 dla lateksu silikonowanego i polichlorku winylu skala 1 3 dla polipropylenu, tereftalanu polibutylenu i poliamidu

4 134 J. Kwiecińska, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 2 Ryc. 1. Wartości średnie i przedziały ufności wyników tworzenia biofilmu przez szczepy P. mirabilis (n=84) na powierzchni lateksu silikonowanego i polichlorku winylu biofilmu przez pałeczki P. mirabilis ocenianego metodą jakościową a rodzajem powierzchni badanego biomateriału. W ocenie metodą ilościową, z biofilmu tworzonego na powierzchni lateksu silikonowanego izolowano średnio 131,2 j.t.k. x 10 6 x ml -1, natomiast na powierzchni polichlorku winylu 60,7 j.t.k. x 10 6 x ml -1. Różnice w uzyskanych wartościach są istotne statystycznie (p<0,0000). Średnio 192,9 j.t.k. x 10 4 x ml -1 komórek wyosobniono z biofilmów tworzonych przez szczepy P. mirabilis na powierzchni polipropylenu, 99,4 j.t.k. x 10 6 x ml -1 - na powierzchni z tereftalanu polibutylenu, a 63,7 j.t.k. x 10 4 x ml -1 - z poliamidu. Wykazano statystycznie istotną różnicę (p<0,0000) w tworzeniu biofilmu przez pałeczki P. mirabilis na powierzchni badanych biomateriałów. Najwyższy (0,7879) współczynnik korelacji wyników dwóch wykorzystanych metod uzyskano dla tereftalanu polibutylenu. Wyniki oceny tworzenia biofilmu na poliamidzie (0,7599), polipropylenie (0,7089) oraz polichlorku winylu (0,6925) cechowały wysokie współczynniki korelacji. Najniższy współczynnik korelacji Spearmana (0,5042) otrzymano dla wyników oceny tworzenia biofilmu na powierzchni lateksu silikonowanego. DYSKUSJA Tworzenie biofilmu przez drobnoustroje jest jednym z problemów terapeutycznych współczesnej medycyny. Coraz szerzej stosowane w diagnostyce i leczeniu chorób bio-

5 Nr 2 Tworzenie biofilmu na biomateriałach przez P. mirabilis 135 Ryc. 2. Wartości średnie i przedziały ufności wyników tworzenia biofilmu przez szczepy P. mirabilis (n=84) na powierzchni polipropylenu, tereftalanu polibutylenu i poliamidu materiały stanowią dogodne miejsce rozwoju drobnoustrojów zorganizowanych w biofilm strukturę umożliwiając im przetrwanie niekorzystnych warunków środowiska (11). Tworzenie biofilmu jest procesem dynamicznym, na który ma wpływ szereg czynników, np. rodzaj powierzchni, na której dochodzi do adhezji drobnoustrojów lub właściwości samych drobnoustrojów (3, 7). Z badań prowadzonych przez Downer i wsp. (4) wynika, że pałeczki P. mirabilis przylegają intensywniej do powierzchni hydrofobowych. Stickler i wsp. (16) wykazali, że na tworzenie biofilmu przez pałeczki P. mirabilis ma wpływ odczyn środowiska. Badany przez wymienionych autorów szczep P. mirabilis pozbawiony aktywności ureazy, nie tworzył biofilmu na hydrofilowej powierzchni agarozowej umieszczonej w moczu o ph 8,0. Zwiększenie ph moczu do 8,2 skutkowało intensywnym tworzeniem biofilmu na badanej powierzchni. W doświadczeniach z zastosowaniem dynamicznego modelu przepływu moczu nie doszło do zablokowania światła cewnika wykonanego z silikonu i lateksu pokrytego hydrożelem również przy kwaśnym ph moczu (18). W dostępnym piśmiennictwie brak jest informacji dotyczących równoczesnej oceny tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów przez te same szczepy Proteus sp. Z badań własnych wynika, że pałeczki P. mirabilis tworzą biofilm na lateksie silikonowanym, polichlorku winylu, z których wykonuje się cewniki do pęcherza moczowego, oraz na polipropylenie, tereftalanie polibutylenu i poliamidzie, z których wytwarza się nici chirurgiczne. Szybką metodą jakościową stwierdzono zdolność szczepów do tworzenia filmu bakteryjnego, ale nie wykazano różnic w jego tworzeniu na powierzchniach badanych

6 136 J. Kwiecińska, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 2 biomateriałów. Jednak na podstawie wyników uzyskanych metodą ilościową stwierdzono zależność pomiędzy rodzajem stosowanego biomateriału a stopniem tworzenia biofilmu przez pałeczki P. mirabilis. W dostępnym piśmiennictwie brak jest doniesień porównujących wyniki oceny tworzenia biofilmu metodą jakościową Richardsa i metodą ilościową. Uzyskane w niniejszej pracy wyniki wskazują, że metoda Richardsa może być z powodzeniem stosowana do szybkiej identyfikacji i oceny intensywności tworzenia biofilmu P. mirabilis. W badaniach Wolskiej i Jakubczaka (20), którzy metodą Richardsa oceniali adhezję i tworzenie biofilmu przez pałeczki Pseudomonas aeruginosa na powierzchni polichlorku winylu i lateksu silikonowanego, udowodniono wpływ rodzaju biomateriału na zdolność drobnoustrojów do tworzenia biofilmu. Wymienieni autorzy stwierdzili 94,6% szczepów tworzących biofilm na powierzchni polichlorku winylu, natomiast na powierzchni lateksu silikonowanego 78,9%. W badaniach własnych wykazano, że rodzaj biomateriału ma wpływ na intensywność tworzenia biofilmu. Biofilm utworzony przez szczepy P. mirabilis na powierzchni cewnika wykonanego z polichlorku winylu złożony jest z ponad dwukrotnie mniejszej liczby komórek niż biofilm powstały na powierzchni lateksu silikonowanego. Wyniki te są odmienne do uzyskanych przez Mączyńską i wsp. (8) dla pałeczek Klebsiella sp., które intensywniej tworzą biofilm na powierzchni polichlorku winylu niż lateksu i lateksu silikonowanego. Nie wykluczone, że zjawisko tworzenia biofilmu u pałeczek Proteus sp. zależy od postaci morfologicznej komórek, co w przyszłości należałoby wykazać eksperymentalnie. WNIOSKI 1. Wysoka korelacja wyników metody Richardsa i ilościowej oceny tworzenia biofilmu pozwala na korzystanie z metody jakościowej jako szybkiej techniki określającej stopień tworzenia in vitro biofilmu przez pałeczki P. mirabilis. 2. Tworzenie biofilmu przez szczepy P. mirabilis zależy od rodzaju biomateriału na powierzchni cewników wykonanych z polichlorku winylu oraz nici chirurgicznych z poliamidu pałeczki P. mirabilis tworzą słabiej biofilm niż na powierzchni pozostałych badanych biomateriałów, tj.: lateksu silikonowanego, polipropylenu i tereftalanu polibutylenu. J. Kwiecińska-Piróg, T. Bogiel, E. Gospodarek Evaluation of biofilm formation by Proteus mirabilis strains on the surface of different biomaterials by two methods SUMMARY Proteus sp. rods are opportunistic human pathogens. These microorganisms are mainly isolated from patients with urinary tract infections, particularly associated with using of biomaterials, on which surface they can form biofilm. The aim of our study was the estimation of Proteus mirabilis rods ability to form biofilm on the surface of 5 biomaterials (polychloride vinyl, silicone latex, polypropylene,

