ANALIZA WZROSTU BIOFILMU PSEUDOMONAS AERUGINOSA W ZALEŻNOŚCI OD WARUNKÓW NAMNAŻANIA SZCZEPÓW I BARWIENIA BIOFILMU

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Agnieszka Kalicińska 1, Stefan Tyski 1,2 ANALIZA WZROSTU BIOFILMU PSEUDOMONAS AERUGINOSA W ZALEŻNOŚCI OD WARUNKÓW NAMNAŻANIA SZCZEPÓW I BARWIENIA BIOFILMU 1) Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: prof. dr hab. S. Tyski 2) Narodowy Instytut Leków w Warszawie Przedstawiono wyniki tworzenia biofilmu na mikropłytkach polistyrenowych przez szczepy P. aeruginosa rosnące w 3 wybranych podłożach hodowlanych, przy użyciu trzech metod barwienia biofilmów bakteryjnych. Najbardziej efektywną okazała się metoda barwienia z użyciem 3% bromku 3-(4,5- dimetylo-2-tiazolilo)-2,5difenylo-2h-tetrazoliowego. W trzech badanych grupach izolatów odnotowano największy procentowy udział szczepów średnio-rosnących, podczas gdy w czwartej grupie (izolaty z plwociny od chorych z mukowiscydozą) obserwowano największy udział szczepów wolno-rosnących. Biofilm to wysoce zorganizowana, wielowarstwowa struktura, zbudowana z komórek jednego bądź wielu gatunków drobnoustrojów i wydzielanej przez nie zewnątrzkomórkowej polisacharydowej macierzy. Wykazuje zdolność adhezji zarówno do powierzchni ożywionych jak i nieożywionych (13). Biofilm jest obecny w środowisku naturalnym, stanowi problem w medycynie, przemyśle, wszędzie tam gdzie tylko bakterie mogą bytować. Biofilm może formować się praktycznie, w każdym wilgotnym środowisku, w którym znajdują się odpowiednie substancje odżywcze (6, 14). Najważniejszymi czynnikami środowiskowymi warunkującymi zdolność bakterii do tworzenia biofilmu na powierzchniach abiotycznych są: dostępność do składników odżywczych, ph podłoża czy obecność w środowisku różnych specyficznych substancji. Zmiany tych parametrów mogą wpływać na procesy formowania się biofilmu na powierzchniach abiotycznych (16). Zaobserwowano również, że bakterie w warunkach głodowych szybciej ulegają adhezji do powierzchni materiału, zmieniając swój kształt, powodują wzrost przepływu i dostępności składników odżywczych, co może być sposobem ułatwiającym przetrwanie drobnoustrojów (17). W procesie formowania się biofilmu istotną rolę odgrywa również charakter i rodzaj powierzchni. Do powierzchni nieożywionych, na których najczęściej obserwujemy biofilm należą powierzchnie ze szkła, stali i metalu, a także inne powierzchnie takie jak teflon,

2 244 A. Kalicińska, S. Tyski Nr 3 silikon, guma, polistyren, polipropylen (3). Dodawane dodatki polimerowe i plastyczne mogą również przyczyniać się do rozwoju biofilmów (9). Jedni autorzy utrzymują, iż ze wzrostem chropowatości powierzchni rośnie zdolność bakterii do tworzenia biofilmów (1, 3, 10), natomiast inni nie stwierdzali korelacji między tymi procesami (7). Stosowane obecnie metody pośrednie i bezpośrednie pozwalają ilościowo ocenić produkowany przez badane szczepy biofilm. Do metod pośrednich należą metody hodowli biofilmu prowadzone na powierzchniach płytek titracyjnych, w których komórki tworzące biofilm barwione są przy użyciu takich barwników jak np. fiolet krystaliczny, chlorek trójfenylotetrazoliowy czy safranina. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne i metoda hodowli. W pierwszym etapie badań dokonano oceny dynamiki tworzenia biofilmu przez 20 wybranych szczepów Pseudomonas aeruginosa, po 5 izolatów pochodzących z: plwociny osób chorych na mukowiscydozę (M), z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych (BAL), z moczu (U), z krwi lub wymazów z ran (BL); pobranych od chorych leczonych w Instytucie Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie-Międzylesiu. W drugim etapie zbadano 153 szczepy P. aeruginosa. Spośród nich 50 szczepów izolowano z BAL-u, 46 z moczu, 39 z plwociny osób chorych na mukowiscydozę i 18 pochodziło z krwi lub wymazów z ran. Bakterie były przechowywane w temperaturze -70 o C, na podłożu - wyciąg mózgowo-sercowy (BHI) (Difco) z 20% glicerolem (Chempur). Następnie badane szczepy wysiewano na bulion odżywczy zestalony agarem i inkubowano 18-24h w 37 C. Dalsze hodowle drobnoustrojów były prowadzone godzin, w 37 C, w trzech płynnych podłożach wzrostowych: podłożu Luria-Bertani (LB): bacto trypton 10g/l (Btl), ekstrakt drożdżowy 5 g/l (Difco), NaCl 10 g/l (Chempur), agar 17 g/l (Biocorp), ph 7,2 podłożu kazeinowo-sojowym (TSB): bacto trypton 17g/l (Btl), pepton sojowy 3g/l (Difco), glukoza 2,5 g/l, fosforan dwupotasowy 2,5 g/l (Poch), NaCl 5 g/l, agar 17 g/l (Biocorp) z dodatkiem 2% glukozy (Poch), ph 7,4-7,6 oraz na podłożu z wyciągiem mózgowo-sercowym (BHI) (Difco). W kolejnym etapie szczepy przesiewano na odpowiednie skosy, zawierające podłoża LB, BHI i TSB z 2 % glukozy zestalone agarem i inkubowano przez kolejne h w temp. 37 C. Następnie sporządzano zawiesiny komórek drobnoustrojów w 0,9% NaCl i ustalano ich gęstość na około 2,9 jednostki w skali McFarlanda, rozcieńczano dziesięciokrotnie odpowiednim podłożem i umieszczano po 200 µl w dołkach polistyrenowych płytek titracyjnych (Kartell). Hodowle inkubowano przez 2, 4, 7, 24 i 48 godzin w 37 o C. Dalsze postępowanie było następujące w zależności od użytej metody barwienia. Metody barwienia. W pierwszym etapie pracy badano dynamikę tworzenia biofilmu przez 20 wybranych szczepów P. aeruginosa, hodując drobnoustroje w 3 podłożach: LB, BHI, TSB 2%glu. Stosowano trzy metody barwienia biofilmu: 3 % bromkiem 3-(4,5-dimetylo- 2-tiazolilo)-2,5difenylo-2H-tetrazoliowym (MTT) (AppliChem), 1 % chlorkiem 2,3,5-trójfenylotetrazoliowym (TTC) (Reanal) oraz 2 % fioletem krystalicznym (FK) (Chemapol). W drugim etapie pracy przebadano 153 szczepy P. aeruginosa. Biorąc pod uwagę wyniki uzyskane w pierwszym etapie, hodowle prowadzone były na dwóch podłożach: LB i TSB 2%glu, i zastosowaniu jednej wybranej metody barwienia biofilmu z użyciem MTT.

