Wytwarzanie śluzu pozakomórkowego, a adhezja pałeczek Morganella morganii do polistyrenu

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Anna Michalska, Patrycja Zalas-Więcek, Barbara Sielska, Eugenia Gospodarek Wytwarzanie śluzu pozakomórkowego, a adhezja pałeczek Morganella morganii do polistyrenu Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK Oceniono zdolność wytwarzania śluzu pozakomórkowego oraz adhezji do polistyrenu pałeczek Morganella morganii. Badaniem objęto 50 szczepów. Pięć (10,0%) z nich wytwarzało śluz pozakomórkowy. Zdolność adhezji do polistyrenu wykazało 36 (72,0%) szczepów, w tym silnie adherowało 6 szczepów (12,0%), średnio - 12 (24,0%), a słabo 18 (36,0%). Adhezja bakterii do powierzchni sztucznych (w tym biomateriałów) jest procesem złożonym, zależnym od wielu czynników fizycznych i chemicznych, m.in. od substancji wytwarzanych pozakomórkowo integralnie związanych z komórką bakteryjną, takich jak polisacharyd śluzu (1, 10). M. morganii to Gram-ujemna pałeczka należąca do drobnoustrojów oportunistycznych. Opisano wiele przypadków zakażeń z udziałem tych pałeczek (2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 17, 18, 19, 21). Najczęściej izolowano je od chorych z zakażeniami układu moczowego, bakteriemią (sepsą) oraz z zakażeniami ran pooperacyjnych (9, 12). M. morganii była również izolowana z biomateriałów (dane niepublikowane), dlatego postanowiono ocenić zdolność adhezji pałeczek M. morganii do polistyrenu (polimeru używanego w badaniach nad adhezją drobnoustrojów) oraz zdolność wytwarzania śluzu pozakomórkowego. MATERIAŁ I METODY Szczepy. Przedmiot badań stanowiło 50 szczepów M. morganii pochodzących z materiału klinicznego, izolowanych w latach w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr A. Jurasza w Bydgoszczy, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (SU CM UMK). Każdy szczep pochodził od innego chorego. Przechowywanie szczepów. Szczepy przechowywano w temperaturze -80 C w płynnym podłożu tryptozowo-sojowym (Tryptic Soy Broth, TSB, Becton Dickinson) z dodatkiem 15% glicerolu (Polskie Odczynniki Chemiczne, POCH).

2 30 A. Michalska i inni Nr 1 I d e n t y f i k a c j a. Identyfikację szczepów M. morganii do gatunku przeprowadzono na podstawie oceny morfologii kolonii na podłożu Mac Conkey Agar (MCA) (Becton Dickinson) oraz wyników reakcji biochemicznych ujętych w testach ID 32E (biomérieux). Ocena zdolności adhezji pałeczek M. morganii do polistyrenu. Ocenę adhezji pałeczek M. morganii do polistyrenu wykonywano stosując metodę opisaną przez Christensena i wsp. (5) w modyfikacji własnej. Rozszerzono kryterium oceny adhezji, wprowadzając czterostopniowe (brak, słaba, średnia, silna) zamiast kryterium trzystopniowego (brak, słaba, silna). Szczepy pałeczek M. morganii hodowano na podłożu MCA w temperaturze 37 C przez 20 godzin. Uzyskaną hodowlę wprowadzano do podłoża TSB tak, by uzyskać zawiesinę bakterii o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda. Następnie do trzech kolejnych studzienek 96-dołkowych, okrągłodennych sterylnych płytek titracyjnych (Medlab) wprowadzano po 150 μl otrzymanej zawiesiny bakteryjnej. Hodowle inkubowano przez 20 godzin w temperaturze 37 C, następnie usuwano zawiesiny bakterii, a płytki przemywano trzykrotnie jałowym 0,01 M buforowanym roztworem soli fizjologicznej (Phosphate Buffered Saline, PBS) o ph 