ESBL-DODATNIE I ESBL-UJEMNE SZCZEPY KLEBSIELLA PNEUMONIAE I KLEBSIELLA OXYTOCA WYSTĘPOWANIE W MATERIALE KLINICZNYM I WRAŻLIWOŚĆ NA WYBRANE ANTYBIOTYKI

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: Alicja Sękowska, Joanna Wróblewska, Eugenia Gospodarek ESBL-DODATNIE I ESBL-UJEMNE SZCZEPY KLEBSIELLA PNEUMONIAE I KLEBSIELLA OXYTOCA WYSTĘPOWANIE W MATERIALE KLINICZNYM I WRAŻLIWOŚĆ NA WYBRANE ANTYBIOTYKI Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum w Bydgoszczy UMK w Toruniu Dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK Oceniono wrażliwość i częstość występowania w materiale klinicznym szczepów K. pneumoniae i K. oxytoca ESBL-dodatnich i ESBL-ujemnych na wybrane antybiotyki. Najwięcej szczepów było wrażliwych na imipenem i fluorochinolony. Pałeczki Klebsiella sp. są jednymi z ważniejszych patogenów szpitalnych. Ich udział w zakażeniach stopniowo wzrasta i często jest związany z wielolekoopornością. Bakterie te głównie odpowiadają za zakażenia układu moczowego, dróg oddechowych, ran i bakteriemie. Wytwarzanie beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum działania typu ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamases) jest najważniejszym mechanizmem oporności pałeczek Klebsiella sp. na antybiotyki beta-laktamowe. Obecnie znanych jest kilka metod umożliwiających ocenę wytwarzania tego mechanizmu oporności: metoda dwóch krążków (DDST), metoda krążków połączonych, E-testy, zastosowanie systemów automatycznych (VITEK, Sceptor, Walk Away, Phoenix). Celem pracy była ocena lekowrażliwości oraz częstości występowania w materiale klinicznym szczepów wytwarzających lub nie beta-laktamazy typu ESBL. MATERIAŁ I METODY Przedmiot badań stanowiło 109 szczepów K. pneumoniae i 91 K. oxytoca izolowanych z próbek materiału klinicznego w latach od pacjentów leczonych w Szpitalu Uniwersyteckim im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy i w poradniach przyklinicznych tego szpitala. Szczepy pochodziły z: moczu 78 (39,0%) szczepów, wymazów z ran 42 (21,0%), biomateriałów 22 (11,0%), moczu cewnikowanego 18 (9,0%), krwi 14 (7,0%), materiału z górnych i dolnych dróg oddechowych (po 7 szczepów 3,5%) i innego materiału 12 (6,0%). Lekowrażliwość szczepów Klebsiella sp. oznaczano metodą krążkowo-dyfuzyjną (5) stosując krążki z : amoksycyliną i kwasem klawulanowym (20/10μg), piperacyliną (100μg), piperacyliną z tazobaktamem (100/10μg), cefoksytyną (30μg), ceftazidimem

2 40 A. Sękowska, J. Wróblewska, E. Gospodarek Nr 1 (30μg), cefotaksymem (30μg), cefoperazonem (75μg), aztreonamem (30μg), imipenemem (10μg), gentamicyną (10μg), amikacyną (30μg), netilmycyną (30μg), norfloksacyną (10μg), ciprofloksacyną (5μg), sulfametoksazolem z trimetoprimem (23,75/1,25μg) i tetracykliną (30μg). Kontrolę stanowił szczep E. coli ATCC Zdolność wytwarzania enzymów ESBL określano metodą DDST (6), stosując krążki z cefotaksymem (30 μg), ceftazidimem (30 μg), aztreonamem (30 μg) oraz amoksycyliną z kwasem klawulanowym (20/10 μg). Powiększenie strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z cefalosporynami i/lub z aztreonamem od strony krążka z inhibitorem beta-laktamazy uznawano za wynik dodatni, a szczep kwalifikowano jako ESBL (+). Dla każdego szczepu ESBL (+) w teście DDST, wykonano testy według CLSI (10) i Appleton (2). W pierwszym teście stosowano krążki z cefotaksymem (30μg) i ceftazidimem (30μg) oraz ich połączenia z kwasem klawulanowym. W teście według Appleton (2) stosowano cefpodoksym (10μg) i jego połączenie z kwasem klawulanowym (10/1μg) (OXOID). Dla szczepów ESBL (+) średnica strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka z cefalosporyną i kwasem klawulanowym była 5 mm od średnicy strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka z samą cefalosporyną. Kontrolę stanowił szczep wzorcowy K. pneumoniae ATCC WYNIKI Analizując wrażliwość pałeczek Klebsiella sp. na antybiotyki beta-laktamowe stwierdzono, że szczepy ESBL (-) były bardziej wrażliwe niż szczepy ESBL (+) dla każdego z badanych gatunków (Tabela I). Wyjątek stanowiły szczepy K. pneumoniae wrażliwe na ceftazidim i szczepy K. oxytoca wrażliwe na cefotaksym i aztreonam, u których wyższe odsetki odnotowano dla szczepów ESBL (+). Zastosowanie inhibitora beta-laktamaz przywracało niektórym szczepom wrażliwość na antybiotyk beta-laktamowy. Spośród badanych cefalosporyn najwyższe odsetki szczepów wrażliwych stwierdzono dla cefoksytyny i cefepimu dla szczepów ESBL (-) i dla ceftazidimu dla szczepów ESBL (+). Nie odnotowano szczepu Klebsiella sp. opornego na imipenem. Badając wrażliwość na leki inne niż beta-laktamowe obserwowano wyższe odsetki szczepów wrażliwych wśród pałeczek ESBL (-) (Tabela II). Wyjątek stanowiła wrażliwość na netilmycynę i norfloksacynę pałeczek K. oxytoca, dla których odsetki szczepów wrażliwych ESBL (+) i ESBL (-) były identyczne. Wśród szczepów K. oxytoca odsetki szczepów ESBL (+) i ESBL (-) były zbliżone, a różnice nie przekraczały 18%. Dla szczepów K. pneumoniae różnice w odsetkach były wyższe i wynosiły od 59,3% dla norfloksacyny do 72,5% dla amikacyny. W teście wstępnym wykryto 51-46,8% szczepów K. pneumoniae i 21 23,1% szczepów K. oxytoca ESBL (+). Szczepy ESBL (+) izolowano: z moczu 37-51,4%, z biomateriałów 9-12,5%, z wymazów z ran 9-12,5%, z krwi 7-9,8%, z moczu cewnikowanego 5-6,9% oraz 5-6,9% szczepów z innego materiału klinicznego. W teście potwierdzającym odnotowano 69 (34,5%) szczepów Klebsiella sp. ESBL (+) (50 45,9% szczepów K. pneumoniae i 19 20,9% szczepów K. oxytoca). Dla poszczególnych cefalosporyn i ich połączeń z kwasem klawulanowym stwierdzono wyniki dodatnie dla cefpodoksymu - 63 szczepy (48 K. pneumoniae i 15 K. oxytoca), dla cefotaksymu - 58 szczepów (46 K. pneumoniae i 12 K. oxytoca), dla ceftazidimu 51 szczepów (odpowiednio 40 K. pneumoniae i 11 K. oxytoca).

3 Nr 1 ESBL-dodatnie i ESBL-ujemne K. pneumoniae i K. oxytoca 41 Tabela I. Wrażliwość szczepów K. pneumoniae i K. oxytoca ESBL-dodatnich i ESBL-ujemnych na antybiotyki beta-laktamowe Liczba i (%) szczepów Antybiotyk K. pneumoniae (n=109) K. oxytoca (n=91) Ogółem (n=200) ESBL(+) ESBL(-) ESBL(+) ESBL(-) ESBL(+) ESBL(-) (n=51) (n=58) (n=21) (n=70) (n=84) (n=116) Piperacylina (23,5) (55,2) (80,9) (88,6) (34,5) (81,0) Amoksycylina / kwas klawulanowy 18 (35,3) 38 (65,5) 15 (71,4) 54 (77,1) 33 (39,3) 92 (79,3) Piperacylina / tazobaktam 34 (66,7) 50 (86,2) 19 (90,5) 65 (92,8) 53 (63,1) 115 (99,1) Cefoksytyna (64,7) (86,2) (90,5) (91,4) (61,9) (98,3) Cefotaksym (49,0) (63,8) (90,5) (78,6) (52,4) (79,3) Ceftazidim (70,6) (67,2) (90,5) (95,7) (65,5) (91,4) Cefepim (62,7) (86,2) (80,9) (91,4) (58,3) (98,3) Aztreonam (45,1) (69,0) (76,2) (74,3) (46,4) (79,3) Imipenem (100,0) (100,0) (100,0) (100,0) (100,0) (100,0) Tabela II. Wrażliwość szczepów K. pneumoniae i K. oxytoca ESBL-dodatnich i ESBL-ujemnych na inne antybiotyki niż beta-laktamowe Antybiotyk Gentamicyna Tobramycyna Amikacyna Netilmycyna Trimetoprim / sulfametoksazol Norfloksacyna Ciprofloksacyna Tetracyklina Liczba i (%) szczepów K. pneumoniae (n=109) K. oxytoca (n=91) Ogółem (n=200) ESBL(+) (n=51) ESBL(-) (n=58) ESBL(+) (n=21) ESBL(-) (n=70) ESBL(+) (n=72) ESBL(-) (n=128) (13,7) (82,7) (71,4) (80,0) (30,5) (81,2) (17,6) (89,6) (85,7) (90,0) (37,5) (89,8) (13,7) (86,2) (85,7) (88,6) (34,7) (87,5) (15,7) (86,2) (85,7) (85,7) (36,1) (85,9) (7,8) (77,6) (71,4) (88,6) (26,4) (83,6) (37,2) (96,5) (100,0) (100,0) (55,6) (98,4) (31,4) (94,8) (85,7) (100,0) (47,2) (97,6) (15,7) (75,9) (61,9) (78,6) (29,1) (77,3)

4 42 A. Sękowska, J. Wróblewska, E. Gospodarek Nr 1 DYSKUSJA Pałeczki Klebsiella sp. najczęściej są izolowane z moczu, materiału z dróg oddechowych, wymazów z ran i krwi. W przedstawionej pracy najwięcej szczepów Klebsiella sp. (69,0%) wyhodowano z moczu oraz wymazów z ran. Özakin i inni (9) najwięcej szczepów wyhodowali z moczu, następnie z krwi i dolnych dróg oddechowych, a dopiero na czwartym miejscu szczepy pochodzące z ran. Kiffer i inni (7) zwrócili uwagę na wysoki odsetek szczepów pochodzących z dróg oddechowych i krwi, ale dotyczyło to tylko gatunku K. pneumoniae. Różnice mogą wynikać ze specyfiki oddziałów, szczepów, a także chorych, od których hodowano szczepy. Na uwagę zasługuje także zróżnicowanie częstości występowania szczepów w materiale klinicznym pod względem gatunkowym. Szczepy K. oxytoca są często izolowane z wymazów z ran. Stąd, zapewne wysoki odsetek szczepów izolowanych z tego materiału w obecnej pracy. Większość badanych szczepów ESBL (-) było wrażliwych na antybiotyki. Odsetki szczepów wrażliwych wynosiły od 77,3% na tetracyklinę do 100,0% na imipenem. Wśród szczepów ESBL (+) najwyższy odsetek szczepów wrażliwych obserwowano dla imipenemu (100,0%). Aktualnie wiadomo, że pierwszy szczep K. pneumoniae oporny na imipenem pojawił się w Polsce w naszym szpitalu (13). Odsetki szczepów wrażliwych na inne antybiotyki beta-laktamowe wynosiły od 34,5% na piperacylinę do 65,5% na ceftazidim. Radosz-Komoniewska i wsp. (11) nie odnotowali żadnego szczepu wrażliwego na piperacylinę. Oceniając wrażliwość szczepów Klebsiella sp. na antybiotyki inne niż beta-laktamowe stwierdzono najwyższe odsetki szczepów wrażliwych na norfloksacynę (55,6%), najniższe na kotrimoksazol (26,4%), Badania