DHPLC. Denaturing high performance liquid chromatography. Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko

Podobne dokumenty
Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

PORÓWNANIE FAZ STACJONARNYCH STOSOWANYCH W HPLC

Wpływ ilości modyfikatora na współczynnik retencji w technice wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Ilość TAK TAK TAK TAK TAK TAK

CHROMATOGRAFIA W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH RP-HPLC

Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej

ROZDZIELENIE OD PODSTAW czyli wszystko (?) O KOLUMNIE CHROMATOGRAFICZNEJ

Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

Wykład 9: HUMAN GENOME PROJECT HUMAN GENOME PROJECT

GraŜyna Chwatko Zakład Chemii Środowiska

Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK RETENCJI W TECHNICE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Kolumnowa Chromatografia Cieczowa I. 1. Czym różni się (z punktu widzenia użytkownika) chromatografia gazowa od chromatografii cieczowej?

mikrosatelitarne, minisatelitarne i polimorfizm liczby kopii

Pytania z Chromatografii Cieczowej

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II

Wykład: HUMAN GENOME PROJECT HUMAN GENOME PROJECT

prof. Joanna Chorostowska-Wynimko Zakład Genetyki i Immunologii Klinicznej Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie

Biologia Molekularna Podstawy

Ślesin, 29 maja 2019 XXV Sympozjum Analityka od podstaw

SPECJALNE TECHNIKI ROZDZIELANIA W BIOTECHNOLOGII. Laboratorium nr1 CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH

PCR - ang. polymerase chain reaction

MATERIAŁY DO ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH - CHROMATOGRAFIA JONOWA

Politechnika Wrocławska. Dopasowywanie sekwencji Sequence alignment

Kontrola produktu leczniczego. Piotr Podsadni

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych

RP WPROWADZENIE. M. Kamiński PG WCh Gdańsk Układy faz odwróconych RP-HPLC, RP-TLC gdy:

PL B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

PCR. Aleksandra Sałagacka

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier.

Scenariusz lekcji przyrody/biologii (2 jednostki lekcyjne)

Wysokosprawna chromatografia cieczowa dobór warunków separacji wybranych związków

Biologia medyczna, materiały dla studentów

Proteomika. Złożoność proteomów

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

HUMAN GENOME PROJECT

Chromatografia kolumnowa planarna

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Konspekt lekcji biologii w kl. III gimnazjum

KARTA PRZEDMIOTU. 1. NAZWA PRZEDMIOTU: Genetyka w sporcie KOD S/I/st/24

ANALIZA DANYCH POCHODZĄCYCH Z SEKWENCJONOWANIA NASTĘPNEJ GENERACJI

Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 Nowoczesne techniki analityczne

Pytania Egzamin Licencjacki. 1. Wyjaśnij pojęcie: szybkość reakcji enzymatycznej. Omów metodę wyznaczenia szybkości reakcji enzymatycznej.

Zmienność genomu. Przyczyny, skutki i sposoby kontroli

PODSTAWY BIOINFORMATYKI 11 BAZA DANYCH HAPMAP

POTWIERDZANIE TOŻSAMOSCI PRZY ZASTOSOWANIU RÓŻNYCH TECHNIK ANALITYCZNYCH

Dr hab.n.med. Renata Jacewicz

Nowe podejście do chromatograficznej analizy związków budujących kwasy nukleinowe

Przydatność technologii Sekwencjonowania Nowej Generacji (NGS) w kolekcjach Banków Genów Joanna Noceń Kinga Smolińska Marta Puchta Kierownik tematu:

-- w części przypomnienie - Gdańsk 2010

BADANIA WŁAŚCIWOŚCI LIPOFILOWYCH ZWIĄZKÓW PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

Skrypt Bioinformatyka DRAFT Strona 67

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

Projektowanie reakcji multiplex- PCR

GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR. RealTime- PCR. Nested- PCR. Digital- PCR.

PP7: Wymiana jonowa i chromatografia jonowymienna oznaczanie kationów i anionów

PCR - ang. polymerase chain reaction

Dominika Stelmach Gr. 10B2

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Techniki immunochemiczne. opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami

PCR - ang. polymerase chain reaction

Elektroforeza kwasów nukleinowych

ZAKŁAD CHEMII ANALITYCZNEJ

Genetyka, materiały dla studentów Pielęgniarstwa

WYZNACZANIE ZAKRESU WYKLUCZANIA DLA WYPEŁNIEŃ STOSOWANYCH W WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII WYKLUCZANIA (HPSEC)

3. Podstawy genetyki S YLABUS MODUŁU (PRZEDMIOTU) I nformacje ogólne. Nazwa modułu. Kod F3/A. Podstawy genetyki. modułu

AmpliTest Babesia spp. (PCR)

Jolanta Jaroszewska-Manaj 1. i identyfikacji związków organicznych. Jolanta Jaroszewska-Manaj 2

Podstawowe techniki barwienia chromosomów

Mutacje jako źródło różnorodności wewnątrzgatunkowej

Bioinformatyka Laboratorium, 30h. Michał Bereta

RP WPROWADZENIE. M. Kamioski PG WCh Gdaosk 2013

Wprowadzenie do genetyki sądowej. Materiały biologiczne. Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów

MARKERY MIKROSATELITARNE

Materiały pochodzą z Platformy Edukacyjnej Portalu

Kombinatoryczna analiza widm 2D-NOESY w spektroskopii Magnetycznego Rezonansu Jądrowego cząsteczek RNA. Marta Szachniuk

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Spis treści 1 Komórki i wirusy Budowa komórki Budowa k

Materiał obowiązujący do ćwiczeń z analizy instrumentalnej II rok OAM

Podstawowe techniki barwienia chromosomów

EFEKT SOLNY BRÖNSTEDA

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

8. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

SYLABUS MODUŁU (PRZEDMIOTU) Informacje ogólne

Identyfikacja węglowodorów aromatycznych techniką GC-MS

ANALIZA DANYCH POCHODZĄCYCH Z SEKWENCJONOWANIA NASTĘPNEJ GENERACJI

DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących

Elektroforeza kwasów nukleinowych

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ REAKCJI CHEMICZNYCH. ILOŚCIOWE ZBADANIE SZYBKOŚCI ROZPADU NADTLENKU WODORU.

