woda do 1000 ml ph=6,9-7,1. Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml). Agar z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (YS)

Transkrypt

1 Ćwiczenie 1, 2, 3, 4 Skrining ze środowiska naturalnego: selekcja promieniowców zdolnych do produkcji antybiotyków. Testowanie zdolności do syntezy antybiotyków przez wyselekcjonowane szczepy promieniowców I tydzień (ćwiczenie 1) Materiał: próbka gleby Przygotowanie materiału: próbkę gleby (200 g) zmieszać z 5 g węglanu wapnia, inkubować przez 7 dni w temperaturze 26 C. W takich warunkach następuje zahamowanie wzrostu grzybów, a wypromowanie wzrostu promieniowców (gleby obojętne lub alkaliczne o stosunkowo niskim uwodnieniu). Przesuszenie gleby dodatkowo powoduje zmniejszenie ilości bakterii nieprzetrwalnikujących. II tydzień (ćwiczenie 2) Cel ćwiczenia: izolacja drobnoustrojów glebowych wytwarzających antybiotyki Odczynniki i podłoża: Agar z glicerolem, argininą i solami mineralnymi (AGS) chlorowodorek argininy glicerol 12,5 g K 2 HPO 4 NaCl MgSO 4 0,5 g Fe 2 (SO 4 ) 3 0,01 g CuSO 4 ZnSO 4 MnSO 4 woda do 1000 ml ph=6,9-7,1. Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml). Agar z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (YS) wyciąg glebowy 1000 ml ekstrakt drożdżowy 20,0 g Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml). 0,9% NaCl 0,1% roztwór Tween 80 w soli fizjologicznej 1

2 Wykonanie: 1. Przygotować wyciąg glebowy (10 g gleby wytrząsać w 90 ml soli fizjologicznej z dodatkiem Tweenu przez około 30 minut, odstawić na 1 minutę do opadnięcia większych cząstek). 2. Przygotować szereg 10-krotnych rozcieńczeń w soli fizjologicznej ( ) po 1 ml rozcieńczenia na 9 ml soli fizjologicznej. Wyciąg glebowy traktować jako rozcieńczenie Wykonać posiew powierzchniowy (mazany) na ze po 0,1 ml każdego z rozcieńczeń. Inkubować hodowle przez 7 dni w temperaturze 28 C. Ryc. Schemat wykonania szeregu rozcieńczeń wyciągu glebowego. Wyniki: Określić liczbę kolonii (CFU colony forming units) wyrosłych na ze przy poszczególnych rozcieńczeniach wyciągu glebowego i opisać morfologię obserwowanych grzybni wygląd, kolor, wielkość, powierzchnia itp. 2

3 Tabela. Wyniki obserwacji (morfologia i liczba CFU) Rozcieńczenie wyciągu glebowego glebowy (YS) liczba kolonii morfologia kolonii liczba kolonii AGS morfologia kolonii Wnioski:... III tydzień (ćwiczenie 3) Cel ćwiczenia: Uzyskanie czystych szczepów promieniowców glebowych i analiza ich antagonizmów wobec wzorcowych szczepów patogennych bakterii i/lub grzybów. Podłoża: PDA (potato-dextrose ): wyciąg ziemniaczany 500 ml (z 300 g ziemniaków) glukoza 20,0 g woda do 1000 ml 3

4 Wykonanie: Wybrane kolonie promieniowców wyizolowane z gleby (ćwiczenie 2.) przeszczepić na płytki z em ziemniacznym (PDA). Inkubować przez 7 dni w temp. 28 C. IV tydzień (ćwiczenie 4) Podłoża: Agar wysiewny Penassay (Grove & Randall Antibiotic Agar No 1): glukoza wyciąg mięsny 1,5 g pepton kazeinowy 4,0 g pepton mięsny 6,0 g wyciąg drożdżowy 3,0 g woda do 1000 ml; ph=6,5 Wykonanie: Po 7 dniach wysiać ezą wybrane szczepy (z poprzedniego ćwiczenia) na szalki z podłożem wysiewnym do badania aktywności antybiotycznej (Penassay ). Posiew wykonać w postaci dwóch linii wzdłuż szalki. Inkubować przez 7 dni w temp. 28 C. V tydzień (ćwiczenie 4 kontynuacja: odczyt i analiza wyników całego eksperymentu) Materiał: szczepy wzorcowe Bacillus cereus, Candida albicans, Escherichia coli Wykonanie: Po 7 dniach nanieść na płytki z em wysiewnym kolonie wybranych drobnoustrojów wzorcowych dokładnie wzdłuż uprzednio narysowanych linii prostopadłych do linii wysiewu testowanych szczepów promieniowców. Linie nie mogą stykać się bezpośrednio z wyrosłymi koloniami promieniowców. Płytki inkubować przez 48 godzin w temp. 37 C, a następnie dokonać oceny zdolności badanych szczepów promieniowców do hamowania wzrostu drobnoustrojów wzorcowych. Opisać swoją płytkę z naniesionymi szczepami promieniowców i szczepów testowych 4

5 Ryc. Schemat opisu płytki z em Penassay Wyniki: Tabela. Analiza antagonizmów ocena występowania i wielkości stref zahamowania wzrostu wzorcowych szczepów patogennych wielkość stref zahamowania wzrostu [mm] B. cereus C. albicans E. coli szczep 1. szczep 2. Na podstawie powyższej analizy oszacować potencjał wyizolowanych szczepów promieniowców glebowych do produkcji substancji o charakterze antybiotycznym: 5