WPŁYW WŁAŚCIWOŚCI HYDROFOBOWYCH CANDIDA SP. NA ZDOLNOŚĆ WYTWARZANIA BIOFILMU NA POWIERZCHNI WYBRANYCH BIOMATERIAŁÓW

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Emilia Ciok Pater, Eugenia Gospodarek, Małgorzata Prażyńska, Tomasz Bogiel WPŁYW WŁAŚCIWOŚCI HYDROFOBOWYCH CANDIDA SP. NA ZDOLNOŚĆ WYTWARZANIA BIOFILMU NA POWIERZCHNI WYBRANYCH BIOMATERIAŁÓW Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Oceniono właściwości hydrofobowe 150 szczepów Candida sp. wykorzystując metody agregacji: w soli (SAT) i w p-ksylenie (MATH). Zdolność wytwarzania biofilmu oceniano metodą redukcji TTC na 5 biomateriałach: lateksie silikonowanym, polichlorku winylu, polistyrenie, nylonie oraz polimetakrylanie metylu. Stwierdzono zależność między właściwościami hydrofobowymi drożdży a zdolnością wytwarzania biofilmu. W ostatnich latach odnotowuje się wzrost częstości występowania zakażeń szpitalnych wywoływanych przez drożdże z rodzaju Candida. Zakażenia te związane są, między innymi, ze zdolnością Candida sp. do wytwarzania biofilmu na powierzchni różnych, używanych w medycynie biomateriałów, stanowiąc poważny problem terapeutyczny, ze względu na oporność biofilmu na obecnie stosowane antymikotyki. W procesie zakażenia hydrofobowe właściwości komórek grzybów uważane są za jedną z cech warunkujących ich chorobotwórczość (5, 11). Właściwości hydrofobowe drobnoustrojów to niespecyficzny czynnik warunkujący ich adhezję do komórek gospodarza oraz do powierzchni biomateriałów. Celem pracy była ocena wpływu właściwości hydrofobowych drożdży Candida sp. na zdolność wytwarzania biofilmu na powierzchni wybranych biomateriałów. MATERIAŁ I METODY Badaniem objęto 150 szczepów Candida sp.: 66 izolowanych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy, 50 - ze 107 Szpitala Wojskowego z Przychodnią Samodzielnego Publicznego Zakładu Opieki Zdrowotnej w Wałczu, 18 - ze Szpitala Wojewódzkiego we Włocławku oraz 16 - z Kujawsko Pomorskiego Centrum Pulmonologii w Bydgoszczy. Szczepy te izolowano w latach z próbek materiału klinicznego pobranych od pacjentów hospitalizowanych (126 szczepów) i leczonych ambulatoryjnie (24 szczepy).

2 268 E. Ciok-Pater i inni Nr 3 W celu oceny przynależności gatunkowej drożdże wysiewano na agar Sabourauda (bio- Mérieux) i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37 C. Identyfikację szczepów Candida sp. przeprowadzono z zastosowaniem testu filamentacji, testu API Candida (biomérieux) oraz w oparciu o morfologię kolonii na podłożu chromogennym ID CAN 2 (biomérieux). Przynależność gatunkową badanych szczepów przedstawiono na rycinie 1. C. lipolytica C. kefyr C. guilliermondii C. famata C. lusitaniae C. krusei C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis 0,7% 0,7% 1,3% 4,0% 5,3% 5,3% 8,0% 8,7% 9,3% C. albicans 56,7% 0,0% 20,0% 40,0% 60,0% Ryc. 1. Przynależność gatunkowa badanych szczepów Candida sp. (n=150) Właściwości hydrofobowe (Cell Surface Hydrophobicity, CSH) drożdży oceniano metodą agregacji w soli (Salt Aggregation Test, SAT) (4) i metodą agregacji w p ksylenie (Microbe Adhesion to Hydrocarbon Test, MATH) (8). Właściwości hydrofobowe powierzchni drożdży oceniano w metodzie SAT wizualnie przyjmując trzystopniową skalę: szczepy o właściwościach; bardzo silnie hydrofobowych agregacja szczepów w PBS; silnie hydrofobowych agregacja w stężeniach: 0,1 1,6 M (NH 4 ) 2 SO 4 ; hydrofilowych agregacja lub jej brak w stężeniach powyżej 1,8 M (NH 4 ) 2 SO 4. Intensywność reakcji w metodzie MATH CSH określano w odsetkach według wzoru: OD 570 początkowej zawiesiny drożdży x 100% OD 570 początkowej zawiesiny drożdży - OD 570 po wytrząsaniu zawiesiny grzybów z p ksylenem Szczepy podzielono na: bardzo silnie hydrofobowe, jeżeli otrzymana wartość wynosiła powyżej 50%; silnie hydrofobowe, jeżeli otrzymana wartość wynosiła 20-50%; hydrofilowe, jeżeli otrzymana wartość była poniżej 20%. Ocenę tworzenia biofilmu przez badane szczepy prowadzono stosując własną modyfikację metody (hodowle delikatnie wytrząsano przez dwie pierwsze z 72 godzin inkubacji) opisanej przez Richardsa i wsp. (wg 9), na 5 biomateriałach: lateksie silikonowanym (RÜSCH), polichlorku winylu (GALMED), polistyrenie (Medlab-Products), nylonie

3 Nr 3 Hydrofobowe właściwości Candida sp. 269 (DAMEN) oraz polimetakrylanie metylu (Zhermack). Zdolność wytwarzania biofilmu na każdym z badanych biomateriałów oceniano w umownej, czterostopniowej skali: bardzo silna, silna, słaba i brak. Do obliczeń statystycznych w pracy zastosowano z-test porównujący wartości średnie w dwóch grupach o dużej liczebności (n>50). Przy weryfikacji hipotez przyjęto poziom istotności p=0,05. WYNIKI Wśród 150 szczepów Candida sp. hydrofobowe właściwości wykazano u 60 (40,0%). Zdolność wytwarzania biofilmu na wybranych biomateriałach przedstawiono w tabeli I. Tabela I. Wytwarzanie biofilmu na wybranych biomateriałach przez hydrofobowe (n=60) i hydrofilowe (n=90) szczepy Candida sp. Biomaterial Lateks silikonowany Polichlorek winylu Polistyren Nylon Polimetakrylan metylu Szczepy tworzące biofilm (n=150) Tworzenie biofilmu przez szczepy hydrofobowe (n=60) Bardzo silne Silne Słabe Ogółem Bardzo silne (38,7%) (20,0%) (20,0%) (18,3%) (58,3%) (39,3%) (18,3%) (33,3%) (10,0%) (61,7%) (35,3%) (13,3%) (20,0%) (23,3%) (56,7%) (30,7%) (16,7%) (6,7%) (25,0%) (48,3%) (40,0%) (40,0%) (18,3%) (3,3%) (61,7%) Tworzenie biofilmu przez szczepy hydrofilowe (n=90) 6 (6,7%) 4 (4,4%) 2 (2,2%) 3 (3,3%) 11 (12,2%) Silne Słabe Ogółem 5 (5,6%) 7 (7,8%) 4 (4,4%) 5 (5,6%) 9 (10,0%) (13,3%) (25,6%) (12,2%) (24,4%) (14,4%) (21,1%) 9 17 (10,0%) (18,9%) 2 22 (2,2%) (24,4%) Szczepy Candida sp. o właściwościach hydrofobowych statystycznie częściej niż o właściwościach hydrofilowych, wytwarzały biofilm na powierzchni lateksu silikonowanego, odpowiednio: 35 (58,3%) i 23 (25,6%) szczepy (z=4,15, p<0,0001), polichlorku winylu - 37 (61,7%) i 22 (24,4%) szczepy (z=5,11, p<0,0001), polistyrenu 34 (56,7%) i 19 (21,1%) szczepów (z=4,59, p<0,0001), nylonu 29 (48,3%) i 17 (18,9%) szczepów (z=3,42, p<0,0001) oraz na powierzchni polimetakrylanu metylu 37 (61,7%) i 22 (24,4%) szczepy (z=4,78, p<0,0001). DYSKUSJA Biofilm stał się poważnym problemem współczesnej medycyny. Zakażenia z jego udziałem sprawiają trudności terapeutyczne związane z opornością na stosowane leki. Zdolność grzybów z rodzaju Candida do wytwarzania biofilmu na powierzchni różnych

4 270 E. Ciok-Pater i inni Nr 3 biomateriałów stosowanych w medycynie została udowodniona w licznych publikacjach (1, 2, 6, 7, 10, 12). W niniejszej pracy badano wpływ właściwości hydrofobowych szczepów Candida sp. na zdolność wytwarzania biofilmu. Szczepy hydrofobowe statystycznie częściej wytwarzały biofilm na powierzchni wszystkich badanych biomateriałów. Szczepy C. kefyr i C. lipolytica, u których nie stwierdzono wytwarzania biofilmu posiadały właściwości hydrofilowe powierzchni komórek. Stwierdzono statystycznie istotną zależność między właściwościami hydrofobowymi badanych grzybów, a ich zdolnością wytwarzania biofilmu na powierzchni badanych biomateriałów. Podobne wyniki uzyskali Li i wsp. (3). Badacze stwierdzili wpływ właściwości hydrofobowych na zdolność wytwarzania biofilmu na powierzchni polistyrenu przez szczepy C. albicans. Przedstawione wyniki badań własnych świadczą o zdolności wytwarzania biofilmu przez drożdże z rodzaju Candida. Stwierdzono zależność między właściwościami hydrofobowymi powierzchni komórek badanych szczepów, a zdolnością wytwarzania biofilmu. WNIOSKI 1. Drożdże Candida sp. o właściwościach hydrofobowych statystycznie częściej niż szczepy hydrofilowe wytwarzają biofilm na powierzchni badanych biomateriałów. 2. Właściwości hydrofobowe grzybów z rodzaju Candida mogą mieć znaczenie w wytwarzaniu biofilmu w zakażeniach u chorych, u których stosowane są biomateriały. E. Ciok Pater, E. Gospodarek, M. Prażyńska, T. Bogiel THE INFLUENCE OF CELL SURFACE HYDROPHOBICITY CANDIDA SP. ON BIOFILM FORMATION ON DIFFERENT BIOMATERIALS SUMMARY The ability of yeasts to form biofilm is believed to play an important role in patomechanism of fungal infection. Candida sp. is considered to form biofilm on surfaces of biomaterials used in production of catheters, drains and prosthesis. Therefore this may lead to serious problems in patients with biomaterials used for diagnostic or therapeutic purposes. The aim of the study was to evaluate the influence of cell surface hydrophobicity (CSH) of Candida sp. on biofilm formation on different biomaterials. CSH was evaluated by two methods: Salt Aggregation Test (SAT) and Microbe Adhesion to Hydrocarbon Test (MATH). Biofilm formation on different biomaterials was measured by Richard s method after 72 hour incubation at 37ºC. Candida biofilm formation occurred more frequently in case of strains exhibiting hydrophobic than hydrophilic properties of cell surface. The statistically significant correlation between CSH and ability of biofilm formation on different biomaterials was observed (p<0,05).

5 Nr 3 Hydrofobowe właściwości Candida sp. 271 PIŚMIENNICTWO 1. Bizerra FC, Nakamura CV, de Poersch C i inni. Characteristics of biofilm formation by Candida tropicalis and antifungal resistance. FEMS Yeast Res 2008; 8: Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK i inni. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development architecture and drug resistance. J Bacteriol 2001; 183: Li X, Yan Z, Xu J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiology 2003; 149: Lindahl M, Faris A, Wadström T, Hjertén S. A new test based on salting out to measure relative surface hydrophobicity of bacterial cells. Biochim Biophys Acta 1981; 677: Macura AB. Mechanizmy determinujące patogenność grzybów z rodzaju Candida. Przegl Dermatol 1994; 81: Ramage G, Martinez JP, López-Ribot JL. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem. FEMS Yeast Res 2006; 6: Ramage G, Saville SP, Thomas DP, López-Ribot J. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell 2005; 4: Rosenberg M, Doyle RJ. Microbial cells surface hydrophobicity. American Society for Microbiology. 1st ed. Washington, DC Różalska B, Sadowska B, Więckowska M, Rudnicka W. Wykrywanie biofilmu bakteryjnego na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50: Shin JH, Kee SJ, Shin MG i inni. Biofilm production by isolates of Candida species recovered from nonneutropenic patients: comparison of bloodstream isolates with isolates from other sources. J Clin Microbiol 2002; 40: Szymankiewicz M, Janicka G, Sieradzka E, Krawiecka D. Ocena produkcji śluzu i właściwości hydrofobowych u wybranych grzybów z rodzaju Candida. Prog Med Res 2003; 1: Vinithia M, Ballal M. Biofilm as virulence marker in Candida isolated from blood. World J Med Sci 2007; 2: Otrzymano: 16 VII 2009 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium im. Rydygiera w Bydgoszczy, UMK w Toruniu

6