7,2. Przyległe bakterie utrwalano 96% alkoholem etylowym (POCH) przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie barwiono przez 5 minut roztworem fioletu krystalicznego (POCH). Nadmiar barwnika usuwano przez płukanie płytek wodą wodociągową, do uzyskania bezbarwnych popłuczyn. Po wysuszeniu płytek w temperaturze pokojowej dokonywano odczytu gęstości optycznej (Optical Density, OD) zaadherowanych komórek bakteryjnych w wielodetekcyjnym czytniku mikropłytek Synergy HT (BIO-TEK) przy długości fali λ = 570 nm. Ocenę adhezji przeprowadzano trzykrotnie dla każdego szczepu, a wyniki uśredniano. Jako kontrolę stosowano jałowe podłoże TSB wprowadzane do dołków płytek titracyjnych, poddawane inkubacji tak, jak w przypadku hodowli bakteryjnej. Na podstawie średniej odczytów OD dla dołków płytki kontrolnej powiększonej o trzy odchylenia standardowe, w stosunku do badanych szczepów M. morganii zastosowano następujące kryteria adhezji: brak adhezji OD < 0,214; słaba adhezja OD > 0,214 i 0,321; średnia adhezja > 0,321 i 0,428; silna adhezja OD > 0,428. Ocena wytwarzania pozakomórkowego śluzu przez szczepy M. morganii. Do oceny wytwarzania pozakomórkowego śluzu przez badane szczepy M. morganii posłużono się metodą Ishiguro i wsp. (10) w modyfikacji własnej. Z 20-godzinnej hodowli badanych szczepów prowadzonej w temperaturze 37ºC w podłożu TSB uzyskiwano osad (przez odwirowanie hodowli przy 4500 RPM (Routs Per Minute) przez 10 minut), który następnie przemywano dwukrotnie jałowym 0,01 M roztworem PBS (ph 7,2) i zawieszano do gęstości 2 według skali MacFarlanda. W jałowych probówkach typu Eppendorf umieszczano 500 μl uzyskanej zawiesiny i dodawano taką samą objętość roztworu czerwieni Congo (Congo Red, Sigma) o stężeniu 15 μg/ml. Mieszaninę wytrząsano przez 5 minut (1400 RPM), a następnie wirowano przy RPM przez 10 minut. Uzyskany supernatant umieszczano w studzienkach okrągłodennych, jałowych płytek 96-dołkowych i mierzono jego OD w wielodetekcyjnym czytniku mikropłytek Synergy HT, przy długości fali λ = 480 nm. Odczytu dokonywano względem próby zerowej, którą stanowiła mieszanina 500 μl PBS z taką samą objętością roztworu czerwieni Congo. Doświadczenie powtarzano trzykrotnie dla każdej z prób, a otrzymane wyniki uśredniano.

3 Nr 1 Adhezja M. morganii do polistyrenu 31 W celu obiektywizacji uzyskanych wyników równolegle prowadzono pomiar OD zawiesin bakteryjnych stosowanych w doświadczeniu. Otrzymane wyniki wiązania czerwieni Congo przeliczono na jedną jednostkę OD tych zawiesin. WYNIKI Ocena zdolności adhezji pałeczek M. morganii do polistyrenu. Wyniki oceny adhezji pałeczek M. morganii do polistyrenu przedstawiają ryciny 1 i 2. Spośród 50 przebadanych szczepów zdolność adhezji do polistyrenu wykazywało 36 szczepów (72,0%), 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 72,0% 30,0% 20,0% 10,0% 28,0% 0,0% Szczepy adherujące n= 36 Szczepy nieadherujące n= 14 Ryc. 1. Adhezja do polistyrenu pałeczek M. morganii (n= 50) 40,0% 35,0% 30,0% 25,0% 20,0% 36,0% 15,0% 24,0% 28,0% 10,0% 5,0% 12,0% 0,0% Silnie adherujące n= 6 Średnio adherujące n= 12 Słabo adherujące n= 18 Nieadherujące n= 14 Ryc. 2. Adhezja do polistyrenu pałeczek M. morganii (n= 50) z uwzględnieniem stopnia adhezji

4 32 A. Michalska i inni Nr 1 w tym silnie adherowało 6 szczepów (12,0%), średnio - 12 (24,0%), a słabo - 18 (36,0%) szczepów. Szczepy adherujące do polistyrenu najczęściej pochodziły z: wymazu z ran (16,0-44,4% szczepów) i z moczu (5,0-13,9% szczepów) (Tabela I). Tab. I. Pochodzenie adherujących do polistyrenu szczepów M. morganii (n= 36) z uwzględnieniem stopnia adhezji Rodzaj materiału Szczepy silnie adherujące (n= 6) Szczepy średnio adherujące (n= 12) Szczepy słabo adherujące (n= 18) Ogółem (n= 36) Wymaz z ran 3* 50,0** 5 41,7 8 44,4 16 Mocz ,0 2 11,1 5 Popłuczyny oskrzelowopęcherzykowe 1 16, ,1 3 Wymaz z odleżyny , Krew ,7 3 Inny materiał 2 33,3 1 8,3 3 16,7 6 * - liczba szczepów ** - odsetek szczepów [%] Zdolność adhezji do polistyrenu posiadały szczepy M. morganii pochodzące z: Kliniki Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Oddziałem Anestezjologii i Intensywnej Terapii Dziecięcej - 7 (19,4%) szczepów, Kliniki Chirurgii Ogólnej i Naczyń - 6 (16,7%) szczepów oraz Kliniki Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej 3 (8,3%) szczepy. Ocena zdolności wytwarzania pozakomórkowego śluzu. Wyniki oceny wytwarzania śluzu pozakomórkowego przedstawiono na rycinie 3. Zdolność wytwarzania 90,0% 75,0% 60,0% 45,0% 90,0% 30,0% 15,0% 4,0% 6,0% 0,0% Szczepy wytwarzajace śluz n= 2 Szczepy słabo wytwarzajace śluz n= 3 Szczepy nie wytwarzajace śluzu n= 45 Ryc. 3. Zdolność wytwarzania pozakomórkowego śluzu przez szczepy M. morganii (n= 50)

5 Nr 1 Adhezja M. morganii do polistyrenu 33 pozakomórkowego śluzu wykazało tylko 5 (10,0%) szczepów. Szczepy wytwarzające śluz pochodziły z: wymazu z ran - 2 (4,0%) szczepy i po jednym (2,0%) szczepie z krwi, moczu i ropy. DYSKUSJA Jednym z ważniejszych czynników wirulencji drobnoustrojów odgrywającym ważną rolę w patogenezie zakażeń jest adhezja do powierzchni ożywionych i nieożywionych. Zjawisko adhezji drobnoustrojów jest procesem aktywnie przebiegającym i wykazującym dużą złożoność (16). Na podstawie wyników badań własnych stwierdzono, że zdolność adhezji do polistyrenu wykazywało 36 (72,0%) szczepów M. morganii. Spośród szczepów adherujących najwięcej pochodziło od chorych leczonych w Klinice Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Oddziałem Anestezjologii i Intensywnej Terapii Dziecięcej, Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej oraz Klinice Chirurgii Ogólnej i Naczyń. Szczepy adherujące do polistyrenu najczęściej pochodziły z: wymazu z ran - 16 (44,4%) i z moczu - 5 (13,9%). W dostępnym piśmiennictwie brakuje prac, których autorzy ocenialiby właściwości adhezyjne pałeczek Morganella sp. i zwróciliby uwagę na pochodzenie szczepów wykazujących te właściwości. W badaniach przeprowadzonych przez Michalską (13) dotyczących właściwości adhezyjnych pałeczek rodzaju Enterobacter sp. wykazano, że zdolność adhezji do polistyrenu posiadało 25,7% szczepów. Szczepy te były najczęściej izolowane z moczu (40,1%) oraz wymazu z ran (20,0%). Pochodziły one od chorych leczonych w Klinice Chirurgii Ogólnej i Naczyń (20,0%) oraz Klinice Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Oddziałem Anestezjologii i Intensywnej Terapii Dziecięcej (15,7%). Przypuszczalnie może to mieć związek ze stosowaniem u tych pacjentów cewników moczowych i naczyniowych oraz inwazyjnych procedur diagnostycznych i leczniczych. Adhezja jest procesem zależnym od wielu czynników fizycznych i chemicznych, m.in. od substancji wytwarzanych pozakomórkowo integralnie związanych z komórką bakteryjną, takich jak polisacharyd śluzu (1,7). Stosując do oceny wytwarzania śluzu pozakomórkowego przez pałeczki M. morganii metodę wiązania czerwieni Congo stwierdzono, że właściwość tą wykazuje 5 (10,0%) szczepów. W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono prac, których autorzy podjęli temat zdolności wytwarzania pozakomórkowego śluzu u pałeczek Morganella sp. Wśród pałeczek Enterobacteriaceae zdolność tę wykazano m. in. u pałeczek Enterobacter sp. (13) i E. coli (22), a wśród innych drobnoustrojów również u Staphylococcus sp. (20) i Enterococcus sp. (8). Michalska (13) badając szczepy Enterobacter sp. uzyskała 26,7% szczepów wytwarzających śluz. Türkyilmaz i Eskiizmirlier (20) oceniając tę właściwość wśród szczepów Staphylococcus sp. wykazali, że 74,4% szczepów gronkowców koagulazo- -dodatnich posiadało tę cechę, natomiast wśród CNS tylko 36,6% szczepów. Donelli i wsp. (8) oceniali wytwarzanie śluzu u 13. szczepów Enterococcus faecalis i 9. E. faecium. Spośród badanych enterokoków 10 (47%) wykazywało silną zdolność wytwarzania śluzu pozakomórkowego, w tym 9 szczepów E. faecalis i jeden E. faecium. Uzyskane wyniki badań nasunęły wniosek o braku korelacji pomiędzy wytwarzaniem śluzu pozakomórkowego, a adhezją do polistyrenu pałeczek M. morganii. Zalas-Więcek i wsp. (22) badając szczepy E. coli izolowane z moczu i krwi stwierdzili, że szczepy nie-

6 34 A. Michalska i inni Nr 1 adherujące do polistyrenu wytwarzały więcej materiału pozakomórkowego niż szczepy adherujące. Podobne wyniki uzyskał Deptuła (7), który stwierdził brak związku pomiędzy wynikami uzyskanymi w ocenie wiązania czerwieni Congo, a adhezją do polistyrenu w grupie wielolekoopornych i wielolekowrażliwych szczepów Pseudomonas aeruginosa. Z kolei Nayak i wsp. (14) prowadząc badania nad szczepami gronkowca naskórkowego wykazali, że 47 (78,0%) spośród 57. adherujących szczepów posiadało zdolność wytwarzania śluzu pozakomórkowego. Cechę tę posiadało natomiast tylko 12 (16,0%) z 75 nieadherujących szczepów. Wyjaśnienie podłoża zjawiska wytwarzania śluzu pozakomórkowego oraz jego udziału w procesie adhezji bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych do powierzchni ożywionych i nieożywionych wymaga dalszych badań. A. Michalska, P. Zalas-Więcek, B. Sielska, E. Gospodarek Extracellular slime production and adhesion of Morganella morganii strains to polystyrene SUMMARY The aim of this study was the evaluation of the ability of extracellular slime production and adhesive properties of M. morganii strains. This study included 50 of M. morganii strains isolated from clinical samples. All of these strains were isolated in the Clinical Microbiology Department of dr. A. Jurasz University Hospital in Five (10,0%) out of 50. M. morganii strains demonstrated extracellular slime production. Adherence to polystyrene revealed 36 (72,0%) of M. morganii strains in it 6 strains (12,0%) adhered strongly, medium - 12 (24,0%) and weakly - 18 (36,0%). PIŚMIENNICTWO 1. Bartoszewicz M, Nowicka J, Rygiel A, Karoń J. Fenotypowa charakterystyka gronkowców koagulazo-ujemnych izolowanych z ran od pacjentów hospitalizowanych na oddziale oparzeniowym i chirurgii urazowej. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: Bilgin SS, Olcay SE, Demirtas AM. Complication of felon caused by Morganella morganii; case report. J Ankara Med School 2003; 25: Cetin M, Ocak S, Kuvandik G, i inni. Morganella morganii-associated arthritis in a diabetic patient. Adv Ther 2008; 25: Choua CY, Liangb PC, Chena CA, Leea CN. Cervical abscess with vaginal fistula after extraperitoneal cesarean section. J Formos Med Assoc 2007; 106: Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ i inni. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates a quantitative model for adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol 1985; 22: Del Pozo J, García-Silva J, Almagro M i inni. Ecthyma gangrenosum-like eruption associated with Morganella morganii infection. Br J Dermatol 1998; 139: Deptuła A. Wielolekowrażliwe i wielolekooporne szczepy Pseudomonas aeruginosa porównanie wybranych czynników wirulencji. Collegium Medicum im L. Rydygiera Bydgoszcz 2006; rozprawa doktorska

7 Nr 1 Adhezja M. morganii do polistyrenu Donelli G, Paoletti C, Baldassarri L i inni. Sex pheromone response, clumping, and slime production in enterococcal strains isolated from occluded biliary stents. J Clin Microbiol 2004; 42: Falagas ME, Kavvadia PK, Mantadakis E i inni. Morganella morganii infections in a general tertiary hospital. Infection 2006; 34: Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989; 42: Ishiguro E, Ainsworth T, Trust TJ, Kay WW. Congo red agar, a differential medium for Aeromonas salmonicida, detects the presence of the cell surface protein array involved in virulence. J Bacteriol 1985; 164: Kim BN, Kim NJ, Kim MN i inni. Bacteraemia due to tribe Proteae. A review of 132 cases during a decade ( ). Scand J Infect Dis 2003; 35: Michalska A. Ocena wybranych właściwości biologicznych oraz pokrewieństwa szczepów pałeczek Enterobacter spp. Collegium Medicum im. L. Rydygiera. Bydgoszcz 2008; rozprawa doktorska. 14. Nayak N, Nag TC, Satpathy G, Ray SB. Ultrastructural analysis of slime positive & slime negative Staphylococcus epidermidis isolates in infectious keratitis. Indian J Med Res 2007; 125: Osanai S, Nakata H, Ishida K i inni. Renal abscess with Morganella morganii complicating leukemoid reaction. Intern Med 2008; 47: Różalski A, Sidorczyk Z, and Kotełko K. Potential virulence factors of Proteus bacilli. Microbiol Mol Biol Rev 1997; 61: Samonis G, Anatoliotaki M, Apostolakou H i inni. Fatal septicemia and meningitis due to Morganella morganii in a patient with Hodgkin s disease. Scand J Infect Dis 2001; 33: Sica S, DiMario A, Salutari P i inni. Morganella morganii pericarditis after resolvent splenectomy for immune pancytopenia following allogenic bone marrow transplantation for acute lymphoblastic leukemia. Clin Infect Dis 1995; 21: Tsai WC, Chang LK. Morganella morganii causing solitary liver abscess complicated by pyopericardium and left pleural effusion in a nondiabetic patient. J Microbiol Immunol Infect 2002; 35: Türkyilmaz S, Eskiizmirlier S. Detection of slime factor production and antibiotic resistance in Staphylococcus strains isolated from various animal clinical samples. Turk J Vet Anim Sci 2006; 30: Wang TJ, Huang JS, Hsueh PR.. Acute postoperative Morganella morganii panophthalmitis. Eye (Lond) 2005; 19: Zalas-Więcek P, Gospodarek E, Piecyk K. Wytwarzanie śluzu pozakomórkowego, a adhezja pałeczek Escherichia coli do polistyrenu. Med Dośw Microbiol 2009; 61: Otrzymano: 22 XI 2010 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium im. Rydygiera w Bydgoszczy, UMK w Toruniu

8