7 Nr 2 Tworzenie biofilmu na biomateriałach przez P. mirabilis 137 polybutylen teraftalan and polyamide) using Richards and quantitative method and comparison results of both methods. A total number of 84 P. mirabilis strains were included into the study. All of them were isolated in the Department of Clinical Microbiology University Hospital no. 1 of dr A. Jurasz Collegium Medicum of L. Rydygier in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Toruń between 2005 and Examined P. mirabilis strains formed heavy biofilm with statistically significantly values on the surface of silicone latex than on polychloride vinyl and on polypropylene surface than polybutylen teraftalen or polyamide. High correlation of both methods was established. The Richards method can be used to quick identification of P. mirabilis biofilm. PIŚMIENNICTWO 1. Alamuri P, Mobley HLT. A novel autotransporter of uropathogenic Proteus mirabilis is both a cytotoxin and an agglutinin. Mol Microbiol 2008; 68: Coker Ch, Poore CA, Li X, Mobley HLT. Pathogenesis of Proteus mirabilis urinary tract infection. Microb Infect 2000; 2: Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002; 15: Downer A, Morris N, Feast WJ, Stickler D. Polymer surface properties and their effect on the adhesion of Proteus mirabilis. J Eng Med 2003; 217: Endimiani A, Luzzaro F, Brigante G i inni. Proteus mirabilis bloodstream infections: risk factors and treatment outcome related to the expression of extended-spectrum β lactamases. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: Jacobsen SM, Stickler DJ, Mobley HLT, Shirtliff ME. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clin Micorbiol Rev 2008; 21: Jones BV, Mahenthiralingam E, Sabbuba NA, Stickler DJ. Role of swarming in the formation of crystalline Proteus mirabilis biofilm on urinary catheters. J Med Microbiol 2005; 54: Mączyńska BM, Smutnicka DS, Przondo-Mordarska APM i inni. The biofilm formation of Klebsiella strains isolated from various infections on chemically different catheters. ESCMID Kopenhaga; April 2-5, Moragan SD, Rigby D, Stickler DJ. A study of the structure of crystalline bacterial biofilms that can encrust and block silver Foley catheters. Urol Res 2009; 37: Paduch DA, Niedzielski J. Materiały biomedyczne. Część I: Pojęcie filmu biologicznego (biofilmu) i fizykochemiczne podstawy przyczepności substancji organicznych do biomateriałów. Chir Pol 2005; 7: Prakash B, Veeregowda BM, Krishnappa G. Biofilms: a survival strategy of bacteria. Curr Science 2003; 85: Rashid T, Ebringer A. Rheumatoid arthritis is linked to Proteus-the evidence. Clin Rheumatol 2007; 26: Różalska B, Sadowska B, Więckowska M, Rudnicka W. Wykrywanie biofilmu bakteryjnego na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50: Różalski A, Kwil I, Torzewska A i inni. Bakterie z rodzaju Proteus cechy i czynniki chorobotwórczości. Post Hig Med Dośw 2007; 61: Sosa V, Schlap G, Zunino P. Proteus mirabilis isolates of different origins do not show correlation with virulence attributes and can colonize the urinary tract of mice. Microbiology 2006; 152: Stickler DJ, Lear JC, Morris NS i inni. Observation on the adherence of Proteus mirabilis onto polymer surfaces. J App Microbiol 2006; 100:

8 138 J. Kwiecińska, T. Bogiel, E. Gospodarek Nr Stickler DJ, Morgan SD. Modulation of crystalline Proteus mirabilis biofilm development on urinary catheters. J Med Microbiol 2006; 55: Stickler DJ, Morgan SD. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block Foley catheters. J Hosp Infect 2008; 69: Watnick P, Kolter R. Biofilm, city of microbes. J Bacteriol 2000; 182: Wolska K, Jakubczak A. Wykrywanie biofilmu Pseudomonas aeruginosa na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 2003; 55: Otrzymano: 3 IV 2011 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium im. Rydygiera w Bydgoszczy, UMK w Toruniu