HYDROFOBOWE I HEMAGLUTYNACYJNE WŁAŚCIWOŚCI PAŁECZEK KLEBSIELLA PNEUMONIAE I KLEBSIELLA OXYTOCA

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: Alicja Sękowska, Eugenia Gospodarek HYDROFOBOWE I HEMAGLUTYNACYJNE WŁAŚCIWOŚCI PAŁECZEK KLEBSIELLA PNEUMONIAE I KLEBSIELLA OXYTOCA Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. E. Gospodarek prof. UMK Oceniono hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości 100 szczepów K. pneumoniae i 88 szczepów K. oxytoca izolowanych z próbek materiału klinicznego. Dokonano także analizy związku pomiędzy hydrofobowymi i hemaglutynacyjnymi właściwościami badanych izolatów. Najczęstsze zakażenia powodowane przez pałeczki Klebsiella sp. to zakażenia dróg oddechowych, układu moczowego, ran oraz zakażenia ogólnoustrojowe (15). W każdym z tych rodzajów zakażeń, bez względu na lokalizację, bakterie wchodzą w kontakt z komórkami gospodarza. Zaobserwowano, że pałeczki Klebsiella sp. mogą przylegać do komórek nabłonkowych (3, 20), erytrocytów (16), a także komórek roślin (6). Z niespecyficznych mechanizmów bakteryjnej adhezji hydrofobowość powierzchni komórki jest podstawowym czynnikiem warunkującym adhezję (10). Następstwem adhezji niespecyficznej są swoiste procesy przylegania związane z interakcjami receptor-ligand, wspomagane przez udział nie receptorowych struktur występujących na powierzchni komórek bakteryjnych (18). Specyficznie wiązane cukry, białka i lektyny działają jak adhezyny lub hemaglutyniny, które przylegają do erytrocytów i powodują hemaglutynację (13). Wydaje się słuszne określenie, że szczepy o powierzchni hydrofobowej częściej przylegają do erytrocytów. Celem pracy była ocena hydrofobowych i hemaglutynacyjnych właściwości pałeczek K. pneumoniae i K. oxytoca oraz analiza związku między badanymi właściwościami. MATERIAŁ I METODY Przedmiot badań stanowiło 100 szczepów Klebsiella pneumoniae i 88 Klebsiella oxytoca izolowanych z próbek materiału klinicznego. Identyfikację izolatów przeprowadzono przy użyciu testów biochemicznych ID32E (biomérieux). Szczepy hodowano 24 godziny na podłożu Tryptic Soy Agar (Becton-Dickinson) wzbogaconym 5% krwi. Hydrofobowość powierzchni komórek Klebsiella sp. oceniono metodą Rosenberga i wsp. (17). Na podstawie uzyskanych wyników szczepy bakteryjne podzielono na dwie

2 46 A. Sękowska, E. Gospodarek Nr 1 grupy: hydrofobowe - powyżej 25% komórek przylegających do p-ksylenu i hydrofilowe - poniżej 25% komórek przylegających do p-ksylenu. Ocenę hemaglutynacyjnych właściwości pałeczek Klebsiella sp. przeprowadzono według metody Blanco i wsp. (1). W doświadczeniu zastosowano czerwone krwinki ludzkie grupy O i baranie w dwóch układach: hemaglutynacja naturalnych krwinek ludzkich (L) i baranich (B) oraz hemaglutynacja krwinek poddanych działaniu kwasu taninowego (Merck) (ludzkie krwinki taninowane - LT, baranie krwinki taninowane - BT). Ze szczepami, które dawały dodatnią reakcję hemaglutynacji przeprowadzono test zahamowania hemaglutynacji z wybranymi cukrami. Jako inhibitorów hemaglutynacji użyto 0,1 M roztworów następujących cukrów: D-glukozy, D-mannozy, D-rybozy, L-fukozy, α -laktozy, sacharozy, D-galaktozy i D-ksylozy (Sigma). Przygotowanie i taninowanie krwinek przeprowadzono według metody Gałązki i Sporzyńskiej (4). WYNIKI Spośród badanych szczepów K. pneumoniae 30 (30,0%) posiadało hydrofobowe właściwości. Wśród szczepów K. oxytoca u 17 (19,3%) wykryto powierzchnię hydrofobową. Hemaglutynacyjne właściwości wykazano u 45 (45,0%) szczepów K. pneumoniae i 20 (22,7%) szczepów K. oxytoca. Krwinki taninowane częściej ulegały hemaglutynacji pod wpływem szczepów K. pneumoniae (66,0%) i K. oxytoca (25,0%) niż krwinki naturalne. Krwinki baranie taninowane najczęściej ulegały hemaglutynacji pod wpływem badanych szczepów, najrzadziej krwinki ludzkie. Pod wpływem szczepów K. pneumoniae odnotowano 9 wzorów hemaglutynacji (najczęstszy wzór L(-)LT(+)B(-)BT(+), a pod wpływem szczepów K. oxytoca 4 wzory (najczęstszy wzór L(-)LT(-)B(-)BT(+) (Tab. I). Tabela I. Wzory hemaglutynacyjnej aktywności pałeczek Klebsiella sp. (n=65) Wzór hemaglutynacji Liczba szczepów K. pneumoniae (n=45) K. oxytoca (n=20) L(-)LT(+)B(-)BT(+) 15 5 L(-)LT(-)B(-)BT(+) 12 9 L(+)LT(+)B(+)BT(+) 6 0 L(-)LT(+)B(-)BT(-) 5 0 L(-)LT(-)B(+)BT(+) 3 0 L(+)LT(-)B(+)BT(-) 1 3 L(-)LT(+)B(+)BT(+) 1 0 L(+)LT(-)B(+)BT(+) 1 0 L(-)LT(+)B(+)BT(-) 1 3 Ze szczepami wykazującymi hemaglutynacyjne właściwości wykonano test zahamowania hemaglutynacji. Pod wpływem szczepów K. pneumoniae odnotowano 19 wzorów zahamowania hemaglutynacji. Najczęściej zahamowanie hemaglutynacji następowało w obecności wszystkich badanych cukrów. Pod wpływem szczepów K. oxytoca odnotowano 7 wzorów zahamowania hemaglutynacji. Najczęściej obserwowano wzór D-glukoza D- mannoza. Zahamowanie hemaglutynacji krwinek przez szczepy obu badanych gatunków najczęściej obserwowano w obecności D-glukozy i D-mannozy (Tab. II).

3 Nr 1 Hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości K. pneumoniae i K. oxytoca 47 Tabela II. Wzory zahamowania hemaglutynacyjnej aktywności pałeczek Klebsiella sp. pod wpływem cukrów. Wzór zahamowania hemaglutynacji Liczba szczepów K. pneumoniae K. oxytoca W 23 0 D-glu D-man 16 8 D-glu D-man D-gal D-ksyl 8 0 D-glu D-man L-fuc 6 1 L-fuc sach 4 0 D-glu D-ryb α-lakt 3 0 D-glu D-man D-gal 3 1 D-glu L-fuc 2 5 D-man 2 0 D-glu D-man D-ryb L-fuc α-lakt 1 0 D-glu D-ryb L-fuc α-lakt sach 1 0 D-glu D-man sach 1 0 D-man L-fuc sach 1 0 D-ryb L-fuc α-lakt 1 0 D-glu α-lakt 1 0 D-glu D-gal 1 0 D-glu 1 6 L-fuc α-lakt 1 0 L-fuc 1 2 α-lakt 0 1 W wszystkie badane cukry Analizując związek pomiędzy hydrofobowymi a hemaglutynacyjnymi właściwościami odnotowano, że 27 (36,0%) szczepów K. pneumoniae i 15 (40,5%) szczepów K. oxytoca posiadało obie badane właściwości. DYSKUSJA Adhezja jest ważnym początkowym etapem w patogenezie zakażeń bakteryjnych. Bakterie zazwyczaj tworzą na swojej powierzchni struktury, których pierwszą funkcją jest interakcja z receptorem w błonach komórek docelowych. Mogą też aglutynować erytrocyty zwierząt. Interakcje z nimi mogą mieć związek z patogenezą zakażeń. Według Okamoto i wsp. (14) hydrofobowość powierzchni komórki i obecność hemaglutynin są jednymi z ważniejszych czynników wirulencji różnych bakterii. W obecnej pracy odnotowano ponad 20% szczepów Klebsiella sp. o powierzchni hydrofobowej. Otrzymane wyniki są zbliżone do uzyskanych przez Hoštacká i Klokočniková (7) w odniesieniu do szczepów K. oxytoca. Natomiast różnią się w przypadku szczepów K. pneumoniae. W przedstawianej pracy nie odnotowano szczepów Klebsiella sp. silnie hydrofobowych, co potwierdzają badania innych autorów (2, 7).

