Ocena tworzenia biofilmu przez Staphylococcus aureus i Escherichia coli na powierzchni siatki polipropylenowej *

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Adrian Reśliński 1, Agnieszka Mikucka 2, Joanna Kwiecińska-Piróg 2, Katarzyna Głowacka 3, Eugenia Gospodarek 2, Stanisław Dąbrowiecki 1 Ocena tworzenia biofilmu przez Staphylococcus aureus i Escherichia coli na powierzchni siatki polipropylenowej * 1 Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. Stanisław Dąbrowiecki, prof. UMK 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. Eugenia Gospodarek, prof. UMK 3 Katedra Fizjologii i Biotechnologii Roślin Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Kierownik: prof. dr hab. Ryszard Górecki Oceniano tworzenie biofilmu przez szczepy Staphylococcus aureus i Escherichia coli na powierzchni siatki polipropylenowej. Badanie przeprowadzono metodą redukcji chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC) oraz w skaningowym mikroskopie elektronowym. Stwierdzono, że szczepy S. aureus silniej tworzyły biofilm niż szczepy E. coli. Plastyka przepukliny z implantacją biomateriału jest jedną z najczęściej wykonywanych operacji w chirurgii ogólnej. Groźnym powikłaniem tej metody leczenia jest głębokie zakażenie miejsca operowanego (ZMO) obejmujące wszczepiony materiał syntetyczny (1). Do najczęstszych czynników etiologicznych głębokiego ZMO u pacjentów poddanych hernioplastyce zalicza się: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis oraz Escherichia coli (1,2,3,4). To, jakie drobnoustroje kolonizują implant, zależy od drogi zakażenia wszczepionego biomateriału oraz miejsca jego wszczepiania. Powstanie biofilmu może być efektem kontaminacji implantu w czasie zabiegu, translokacji bakterii z jelita grubego lub też wynikać z przejściowej bakteriemii u chorego (4). Wykazano, że bakterie mogą tworzyć na powierzchni biomateriałów stosowanych w chirurgii przepuklin biofilm (2,3,5), chroniący przed działaniem układu odpornościowego oraz antybiotyków (6). Jego obecność powoduje przewlekły i nawracający przebieg głębokiego ZMO. Ponadto, biofilm jest odpowiedzialny za brak integracji wszczepionej siatki chirurgicznej z przylegającymi tkankami (2). * Praca była finansowana ze środków grantu UMK 06/2009

2 22 A. Reśliński i inni Nr 1 Celem pracy były ocena tworzenia biofilmu przez S. aureus oraz E. coli na powierzchni siatki polipropylenowej. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakterii. Materiał do badań stanowiło 108 szczepów bakterii pochodzących z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (CM UMK), izolowanych w latach z wymazów z rany oraz z próbek ropy chorych hospitalizowanych w Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej (63 szczepy), Klinice Chirurgii Ogólnej i Naczyń (36 szczepów) oraz Klinice Transplantologii i Chirurgii Ogólnej (9 szczepów) Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Wśród izolatów było 62 (57,4%) szczepów S. aureus oraz 46 (42,6%) E. coli. Identyfikacji S. aureus dokonano na podstawie morfologii kolonii na podłożu Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (Becton Dickinson), obecności koagulazy związanej (clumping factor) i/lub wolnej oraz korzystając w przypadkach wymagających weryfikacji z wyniku reakcji biochemicznych testów ID32 Staph (biomérieux). W identyfikacji pałeczek E. coli brano pod uwagę morfologię kolonii na podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson) oraz wyniki reakcji biochemicznych uzyskanych w testach ID32 E (biomérieux). Szczepy przechowywano w bulionie sercowo- -mózgowym (Brain Heart Infusion, BHI) (biomérieux) z dodatkiem 15% glicerolu (POCH) w temperaturze -70ºC. Do badań wybrano szczepy pochodzące od różnych pacjentów. Ocena tworzenia biofilmu. Badania przeprowadzono metodą opartą na redukcji bezbarwnego chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC) (POCH) do czerwonego formazanu prowadzoną przez metabolicznie aktywne bakterie (7). Sterylnie przygotowane fragmenty monofilamentowej siatki polipropylenowej (Tricomed) o wymiarach 2 x 1 cm umieszczano w probówkach zawierających 4 ml bulionu tryptozowo-sojowego (Tryptic Soy Broth, TSB) (Becton-Dickinson) z zawiesiną bakteryjną o gęstości 1 według skali MacFarlanda. Próby inkubowano w temperaturze 37 0 C w atmosferze tlenowej przez 72 godziny, wymieniając płyn hodowlany na nowe, jałowe podłoże TSB co 24 godziny. Następnie fragmenty biomateriału przemywano buforowanym roztworem 0,9% chlorku sodu (Phosphate Bufferd Saline, PBS) o ph 7,2 i umieszczano w 4 ml jałowego podłoża TSB zawierającego 50 µl 1% roztworu TTC. Próby inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37 0 C w atmosferze tlenowej, obserwując pojawienie się czerwonego formazanu. Stopień Tabela I. Tworzenie biofilmu przez szczepy S. aureus i E. coli na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej Szczepy S. aureus (n=62) Szczepy E. coli (m=46) Tworzenie Klinika Klinika biofilmu CHOIE CHOIN CHOIT CHOIE CHOIN CHOIT 35* Bardzo silne 18 (94,7) 2 (66,7) 12 (52,2) 10 (58,8) 3 (50,0) (87,5)** Silne 1 (2,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 11 (47,8) 7 (41,2) 3 (50,0) Słabe 4 (10) 1 (5,3) 1 (33,3) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) (* - liczba szczepów, ** - odsetek, CHOIE Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej, CHOIN Klinika Chirurgii Ogólnej i Naczyniowej, CHOIT Klinika Transplantologii i Chirurgii Ogólnej)