3 Nr 3 Biofilm P. aeruginosa 245 Metoda barwienia z użyciem 2% fioletu krystalicznego (FK). Po określonym czasie inkubacji drobnoustrojów w dołkach płytek titracyjnych (2, 4, 7, 24 lub 48 h) materiał usuwano, dołki płukano 9-krotnie buforem PBS (POCh), aby usunąć podłoże wraz z bakteriami planktonowymi. Powstały biofilm utrwalano przez 10 minut 3% roztworem formaliny [POCh]. Następnie dołki płukano 3-krotnie PBS, dodawano po 200 µl 2% wodnego roztworu fioletu krystalicznego i pozostawiano na 15 minut, po czym płytki trzykrotnie płukano wodą destylowaną i do dołków dodawano po 200 µl 96% etanolu (POCh). Natężenie barwy roztworów w dołkach płytek titracyjnych odczytywano przy użyciu spektrofotometru KC JUNIOR (Bio-Tek) przy długości fali λ = 584 nm. Metoda barwienia z użyciem 1% chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC). Do założonych hodowli bakteryjnych w dołkach płytek titracyjnych dodawano po 20 µl roztworu TTC i inkubowano przez 2-48 h w 37 C. Po tym czasie dołki płukano 9-krotnie buforem PBS. Powstały biofilm utrwalano przez 10 minut 3% roztworem formaliny. Następnie dołki płukano trzykrotnie PBS i dodawano po 200 μl 96% etanolu (POCh). Gęstość optyczną (OD) odczytywano przy długości fali λ = 495 nm. Metoda barwienia z użyciem 3% bromku 3-4,5-dimetylo-2-tiazolilo)- 2,5difenylo-2H-tetrazoliowego (MTT). Po określonym czasie inkubacji od 2 do 48 h usuwano zawiesinę bakteryjną z dołków, po czym dodawano po 50 μl MTT i 150 μl PBS. Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 o C materiał usuwano, a obecny na ściankach płytek biofilm rozpuszczano dodając 150 μl DMSO i 25 μl buforu glicynowego (Poch). Wartości absorbancji odczytano przy długości fali λ = 554 nm. Ocena statystyczna wyników. Badania prowadzono w 2 powtórzeniach i analizowano statystycznie. Dla każdego z badanych szczepów obliczono średnie wartości absorbancji i odchylenia standardowe. W przypadku gdy wartość odchylenia standardowego przekraczała 20% średniej wartości absorbancji, wówczas próbę powtarzano. W celu sprawdzenia poprawności wykonywanych oznaczeń, równocześnie na płytkach z badanymi szczepami prowadzono hodowle trzech szczepów P. aeruginosa (kontrolnych). Scharakteryzowano je jako szczepy szybko - (Kd), średnio - (Kś) i wolno - rosnące (Km). WYNIKI W pierwszym etapie badań dokonano oceny dynamiki tworzenia biofilmu przez 20 szczepów P. aeruginosa. Używając każdej z trzech metod barwienia zaobserwowano rozwój biofilmów bakteryjnych we wszystkich z testowanych podłoży hodowlanych. Wszystkie badane szczepy P. aeruginosa wykazały zdolność adhezji do ścianek płytek titracyjnych. Metody różniły się między sobą czułością i otrzymywanymi wartościami absorbancji, które mieściły się w następujących przedziałach: 0,15 A 554 3,0 (w metodzie z MTT) 0,08 A 495 2,2 (w metodzie z TTC) 0,12 A 584 4,0 (w metodzie z FK) Porównanie wyników badanych szczepów z wynikami uzyskanymi dla szczepów kontrolnych pozwoliło na sklasyfikowanie poszczególnych szczepów jako szczepy wolno-, średnio- i szybko- rosnące. Przyjęto własną klasyfikację szczepów w zależności od wartości absorbancji, wskazującej na dynamikę tworzenia biofilmu. W zależności od sposobu barwie-

4 246 A. Kalicińska, S. Tyski Nr 3 nia biofilmu, stosowano różną długość fali światła i różne graniczne wartości absorbancji dla poszczególnych grup szczepów. Szczepy zostały porównane również w czterech grupach według miejsca izolacji: szczepy pochodzące z plwociny chorych na mukowiscydozę (M), szczepy izolowane z moczu (U), szczepy z krwi bądź wymazów z ran (BL) i szczepy otrzymane z próbek popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych (BAL). W obrębie każdej z badanych grup obserwowano szczepy zarówno wolno- średnio- jak i szybko- rosnące. Nie było dominacji konkretnej grupy drobnoustrojów pod względem tempa wzrostu. Używając metod z fioletem krystalicznym i TTC zaobserwowano największy odsetek szczepów wolno tworzących biofilm w grupie izolatów (M). Dokonano oceny zdolności wzrostu badanych szczepów w trzech wybranych podłożach hodowlanych. Drobnoustroje rosły porównywalnie we wszystkich podłożach. Najwyższe wartości absorbancji obserwowano w podłożu TSB 2%glu. Najbardziej powtarzalne wyniki o najmniejszych wartościach odchylenia standardowego uzyskano w podłożu LB. Największe odchylenia standardowe obserwowano w przypadku podłoża BHI. Barwiąc fioletem krystalicznym hodowle prowadzone 7 i więcej godzin wielokrotnie otrzymywano wyniki absorbancji powyżej 4 OD. Uniemożliwiało to obserwację dynamiki wzrostu szczególnie szczepów szybko rosnących, ze względu na brak możliwości dokładnego odczytu spektrofotometrycznego starszych hodowli. Przy użyciu tej metody barwienia można było efektywnie śledzić dynamikę wzrostu drobnoustrojów jedynie w czasie 2-7 godzin (Ryc. 1). Barwiąc biofilm TTC otrzymywano bardzo niskie wartości absorbancji. W przypadku Ryc.1. Dynamika wzrostu 20 szczepów P. aeruginosa tworzących biofilm, zaobserwowana przy wykorzystaniu metody barwienia z fioletem krystalicznym, w podłożu LB. Objaśnienia: M-izolaty z plwociny od chorych z mukowiscydozą, BAL-izolaty z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, BL-izolaty z krwi lub wymazów z ran chorych, U-izolaty z moczu, Kd, Km-szczepy kontrolne. hodowli 2, 4 i 7 godzinnej często uzyskiwano wartości A 495 < 0,2 OD, co uniemożliwiało dokładną obserwację wzrostu szczepów w pierwszych godzinach prowadzonych hodowli,

5 Nr 3 Biofilm P. aeruginosa 247 zwłaszcza szczepów wolno rosnących. Wzrost biofilmu najlepiej można było obserwować w czasie 7-48 godzin (Ryc.2). Ryc.2. Dynamika wzrostu 20 szczepów P. aeruginosa tworzących biofilm, zaobserwowana przy wykorzystaniu metody barwienia z TTC, w podłożu LB. Objaśnienia: M-izolaty z plwociny od chorych z mukowiscydozą, BAL-izolaty z popłuczyn pęcherzykowooskrzelowych, BL-izolaty z krwi lub wymazów z ran chorych, U-izolaty z moczu, Kd, Km-szczepy kontrolne. Najbardziej skuteczną w ocenie wzrostu biofilmu okazała się metoda z użyciem barwnika MTT. Wartości absorbancji znalazły się w przedziale 0,2-4,0 OD. Można było obserwować dynamikę wzrostu szczepów zarówno wolno, średnio jak i szybko rosnących, w najdłuższym przedziale czasowym od 2-32 godzin (Ryc.3). Ryc.3. Dynamika wzrostu 20 szczepów P. aeruginosa tworzących biofilm, zaobserwowana przy wykorzystaniu metody barwienia z MTT, w podłożu LB. Objaśnienia: BAL-izolaty z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, U-izolaty z moczu, BL-izolaty z krwi lub wymazow z ran, M-izolaty z plwociny; Kd, Km-szczepy kontrolne. W metodzie z użyciem fioletu krystalicznego, w podłożu LB znaczny odsetek badanych szczepów (52% po 4 h i 30% po 7 h) osiągał maksymalne wartości absorbancji powyżej

6 248 A. Kalicińska, S. Tyski Nr 3 wartości 2,0 OD, natomiast w metodzie z TTC poniżej 0,2 OD (39% po 7 h, 22% po 24 h i po 48 h). Utrudniało to obserwację tempa wzrostu bakterii, ze względu na możliwość dokonania dokładnego pomiaru spektrofotometrycznego. Podobne zależności były obserwowane na pozostałych dwóch podłożach hodowlanych. W podłożu LB najmniejszy procentowy udział wartości poniżej 0,2 (0%) i powyżej 2,0 (8,7% po 4 h i 13% po 7h) obserwowano w metodzie z użyciem MTT, natomiast nie obserwowano takich wartości na podłożach BHI i TSB 2%glu. Metoda ta, dzięki wartościom mieszczącym się w odczytywalnym spektrofotometrycznie przedziale, pozwoliła obserwować formowanie się biofilmu w najdłuższym przedziale czasowym. Do kolejnego etapu wybrano podłoża LB i TSB 2%glu oraz metodę barwienia z użyciem MTT. Dokonano porównania wzrostu 153 szczepów P. aeruginosa. W oparciu o przedstawione poniżej wartości absorbancji, szczepy podzielono na wolno-, szybko- i średniorosnące. 0,17 A 554 < 0,50 szczepy wolno-rosnące 0,50 A 554 < 0,80 szczepy średnio-rosnące A 554 0,80 szczepy szybko-rosnące Porównując szczepy rosnące na podłożu LB według miejsca izolacji zaobserwowano, że dominowały szczepy średnio-rosnące i stanowiły największy odsetek, we wszystkich badanych grupach (M-41%, BL-44%, BAL-50%, U-61%) (Ryc.4). Jedynie w grupie szczepów izolowanych z plwociny obserwowano największy procentowy udział szczepów szybko-rosnących w porównaniu z pozostałymi grupami szczepów. Ryc.4. Porównanie tempa wzrostu biofilmów P. aeruginosa w podłożu LB, w zależności od materiału klinicznego, z którego izolat pochodził. Objaśnienia: BAL-izolaty z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, U-izolaty z moczu, BL-izolaty z krwi lub wymazow z ran, M-izolaty z plwociny. Podobny wzrost obserwowano wśród szczepów rosnących w podłożu TSB 2%glu (Ryc.5). W porównaniu do hodowli w podłożu LB, w przypadku szczepów pochodzących z BAL, U, BL - dominowały szczepy średnio rosnące (U-72%, BAL-68%, BL-61%). Tylko w grupie szczepów izolowanych z plwociny zanotowano największy udział szczepów wolno-rosnących (38%), w porównaniu z pozostałymi grupami szczepów, oraz szczepów szybko-rosnących (28%). Najmniejszy odsetek szczepów wolno-rosnących spośród badanych grup

7 Nr 3 Biofilm P. aeruginosa 249 Ryc.5. Porównanie tempa wzrostu biofilmów P. aeruginosa w podłożu TSB wzbogaconym 2% glukozą, w zależności od materiału klinicznego, z którego izolat pochodził. Objaśnienia: BAL-izolaty z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, U-izolaty z moczu, BL-izolaty z krwi lub wymazow z ran, M-izolaty z plwociny. zauważono w przypadku szczepów izolowanych z moczu (U-8%), podczas gdy na podłożu LB wykazano go u szczepów izolowanych z krwi lub wymazów z ran (BL-16%). DYSKUSJA Powszechnie stosowanymi pośrednimi metodami barwienia biofilmów są metody z użyciem fioletu krystalicznego czy safraniny, prowadzone na 96-dołkowych płytkach titracyjnych, oparte o odczyt spektrofotometryczny (12). Metody te są szeroko rozpowszechnione ze względu na czułość i prostotę wykonania pomiaru (5). Po zabarwieniu biofilmu wybranym barwnikiem, a następnie odpłukaniu płytki, dochodzi do usunięcia drobnoustrojów niezwiązanych z badaną powierzchnią. Jednakże fiolet krystaliczny oddziaływuje z negatywnie naładowanymi cząsteczkami, takimi jak kwasy nukleinowe i kwasy polisacharydowe (4), dlatego metoda ta pozwala obserwować całą masę wytworzonego biofilmu na powierzchni płytek titracyjnych, zarówno żywych komórek jak i wydzielanej przez nie substancji pozakomórkowej (5). Jak wynika z badań własnych, otrzymywane wysokie wartości absorbancji A 584 już po paru godzinach hodowli biofilmów szczepów P. aeruginosa uniemożliwiały dokładny odczyt spektrofotometryczny wyników i obserwację wzrostu tylko żywych komórek tworzących biofilm. Posługując się metodą z TTC możemy obserwować jedynie żywe komórki wchodzące w skład biofilmu (20). Mogą one być wykrywane, ponieważ w wyniku enzymatycznej redukcji tej substancji pod wpływem dehydrogenazy możemy obserwować kryształki formazanu, powodujące czerwone zabarwienie roztworu (8). Odczytywana spektrofotometrycznie gęstość optyczna roztworu formazanu jest wprost proporcjonalna do liczby żywych komórek tworzących biofilm. W przeprowadzonych badaniach w metodzie barwienia z TTC otrzymane wartości absorbancji były na niskim poziomie, co szczególnie uniemożliwiało obserwację szczepów wolno rosnących.

8 250 A. Kalicińska, S. Tyski Nr 3 Do oceny wzrostu biofilmów często używane są różne modyfikacje metody z użyciem MTT, pozwalające ocenić ilość wytwarzanego biofilmu (11, 20). Barwnik MTT, podobnie jak TTC oddziałuje ze składnikami szlaków biochemicznych żywych komórek. Jest to metoda, pozwalająca śledzić proces formowania się biofilmu przez bakterie o różnym tempie wzrostu. W przedstawionych wynikach dzięki wartościom absorbancji mieszczącym się w odczytywalnych spektrofotometrycznie przedziałach absorbancji, można było obserwować wzrost szczepów zarówno szybko-, średnio- jak i wolno rosnących. Użyte trzy metody barwienia, ze względu na otrzymywane wartości absorbancji, były wykonywane dla biofilmów o różnych czasach hodowli. Porównując dynamikę wzrostu poszczególnych szczepów, można było zauważyć, że tylko część szczepów szybko-, średnio-, wolno- rosnących w metodzie barwienia z MTT odpowiada tym samym szczepom barwionym metodą z użyciem TTC, natomiast w większości przypadków nie odpowiadają one szczepom barwionym fioletem krystalicznym. W metodzie barwienia z MTT hodowle były inkubowane razem z barwnikiem zawsze przez okres 2 godziny, podczas gdy w metodzie z TTC inkubacja trwała od 2 do 48 godzin, co może mieć wpływ na różnice w otrzymanych wartościach, w poszczególnych metodach. Jednym z czynników, które mogą warunkować zdolność bakterii do tworzenia biofilmu na powierzchniach abiotycznych jest dostępność składników odżywczych. Meier-Schneiders i wsp. wykazali, że dodatek glukozy do podłoża hodowlanego dla P. aeruginosa przyspieszał przyczepianie się komórek do powierzchni szkła (15). Podczas gdy z badań przeprowadzonych przez innych badaczy wynika, że skład pożywki nie wpływa na szybkość tworzonego biofilmu (1, 18, 19). We własnych badaniach szczepy hodowano w trzech podłożach: LB, BHI i TSB 2%glu. Szczepy rosły na podobnym poziomie, choć nieco większy wzrost bakterii zaobserwowano w podłożu TSB 2%glu. Ciekawą grupę stanowiły izolaty szczepów z plwociny chorych na mukowiscydozę. Tylko w tej grupie odnotowano największy procentowy udział szczepów wolno-rosnących, przy podobnym udziale pozostałych grup szczepów. Może być to związane ze zwiększoną produkcją śluzu przez te szczepy. Opracowanie czułych metod hodowli biofilmów stanowi ważne zagadnienie, pozwalające dokładniej poznać jego strukturę, właściwości oraz staje się pomocne w opracowaniu skutecznych metod eradykacji biofilmu. Otrzymane w pracy wyniki pozwoliły wyodrębnić grupę izolatów o dużej dynamice wytwarzania biofilmu oraz na wybór najbardziej optymalnych podłoży (LB, TSB 2%glu ) jak i metody hodowli biofilmów (MTT) tworzonych przez szczepy P. aeruginosa, co może być przydatne w badaniu skuteczności środków dezynfekujących i antyseptycznych w walce z biofilmem P. aeruginosa. Autorzy pracy składają serdeczne podziękowania za udostępnienie do badań szczepów P. aeruginosa panu dr hab. Janowi Patzerowi i pani dr Katarzynie Semczuk z Instytutu Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie-Międzylesiu.

9 Nr 3 Biofilm P. aeruginosa 251 A. Kalicińska, S. Tyski ANALYSIS OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA BIOFILM PRODUCTION IN RELATION TO CULTIVATION MEDIA AND BIOFILM STAINING METHODS. SUMMARY The aim of this study was to analyse P. aeruginosa biofilm growing in three media, using three methods of biofilm staining: with 2% crystal violet solution (CV), with 1% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride solution (TTC) and 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 diphenyl-2h-tetrazolium bromide (MTT). Using the method with MTT solution we could observe growth of strains forming biofilm both slowly or quickly. Achieved values of absorbation allow to observe dynamic of growing selected strains in the period of time. Among three groups of analysed strains, the biggest percentage of medium growing strains were achieved, while in the fourth group (strains isolated from spit of patients with cystic fibrosis) the biggest percentage of low growing strains was observed. Achieved results allow to select the strains quickly forming biofilm, the best media (LB, TSB 2%glu ) and method of biofilm staining (MTT), which will be used in the further studies. PIŚMIENNICTWO 1. Bagge D, Hjelm M, Johansen C i inni. Shewanella putrefaciens adhesion and biofilm formation on food processing surfaces. Appl Environ Microbiol 2001; 67: Barnes LM, Lo MF, Adams MR, Chamberline AHL. Effect of milk proteins on adhesion of bacteria to stainless steel surfaces. Appl Environ Microbiol 1999; 65: Bower CK, McGuire J, Daeschel MA. The adhezion and deatachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends Food Sci Technol 1996; 7: Burmølle M, Webb JS, Rao D, Hansen LH, i inni. Enhanced Biofilm Formation and Increased Resistance to Antimicrobial Agents and Bacterial Invasion Are Caused by Synergistic Interactions in Multispecies Biofilms. Applied Environ Microb 2006; 72: Burton E, Yakandawala N, LoVetri K, Madhyastha MS. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J Industrial Microbiol Biotechnol 2007; 34: Davey ME. Caiazza NC, O Toole GA. Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol 2003; 185: Flint SH, Brooks JD, Bremer PJ. Properties of the stainless steel substrate, influencing the adhesion of thermo-resistant streptococci. J Food ENG 2000; 43: Gabrielson J, Hart M, Jarelov A i inni. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. J Microbiol Methods 2002; 50: Gu JD, Belay B, Mitchell R. Protection of catheter surfaces from adhesion of Pseudomonas aeruginosa by a combination of silver ions and lecitins. World J Microbiol Biotechnol 2001; 17: Han Y, Sherman DM, Linton RH, Nielsen SS, Nielson PE. The effects of washing and chlorine dioxide gas on surrival and attachment of Escherichia coli O 157:H7 to green pepper surfaces. Food Microbiol 2000; 17: Kairo SK, Bedwell J, Tyler PC i inni. Development of a tetrazolium salt assay for rapid determination of viability of BCG vaccines. Vaccine 1999; 17:

10 252 A. Kalicińska, S. Tyski Nr Lembke C, Podbielski A, Hidalgo-Grass C i inni. Characterization of Biofilm Formation by Clinically Relevant Serotypes of Group A Streptococci., Appl Environ Microbiol 2006; 72(4): Lewis K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: Marshall KC. Biofilms: an overview of bacterial adhesion, activity, and control at surfaces. ASM News 1992; 58: Meier-Schneiders M, Busch C, Diekert G. The attachment of bacterial cells to surfaces under anaerobic conditions. Appl Microbiol Biotechnol 1993; 38: Mikucka A, Gospodarek E, Ulatowska B. Wpływ warunków hodowli na hydrofobowe właściwości pałeczek z rodzaju Serratia. Med Dośw Mikrobiol 2001; 52: Mueller RF. Bacterial transport and colonization in low nutrient environments. Wat Res 1996; 30: Peng J-S, Tsai W-C, Chou C-C. Surface characteristic of Bacillus cereus and its adhesion to the stainless steel.: Int J Food Microbiol 2001; 65: Trafny EA. Powstawanie biofilmu Pseudomonas aeruginosa i jego znaczenie w patogenezie zakażeń przewlekłych. Post Mikrobiol 2000; 39: Walencka E, Sadowska B, Różalska S, Hryniewicz W, Różalska B. Staphylococcus aureus biofilm as a target for single or repeated doses of oxacillin, vancomycin, linezolid. and/or lysostaphin. Folia Microbiologica 2006; 51: Otrzymano: 30 VI 2009 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Oczki 3, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej WUM