Katarzyna Jachna-Sawicka, Maja Kleszczyńska, Eugenia Gospodarek

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Adhezja oraz wytwarzanie śluzu zewnątrzkomórkowego przez dzikie i kliniczne szczepy pałeczek Acinetobacter baumannii Adhesion and slime production by wild and clinical strains of Acinetobacter baumannii Katarzyna Jachna-Sawicka, Maja Kleszczyńska, Eugenia Gospodarek Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Celem pracy była ocena adhezji i wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego przez szczepy Acinetobacter baumannii izolowane z różnych środowisk. Spośród 51 badanych szczepów A. baumannii, z materiału pochodzącego z dolnych dróg oddechowych wyosobniono 14 szczepów, z wymazu z rany 17, a pozostałe 20 szczepów izolowano z próbek gleby. Do polistyrenu adherowało 51,0% badanych szczepów, w tym 70,0% szczepów dzikich oraz 38,7% szczepów klinicznych. Wytwarzanie śluzu stwierdzono u 31,4% szczepów, z czego najliczniejszą (42,9%) grupę stanowiły szczepy izolowane z dróg oddechowych. Nie wykazano związku między wytwarzaniem śluzu zewnątrzkomórkowego, a adhezją szczepów do polistyrenu. Słowa kluczowe: Acinetobacter baumannii, adhezja, chorobotwórczość, śluz zewnątrzkomórkowy ABSTRACT Introduction: Adhesion of bacteria to the surface plays a key role in the development of infection, and is the first stage of biofilm formation. The ability of A. baumannii strains to adhesion and forming biofilms on abiotic surfaces, as well as eucaryotic cells was described. A. baumannii is also capable of secretion of the exopolysaccharide (EPS) - a substance that allows the binding of bacterial cells to the surface, and with each other. The aim of this study was to evaluate the ability of biofilm formation and slime production by wild-type and clinical strains of A. baumannii. Methods: We examinated 51 strains of A. baumannii, including 14 isolated from lower respiratory tract, 17 from wound swabs and 20 from the soil. Adhesion to polystyrene was evaluated by modified Christensen methods and slime production by Ishiguro method.

2 222 K. Jachna-Sawicka, M. Kleszczyńska, E. Gospodarek Nr 3 Results: Adhesion to polystyrene was observed in 51,0% of strains, including 70,0% of wild-type and 38,7% of clinical strains (64,7% strains from wound swabs and one strain from lower respiratory tract). Slime production was found in 31,4% of strains, of which the largest (42.9%) group strains were isolated from lower respiratory tract. There was no correlation between production of extracellular slime, and the adhesion of strains to polystyrene. Conclusions: Different levels of expression of virulence factors in A. baumannii strains isolated from different origin indicates their importance in the colonisation ecological niches and the development of infections at various sites. Key words: Acinetobacter baumannii, bacterial adhesion, pathogenicity, slime production WSTĘP Adhezja bakterii do powierzchni odgrywa kluczową rolę w rozwoju zakażenia oraz jest pierwszym etapem tworzenia biofilmu. Pałeczki rodzaju Acinetobacter wykazują zdolność adhezji zarówno do powierzchni nieożywionych, jak i do komórek eukariotycznych (5, 8, 9, 14, 17, 18). Do nieswoistych mechanizmów odpowiedzialnych za adhezję zalicza się siły termodynamiczne, napięcie powierzchniowe, siły van der Waalsa oraz oddziaływania