3 Nr 1 Tworzenie biofilmu przez S. aureus i E. coli 23 Ryc. 1. Biofilm S. aureus na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej; skaningowy mikroskop elektronowy (powiększenie 1500x). Ryc. 2. Biofilm S. aureus na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej; skaningowy mikroskop elektronowy (powiększenie 3500x).

4 24 A. Reśliński i inni Nr 1 Ryc. 3. Biofilm E. coli na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej; skaningowy mikroskop elektronowy (powiększenie 1500x). Ryc. 4. Biofilm E. coli na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej; skaningowy mikroskop elektronowy (powiększenie 3500x).

5 Nr 1 Tworzenie biofilmu przez S. aureus i E. coli 25 redukcji TTC oceniano według skali: 0 brak redukcji TTC (brak tworzenia biofilmu), 1 lekkie punktowe zaróżowienie powierzchni implantu (słabe tworzenie biofilmu), 2 zaróżowienie całej powierzchni implantu (silne tworzenie biofilmu), 3 zaczerwienienie całej powierzchni implantu, zmętnienie oraz czerwona barwa podłoża (bardzo silne tworzenie biofilmu). Badanie dla każdego szczepu wykonano w trzech powtórzeniach. Jako kontrolę zastosowano jałowy fragment biomateriału w jałowym podłożu TSB. Powstały biofilm na powierzchni siatki polipropylenowej badano również w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM) (JEOL). Wybrane losowo fragmenty implantów po 72 godzinnej inkubacji w podłożu TSB z zawiesiną bakteryjną o gęstości 1 według skali MacFarlanda przemywano PBS o ph 7,2. Następnie utrwalano w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego (POCH) w 0,1 M buforze fosforanowym o ph 7,4 przez godzin w temperaturze 4 0 C. Po utrwaleniu biomateriał płukano 2-krotnie przez 20 minut w buforze fosforanowym w temperaturze pokojowej. Następnie próbki odwadniano w alkoholu etylowym o wzrastającym stężeniu 30, 50, 70, 80, 96% po 10 minut oraz 2-krotnie w etanolu 99,8% (POCH) przez 30 minut. Po odwodnieniu siatkę polipropylenową przenoszono do komory suszarki Critical Point Dryer - CDP 030 (Bal-Tec) wypełnionej octanem amylu (Sigma- -Aldrich) i przeprowadzano suszenie w punkcie krytycznym CO 2, tj. w temperaturze 31 C pod ciśnieniem 73 atmosfer. Wysuszony materiał umieszczano na miedzianych stolikach i napylano złotem w atmosferze argonu w napylarce jonowej Fine Coater JCF-1200 (JEOL), następnie umieszczano w kolumnie mikroskopu elektronowego JSM-5310LV (JEOL) i prowadzono badanie przy napięciu 20 kv. Wyniki rejestrowano na czarno-białym filmie fotograficznym ILFORD FP4 PLUS 125. Statystyczna analiza wyników. Ze względu na charakter porządkowy skali wyników zastosowano testy nieparametryczne porównujące zmienne niezależne. Do oceny zależności między gatunkiem bakterii a zdolnością do tworzenia biofilmu zastosowano test Kołmogorowa-Smirnowa. Za poziom istotności przyjęto wartość p=0,05. Obliczenia statystyczne wykonano przy pomocy programu Statistica 8.0 WYNIKI Wszystkie badane szczepy tworzyły biofilm na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej. Stwierdzono istotną statystycznie różnicę (p<0,005) w stopniu tworzenia biofilmu w zależności od gatunku bakterii. Szczepy S. aureus tworzyły silniej biofilm