4 48 A. Sękowska, E. Gospodarek Nr 1 Hemaglutynacyjne właściwości pałeczek Gram-ujemnych były tematem wcześniejszych opracowań (5, 11, 12). Szczepy badane w prezentowanej pracy wykazywały zdolność adhezji do komórek żywych (ludzkich i baranich), chociaż w mniejszym stopniu niż do komórek poddanych działaniu garbnika. Podobne wyniki uzyskała Janicka i wsp. (8) badając hemaglutynacyjne właściwości szczepów E. coli. Autorzy powyższej pracy tłumaczą ten fakt odsłonięciem przez garbnik receptorów głębszych warstw ścian krwinki lub modyfikacją przy użyciu garbnika struktur chemicznych istniejących już na powierzchni krwinki. Spośród badanych szczepów ponad 30% posiadało hemaglutynacyjne właściwości. W obecnej pracy częściej obserwowano szczepy hemaglutynujące krwinki baranie niż ludzkie. Przondo-Hessek i Pulverer (16) badając zdolność do hemaglutynacji ponad 300 szczepów Klebsiella sp. nie zaobserwowali szczepów aglutynujących krwinki baranie, a aglutynację krwinek ludzkich odnotowali tylko pod wpływem dwóch szczepów. Rozbieżności mogą wynikać z odmienności osobniczej szczepów, a także właściwości ludzi i zwierząt, od których pochodziła krew. Właściwości te mogą być związane z ekspresją różnych receptorów krwinkowych, co może tłumaczyć zaobserwowane różnice. Analizując wzory zahamowania hemaglutynacji zaobserwowano duże zróżnicowanie receptorów cukrowych na powierzchni komórek Klebsiella sp. Większe zróżnicowane wzorów zahamowania hemaglutynacji krwinek odnotowano dla szczepów K. pneumoniae niż K. oxytoca. U bakterii Gram-ujemnych wykazano, że specyficzne interakcje lektynareceptor mogą mieć znaczenie w patogenezie chorób (wg 19). Być może obecność tak wielu różnych receptorów wiąże się z większą chorobotwórczością K. pneumoniae i częstszym powodowaniem zakażeń. W przedstawianej pracy wykazano, że szczepy należące do tego samego gatunku mogą posiadać receptory dla wielu różnych cukrów. Według Garber i wsp. (5) hemaglutynacja zależy od stopnia hydrofobowości komórki bakteryjnej. W obecnej pracy ponad 30% szczepów K. pneumoniae i ponad 40% szczepów K. oxytoca ocenionych jako hydrofobowe posiadało właściwości hemaglutynacyjne. Uzyskane wyniki częściowo wydają się potwierdzać doniesienia Garbera i wsp. (5). Jednak odnotowano szczepy, które posiadały powierzchnię hydrofilową i hemaglutynowały krwinki. Można więc przypuszczać, że przyleganie pałeczek Klebsiella sp. do komórek żywych może być związane z hydrofobowością powierzchni, ale może również wynikać z obecności swoistych receptorów o charakterze lektyn lub adhezyn. PODSUMOWANIE Baranie krwinki taninowane najczęściej ulegały hemaglutynacji pod wpływem pałeczek Klebsiella sp. Zahamowanie hemaglutynacji krwinek przez szczepy K. pneumoniae najczęściej obserwowano w obecności D-glukozy i D-mannozy, natomiast przez szczepy K. oxytoca w obecności D-glukozy.

5 Nr 1 Hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości K. pneumoniae i K. oxytoca 49 A. Sękowska, E. Gospodarek HYDROPHOBIC AND HEMAGGLUTINATING PROPERTIES OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE AND KLEBSIELLA OXYTOCA SUMMARY The aim of this study was to estimated hydrophobic and hemnagglutinating properties of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca rods. The hydrophobcity was evaluated according to the method of Rosenberg et al. The hemagglutinating properties were estimated by method of Blanco et al. Forty seven hydrophobic Klebsiella strains (30 K. pneumoniae strains and 17 K. oxytoca strains) were detected. Hemagglutinating properties were observed in 65 Klebsiella strains (45 K. pneumoniae strains and 20 K. oxytoca strains). Hemagglutination of sheep tannined erythrocytes the most frequently was observed. Inhibition of hemagglutination of erythrocytes by K. pneumoniae strains was most frequently observed in presence of D-glucose and D-mannose and by K. oxytoca strains in presence of D-glucose. PIŚMIENNICTWO 1. Blanco M, Blanco JE, Alonso MP i inni. Virulence factors and O groups of Escherichia coli isolates from patients with acute pyelonephritis, cystitis and asymptomatic bacteriuria. Eur J Epidemiol 1996, 12: Camprubi S, Merino S, Benedi J i inni. Physicochemical surface properties of Klebsiella pneumoniae. Curr Microbiol 1992; 24: Cortés G, Borrel N, de Astorza B i inni. Molecular analysis of the contribution of the capsular polysaccharide and the lipopolysaccharide O side chain to the virulence of Klebsiella pneumoniae in a murine model pneumonia. Infect Immun 2002; 70: Gałązka A, Sporzyńska Z. Odczyn biernej hemaglutynacji. Wydawnictwo PZH. Warszawa Garber N, Sharon N, Shohet D i inni. Contribution of hydrophobicity to hemagglutination reactions of Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun 1985; 50: Haahtela KE, Tarkka E, Korhonen TK. Type 1 fimbrie-mediated adhesion of enteric bacteria to grass roots. Appl Environ Microbiol 1985; 49: Hoštacká A, Klokočniková L. Antibiotic susceptibility, serum response and surfce properties of Klebsiella species Microbios 2001; 104: Janicka G, Białek M, Kruszyńska E i inni. Właściwości hemaglutynacyjne Escherichia coli. Diagn Lab 1998; 34: Lemke MJ, Churchill PF, Wetzel RG. Effect of substrate and cell surface hydrophobicity on phosphate utilization in bacteria. Appl Environ Microbiol 1995; 61: Malm A, Biernasiuk A, Łoś R i inni. Slime production and cell surface hydrophobicity of nasopharyngeal and skin staphylococci isolated from healthy people. Pol J Microbiol 2005; 54: Mikcha JMG, Piantino Ferreira AJ i inni. Hemagglutinating properties of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources. Braz J Microbiol 2004; 35: Mishra M, Thakar YS, Pathan AA. Haemagglutination, haemolysin production and serum resistance of Proteus and related species isolated from clinical sources. Ind J Med Microbiol 2001; 19: Møller JD, Larsen JL, Madsen L i inni. Involvment of a sialic acid-binding lectin with hemagglutination and hydrophobicity of Flavobacterium psychrophilum. Appl Environ Microbiol 2003; 69:

6 50 A. Sękowska, E. Gospodarek Nr Okamoto K, Inoue T, Ichikawa H i inni. Adherence of Yersinia enterocolitica to mammalian epithelial cell lines. Microbiol Immunol 1980; 24: Podschun R, Ullmann U. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods and pathogenicity factors. Clin Microbiol Rev 1998; 11: Przondo-Hessek A, Pulverer G. Hemagglutinins of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca. Zbl Bakt Hyg 1983; 255: Rosenberg M, Gutnick D, Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiol Lett 1980; 9: Różalska B. Infekcje towarzyszące stosowaniu w medycynie biomateriałów. Post Hig Med Dośw 1994; 48: Rupp ME, Archer GL. Hemagglutination and adherence to plastic by Staphylococcus epidermidis. Infect Immun 1992; 60: Sahly H, Podschun R, Oelschlaeger TA i inni. Capsule impedes adhesion to and invasion of epithelial cells by Klebsiella pneumoniae. Infect Immun 2000; 68: Otrzymano: 10 X 2007 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu