DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko
Mini-słowniczek SNP (Single Nucleotide Polymorphism) - zmienność sekwencji DNA; HET - analiza heterodupleksów; HPLC - chromatografia cieczowa; PCR - reakcja łańcuchowa polimeryzacji; amplikon - fragment DNA powstały w wyniku amplifikacji.
Cel metody - Porównanie dwóch lub większej liczby chromosomów za pomocą mieszaniny zdenaturowanych amplikonów PCR, które pozwala na detekcję mutacji dzięki różnej retencji homo- lub heterodupleksów DNA w układzie odwróconej fazy. - Można znajdować substytucje pojedynczych nukleotydów, krótkie insercje i delecje oraz polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNPs), - Temperatura wpływa tu na czułość detekcji i jej wartość optymalna może być wyznaczana metodami komputerowymi.
Faza stacjonarna Stanowią ją alkilowane nieporowate cząstki kopolimeru polistyrenu i poliwinylobenzenu, o średnicy 2-3 mikrometrów (DNASep) Umożliwia rozdzielenie cząsteczek kwasów nukleinowych przy pomocy chromatografii par jonowych, z zastosowaniem układu odwróconej fazy.
Separacja DNA Stosuje się hydroorganiczny eluent (związek wymywający), zawierający amfifilowe jony, np. trietyloamonowe, pochodzące z octanu trietyloaminowego (TEAA). Dodatnio naładowane jony trietyloamonowe są adsorbowane między niepolarną fazę stacjonarną, a hydroorganiczną fazę ruchomą, co prowadzi do pojawienia się dodatniego ładunku powierzchniowego. Wielkość tego ładunku zależy od wielu czynników, tj. temperatury, siły jonowej, stałej dielektrycznej fazy mobilnej, itd.
Separacja DNA Retencja cząsteczek dsdna będzie zależeć od siły oddziaływań elektrostatycznych między dodatnio naładowaną powierzchnią fazy stacjonarnej, której ładunek zawdzięcza związanym jonom trietyloamonowym, z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi cząsteczek DNA. Wymywanie odbywa się na skutek zwiększania stężenia rozpuszczalnika organicznego, np. acetonitrylu w fazie mobilnej, co skutkuje desorpcją dodatnio naładowanych jonów, a w konsekwencji i dsdna.
Detekcja heterodupleksów Heterodupleksy charakteryzują się mniejszą stabilnością niż homodupleksy, przez co nawet częściowa ich denaturacja pozwala na uzyskanie znacznej różnicy w retencji. Ta niestabilność wynika z obecności naprzeciw siebie niekomplementarnych zasad. Heterodupleksy zawierające parę G-T będą pozostawały w układzie dłużej niż heterodupleksy z parą A-C, ponieważ otaczające ją inne pary zasad bardziej stabilizują cząsteczkę.
Przebieg metody DHPLC http://4ffkhs61xjo3g7q3l6b7s61t.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/dhpl C.swf http://www.adsbiotec.com/products/laboratory-automation/wave/
Wpływ ilości TEAA i temperatury Zwiększenie stężenia TEAA w fazie ruchomej skutkowało koniecznością podniesienia temperatury w celu efektywnej denaturacji. Nie zwiększyło to rozdzielczości metody. Niektóre mutacje są wykrywane tylko przy zastosowaniu określonej wartości temperatury.
Multipleksowe wykrywanie mutacji
DHPLC w warunkach całkowicie denaturujących DHPLC w warunkach częściowo denaturujących niesie ze sobą problemy: - mieszanie badanego genomu z referencją przed analizą - dodatkowe metody są drogie Rozwiązanie: dzięki całkowitej denaturacji DHPLC rozwija się pojedyncze kwasy nukleinowe jako funkcję ich składu, a nie wielkości.
Kolejność wypłukiwania kwasów nukleinowych czas wypłukiwania Cytozyna hydrofilowa Guanina grupa karbonylowa i aminowa Adenina grupa aminowa Tymina grupa metylowa; hydrofobowa
Zastosowanie - mapowanie genów (Arabidopsis thaliana), - badanie wzajemnego wpływu wad genetycznych, - detekcja metylacji, - analiza ilościowa ekspresji genów, - szukanie w genach mutacji, które mogą wywołać chorobę nowotworową,
Podsumowanie - Metoda DHPLC umożliwia rozpoznanie mutacji dzięki rozróżnieniu homo- i heterodupleksów, - Wymaga tylko wcześniejszego przeprowadzenia reakcji PCR, poza tym jest metodą bardzo prostą, - Pozwala na mapowanie genów, - Temperatura, w jakiej jest przeprowadzany pomiar, ma wpływ na jego czułość.
Zapraszamy do zadawania pytań :) Dziękujemy za uwagę Prezentacja przygotowana na podstawie artykułu Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review, Wenzhong Xiao i Peter J. Oefner, Human Mutation, 2001