hydrofobowe. Adhezja swoista zależy od specyficznych powierzchniowych adhezyn umiejscowionych na powierzchni zewnętrznych struktur komórki bakteryjnej. Biofilm (błona biologiczna, biowarstwa) jest społecznością wielokomórkową, złożoną z bakterii (rzadziej grzybów) należących do tego samego lub różnych gatunków, wykazujących zdolność adhezji do podłoża i do siebie nawzajem. Udowodniono jego znaczenie w patogenezie wielu zakażeń (4, 7, 16, 21). Zdolność do tworzenia biofilmu uznaje się za jeden z czynników wirulencji drobnoustrojów. Pałeczki A. baumannii mają zdolność wydzielania egzopolisacharydu (EPS, extracellular polimer substances) substancji umożliwiającej wiązanie komórek bakterii z powierzchnią i ze sobą nawzajem. Celem pracy była ocena zdolności adhezji do polistyrenu i wytwarzania zewnątrzkomórkowego śluzu przez szczepy A. baumannii izolowane z materiału klinicznego oraz z gleby. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiło 51 szczepów pałeczek A. baumannii. Spośród nich 31 izolowano od 29 chorych leczonych w Szpitalu Uniwersyteckim im. dra A. Jurasza w Bydgoszczy. Z materiału pochodzącego z dolnych dróg oddechowych (BAL, ang. bronchoalveolar lavage, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe) wyosobniono 14 szczepów, natomiast 17 z wymazu z rany. Pozostałe 20 szczepów pochodziło z próbek gleby. Identyfikację do gatunku przeprowadzono przy użyciu testów API 20 NE (biomérieux), które wykonano zgodnie z zaleceniami producenta. Wyniki reakcji biochemicznych odczytywano w systemie komputerowym ATB Expression z zastosowaniem bazy danych wersji V Zdolności adhezyjne badanych szczepów oceniano w jałowych, polistyrenowych płytkach wielodołkowych (Medlab) według metody Christensena i wsp. (6). Badane szczepy

3 Nr 3 Właściwości adhezyjne A. baumannii 223 hodowano na podłożu MacConkey Agar (biomérieux) przez 24 godziny w temperaturze 37 C. Wyrosłe kolonie zawieszano w bulionie tryptozowo-sojowym (Tripticase Soy Broth, TSB) i hodowano przez 20 godzin w temperaturze 37 C. Następnie badane szczepy zawieszano w 5 ml TSB, aby uzyskać zawiesinę bakterii o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda. Po 100 µl uzyskanej zawiesiny wprowadzano (w trzech powtórzeniach) do studzienek płytek wielodołkowych i prowadzono inkubację w warunkach tlenowych przez 24 godziny w temperaturze 37 C. Hodowle usuwano, a płytki przemywano roztworem PBS o ph 7,2. Bakterie przylegające do płytki utrwalano przez minutę 96% alkoholem etylowym i barwiono przez 5 minut 15% wodnym roztworem fioletu krystalicznego. Nadmiar barwnika usuwano, a płytki przemywano wodą wodociągową. Po wysuszeniu płytek, związany z powierzchnią płytki fiolet krystaliczny rozpuszczano w 75% alkoholu etylowym i odczytywano gęstość optyczną (OD, optilcal density) przy użyciu czytnika mikropłytek Synergy HT (Biotek) przy długości fali λ=540 nm. Kontrolę stanowiło jałowe podłoże TSB poddawane tym samym, co badane szczepy etapom analizy. Uzyskane wyniki pomiarów uśredniano. Interpretacja uzyskanych wyników polegała na powiększeniu o wartość trzech odchyleń standardowych średniej odczytów OD dla próby kontrolnej. Na tej podstawie szczepy bakteryjne podzielono na cztery grupy: nie adherujące (OD 0,795), słabo adherujące (OD >0,795 i 1,336), średnio adherujące (OD >1,336 i 1,877), silnie adherujące (OD >1,877) do polistyrenu. W celu oceny wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego przez pałeczki A. baumannii zastosowano metodę Ishiguro i wsp. (12) w modyfikacji własnej. Dwudziestogodzinne hodowle badanych szczepów w podłożu TSB prowadzone w temperaturze 37 C odwirowywano (10 minut/2,5-3 RPM). Supernatant usuwano, a z osadu przygotowywano zawiesiny w PBS (ph 7,2) o gęstości 2,0 według skali MacFarlanda. Następnie w jałowych probówkach typu Eppendorf umieszczano 250 µl zawiesiny i taką samą objętość roztworu czerwieni Congo (Sigma) o stężeniu 15 µl/ml. Mieszaninę wytrząsano przez 5 minut/1400 RPM, a następnie wirowano przez 10 minut przy 13,5 RPM. Uzyskany supernatant przenoszono do studzienek okrągłodennych sterylnych płytek polistyrenowych, w objętości po 100 µl (w trzech powtórzeniach dla każdej próby) i mierzono OD supernatantu w wielodetekcyjnym czytniku mikropłytek Synergy HT, przy długości fali λ=480 nm. Kontrolę stanowiło 50 µl jałowego podłoża TSB z taką samą objętością stosowanego roztworu czerwieni Congo. Uzyskane wyniki pomiarów uśredniano. Równolegle prowadzono pomiar OD zawiesin bakteryjnych. Otrzymane wyniki wiązania czerwieni Congo przeliczano na jednostkę OD zawiesin bakteryjnych i przedstawiono jako wartość procentową według wzoru: OD 480 badanej próby po inkubacji z czerwienią Congo % wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego = x100% OD480 zawiesin bakteryjnych Na podstawie uzyskanych wyników szczepy podzielono na trzy grupy: szczepy obficie wytwarzające śluz ( 10%), szczepy słabo wytwarzające śluz ( 5% i < 10%), szczepy niewytwarzające śluzu (< 5%).

4 224 K. Jachna-Sawicka, M. Kleszczyńska, E. Gospodarek Nr 3 WYNIKI Spośród 51 badanych szczepów zdolność adhezji do polistyrenu wykazało 26 (51,0%). Słabo adherowało 15 (29,4%) szczepów, średnio - 8 (15,7%) szczepów, natomiast trzy (5,9%) szczepy wykazały silne właściwości adhezyjne (Ryc. 1). 60% 49,0% 45% 29,4% 30% 15,7% 15% 5,9% 0% Szczepy silnie adherujące Szczepy średnio adherujące Szczepy słabo adherujące Rycina 1. Adhezja pałeczek A. baumannii (n=51) do polistyrenu Szczepy nieadherujące Gleba (n=20) Materiał kliniczny (n=31) Wymaz z rany (n=17) BAL (n=14) 0% 20% 40% 60% 80% 100% Szczepy silnie adherujące Szczepy słabo adherujące Szczepy średnio adherujące Szczepy nieadherujące Rycina 2. Adhezja do polistyrenu pałeczek A. baumannii (n=51) z uwzględnieniem ich pochodzenia Rycina 2 obrazuje wyniki oceny adhezji badanych szczepów do polistyrenu w zależności od ich pochodzenia. Adhezję do polistyrenu stwierdzono u 14 (70,0%) szczepów glebowych, 11 (64,7%) szczepów wyosobnionych z wymazu z rany i jednego szczepu z dolnych dróg oddechowych. Zdolność słabej adhezji do polistyrenu wykazano u 45,0% szczepów glebowych, 29,4% szczepów z wymazów z rany i 7,2% z materiału z dolnych dróg oddechowych. Natomiast szczepy średnio adherujące stanowiły 35,3% szczepów