Transkrypt:

DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko

Mini-słowniczek SNP (Single Nucleotide Polymorphism) - zmienność sekwencji DNA; HET - analiza heterodupleksów; HPLC - chromatografia cieczowa; PCR - reakcja łańcuchowa polimeryzacji; amplikon - fragment DNA powstały w wyniku amplifikacji.

Cel metody - Porównanie dwóch lub większej liczby chromosomów za pomocą mieszaniny zdenaturowanych amplikonów PCR, które pozwala na detekcję mutacji dzięki różnej retencji homo- lub heterodupleksów DNA w układzie odwróconej fazy. - Można znajdować substytucje pojedynczych nukleotydów, krótkie insercje i delecje oraz polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNPs), - Temperatura wpływa tu na czułość detekcji i jej wartość optymalna może być wyznaczana metodami komputerowymi.

Faza stacjonarna Stanowią ją alkilowane nieporowate cząstki kopolimeru polistyrenu i poliwinylobenzenu, o średnicy 2-3 mikrometrów (DNASep) Umożliwia rozdzielenie cząsteczek kwasów nukleinowych przy pomocy chromatografii par jonowych, z zastosowaniem układu odwróconej fazy.

Separacja DNA Stosuje się hydroorganiczny eluent (związek wymywający), zawierający amfifilowe jony, np. trietyloamonowe, pochodzące z octanu trietyloaminowego (TEAA). Dodatnio naładowane jony trietyloamonowe są adsorbowane między niepolarną fazę stacjonarną, a hydroorganiczną fazę ruchomą, co prowadzi do pojawienia się dodatniego ładunku powierzchniowego. Wielkość tego ładunku zależy od wielu czynników, tj. temperatury, siły jonowej, stałej dielektrycznej fazy mobilnej, itd.

Separacja DNA Retencja cząsteczek dsdna będzie zależeć od siły oddziaływań elektrostatycznych między dodatnio naładowaną powierzchnią fazy stacjonarnej, której ładunek zawdzięcza związanym jonom trietyloamonowym, z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi cząsteczek DNA. Wymywanie odbywa się na skutek zwiększania stężenia rozpuszczalnika organicznego, np. acetonitrylu w fazie mobilnej, co skutkuje desorpcją dodatnio naładowanych jonów, a w konsekwencji i dsdna.

Detekcja heterodupleksów Heterodupleksy charakteryzują się mniejszą stabilnością niż homodupleksy, przez co nawet częściowa ich denaturacja pozwala na uzyskanie znacznej różnicy w retencji. Ta niestabilność wynika z obecności naprzeciw siebie niekomplementarnych zasad. Heterodupleksy zawierające parę G-T będą pozostawały w układzie dłużej niż heterodupleksy z parą A-C, ponieważ otaczające ją inne pary zasad bardziej stabilizują cząsteczkę.

Przebieg metody DHPLC http://4ffkhs61xjo3g7q3l6b7s61t.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/dhpl C.swf http://www.adsbiotec.com/products/laboratory-automation/wave/

Wpływ ilości TEAA i temperatury Zwiększenie stężenia TEAA w fazie ruchomej skutkowało koniecznością podniesienia temperatury w celu efektywnej denaturacji. Nie zwiększyło to rozdzielczości metody. Niektóre mutacje są wykrywane tylko przy zastosowaniu określonej wartości temperatury.

Multipleksowe wykrywanie mutacji

DHPLC w warunkach całkowicie denaturujących DHPLC w warunkach częściowo denaturujących niesie ze sobą problemy: - mieszanie badanego genomu z referencją przed analizą - dodatkowe metody są drogie Rozwiązanie: dzięki całkowitej denaturacji DHPLC rozwija się pojedyncze kwasy nukleinowe jako funkcję ich składu, a nie wielkości.

Kolejność wypłukiwania kwasów nukleinowych czas wypłukiwania Cytozyna hydrofilowa Guanina grupa karbonylowa i aminowa Adenina grupa aminowa Tymina grupa metylowa; hydrofobowa

Zastosowanie - mapowanie genów (Arabidopsis thaliana), - badanie wzajemnego wpływu wad genetycznych, - detekcja metylacji, - analiza ilościowa ekspresji genów, - szukanie w genach mutacji, które mogą wywołać chorobę nowotworową,

Podsumowanie - Metoda DHPLC umożliwia rozpoznanie mutacji dzięki rozróżnieniu homo- i heterodupleksów, - Wymaga tylko wcześniejszego przeprowadzenia reakcji PCR, poza tym jest metodą bardzo prostą, - Pozwala na mapowanie genów, - Temperatura, w jakiej jest przeprowadzany pomiar, ma wpływ na jego czułość.

Zapraszamy do zadawania pytań :) Dziękujemy za uwagę Prezentacja przygotowana na podstawie artykułu Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review, Wenzhong Xiao i Peter J. Oefner, Human Mutation, 2001