w porównaniu do szczepów E. coli. W grupie 62 szczepów S. aureus 55 (88,7%) bardzo silnie tworzyło biofilm, 1 (2,5%) szczep silnie, a 6 (9,7%) słabo. Wśród 46 szczepów E. coli 25 (54,3%) charakteryzowało się bardzo silnym tworzeniem biofilm, natomiast 21 (45,7%) silnym. Ocenę tworzonia biofilmu przez badane szczepy przedstawiono w tabeli I. Badanie w skaningowym mikroskopie elektronowym wykazało obecność bakterii przylegających do powierzchni włókien siatki polipropylenowej (Ryc. 1,2,3,4). Skupiska bakterii obserwowano w miejscach krzyżowania się włókien.

6 26 A. Reśliński i inni Nr 1 DYSKUSJA W pracy oceniano tworzenie biofilmu przez S. aureus i E. coli na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej, będącej najczęściej stosowanym biomateriałem w chirurgii przepuklin (8). Badanie z użyciem TTC wykazało, że szczepy S. aureus silniej tworzyły biofilm na badanym biomateriale niż szczepy E. coli. Do czynników odgrywających istotną rolę w tworzeniu biofilmu na powierzchni siatek przepuklinowych zalicza się strukturę oraz hydrofobowość implantatu (5,9). W badaniu zastosowano monofilamentową siatkę wykonaną z polipropylenu uznawanego za materiał hydrofobowy (10), sprzyjający adhezji bakterii o właściwościach hydrofobowych (11). Wykazano, że bakterie S. aureus cechują się większą hydrofobowością oraz silniejszą adhezją do polipropylenu niż E. coli (10,12). Być może wymienione właściwości są odpowiedzialne za silniejsze tworzenie biofilmu przez S. aureus w porównaniu do E. coli obserwowane przez Engelsmana i wsp. (5) oraz w badaniach własnych. Jednak, według Cerca i wsp. (13) hydrofobowość komórki bakteryjnej ma nieznaczny wpływ na adhezję, a początkowa adhezja nie wpływa na ilość powstałego biofilmu. Z powyższymi obserwacjami korelują wyniki badań Gungor i wsp. (14), którzy nie stwierdzili istotnej statystycznie różnicy w adhezji S. aureus i E. coli do powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej. Różne wnioski uzyskane w badaniach wymienionych grup badawczych wskazują, iż doświadczenie wymaga kontynuacji i zestawienia wyników dla większej oraz porównywalnej liczbie szczepów z S. aureus i E. coli. W badaniach własnych z użyciem SEM stwierdzono, że bakterie kolonizujące monofilamentową siatkę polipropylenową gromadzą się w miejscach krzyżowania się włókien. Podobnych obserwacji dokonali Bellón i wsp. (15). Prawdopodobnie jest to spowodowane obecnością nisz między krzyżującymi się włóknami siatki, stanowiących dogodne warunki dla rozwoju bakterii oraz dużą powierzchnią i wynikającą z tego zwiększoną adhezją bakteryjną. WNIOSKI Szczepy S. aureus silniej niż E. coli tworzą biofilm na powierzchni monofilamentowej siatki polipropylenowej. A. Reśliński, A. Mikucka, J. Kwiecińska-Piróg, K. Głowacka, E. Gospodarek, S. Dąbrowiecki Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh SUMMARY A serious complication of hernioplasty with the use of a biomaterial implant is deep surgical site infection (SSI) encompassing the implant. Among the most common etiological factors of deep SSI in patients after hernioplasty are Staphylococcus aureus and Escherichia coli strains, which may create a

7 Nr 1 Tworzenie biofilmu przez S. aureus i E. coli 27 biofilm on the surface of synthetic implants. The aim of this study was assessment of biofilm formation by S. aureus and E. coli on the surface of polypropylene mesh. The study included 108 strains (62 S. aureus and 46 E. coli) from the collection of Department of Microbiology Collegium Medicum im. L. Rydygier in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun (CM UMK). Evaluation of biofilm formation was performed using the method of reduction of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) and a scanning electron microscope. In the group of S. aureus strains, 88.7% isolates formed biofilm very strongly, 1.6% strongly, and 9.7% poor. Among E. coli strains, 54.3% isolates were characterized by very strong biofilm formation, while 45.7% strong biofilm formation. Strains of S. aureus strongly than E. coli form a biofilm on the surface of monofilament polypropylene mesh. PIŚMIENNICTWO 1. Stremitzer S, Bachleitner-Hofmann T, Gradl B i inni. Mesh graft infection following abdominal hernia repair: risk factor evaluation and strategies of mesh graft preservation. A retrospective analysis of 476 operations. World J Surg 2010, 34: Tolino MJ, Tripoloni DE, Ratto R i inni. Infections associated with prosthetic repairs of abdominal wall hernias: pathology, management and results. Hernia 2009, 13: Reśliński A, Mikucka A, Szmytkowski J i inni. Biofilm detection on the surface of hernia mesh implants. Adv Clin Exp Med 2010, 6: Petersen S, Henke G, Freitag M i inni. Deep prosthesis infection in incisional hernia repair: predictive factors and clinical outcome. Eur J Surg 2001, 167: Engelsman AF, van der Mei HC, Francis KP i inni. Morphological aspects of surgical meshes as a risk factor for bacterial colonization. Br J Surg 2008, 95: Bryers JD. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng 2008, 100: Gallimore B, Gagnon RF, Subang R, Richards GK. Natural history of chronic Staphylococcus epidermidis foreign body infection in a mouse model. J Infect Dis 1991, 164: Engelsman AF, van der Mei HC, Ploeg RJ, Busscher HJ. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials 2007, 28: Engelsman AF, van Dam GM, van der Mei HC, Ploeg RJ. In vivo evaluation of bacterial infection involving morphologically different surgical meshes. Ann Surg 2010, 251: Karakeçili AG, Gümüşderelioğlu M. Comparison of bacterial and tissue cell initial adhesion on hydrophilic/hydrophobic biomaterials. J Biomater Sci Polym Ed 2002, 13: Kiremitçi-Gümüşderelioğlu M, Pesmen A. Microbial adhesion to ionogenic PHEMA, PU and PP implants. Biomaterials 1996, 17: Dickson JS, Koohmaraie M. Cell surface charge characteristics and their relationship to bacterial attachment to meat surfaces. Appl Environ Microbiol 1989, 55: Cerca N, Pier GB, Vilanova M i inni. Quantitative analysis of adhesion and biofilm formation on hydrophilic and hydrophobic surfaces of clinical isolates of Staphylococcus epidermidis. Res Microbiol 2005, 156: Gungor B, Esen S, Gök A i inni. Comparison of the adherence of E. coli and S. aureus to ten different prosthetic mesh grafts: in vitro experimental study. Indian J Surg 2010, 72: Bellón JM, G-Honduvilla N, Jurado F i inni. In vitro interaction of bacteria with polypropylene/ eptfe prostheses. Biomaterials 2001, 22: Otrzymano: 31 I 2011 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej

8