VII. Pałeczki Gram-dodatnie: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus - ćwiczenia praktyczne

Transkrypt

1 VII. Pałeczki Gram-dodatnie: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus - ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Wykonanie barwionych preparatów mikroskopowych preparat barwiony metodą Grama z Corynebacterium pseudodiphtheriticum Opis preparatu: preparat barwiony metodą Grama z Lactobacillus spp. Opis preparatu: preparat barwiony metodą Neissera z. Opis preparatu:

2 Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) gatunek drobnoustroju: Corynebacterium pseudodiphtheriticum typ hemolizy gatunek drobnoustroju: typ hemolizy Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych szczepów maczugowców. a. wykonanie próby na katalazę Szczep badany.. wnioski

3 b. oznaczanie zdolności do redukcji azotanów Zasada metody: Badanie wykrywa zdolność wytwarzania przez bakterie reduktazy azotanowej. W wyniku jej działania drobnoustroje przekształcają jony azotanowe w azotynowe. Dodanie do hodowli odczynnika Griessa (kwas sulfanilowy: α-naftyloamina w kwasie octowym) powoduje, że zachodzi w roztworze reakcja diazowania kwasu sulfanilowego jonami azotynowymi, której produktem jest związek diazowy o barwie ceglastoczerwonej. Wykonanie: 1. Badanie wykonuje się na bulionie z dodatkiem azotanu potasu. 2. Po 24 godzinnej inkubacji do hodowli dodaje się odczynnika Griessa. Ceglastoczerwone zabarwienie hodowli świadczy o redukcji azotanów. próba dodatnia próba ujemna c. wykrywanie zdolności do wytwarzania ureazy Zasada metody: Enzymatyczny rozkład mocznika przez bakterie powoduje powstanie NH 3 i CO 2. Powstający NH 3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę zabarwienia z żółtej na różowoamarantową. Wykonanie: 1. Podłoże zawierające 2% mocznika zaszczepić badanym szczepem. 2. Całość inkubować w 37 0 C godzin. 3. Odczytać wynik. próba dodatnia próba ujemna d. ocena zdolności utleniania/fermentacji glukozy, maltozy, sacharozy Zasada metody: Badanie zdolności sacharolitycznych bakterii wykonuje się na podłożu zawierającym surowicę końską, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, cystynę, 1% glukozy i czerwień fenolową. Kwaśny rozkład węglowodanów powoduje zmianę ph środowiska i zmianę zabarwienia z czerwonego na żółte. Wykonanie: 1. Podłoże zawierające 1% glukozy lub maltozy lub sacharozy zaszczepić badanym szczepem 2. Całość inkubować w 37 0 C godzin. 3. Odczytać wynik. próba dodatnia próba ujemna

4 Ćwiczenie 4. Różnicowanie szczepów Corynebacterium spp. na podstawie wybranych cech biochemicznych 1-redukcja azotanów, 2- wytwarzanie ureazy, 3- O/F glukozy, 4-rozkład maltozy, 5- rozkład sacharozy Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium ulcerans Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium urealyticum

5 Ćwiczenie 5. Identyfikacja szczepów Corynebacterium spp. przy użyciu testu API Coryne Odczyt testu Po inkubacji do mikroprobówek NIT, PYZ, PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag dodać odpowiednie odczynniki wg schematu: 1. Test NIT po kropli NIT1 i NIT2 2. Test PYZ 1 kropla PYZ 3. Testy PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag po kropli ZYM A i ZYM B Odczytać wyniki wg załączonej tabeli.

6 Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Listeria monocytogenes a. próba na katalazę Szczep badany.. wnioski b. hydroliza eskuliny c. wzrost w temperaturze 4 0 C Materiał kliniczny miesza się proporcji 1:10 z bulionem i umieszcza w temp. 4 0 C. Pałeczki Listeria mnożą się w niskich temperaturach. d. test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC wytwarzający hemolizę β. 2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować przez godzin w temperaturze 35 0 C. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca.

7 Staphylococcus aureus ATCC Szczep badany Wnioski..... e. ocena zdolności hemolitycznych na podłożu agarowym z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej typ hemolizy Listeria monocytogenes ruch + typ hemolizy katalaza wzrost w 4 0 C hydroliza eskuliny test CAMP