X. Pałeczki Gram-dodatnie. Rodzaje: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus

Transkrypt

1 X. Pałeczki Gram-dodatnie. Rodzaje: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus Gramujemne pałeczki auksotroficzne. Rodzaj: Haemophilus, Brucella, Legionella Ćwiczenie 1. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie II. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia. preparat bawiony metodą Grama z Corynebacterium pseudodiphtheriticum Opis preparatu: preparat bawiony metodą Grama z Lactobacillus spp. Opis preparatu: preparat bawiony metodą Neissera z. Opis preparatu:

2 Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) rodzaj drobnoustroju: Corynebacterium pseudodiphtheriticum typ hemolizy morfologia kolonii... rodzaj drobnoustroju: typ hemolizy morfologia kolonii... Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych szczepów maczugowców a. wykonanie próby na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie III. Fizjologia bakterii Szczep badany obserwowane wyniki.. wnioski b. oznaczanie zdolności do redukcji azotanów

3 Zasada metody: Badanie wykrywa zdolność wytwarzania przez bakterie reduktazy azotanowej. W wyniku jej działania drobnoustroje przekształcają jony azotanowe w azotynowe. Dodanie do hodowli odczynnika Griessa( kwas sulfanilowy: α-naftyloamina w kwasie octowym) powoduje, że zachodzi w roztworze reakcja diazowania kwasu sulfanilowego jonami azotynowymi, której produktem jest związek diazowy o barwie ceglastoczerwonej. Wykonanie: 1. Badanie wykonuje się na bulionie z dodatkiem azotanu potasu. 2. Po 24 godzinnej inkubacji do hodowli dodaje się odczynnika Griessa. Czerwonoceglaste zabarwienie hodowli świadczy o redukcji azotanów. obserwowane wyniki próba dodatnia próba ujemna c. Wytwarzanie zdolności do wytwarzania ureazy Enzymatyczny rozkład mocznika przez bakterie powoduje powstanie NH 3 i CO 2. Powstający NH 3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę zabarwienia z żółtej na różowo-amarantową. 1. Podłoże zawierające 2% mocznika zaszczepić badanym szczepem. 2. Całość inkubować w 37 0 C godzin. 3. Odczytać wynik. obserwowane wyniki próba dodatnia próba ujemna d. Ocena zdolności utleniania/fermentacji glukozy, maltozy, sacharozy Badanie zdolności sacharolitycznych bakterii wykonuje się na podłożu zawierającym surowicę końską, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, cystynę, 1% glukozy i czerwień fenolową. Kwaśny rozkład węglowodanów powoduje zmianę ph środowiska i zmianę zabarwienia z czerwonego na żółte. 1. Podłoże zawierającego 1% glukozy lub maltozy lub sacharozy zaszczepić badanym szczepem 2. Całość inkubować w 37 0 C godzin. 3. Odczytać wynik. obserwowane wyniki próba dodatnia próba ujemna

4 Ćwiczenie 4. Identyfikacja szczepów Corynebacterium spp. przy użyciu testu API Coryne Odczyt testu Po inkubacji do mikroprobówek NIT, PYZ, PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag dodać odpowiednie odczynniki wg schematu: 1. Test NIT po kropli NIT1 i NIT2 2. Test PYZ 1 kropla PYZ 3. Testy PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag po kropli ZYM A i ZYM B Odczytać wyniki wg załączonej tabeli.

5 Ćwiczenie 5. Różnicowanie szczepów Corynebacterium spp. na podstawie wybranych cech biochemicznych 1-redukcja azotanów, 2- wytwarzanie ureazy, 3- O/F glukozy, 4-rozkład maltozy, 5- rozkład sacharozy Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium ulcerans Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium urealyticum

6 Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Listeria monocytogenes a. Próba na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie III. Fizjologia bakterii Szczep badany.. wnioski obserwowane wyniki b. Hydroliza eskuliny morfologia kolonii... c. Wzrost w temperaturze 4 0 C Materiał kliniczny miesza się proporcji 1:10 z bulionem i umieszcza w temp. 4 0 C. Pałeczki Listeria mnożą się w niskich temperaturach d. Test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC wytwarzający hemolizę β. 2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować przez godzin w temperaturze 35 0 C. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca.

7 Staphylococcus aureus ATCC Szczep badany Wnioski..... e. Ocena zdolności hemolitycznych na podłożu agarowym z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej typ hemolizy morfologia kolonii... Listeria monocytogenes ruch + typ hemolizy katalaza wzrost w 4 0 C hydroliza eskuliny test CAMP

8 Ćwiczenie 7. Wykonanie i ocena preparatu mikroskopowego Haemophilus influenzae barwionego metodą Grama Opis preparatu: Ćwiczenie 8. Zasady hodowli i ocena wzrostu Haemophilus influenzae na podłożach stałych a. Agar czekoladowy H. influenzae rośnie najlepiej na płytkach przygotowanych przez dodanie erytrocytów do płynnego agaru w temperaturze 80ºC i utrzymywanie w temperaturze 50 C przez około 15 minut. Łagodne ogrzewanie erytrocytów powoduje uwalnianie czynnika X - protoporfiryna IX (hematyna), prekursor heminy i czynnika V - nikotynamidoadenozynodifosforan (NAD). Oba te czynniki są niezbędne do wzrostu H. influenzae. Tylko świeżo przygotowany agar czekoladowy umożliwia wzrost H. influenzae, ponieważ czynnik V jest niestabilny i z czasem jest degradowany. Agar czekoladowy... b. Mueller-Hinton II Agar lub Tryptic Soy Agar Po posianiu materiału należy nałożyć krążek BXV (bacytracyna, czynnik wzrostu X i V). Bacytracyna hamuje większość drobnoustrojów, jednocześnie nie wpływając na intensywność wzrostu pałeczek z rodzaju Haemophilus. W strefie obecności czynników X i V (wokół krążka) wzrastają kolonie pałeczek z rodzaju Haemphilus. Trzeba jednak zawsze sprawdzić, czy wyrosłe przy krążku kolonie to drobne pałeczki Gramujemne.

9 Podłoże Tryptic Soy Agar... Ćwiczenie 8. Różnicownie szczepów Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae Pałeczki z rodzaju Haemophilus wymagają do wzrostu obecności czynnika V i/lub czynnika X. To zapotrzebowanie pozwala na ich różnicowanie w obrębie rodzaju i precyzyjne określenie przynależności do gatunku. W badaniach stosuje się krążki diagnostyczne o średnicy 9 mm nasycone; BV - czynnikiem V + bacytracyna B (a' 2j bacytracyny w krążku), BX - czynnikiem X + bacytracyna B (a' 2j bacytracyny w krążku). W celu przeprowadzenia różnicowania pałeczek z rodzaju Haemophilus należy zastosować wystandaryzowane, zgodnie z zaleceniami NCCLS podłoże Mueller-Hinton II Agar. Doprowadzić płytki do temperatury pokojowej. Czystą hodowlę szczepu Haemophilus (np. kolonie wyrosłe wokół krążka BVX przy posiewie materiału klinicznego na podłoże Mueller-Hintona II) zawiesić w roztworze 0,9% NaCI, tak aby uzyskać zawiesinę o gęstości około 0,5 McFarlanda. Przygotowaną zawiesinę posiać jałowym wacikiem i nałożyć krążki diagnostyczne BV i BX w odległości około mm od siebie posiany materiał inkubować w temperaturze 35 C, przez godzin, w atmosferze 5-7% CO 2....

10 Interpretacja wyników i wnioski Ćwiczenie 9. Diagnostyka mikrobiologiczna oparta na teście API NH

11 Wnioski :. Ćwiczenie 10. Badanie lekowrażliwości Haemophilus influenzae... Wnioski:.