5 Nr 3 Właściwości adhezyjne A. baumannii 225 izolowanych z wymazu z rany i 10,0% szczepów glebowych. Szczepy silnie adherujące (15,0%) pochodziły z próbek gleby. Zdolność wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego stwierdzono u 16 (31,4%) spośród 51 badanych szczepów A. baumannii, z czego szczepy słabo wytwarzające śluz stanowiły 25,5% (ryc. 3). Cztery (42,9%) szczepy izolowane z dolnych dróg oddechowych wytwarzały śluz zewnątrzkomórkowy. W grupie 17 szczepów wyosobnionych z wymazów z rany szczepy wykazujące tę cechę stanowiły 35,3%, a wśród szczepów glebowych 25,0% (Tabela I). 75% 68,6% 60% 45% 30% 25,5% 15% 5,9% 0% Szczepy obficie wytwarzające śluz Szczepy słabo wytwarzające śluz Szczepy nie wytwarzające śluzu Rycina 3. Wytwarzanie śluzu zewnątrzkomórkowego przez szczepy A. baumannii (n=51) Tabela I. Wytwarzanie śluzu zewnątrzkomórkowego przez szczepy A. baumannii (n=51) z uwzględnieniem ich pochodzenia Pochodzenie szczepów BAL (n=14) Wymaz z rany (n=17) Gleba (n=20) Szczepy obficie wytwarzające śluz zewnątrzkomórkowy Szczepy słabo wytwarzające śluz zewnątrzkomórkowy Szczepy nie wytwarzające śluzu zewnątrzkomórkowego 0 (0,0%) 4 (42,9%) 10 (57,1%) 1 (5,9%) 6 (29,4%) 10 (64,7%) 2 (10,0%) 3 (15,0%) 13 (75,0%) Wśród 31 szczepów izolowanych z materiału klinicznego 11 (35,5%) wytwarzało śluz zewnątrzkomórkowy. W przypadku 10 (32,3%) szczepów właściwość tę określono jako słabą. Słabe wytwarzanie śluzu zewnątrzkomórkowego stwierdzono u trzech, a obfite u dwóch szczepów glebowych (15,0% i 10,0% odpowiednio). Wykazano, że 15,7% szczepów adherowało do polistyrenu i wytwarzało śluz zewnątrzkomórkowy. Szczepy adherujące i niewytwarzające śluzu stanowiły 35,3%, z czego 10 (50,0%) szczepów pochodziło z gleby, 7 (41,2%) z wymazu z rany i jeden szczep z dolnych dróg oddechowych (Tabela II).

6 226 K. Jachna-Sawicka, M. Kleszczyńska, E. Gospodarek Nr 3 Tabela II. Związek między adhezją do polistyrenu i wytwarzaniem śluzu przez szczepy A. baumannii (n=51) Grupa szczepów Szczepy adherujące i wytwarzające śluz Szczepy adherujące i niewytwarzające śluzu Szczepy nieadherujące i wytwarzające śluz Szczepy nieadherujące i niewytwarzające śluzu BAL (n=14) Wymaz z rany (n=17) Gleba (n=20) Ogółem (n=51) 0 (0,0%) 4 (23,6%) 4 (20,0%) 8 (15,7%) 1 (7,2%) 7 (41,2%) 10 (50,0%) 18 (35,3%) 6 (42,9%) 1 (5,9%) 1 (5,0%) 8 (15,7%) 7 (50,0%) 5 (29,4%) 5 (25%) 17 (33,3%) DYSKUSJA Pałeczki Acinetobacter sp. należą do drobnoustrojów oportunistycznych wywołujących zakażenia szpitalne. Gatunkiem o największym znaczeniu klinicznym jest A. baumannii. W zakażeniach z udziałem tych pałeczek jako jeden z czynników ryzyka wymienia się stosowanie biomateriałów. Rozwój zakażenia w miejscu zastosowania biomateriału, zależy od czasu przylegania drobnoustroju do jego powierzchni, zdolności adhezyjnych, właściwości hydrofobowych, a także wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego, który wpływa stabilizująco na kolonizację biomateriału przez drobnoustrój (21). Adhezja do komórek gospodarza, czy też powierzchni nieożywionych, stanowi istotny proces w kolonizacji i jest kluczowa dla powstawania biofilmu. Stosując do oceny adhezji metodę według Christensena i wsp.(6) w modyfikacji własnej stwierdzono, że około połowa spośród badanych szczepów adherowała do polistyrenu, z czego największą grupę stanowiły szczepy izolowane z próbek gleby. Drugą grupę, co do częstości występowania badanej cechy, stanowiły szczepy izolowane z wymazu z rany. Wyniki te są zgodne z badaniami przeprowadzonymi przez Kraśnickiego i Gospodarek (17) nad adhezją pałeczek Acinetobacter sp. do para-ksylenu, w których zdolnością adhezji cechowało się 48,0% szczepów. Według Koljalg i wsp. (14) szczepy A. baumannii izolowane z ran i moczu miały słabsze właściwości hydrofobowe niż szczepy wyosobnione ze środowiska szpitalnego. W