Radosz-Komoniewskiej i inni (11) potwierdziły wysoki odsetek szczepów wrażliwych na norfloksacynę, chociaż w przeprowadzonych badaniach odnotowali tylko 2% szczepów opornych na ten lek. Być może tak duże rozbieżności są związane z polityką antybiotykową szpitali, w których prowadzono badania. Wrażliwość na aminoglikozydy badanych szczepów była zbliżona do wyników uzyskanych przez innych autorów: dla gentamicyny (8, 11), amikacyny (8), netilmycyny (11). Różnice obserwowane w pracach potwierdzają, że profil lekowrażliwości poszczególnych szczepów ESBL (+) jest zróżnicowany i może być charakterystyczny dla danego szpitala, czy oddziału. W omawianych pracach, podobnie jak w obecnej, najwyższe odsetki szczepów wrażliwych spośród aminoglikozydów odnotowano dla amikacyny. Częstość izolowania szczepów Klebsiella sp. ESBL (+) zależy od wielu czynników (m. in. oddziału, rodzaju szpitala, lokalizacji zakażenia, czynników ryzyka). W naszych badaniach zaobserwowano także związek między gatunkiem a wytwarzaniem tego mechanizmu oporności. Częstsze wytwarzanie beta-laktamaz typu ESBL przez szczepy K. pneumoniae niż K. oxytoca potwierdzają także wyniki uzyskane przez innych autorów (4, 9, 11). W laboratoriach mikrobiologicznych powszechnie stosowana jest metoda DDST, rekomendowana przez KORDL (5). Nie zawsze jednak wyniki w teście wstępnym pokrywają się z tymi uzyskanymi innymi metodami. W obecnej pracy różnica w odsetkach szczepów ESBL (+) w teście DDST i potwierdzającym wynosiła 1,5%. Nie potwierdzają tego wyniki Andrzejewskiej i Szkaradkiewicza (1), którzy zaobserwowali zgodność wyników w obu testach dla szczepów K. pneumoniae. Rozbieżności można tłumaczyć faktem, że nie wszystkie antybiotyki mogą wykryć różne typy enzymów ESBL, np. szczepy ESBL (+) wytwarzające enzym CTX-M mogą zostać nie wykryte, jeżeli jako cefalosporynę wskaźni-

5 Nr 1 ESBL-dodatnie i ESBL-ujemne K. pneumoniae i K. oxytoca 43 kową zastosuje się ceftazidim. Stąd według Livermore i Brown (8) wskazane jest stosowanie kilku antybiotyków jednocześnie do wykrywania szczepów wytwarzających ESBL. Test potwierdzający jest rekomendowany przez CLSI. Metoda ta według Livermore i Brown (8) daje 100% skuteczność wykrycia ESBL u Klebsiella sp. Umożliwia także odróżnienie szczepów wytwarzających AmpC lub enzym K1, gdyż w przypadku tego rodzaju szczepów połączenie cefalosporyny z kwasem klawulanowym daje mniejszą lub nie powoduje strefy zahamowania wzrostu (8). W obecnej pracy najwięcej szczepów ESBL (+) wykryto stosując połączenie cefpodoksymu i cefpodoksymu z kwasem klawulanowym. Wyniki te nie korelują z otrzymanymi przez Rokosz i wsp. (12), którzy stwierdzili zbliżone odsetki szczepów ESBL (+) dla wszystkich połączeń cefalosporyn z kwasem klawulanowym. Różnice w wynikach w metodach oznaczania ESBL mogą wynikać z nakładania się kilku różnych mechanizmów oporności lub wytwarzania przez szczep różnych rodzajów beta-laktamaz. Coudron i inni (3) zwrócili uwagę, że z jednej próbki materiału można izolować szczepy tego samego gatunku, ale zróżnicowane pod względem ekspresji ESBL. Stąd, w badaniach określających zdolność do wytwarzania tych enzymów powinno się stosować inokulum będące mieszaniną masy bakteryjnej pobranej z kilku kolonii wyhodowanego szczepu (1). A. Sękowska, J. Wróblewska, E. Gospodarek ESBL-POSITIVE AND ESBL-NEGATIVE KLEBSIELLA PNEUMONIAE AND KLEBSIELLA OXYTOCA STRAINS - OCCURRENCE IN CLINICAL SPECIMENS AND SUSCEPTIBILITY TO SELECTED ANTIBIOTICS SUMMARY The aim of this study was to evaluated susceptibility to selected antibiotics and occurrence in clinical materials ESBL-positive and ESBL-negative K. pneumoniae and K. oxytoca strains. The susceptibility to selected antibiotics were tested by disk-diffusion method. None of the analysed strains was resistant to imipenem. Among non beta-lactam antibiotics thwe most strains were susceptible to fluoroquinolones. The most frequently K. pneumoniae strains were isolated from urine, K. oxytoca strains were isolated from wounds. PIŚMIENNICTWO 1. Andrzejewska E, Szkaradkiewicz A. Wykrywanie ekspresji β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) wśród klinicznych szczepów Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli; porównanie E-testu i dwóch testów krążkowych. Med Dośw Mikrobiol 2004, 56: Appleton A. Evaluation of a novel diagnostic disc method for detection of extended spectrum β-lactamases. J Antimicrob Chemother 1999, 44 (suppl A): Coudron PE, Moland ES, Sanders CC. Occurrence and detection of ESBL in members of the family Enterobacteriaceae at a Veterans Medical Center: Seek and you may find. J Clin Microbiol 1997, 35: D Azevedo PA, Goncalves ALS, Musskopf MI i inni. Laboratory tests in the detection of extended spectrum beta-lactamase production: National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) screening test, the E-test, the double disk confirmatory test and cefoxitin susceptibility testing. Braz J Infect Dis 2004, 8:

6 44 A. Sękowska, J. Wróblewska, E. Gospodarek Nr 1 5. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K i inni. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego, Warszawa, Jarlier V, Nicolas M, Fournier G i inni. Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis 1988, 10: Kiffer C, Hsiung A, Oplustil C i inni. Antimicrobial susceptibility of Gram-negative bacteria in Brazilian Hospitals: The MYSTIC Program Brazil Braz J Infect Dis 2005, 9: Livermore DM, Brown DFJ. Detection of β-lactamase-mediated resistance. J Antimicrob Chemother 2001, 48 (Suppl S1): Özakin C, Sinirtas M, Sevgican E i inni. Comparison of the E-test method with an automated bacterial identification and antimicrobial susceptibility detection system for screening extendedspectrum β-lactamase producers. Scand J Infect Dis 2003, 35: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, sixteenth informational supplement. CLSI M 100-S16, 26 (3), Radosz-Komoniewska H, Gniadkowski M, Rogala-Zawada D i inni. Incidence of extended spectrum β-lactamases in clinical isolates of the family Enterobacteriaceae in a pediatric hospital. Pol J Microbiol 2004, 53: Rokosz A, Sawicka-Grzelak A, Łuczak M. Zastosowanie czterech wariantów testu krążka diagnostycznego (CD01, CD02, CD03, CD04) do wykrywania ESBL-dodatnich szczepów Gramujemnych pałeczek. Med Dośw Mikrobiol 2005, 57: (Doniesienie na konferencji) Sękowska A, Deptuła A, Hryniewicz W i inni. Izolacja szczepów Klebsiella pneumoniae wytwarzających metalo-β-laktamazy od pacjentów Intensywnej Terapii Szpitala Uniwersyteckiego im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Prezentowane na XI Sympozjum Naukowym Postępy w Medycynie Zakażeń. Warszawa, 30 listopada -1 grudnia Otrzymano: 28 I 2008 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, CM UMK Katedra i Zakład Mikrobiologii ala.sek@wp.pl