XXV. Grzyby cz I. Ćwiczenie 1. Wykonanie i obserwacja preparatów mikroskopowych. a. Candida albicans preparat z hodowli barwiony metoda Grama

Transkrypt

1 XXV. Grzyby cz I. Ćwiczenie 1. Wykonanie i obserwacja preparatów mikroskopowych a. Candida albicans preparat z hodowli barwiony metoda Grama Opis preparatu: b. Saccharomyces cerevisiae preparat z hodowli barwiony metoda Grama Opis preparatu: Ćwiczenia 2. Ocena wzrostu grzybów na podłożach stałych a. Candida albicans na podłożu Sabourauda morfologia kolonii.... b. Candida albicans na podłożu z 5% odwłókniona krwią baranią morfologia kolonii....

2 c. Wzrost Candida spp. na podłożu chromogennym morfologia kolonii.... Ćwiczenie 3. Wykonanie testu filamentacji (test kiełkowania) Zasada metody: Szczepy Candida albicans i Candida dubliniensis, wytwarzają podczas wzrostu na surowicy króliczej lub ludzkiej wypustki (filamenty) tworzące formy plemnikopodobne. Wykonanie oznaczenia: 1. Do probówki zawierającej 0,5 ml surowicy króliczej (lub ludzkiej) dodać 24godzinnej hodowli badanego grzyba. 2. Całość inkubować w C przez 1-3 godz. 3. Po inkubacji z hodowli wykonać preparat niebarwiony (na szkiełko podstawowe nanieść 1 kroplę hodowli, nałożyć szkiełko nakrywkowe) i oglądać pod powiększeniem 400x. Opis preparatu: Ćwiczenie 4. Identyfikacja szczepów z gatunku Candida spp. przy użyciu testu CANDIFAST Zasada metody: Zestaw Candifast przeznaczony do identyfikacji grzybów drożdżopodobnych, najczęściej izolowanych z próbek klinicznych. Za pomocą zestawu można zidentyfikować 7 gatunków Candida, Saccharomyces oraz gatunki ureazo (+): Cryptococcus, lub Trichosporon lub Rhodotorula. Oprócz identyfikacji zestaw umożliwia oznaczenie wyizolowanych szczepów na leki przeciwgrzybicze (amfoterycyna B, nystatyna, flucytozyna, ekonazol, ketokonazol, mikonazol, flukonazol) Wykonanie oznaczenia: Oznaczenie wykonać zgodnie z procedurą producenta:

3

4 Wnioski:.....

5 Ćwiczenie 6. Identyfikacja i badanie lekowrażliwości grzybów z użyciem testu FUNGITEST Zasada metody: FUNGITEST pozwala na badanie wzrostu grzybów w obecności 6 preparatów przeciwgrzybiczych, zastosowanych w dwóch różnych stężeniach, w zmodyfikowanym zbuforowanym podłożu płynnym RPMI 1640, w obecności barwnego wskaźnika redox. O wzroście drożdżaków świadczy redukcja wskaźnika, dzięki czemu podłoże zmienia barwę z niebieskiej na różową. Jeśli wzrost badanego szczepu jest zahamowany przez preparat przeciwgrzybiczy, podłoże pozostaje niebieskie. Zestaw w postaci mikropłytki o 16-tu studzienkach, zawiera: 2 studzienki kontroli wzrostu 12 studzienek z odwodnionymi czynnikami przeciwgrzybiczymi (6 czynników w dwóch różnych stężeniach) 2 studzienki kontroli ujemnej Wartości stężeń antybiotyków ustalono na podstawie wartości MIC dla poszczególnych preparatów, uzyskanych na prototypowej mikropłytce w tej samej procedurze, wg której wykonuje się FUNGITEST. A. PRZYGOTOWANIE ZAWIESINY DROŻDŻAKÓW Z czystej, młodej hodowli na podłożu Sabourauda z antybiotykami lub bez, pobrać dwie podobne kolonie i zawiesić w 3 ml jałowej wody destylowanej. Inokulum powinno mieć gęstość wzorca nr 1 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie 3 x 10 6 komórek/mililitr. Pipetą kalibrowaną rozcieńczyć inokulum w wodzie destylowanej: 100 µl inokulum w 1.9 ml wody. Pobrać 20 µl rozcieńczonego inokulum i zaszczepić podłoże dołączone w zestawie. Liczba komórek w tej zawiesinie wynosi w przybliżeniu 1 x 10 3 / mililitr. B. INOKULACJA MIKROPŁYTKI Pipetą kalibrowaną nanieść po 100 µl zawiesiny komórek do każdej studzienki mikropłytki. Zakryć folią adhezyjną.

6 C. INKUBACJA MIKROPŁYTKI Inkubować: - W temperaturze 32 C przez 72 godziny w przypadku Cryptococcus neoformans - W temperaturze 37 C przez 48 godzin w przypadku innych drożdżaków. D. ODCZYT I INTERPRETACJA WYNIKÓW Test jest ważny tylko wtedy, gdy kontrola dodatnia (T+) ma barwę różową. Należy obserwować zmianę barwy w studzienkach zawierających preparaty przeciwgrzybicze w porównaniu ze studzienkami kontroli ujemnej (niebieskie). Wynik dla każdego preparatu uzyskuje się na podstawie interpretacji barwy w dwóch studzienkach o różnych jego stężeniach: - Niebieska Niebieska = brak wzrostu: wzrost szczepu zahamowany przez antybiotyk in vitro - Różowa Niebieska = słaby wzrost: szczep średnio-wrażliwy - Różowa Różowa = wzrost: szczep oporny na antybiotyk in vitro

7 Ćwiczenie 7. Przygotowanie mikrohodowli Zasada metody: Mikrohodowla jest zakładana w celu uzyskania dobrej jakości preparatów mikroskopowych do oceny mikromorfologii. Najczęściej stosowaną techniką jest mikrohodowla szkiełkowa. Wg. Krzyściak P, Skóra M, Macura AB. Atlas grzybów chorobotwórczych człowieka. MedPharm Polska, Wrocław, Wykonanie mikrohodowli szkiełkowej Na szkiełko podstawowe za pomocą ezy z haczykiem wyciąć fragment podłoża agarowego brzegach wielkości 1 cm. Następnie z do 4 boków przenieść za pomocą ezy z haczykiem po 1mm kawałku agaru z porośnięta grzybnią (zgodnie z rysunkiem). Całość przykryć jałowym szkiełkiem nakrywkowym i inkubować w komorze wilgotnej w 27 0 C przez dni. 2. Wykonanie mikrohodowli techniką Dalmau Na podłożu ryżowym posiać badane szczepy w kształcie litery E Na podłoże nałożyć jałowe szkiełko nakrywkowe, tak aby linie posiewu wystawały poza szkiełko. Całość inkubować w temp 27 0 C. Linie posiewu