badaniach własnych zaobserwowano związek między pochodzeniem szczepów, a adhezją do polistyrenu stwierdzając przewagę tej zdolności u szczepów izolowanych z gleby. Porównując zdolność adhezji do polistyrenu szczepów izolowanych z obu rodzajów próbek materiału klinicznego, należy zwrócić uwagę na niski odsetek szczepów adherujących pochodzących z dolnych dróg oddechowych, w porównaniu ze szczepami wyosobnionymi z wymazu z rany. Być może ma to związek z etiopatogenezą zakażenia rany, gdzie zdolności adhezyjne szczepu, oprócz wytwarzania endo- i egzotoksyn, odgrywają znaczącą rolę. Specyficzna adhezja daje początek rozwoju kolonii bakteryjnej, w coraz bardziej zorganizowaną, złożoną i oporną na leczenie strukturę jaką jest biofilm. Stosując do oceny wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego przez pałeczki A. baumannii metodę wiązania czerwieni Congo, jego tworzenie stwierdzono u 31,4% badanych szczepów. Najliczniejszą grupę wykazującą tę cechę stanowiły szczepy izolowane z dolnych

7 Nr 3 Właściwości adhezyjne A. baumannii 227 dróg oddechowych. Uzyskane wyniki potwierdzają tezę innych autorów zajmujących się badaniem właściwości Pseudomonas aeruginosa (15), że wytwarzanie śluzu jest cechą przede wszystkim szczepów izolowanych z materiału klinicznego. Mogą też wskazywać na znaczenie tej cechy jako czynnika wirulencji biorącego udział w rozwoju zakażenia w obrębie dróg oddechowych (19, 20). Analizując zależność między adhezją szczepów do polistyrenu i wytwarzaniem przez nie śluzu zewnątrzkomórkowego wykazano, że szczepy adherujące do polistyrenu, ale nie wytwarzające śluzu zewnątrzkomórkowego stanowiły największą grupę spośród badanych szczepów A. baumannii. Bartoszewicz i wsp. (2, 3) badając zdolność wytwarzania śluzu i adhezji Staphylococcus spp. do cewników urologicznych i stwierdziły, że 70,0% szczepów adherowało do powierzchni biomateriału, ale nie wytwarzało śluzu zewnątrzkomórkowego. Także Zalas-Więcek i wsp. (22) badając wytwarzanie śluzu i adhezję E. coli do polistyrenu wykazały, że szczepy nieadherujące wytwarzają więcej materiału pozakomórkowego niż adherujące. Natomiast według Hussain i wsp. (11) wytwarzanie śluzu nie jest konieczne w adhezji do powierzchni polimerów, ale stanowi ważny etap podczas kolonizacji. Baldassarri i wsp. (1) wysunęli hipotezę, że śluz zewnątrzkomórkowy może utrudniać dostęp do adhezyn gronkowców odpowiedzialnych za wiązanie bakterii z komórkami gospodarza. Możliwe więc, że warstwa śluzu zewnątrzkomórkowego u badanych pałeczek A. baumannii maskuje powierzchniowe struktury, które biorą udział w wiązaniu komórek z powierzchnią polistyrenu. Oprócz oporności na antybiotyki, także czynniki wirulencji sprzyjają rozwojowi i utrzymywaniu się zakażeń. Śmiertelność pacjentów cierpiących z powodu zakażeń szpitalnych z udziałem pałeczek A. baumannii wynosi, w zależności od czynników ryzyka, nawet 75% (10, 13). Stąd, ważne jest poznanie ich czynników wirulencji, oraz kontynuowanie badań na większej liczbie szczepów. PIŚMIENNICTWO 1. Baldassarri L, Donnelli G, Gelosia A i inni. Expression of slime interferes in vitro detection of host protein receptors of Staphylococcus epidermidis. Infect Immun 1997; 65: Bartoszewicz M, Nowicka J, Przondo-Mordarska A. Wybrane cechy warunkujące chorobotwórczość Staphylococcus haemolyticus. Med Dośw Mikrobiol 2003; 55: Bartoszewicz M, Nowicka J, Przondo-Mordarska A. Ryzyko zakażenia gronkowcami koagulazoujemnymi u cewnikowanych chorych związane z adhezją i wytwarzaniem śluzu. Pol Merk Lek 2004; 17: Bartoszewicz M, Rygiel A. Biofilm jako podstawowy mechanizm zakażenia miejsca operowanego- -metody prewencji w leczeniu miejscowym. Chir Pol 2006; 8: Cevahir N, Melek D, Kaleli I i inni. Evaluation of biofilm production, gelatinase activity, and monose-resistant hemagglutination in Acinetobacer baumannii strains. J Microbiol Immunol Infect 2008; 41: Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ i inni. Adherence of coagulase-negative stsphylococci to medical devices. J Clin Microbiol 1985; 22: Davis S, Martinem L, Kirsner R. The Diabetic foot: The importance of biofilms and wound bed preparation. Curr Diab Rep 2006; 6: Fleischer M, Przondo-Mordarska A. Adhezyny pałeczek z rodzaju Acinetobacter. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50:

8 228 K. Jachna-Sawicka, M. Kleszczyńska, E. Gospodarek Nr 3 9. Gospodarek E. Właściwości hydrofobowe Acinetobacter calcoaceticus. Med Dośw Mikrobiol 1994; 46: Hernández-Torres A, García-Vázquez E, Gómez J, Canteras M, Ruiz J, Yagüe G. Multidrug and carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infections: factors associated with mortality. Medicina Clin 2012; 138: Hussain M, Wilcom MH, White PJ. The slime of cagulase-negative with reference to slime production, adherence, antibiotic resistance and clinical significance. J Hosp Infect 1992; 22: Ishiguro E, Ainsworth T, Trust TJ, Kay WW. Congo red agar, a differentia medium for Aeromonas salmonicida, detects the presence of cell surface protein array involved in virulence. J Bacteriol 1985; 164: Kim YJ, Yoon JH, Kim SI i inni. High mortality associated with Acinetobacter species infection in liver transplant patients. Transplant Proc 2011; 43: Koljalg S, Vuopio-Varkila J, Lyytikainen O i inni. Cell surface properties of Acinetobacter baumannii. AMPIS. 1996;104: Kołodyński J, Fil J, Jankowski S. Powierzchniowe właściwości klinicznych i środowiskowych szczepów Pseudomonas auruginosa. Adv Clin Exp Med 2002; 11: Kosikowska U, Malm A. Biofilm in vivo - intrygujące wyzwanie dla nauki. Farm Pol 2004; 60: Kraśnicki K, Gospodarek E. Adhezja Acinetobacter sp. do para-ksylenu. Med Dośw Mikrobiol 2004; 56: Lee H-W, Koh YM, Kim J i inni. Capacity of multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii to form biofilm and adhere to epithelial cell surfaces. Clin Microbiol Infect 2008; 14: May T, Shinabarger D, Maharay R i inni. Alginate synthesis by Pseudomonas aeruginosa: a key factor in chronic pulmonary infections of cystic fibrosis patient. Clin Microbiol Rev 1991; 4: Prince A. Adhesion receptors of Pseudomonas aeruginosa associated with infections of the respiratory tract. Mikrob Pathogen 1992; 13: Różalska B, Sadowska B, Więckowska M, Rudnicka W. Wykrywanie biofilmu bakteryjnego na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50: Zalas-Więcek P, Gospodarek E, Piecyk K. Wytwarzanie śluzu pozakomórkowego, a adhezja pałeczek Escherichia coli do polistyrenu. Med. Dośw Mikrobiol 2009; 61: Otrzymano: 13 VIII 2012 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Praca wykonana w ramach działalności statutowej - utrzymanie potencjału badawczego Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu.